Herencia, genes y ADN 89 ADN recombinanle 104 Detecién de acidos nucleicos y poteinas 116 Functn dels genes en eucariotas Exennenro cuve: Fipstesis do! provirus de ADN Neem woLccunan: Vey sida 105 102 scresin de la informacion gonciica 97 122 Fundamentos de biologia molecular A BIOLOGIA MOLECULAR CONTEMPORANEA se acupa principalmente de la ‘comprensién de los mecanismos responsables dela transmisién y expre: sin de la informacién genética que en Ultimo término determinan la es- tructura y funcion calulares. Come fue expuesto en el Capitulo 1, todas las célu- las comparten un nimero de propiedades basicas, y ésta unidad subyacente de la biologia celular es paricularmente evidente en e| nivel molecular. Tal unidad ha permitido a los cientificos elegir organismos sencillos (como las bacterias) ‘como modelos para muchos experimentos fundamentales, asumiendo que mo- canismos moleculares similares son comunes en organismos tan distintos como E- coliy ol organismo humano, Numeroses experimentas han demostra- do la validez de esta premisa, y actuaimente es evidente que la biologia mole- ular celular proporciona un marco uniticador para comprender diversos aspec- tos del compartamiento celular. Los avances iniciales en biologia molecular se lograron aprovechando el rapido crecimiento y la facilidad de manipulacién del genoma de bacterias sen- cillas como E. coli, y sus virus. Recientemente se han aplicado con éxito en eucariotas no sélo los principios tundamentales sino también muchos de los abordajes experimentales desarrollados inicialmente en procariotas. El desa- rrollo de las técnicas de ADN recombinante ha tenido un tremendo impacto en la biologia molecular, permitiendo el aislamiento y caracterizacién en detalle de genes eucariotas individualos. Los avances actuales en la tecnologia del ADN recombinante han posibiltado que incluso la secuenciacién completa del geno- ma humano sea un proyecto factible. Herencia, genes y ADN ‘Quiza la propiedad fundamental de todos los sores vivos os la capacidad de reproducirse, Todos los organismos heredan de sus progenitores la informacion ‘genética especiticando su estructura y funcién. De igual forma, todas las células provienen de otras células preexistentes, por lo que el material genético ha de ser replicado y transferido del progenitor a la célula hija en cada division celular. E! modo por e! cual [a informacion genética es replicada y transmitida de célula a célula y de organismo a organismo representa pues una de las cuestiones centraies de la Biologia. Asi, la elucidacién de ios mecanismos de la transmi- sin genética y Ia identificacién del ADN como el material genético fueron des- cubrimientos que constituyen los cimientos de nuestro entendimiento actual de la Biologia a nive! molecular. 8990 © Seccién | Introduccion Figura 3.1 Herencia de genes dominantes y recesivos Genes y cromosomas Los principios gonéticos ckisicos fueron deducidos por Gregor Mendel en 1865, basandose en experimentos con guisantes. Mendel estudid la herencia de un ‘nlimero de rasgos bien definidos, como el color de la semilla, y fue capaz de deducir las reglas generales para su transmisi6n. Interpreto correctamente los patrones de herencia observadios asumiendo que cada rasgo esta determinado or un par de factores heredados, conocidos actualmente como garies. De ‘cada progenitor se hereda una copia del gen (llamada ie!) especificands cada fasgo. Por ejemplo cruzando dos variedades de guisantes —una con se mmillas amarilas y otra con semillas verdes— se obtienen los siguientes resulta- dos (Fig. 3.1): Las copas progenitoras tienen cada una dos copias idénticas del gen que especifica el color amarillo (Y) 0 verde (y) de las semillas, respectiva- mente. Las plantas hijas son por lo tanto hibridos, habiendo heredado un gen para semillas amarillas (¥) y olro para semillas verdes (y). Todas estas plantas hijas (la primera generacién 0 F,) tiene semillas amarillas, por lo que se dice que elamarillo (¥) as ciominante y el verde (yj eooesivo. El genotipo (composicion genética) de los guisantes F, es entonces Yy, y su ‘ene tive (apariencia fisica) es amarillo. Si se cruza un descendiente F, con otro, dando lugar a la genera: cidn F,, los genes de las semillas amarillas y verdes se segregan de tal forma que la proporcién entre plantas F, con -semillas amarillas y aquellas con ser llas verdes es 3:1 Los descubrimientos de Mendel, aparentemente por delante de su tiempo, fueron ignorados hasta 1900, cuando las leyes de Mendel fueron redescubier tas y se reconocié su importancia, Poco después se propuso el papel de los, cromosemias como portadores de genes, al evidenciar que la mayor parte de las células de plantas superiores y animales son «‘iploicie, es decir, contienen dos copias de cada cromosoma. Sin embargo, la formacién de las células ger: minales (el espermatozoide y el Gvulo) se produce a través de un tipo caracte- ristico de division celular (e105!) en el cual un Unico cromosoma de cada par se transmite a cada célula hija (Fig. 3.2). Por lo tanto, el espermatozoide y el 6vulo son hapioices, dado que contiene una copia de cada cromosoma. La union de estas dos células haploides en la fertiizacién da lugar a un nuevo Tas capas progenioras posen cada ura oo Copas m ® pss aos) el gon cue eacten a color progontore amarilo(¥)9 vets (y) Solas semvles t | [aearereerea peetagecackeat | om O4-O SENSE am es dan lugar ala goneracion hiorda F. Dado que V es dominant, todas las er plantas de la F; tienen serillas amavilas, Gametos El cuzamianto entre dos piantas Fy da lugar a la generacion F, con una proporcion caracteristca de 3:1 entre Fenotiges dominants (amarillo) y rocesivo (verve) Goneracien Fs:Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 91 Progenitor masculino Progenitor emenino Las células ciploides contienen dos pence copias de cada cromosoma. Metosis, { Espermatozoite Ovule izacion Repl “Ty La fertitzacién de lugar a la Embrion formacién de un embrion diploid, ‘que contiene un eromosoma de cada progenitor en cada par de Diplido sores) crganismo diploide, que contiene ahora un cromosoma de cada par procedente 2 cada progenitor, masculino y femenino, El comportamiento de los pares de cromosomas se asemeja al de los genes, llevando a la conclusion de que los genes son transportados por los cromasomas. Los fundamentos de las mutaciones, ligamiento genético y las relaciones snire genes y cromosomas fueron en su mayor parte establecidos en experi- mentos con la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Drosophila se man- tiene con facilidad en el laboratorio, y se reproduce cada dos semanas, lo cual ‘una considerable ventaja para experimentos genéticos, De hecho, estas ca- racersticas siguen haciendo a Drasophilaun organismo de eleccion para estu- clos genéticos en animales, particularmente en el andlisis genético del desarro- lloy a diterenciacion ‘Aprincipios de este siglo se identiicaron una serie de alteraciones genéticas {nutaciones) en Drosophila, afectando a caracteristicas tacilmente observa- bles como el color de los ojos o la forma de las alas. Los experimentos de cruzamiento ingicaron que algunos de los genes responsables de estos ras- gos se heredan de forma independiente entre ellos, sugiriendo que estos ge~ Nes se ocalizan en diferentes cromosomas que se segregan independiente- mente durante la meiosis (Fig. 8.3). Otros genes, por otro lado, se heredan Juntos como caracteristicas emparejadas. Dichos genes se dice que estén ligados entre si en virtud de estar localizados en el mismo cromosoma, El ‘numero de grupos de genes ligados es el mismo que el nimero de cromoso- mas (cuatro en Drosophila), apoyando la idea de que los cromasomas son los Porladores do los gones. Sin embargo el ligamiento entre genes no es completo; los cromosomas intecambian material durante la meiosis, dando lugar a la vecombiniavion en tte genes ligados (Fig. 3.4). La frecuencia de recombinacién entre dos genes Igados depende de la distancia entre ellos en el cromosoma; genes que estan ‘21ca se recombinan con menor frecuencia que aquellos que estan lejos entre si, Poro tanto las frecuencias con las que distintos genes se recombinan pue- den ser usadas para determinar su posicion relativa en el cromosoma, perm) tendo la construcoion de mapas geneticos. En 1915 se habian definido y ma- peado casi un centenar de genes en los cuatro cromosomas de Drosophila, Fevando a la aceptacion general de la teoria cromos6mica de la herencia, Figura 3.2 Cromosomas durante la meiosis y fer- tilizacién. Se lustran des pares de cto mosomas de un organism hipotético,92 © Seccidn | Introduccion Copas progent toras Generacién Fy Fiqwa 33 Segregacién y ligamiento genético. (A) Segregacion de dos genes hipotét 00s para la forma (A/a = cuadradorredon- 1] y 0 color (B/D = rojalazul localizados fen distintos cromosomas. (B) Ligamionto da. dos ganes lecalizados en el mismo (A) Segregacién de dos genes hipotéticos para la forma (Aia = cvadradoirecondo y Bib = ojofazul) (6) Ligamionte de dos genes focalizados ene! mismo Cepas progent toras [Dado que ambos ‘ganos ostin en mismo eromosoma, ‘no Se separan entre ‘alls en la moices. “it Dado que los cromosomas se |segregan independientemente| ‘durante la meiosis, a \goneracion Fy da lugar a [cuatro tinos distinos ae eerie Pro tanto, ia \gametos. Q ‘generacion F; produce| solo das tipos de ‘gametes [La generacion Fz muestra 501 dos fenotipos redondotjoy redondafazul— con la proporsion 3:1 eatactaristica de la herenola do un gen dco Lageneracion F, muestra |) cuatiofenatipos distinios cuadrado'ro, cundraco! ‘azul, redondaitojoy redonda azul-c Genes y enzimas Los estudios genéticos iniciales se centraron en la identificacién y localizacion cromesémica de los genes que controlan caracteristicas facilmente observa- bles, como el color de los ojos de Drosophila. Sin embargo, el modo por el que las genes producian los fenotipos observados era desconocido. La primera ob: ‘servacién de la relacidn entre genes y enzimas llego en 1909, cuando se evi- dencié que la enfermedad! hereditaria humana fenilcetonuria (véase Medicina Molecular, Cap. 2) resullaiva de un defecto genético en el metabolismo del ami-Figua 34 Recombinacion genética. Durante la meiosis los miembros de pares de cromosomas, iniercambian material. El resultado es la recombinacion entre genes igados. ‘odcido fenilalanina, Surgié la hipdtesis de que el delecto aparecia por una deliciencia de la enzima necesaria pata catalizar alguna reaccion metabolica limplcada en el metabolismo aminoacido, llevando a la presuncién general de Ue los genes especifican la sintesis de enzimas. Una evidencia mas clara de la relacién entre los genes y la sintesis de enzi- mas legé con los experimentos de George Beadle y Edward Tatum, llevades a cabo en 1941 con el hongo Neurospora crassa. En el laboratorio Neurospora puede cultivarse en medios de cultivo basicos o enriquecidos similares a los ‘descitos en ol Capitulo 1 para el cullivo de E.coli Para Neurospora los medios bésioos contienen Unicamenste sal, glucosa y biotina; los enriquecidas se su- plementan con aminoacidos, vitaminas, purinas y pirimidinas. Beadle y Tatum aislaron cepas mutantes de Neurospora que crecian con normalidad en medios. _enriquecidos pero no crecian en medios basicos. Se encontré que cada mutan- Jerequeria un suplemento nutricional especifico, coma un determinado aminoa- ‘do, para poder crecer. Ademés se correlacionaba la necesidad de un determi: ‘ado nutiente con la incapacidad de la cepa mutante para sintetizarlo. De este modo, cada mutacién producia una deficiencia en una via metabolica especifi ‘ca, Dado que se sabia que estas rutas metabdlicas estaban compuestas de fenzimas, la conclusion de estos experimentos fue que cada gen codificaba la sinlesis de una enzima Unica —ia hipotesis un ger-ainie enzinwa, Actualmente sesabe que muchas enzimas se componen de varios polipéptidos, porlo que la afimacion aceptada en este momento es que cada gen codifica la estructura de ‘na cadena polipeptidica. Identificacién del ADN como ef material genético Elentendimiento de la base cromosémica de la herencia y a relacion entre genes y enzimas no aportaron per so una explicacién molecular del gen. Los ‘omosomas contienen proteinas ademas de ADN, y se creyé inicialmente que 4s genes eran proteinas. La primera evidencia que llev6 a la identificacion del ADN como e! material genético llegd de estudios en bacerias. Estos exper- montos representan el prototipo de los abordajes actuales para detinirla funcion elos genes basados en la introduccion de secuencias de ADN en las células, ‘como sera expuesio mas adelante en este capitulo, Los experimentos que definieron el papel del ADN se derivaron de estudios sobre a bacteria que causa la neumonia (Preumococcus). Las cepas virulen- \de Preumococeus estan rodeadas de una capsula de polisacarido que pro- ala bacteria del ataque del sistema inmune del huésped. Dado que la ula da a las colonias un aspecto liso en el medio de cultivo, las cepas vapsuladas se denominan L. Las cepas mutantes que han perdido la capa- de sintetizar la capsula (denominadas R) forman colonias con el borde 30 no son letales cuando se inoculan en el ratén. En 1928 se observo los ratones inoculados con bacterias no encapsuladas (R) y bacterias uladas (S} inactivadas con calor desarrollaron neumonia y mutieron. viene resefiar que las bacterias aisladas en estos ratones eran del tipo S. perimentos posteriores mostraron que un exiracto de bacterias de tipo S de ceiulas era iqualmente capaz de convertir (0 transformar) bacterias R estado S. Por jo tanto, una sustancia en el extracto S (llamado el principio rsformiador 0 transformante) era responsable de inducir la trays! ornacien wtica de bacteria Ra S, En 1944 Oswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty establecieron de ‘doble que el principio transformador era ADN, purificandolo de extractos Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 93 oa a ee Figuea 3.5 Mapa genético. Tres genes son situa dos en un eromosoma hipotetice basa. dose en las frecuencias de recombina cién entre ellos (1% de recombinacion entre ay b; 8% entre by c; 4% entre a yg. Las frecuencias de. recambina {ién son aproximadamante proporciona- les a la distancia ontre genes on el cro 3% ” > Frecuensias 168 recambinacién94 @ Seccidn | + Introduccion bacterianos y demostrando que su actividad desaparece tras la digestion enz: matica del ADN y no tras la digestion enzimatica de las proteinas (Fig. 3.6) Pose a que estos estudios no llevaron a la aceptacién inmediata del ADN como el material genético, fueron ampliados unos pocos anos después con expert mentos con virus bacterianos. En particular se observ que cuando un virus infectaba a una célula era preciso que el ADN viral penetrara en la célula (pero no las proteinas) para que ol virus se replicara. Ademas, a las particulas virales hijas se transmite el ADN del virus progenitor y no sus proteinas. La concurron- cia de estos resultados junto con estudios posteriores de la actividad del ADN en a transformacion bacteriana llevd a la aceptacién de la idea de que el ADN es ol material genético. Estructura del ADN La comprensién de la estructura tridimensional del ADN, deducida en 1953 por James Watson y Francis Crick, ha sido la base para la biologia molecular ac- tual. En la época de los trabajos de Watson y Crick se sabia que el ADN era un polimero compuesto de cuatro nuclestides —dos purinas (adenina [A] y quan 1a [G)) y dos pirimidinas (citosina [C] y timina {T])— unidas a aztcares fosforila- dos. Dado el papel central del ADN como material genstico, la elucidacion de su estructura tridimensional parecia critica para entender su funcién. El enfoque de Waison y Crick del problema estuvo muy influenciado por la descripcion de Linus Pauling de las uniones por puentes de hidrégeno y la -hélice, un tipo ‘comin de estructura secundaria de las proteinas (véase el Cap. 2). Se obtuvo ademas informacion experimental sobre la estructura del ADN con los estucios de cristalogratia por refraccién de rayos X llevados a cabo por Mautice Wilkins y Rosalind Franklin, El andlisis de estos datos revel6 que el ADN es una hélica que da un gio cada 3,4 nm, y que la distancia entre bases es de 0,34 nm, porlo que en cada vuelta de la hélice hay diez bases. Un dato importante es que el Giametro de la hélice es de 2nm, sugiriendo que esta compuesto no de una sino de dos cadenas de ADN. Bactorias Bactorias no) patogénicasL ——_patogénicas ADN Capsule ‘Se afade ADN purifeado L a bacterias 7 Figua 3.6 ‘Transferencia de informacion genética por el ADN. Se ‘extae ol ADN do una cepa patogénica de Preumococcus, rodeado de una capsula y que forma colonias isas (L). Si se fade este ADN purificado L a un culo de Preumococcus Bactorias L ho patogénicos, que no forman capsula y que forman cole: ras rugosas (R), Se transforman a la forma L. Por lo tanto el |ADN punficade Contiene la informacion genética responsa- ble de la transformacin de bacterias Fen LCapitulo 3 + Fundamentos de biologia molecular © 95 _ ‘Apart de estos datos Watson y Crick construyeron su modelo del ADN (Fig. 37). La principal caracteristica es que se trata de una doble hélice con el esqueleto azuicar-Iosfato en el exterior de la molécula. Las bases estan en el interior, orientadas de tal forma que se forman enlaces de hidrégeno entre puri= nas y pimidinas de cadenas opuestas. El apareamiento de las bases es muy e=pecitico: A siempre se empareja con T y G con C. Esta especificidad explica losresultados previos de Erwin Chargatf, quien analiz6 la composici6n de diver- 508 ADN y encontré que la cantidad de adenina era siempre equivalente ala de timina,y a cantidad de citosina a la de quanina. A causa de esta especiticidad fen el apareamiento de bases las dos hebras de ADN son complementarias: cada hebra contiene toda la informacion necesaria para especificar la secuen- a de bases de la otra Replicacién del ADN Eldescubrimiento de la especificidad en el apareamionto de las bases entre las os hebras del ADN sugirié de forma inmediata una solucién para la cuestion de cémo el material genético dirige su propia replicacién —un proceso que es ne- EL ADN es una doble hice con las bases fn el interior y el esqueleto azucar fostato tnelexterorde la moira, Figura 37 } 034m Estructura det ADN Las bases dela hebras opuestas se aparean mediante enlaces de hidiégeno ene adenina (A) y tinina (Ty entre guanina (@) y atosina (C). Las dos hebras de ADN corren en ieeciones opuesias, denies por los grupos S| y3° de las uridades de desoxitoosas, exramo96 © Seccidn | © Introduccion cesario cada vez que la célula se divide. Se propuso que las dos hebras de la molécula de ADN se podrian separar y servir como moldes para la sintesis de nuevas hebras complementarias, cuya secuencia seria dictada por la especific- dad en el apareamiento de bases (Fig. 3.8). El proceso se denomina ‘epic ion semiconservativa porque una hebra de ADN progenitor se conserva en cada una de las dos moléculas hijas de ADN. En 1958 se obtuvo apoyo directo para la teoria de la replicacién semiconser: vativa del ADN gracias a una serie de elegantes experimentos llevados a cabo por Matthew Meselson y Frank Stahl, en los cuales el ADN fue marcado con is6topos que alteraron su densidad (Fig. 9.9). Se hizo crecer E. coli en medios ‘de cultivo que contenian el isétopo pesado del nitrégeno (N") on lugar del iscto- po normal, mas ligero (N“*). Consecuentemente el ADN de estas bacterias con- tenia N'* y era mas pesado que el de las bacterias crecidas en N”*, Este ADN pesado se podia separar de! ADN que contenia N'* por centritugacion de equil- brio en un gradiente de densidad de CsCl. Esta posibilidad de separar ADN pesado (N") de ADN ligero (N"") permitié estudiar la sintesis de ADN. Se trans- firieron células de E. col que habian crecido en ef medio con N'° a un medio que contenia N', y se les permitié replicarse una vez mas. Se extrajo su ADN y se analiz6 por centrifugacién en un gradiente de densidad de CsCl. Los re- sultados de este analisis indicaron que todo el ADN pesado habia sido rem plazado por ADN de nueva sintesis con una densidad intermedia entre el de las moléculas de ADN pesada (N'") y igera (N"). El significado es que durante la replicacion las dos hebras de ADN parental pesado se separan y sirven de moldes para la sintesis de hebras hijas de ADN ligero, produciendo moléculas, de doble hebra de densidad intermedia. Este experimento proporciono ev: dencia directa de la replicacion semiconservativa del ADN, subrayando la im portancia del apareamiento complementario de bases entre las hebras de la doble hélice. La capacidad de! ADN para servir de molde para su propia replicacion tue establecida mas adelante con la demostracién de que una enzima purificada de E. coli{la ADIN polimerasa) podia catalizar la replicacion del ADN in vitro. Con la presencia de ADN como molde, la ADN polimerasa era capaz de dirigir la incorporacién de nuclestidos en una molécula del ADN comple mentaria, Hebra parental de ADN Hebrahija de ADN Figura 38 Replicacién semiconservaliva del ADN. Las dos hebras de ADN pa: rental se separan,y cada una sirve como motde para la sintosis de una hebra hija por apareamiento complementario de basesBactoias creeds con Bacteria crecidas en NI ——_ ———- Sasa ow Centitugado en solueién de CaC! — “eS Centitugado en solucion de CsC! | Extracion de AON Densidad ‘en aumonta Densicad fen aumento [ADN pesado Los genes acttian determinando la estructura de las proteinas, que son respon- sables de dirigir el metabolismo celular a través de su funcién como enzimas. La identficacion del ADN como el material genético y la elucidacién de su estructu- rarevelaron que la informacién genética se especifica por el orden de las cuatro bases (A, C, Gy T) que constituyen la molécula de ADN. Las proteinas son polimeros de 20 aminodcidos, cuya secuencia determina su estructura y funcién, La primera relacion directa entre una mutacin genética y una alteracién en la setvencia de aminodcidos de una proteina se establecio en 1957, cuando se desoubrid que los pacientes con una enfermedad hereditaria denominada ane- mma de células falciformes poseen moléculas de hemoglobina que difieren de las. noimales en una sola sustitucién de un aminoacido. Se obtuvo un entendimien: tomas profundo de la relacién molecular entre ADN y proteinas tras una serie de experimentos que tomaron como modelos genéticos a E. coli y sus virus, Colinearidad de genes y proteinas La hipdtesis mas simple para entender Ia relacién entro genes y enzimas era queelorden de los nuclestidos en el ADN especificaba el orden de aminodcidos énla proteina. Las mutaciones en un gen se corresponderian con alteraciones ‘nla secuencia de ADN, que resultarian de la sustitucién de un nuciedtide por «i700 de la acicion 0 deleccion de nucledtidos. Estos cambios en la secuencia {e nuciestidos producirian los cambios correspondientes en la secuencia de aminoécidos de la proteina codificada por el gen en cuestién. Esta hipdtesis predecia que distintas mutaciones en el mismo gen alterarian distintos aminoa- Gos en la proteina cocificada, y que las posiciones de las mutaciones en un gone refejarian en las posiciones de las alteraciones en los aminodeidos a lo largo do su producto proteinico. La rapidez de replicacién y la simplicidad del sistema genético de E. coll ‘uoron de gran ayuda para abordar estas cuestiones. Se pueden aislar una gran variedad de mutantes, incluidas mutaciones nuticionales que (de igual modo quelas mutaciones de Neurospora disculidas previamonte) requieren deter) nados aminoacidos para crecer. El rapido crecimiento de E. col hizo posible el ‘slamiento y mapeo de mutaciones multiples en el mismo gen, levando a la primera demostracion de la relacion lineal entre genes y proteinas, En estos ‘studios Charles Yanotsky y sus colaboradores mapeados una serie de muta- ciones en el gen que codifica una onzima necesaria para la sintesis del aminod- Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 97 ‘Transteroncia a N" para una divisiin (cD — SAEED | Extracion de ADN SSS | canton on solucion de CsCl Densidad |ADN hibrido fen aumento Figura 3.9 Domostracién experimental de fa repli: cacién semiconservativa. Se tarslie- ren bacterias quo han sido cullvadas en lun media con ot isotope normal del nite geno (N') a un medio que contiene un Isotope pesado (N'") y se dejan crecer du: rante varias generaciones, Se transfieren de nuevo a un medio que sélo contione Nit se dejan crecer durante una genera: Cién adicional. Se extrae su ADNy se ana liza por centritugacién do equilibrio con tuna soluoien cel CsCl, el cual sedimenta formando un gradiente de densidad. Las rmoléculas de ADN se depositan a una al- tura a la que su densidad es equivalente a la dol CsCl. EI ADN de la bacteria creciga ‘en N que fue transferida para un unico ‘cio en N se deposita a una altura intr: ‘media entre las de! ADN de bacterias cul- tivadas exclusivamonte en N"*y N'™. Esto significa que es una motécula hibrida con tuna hebra ligera y otra pesada98 © Seccidn | * Introduccion Mutactones Proteina normal ‘Susttuciones de aminosicidos resullantes de as mutaciones fo Y ' ' 1 ' ' ; of} oF FU Figura 3.10 Colinearidad de genes y proteinas. Una serie de mutaciones (puntas de fecha) fueron mapeadas en el gen de E. col que codifica la tiptofano sintotasa {linea superior). Las sustituciones de aminodcidos resuitantes de cada mutacion fueron determinadas por se ‘cuenciacion de las proteinas de la bacteria mutante(\inea inferior). Estos andlisis revela ron que el orden de las mutaciones en e! ADN era el mismo que el orden de las susttucio- es de aminoaidos en la proteina codiicada cido tript6fano. El andlisis de las enzimas codificadas por los genes mutantes revel6 que las posiciones relativas de los aminoacidos alterados eran las mis- mas que las de las mutaciones correspondiontes (Fig. 3.10). Por lo tanto la secuencia de aminoacidos en la proteina es colineal con la de mutaciones en el gen, come es de esperar si el orden de nucledtidos en el ADN especitica el orden de aminoacidos en la proteina, Papel del ARN mensajero ‘Aunque la secuencia de nucledtidos en el ADN parecia especificar el orden de Jos aminoacidos en las proteinas, eso no significaba necesariamente que el ADN dirigiera por si mismo la sintesis de proteinas. De hecho, no parecia ser el caso, dado que el ADN se localiza en el nucleo de las células eucaridticas, mientras que la sintesis proteinica se lleva a cabo en el citoplasma. Era necesa- ria otra molécula para llevar la informacién genética del ADN a los sitios donde se realiza la sintesis de proteinas (los ribosomas). EI ARIN se antojaba un buen candidato para ser dicho intermediario porque la similitud de su estructura con la del ADN sugeria que el ARN podia ser sinteti zado a partir de un molde de ADN (Fig, 3.11). El ARN difiere del ADN en que se ‘compone de una cadena Unica en vez de ser de doble cadena, sus azucares son ribosas en vez de desoxirribosas y contiene la base pirimidinica uracilo (U) en vez de timina (T) (véase la Fig, 2.10). Sin embargo, ni el cambio de azicar ni la sustitucién de T por U altera el apareamiento de las bases, por lo que la sintesis de ARN puede ser realizada de manera directa sobre un molde de DN, Ademas, dado que el ARN se localiza primariamente en el citoplasma, parecia un intermediario logico para transferir la informacién del ADN a los ribosomas. Estas caracteristicas del ARN sugirieron una via para el flujo de informacién genética que se conoce como el Hagin cen'ral de la biologia mo- lecular: ADN —> ARN — Proteina De acuerdo con este concepto, las moléculas de ARN se sintetizan a partir de moldes de ADN (un proceso llamado transcripcion), y las proteinas se sintetizan ‘a partir de moldes de ARN (un proceso denominado traduccién). La evidencia experimental sobre la intermediacién de! ARN postulada por el ‘dogma central fue obtenida por Sidney Brenner, Francois Jacob y Matthew Me: Figura 3.11 Sintesis de ARN a partir de ADN. Las dos hebras de ADN se desentollan, y una es sada como molde para la sintesis de una hebra de ARN,Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 99 selson en estudios de E: cot infectados por el bacterisiago T4, La sintesis de ARN do E. coi se interrumpe tras la infeccion por el bacteriétago T4, después elo cval el Unico ARN de nueva sintesis en baciorias infectadas es transcrito a partirdel ADN dol T4. Este ARN del 4 se une a ribosomas bacterianos,transti- tendo a informacién del ADN al lugar donde se roaliza la sintesis proteinica Debido a su funcién como intermediarios en el lujo de informacion genética, las moiéculas de ARN que sirven de moldes para la sintesis proteinica se denomi- nan AFINs mensajeros (AFINm). Son transcritos por una enzima (AFIN pol Imerasa) que cataliza la sintesis de ARN a partir de un molde de ADN. Aparte del ARNm, existen otros dos tipos de moléculas de ARN que son importantes en la sintesis proteinica. EI ARM ribosomico (ARI) es un compo- nente delos ribasomas, y el AF de transferencia (AFM) funeiona como una ‘moléculaadaptadora que alinea los aminodcidos a lo largo del molde de ARNm. Laestructuray funcion de estas moléculas se tatan en la siguiente seccion y en mayor detale en los Capitulos 6 y 7. Céntigo genético {Cémo se traduce la secuencia de nuclestidos del ARNm a la secuencia de aminodcidos de una proteina? En este escalon de la expresién génica se trans- fer informacién genética entre macromoléculas quimicamente no rolaciona- 23 —cidos nucteicos y proteinas— y plantea dos nuevos problemas para en- tender la accién de los genes. Primero, dado que los aminodcidos no se relacionan estructuraimente con las bases de los dcidos nucteicos, ol anareamiento complementario directo en- tre las bases del ARNm y los aminodcidos durante la incorporacién de éstos a las proteinas parecia imposible. ,Cémo se alineaban entonces los aminoacidos sobre el molde de ARN durante la sintesis proteinica? Esta cuestién se aclar6 cone! descubrimiento de que los ARNT sirven de adaptadores entre los aminod- cidosy el ARNm durante la traduccidn (Fig. 3.12). Previamente a su ullizacién enla sintesis proteinica, cada aminodcido se une a su ARNI por medio de una erzima especiica. Ei apareamiento de bases entre una secuencia de reconoc- mento del ARINy una secuencia complementaria en el ARNm dirige al aminod- ‘bdo a su posicién correcta en el molde de ARNm. El segundo problema para traducir una secuencia de nucledtidos a una se- ‘wenca de aminodcidos era la determinacién del codigo genético. 4Cémo se fodta transfer lainformacién contenida en una secuencia nucleotidica de cua- to elementos ala secuencia de 20 aminodcidos disintos que compone las pro- teins? Dado que cuatro nuclestides deben codificar 20 aminodcides, son pre: ‘8 al menos {tes nucledtidos para codificar cada aminodcido. Tomados ‘nividvalmente, los cuatro nucledtidos sélo pueden codticar cuatro aminodcidos, Ylomados en parejas cuatro nuclestidos sé codtican dieciséis (4°) aminoai os, Sin embargo, tomados de tres en tres cuatro nucledtidos podrian codificar 64 (2) aminodcidos distintos —més que suficiente para los 20 aminodcidos ceistentes en las proteinas. Laevidencia experimental directa se obtuvo en estudios con el bacteriéfago 4, portador de mutaciones en un gen conocido detalladamente, llamado ri. os fagos con mutaciones en este gen forman placas anormalmente grandes, {ue son facmente cistinguibles de las fotmadas por fagos del tipo salvaje. Por lbtano, fue senciloaisiar y mapear un cierto numero de estas mutaciones en el 1,0 cua lev6 al establecimiento de un detallado mapa genético de este locus. Fowa 3.12 Funcién del ARN de transferencia. EI ARN do transferencia sirve como un adaptador ‘uant a sintesis proteica. Cada aminoacid (pe, histdina) se une al extremo de un FAA por una enzima apropiada (una aminoacil FINA‘ sintotasa). El RNA cargado se 4inea sobre un molde de FINAm por complementariedad de bases. aries Hissin! ARNT sinetasa ARI cargado ‘Apareamionto por ‘complementanedad / de bases100 Seccién | « Introduccién Figura 3.19 Evidencia genética det codigo do tr- pletes. Fueron estudiadas una serie de utaciones que consistian en la adicion 1 uno, dos 6 tes nucieétidas an el gan ri del bacteridfago T4. La adicién de uno 6 {dos nuclostidos altora ol marco de lectura {de todo el resto del gen, Por tanto todos los aminodcidos son anormales y se pro- duce una proteina inactiva, dando lugar a tun fago mutante. La adicién de tres nu- ledtidos, por el contraro, llera un nico ‘aminoéicida. El marco de iectura del resto el gen es normal, y se produce una pro- tina actva que da lugar al fago do tipo salvaje (TS), Figura 3.14 El triplete UUU codifica a la feni nna. La traduocion io vitro de un AFIN sinttico compuesto de uracios repetidos (un molde de uraciies repetides (un moi de do poli-U) leva ala sintesis do un po- lipeptido compuesto Lricamente por fen= lalanina, ‘Molo de pol: Tracueclon into AON AGG TGA TAT COG GAT ACC.GAG.. . Gon norma ‘Aminoacidos ( Proteina activa —» FagoTS ADN + +1 ruolestida Aminosicidos Proteina inactva—» Mutante ADN +2 nuclebtidos ‘Aminoacidos ( Protoina inaciva—» Mutane AON +9 nuolestidos Aminoscidos Proteina activa —» FagoTS El estudio de las recombinaciones entre mutantes del gen ri que surgieron por adiciones o deleciones de nucledtidos reveld que los fagos que contenian ad: ciones 0 deleciones de uno 0 dos nuclestides siempre mostraban el fenotipo mutante. Sin embargo, los fagos que contenian adiciones o deleciones de tres nuclestidos eran funcionalmente del tipo salvaje (Fig. 3.13). Estos hallazgos sugirieron que el gen se lee en grupos de tres nuclestidos, empezando a partir de un punto fio. Adiciones 0 deleciones de uno o dos nucledtidos alterarian el ‘marco de lectura de todo e! gen, llevando a la coditicacién de aminodcidos anor: males a lo largo de toda la proteina. Por el contrario, la adicién 0 delecién de {tes nucledtidos lleva a la adicién 0 delecién de un solo aminoacid; el resto de Ja secuencia aminoacidica permanece inalterada, produciendo frecuentemente una proteina activa. El desciframiento det cddigo genético se convirtié en un problema de asignar Iripletes de nuclestides a sus correspondientes aminoacides. La aproximacion al problema consistié en el uso de sistemas in vitro que realizaran sintesis pro- teinica (iraduccic 2}, Se sabia que los extractos celulares que contie ren rbosomas, aminoécldos, ANI y las enzimas responsables de unir a los ‘aminoacids con su correspondiente ARNt (aminoacil-ARNt sintetasas) son ca: paces de catalizar la incorporacién de aminodcidos a las proteinas. Esta sinte- sis proteinica depende de la presencia de ARNm unido a los ribosomas, y so puede aumentar afadiendo ARNm purificado. Dado que el ARNm dirige la sin- {esis proteinica en estos sistemas, el cédigo genético podria ser descosificado ‘estudiando la traduccién de ARNm sintélico de secuencia conocida, El primero de dichos experimentos, llevado a cabo por Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei, consistié en la traduccién in vitro de un polimero de ARNm que Unicamente contenia uracilo (Fig. 3.14). Este molde de poli-U dirigié la in- ‘corporacion de un Unico aminoacido —fenilalanina—en un polipéptide formado por residuos repetidos de fenilalanina, Por lo tanto el triplete UU coaiica el aminodécido fenilalanina, Experimentos similares con polimeros de ARNm com- puestos de un nico nucledtide establecieron que AAA codifica la lisina y CCC. cotifica la prolina. El resto del cédigo fue descifrado utiizando polimeros de ARNm compuesios de mezcias de nuclestidos, llevando a la asignacién de los 64 posibles tripletes (denominados covioness) (Tabla 3.1). De los 64 codones, 61 codifican algin aminodicido; los tres restantes (UAA, UAG y UGA) son codo- nes de parada 0 stop que sefializan la terminacién de la sintesis proteinica. El cédigo esta degenerado, dado que muchos aminosicidos estan codificados por mas de un codén. Con pocas excepciones (discutidas en el Cap. 10), todos los organismos utilizan el mismo cédigo genético, apoyando con fuerza la conclu si6n de que todas las células actuales han evolucionado a partir de un ancestro ‘coman.Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 101 ‘Segunda posletén a pail + selena SS REEEES EES. ellen u 6 posicion Pho Ser we Oe vu Pho Ser 1 oe ce Leu Ser stop STOP a Leu Ser stop TW i Lew Pro His ag u Lew Pro His Ag e Lew Pro Gin ang a Lew Fro Gin ag s ie the Asn Ser u te am Asn Sor ° ie Tw Uys ang A Met TH us Ag 6 val Aa asp oy vu va Ala Asp cy c val Ala cu oy A val Aa cw cy 6 Vins ARN y transcripcién inversa (Con el esciarecimiento del cédigo genético, los principios fundamentales de la bobogia molecular celular parecian estar establecidos. De acuerdo con el dog- ma central, el material genético es | ADN, que es capaz de autorreplicarse dems de transcribirse a ARNm, que sirve a su vez de molde para la sintesis Poivinica, Sin embargo, como fue expuesto en ol Capitulo 1, muchos virus tantienen ARN en vez de ADN como material genético, lo cual implica la exis- ‘encia de otros modos de transferencia de informacion. Los genomas de ARN fueron descubiertos en primer lugar en virus vegeta- Jes, muchos de los cuales se componen dnicamente de ARN y proteinas. En los 470350 se obtuvo evidencia directa de que el ARN actiia como material geneti- copormedio de experimentos que demostraron que el ARN purificado del virus {eI masaico de! tabaco podia infectar nuevas células, dando lugar a una proge- fie de vis infectivas. £1 modo de replicacion de la mayoria de los genomas Vieles ARN se determiné posteriormente en estudios de los bacteridfagos ARN ‘dE col Estos virus codifican una onzima especifica que cataliza la sintesis, 2 ARN a partir de un molde de ARN (sintesis de ARN dirigida por ARN), util zindo el mismo mecanismo de apareamiento de bases entre hebras comple- -nentarias que se da durante la replicacion del ADN o durante la transcripeién de ARN a partir de ADN, Sin embargo la sintesis de ARN dirigida por ARN no parecia ser responsa- biede a replicacion de determinados virus animales (virus tumorales de ARN), que son de particular interés dada su capacidad para producir cancer en los snimales intectados. Pese @ que estos virus contienen ARN genémico en las paticulas viales, los experimentos llevadas a cabo por Howard Temin en los @indicaron que se requeria sintesis de ADN en las células infectadas para ‘campletar su ciclo vital, llevando a la hipdtesis de que los virus tumorales de ARN (denominados actualmente retrovirus) se replicaban por medio de la sin- ‘esis de un ADN intermediario, llamado provirus de ADN (Fig. 3.15). Esta hipo- ‘esis ue rocibida inicialmente con incredulidad generalizada dado que implica la102 @ Seccion | * Introduccién TE BE Hipotesis del provirus de ADN El virus de} sarcoma de Rous (VSR), el primer virus inductor de cancer descrto, era de considerable interés como sistema ‘experimental para el estudio de la biologia molecular del céncer. Howard Temin comenz6 su Investigacion en esta area cuando, como estudiante de graduado en 1958, desarrolé el primer método para ia transiormacion de células ormales en células cancerosas tras su infeccién por el VSR. La disponibilidad de un metodo cuantitativo in vitro proporcioné la herramienta necesaria para studios posteriores de transformacién celular y replicacion viral. Mientras Temin realizaba dichos estudios, realiz6 una serie Je inesperadas observaciones que indicaron que Ia replicecién de VSR era basicamente distinta de la de! resto de virus ARN. Estos experiments llevaron a Temin a pproponer la hipstesis del provirus de ADN, que atirmaba que el ARN Viral se copiaba a ADN en las células infectadas-una propuesta que iba directamente en contra de! Universalmente aceptado dogma central de la biologia molecular—. Experimentos La hip6tesis del provirus de ADN se bbasaba en evidencia experimental de diversas fuentes. En primer lugar, los estudios de transformacién celular utiizando mutantes de VSR indicaron que la Informacion genética del vitus determinaba importantes caracteristicas en las o6lulas transformadas. Esta informacion se transmitia a las oélulas hijas tras cada division, incluso en ausencia de replicacién viral. Temin propuso que el genoma viral estaba presente en las células infectadas en una forma estable y heredable, que denoming provirus, La evidencia de que el provirus se compone de ADN se derive de ‘experimentos con inhibidores ‘metabolicos. La actinomicina D, que inhibe la sintesis de ARN a partir de un molde de ADN, inhibia la produccién de virus en células Infectadas por el VSR (véase la Figura). Por otro lado, fos inhibidores de la sintesis de ADN Inhibian estadios precoces de ia infeccién celular por VSR. Esto uso de manifiesto que se requoria sintesis de ADN al principio de la Infeccion y sintesis de ARN dirigida or ADN para produc virus hijos, 0 cual llevé a la propuesta de que el provirus era una copia de ADN del genoma ARN viral. Temin trate de aportar més evidencia utlizando hibridacién de dcidos nucleicos para detectar secuencias virales en e! ADN de células intectadas, pero la ssnsiblidad de las técnicas disponibles era limitada y los datos ‘no fueron convincentes. Impacto La hipstesis det provirus de ADN se propuso basandose en experimentos goneicos y en los efectos de inhibidores Metabélicos. Era una propuesta radical {que contradecia el aceptado dogma central dela biologia molecular. En este contexto, la hipdtesis de Temin de que el VSR se replicaba transtiriendo su informacion de ARN a ADN no sdlo no {ue aceptada por la comunidad Ciontifica, sino que 8 12 16 20 28 Horas {ue recibida con soma generalizada, Sin ‘embargo Temin continué durante los aos 60 sus experimentos tratando de ‘portar una evidencia mas convincente para su hipdtesis. Sus esfuerzos culminaron en 1970 con el ‘descubrimiento por Temin y Satoshi Mizutani, @ independientemente por David Baltimore, de una enzima viral, ‘conocida ahora como transcriptasa inversa, que sintetiza ADN a partir de un molde de ARN —una demostracién bioquimica inequivoca de que el dogma ‘central podfa invertrse—, sintesis de ADN dirigida por ARN —una inversién de! dogma central de ia biolo: | gia molecular—. Sin embargo, en 1970 Howard Temin y David Baltimore descu: brieron de forma independiente que el ARN de los virus tumorales contenia una enzima que catalzalla sintesis de ADN desde un molde de ARN. Adicionalmen- te se obtuvo evidencia fehaciente de la existencia de secuencias de ADN viral| Hipdtesis del provirus de ADN (continuacién) ‘Temin concuyé su articulo de 1970 otros sistemas biolégicas». Como | con la afirmacién de que los pedo Temin, el descubrimiento de fesuitados «consttuyen una fuerte la sintesis de ADN dirgida por ARN ovidencia de que la hipétesis del _ha llevado a importantes avances, provirus de ADN es correcta y que en el entandimiento del cancer, los los vius tumorales de ARN tienen retrovirus humanos y el ‘un genoma de ADN cuando estan _reordenamiento genstico. La dentro de las células y un genoma —_tranecriptasa inversa se ha de ARN cuando estan en forma de _convertido en una herramienta viriones. Estos resultados pueden critica para clonar 1 ADN, {ener importantes implicaciones en _repercutiendo en virtualmente ‘a carcinogénesis de origen viral y __ todas las dreas de la biologia bosiblemente en los modelos de celular y molecular lransferencia de informacién en _contempordnea, enlas células infectadas. La sintesis de ADN a partir de ARN, ahora denomina- {a ranscripcion inverse, fue establecida como un nuevo modo de transferen- ‘a de informacién en sistemas biol6gicos. Latranscripcién inversa es importante no solo en la replicacion de los retro- virus sino también en al menos olros dos aspectos de la biologia molecular y ‘eldar. Primero, la transcripcién inversa no es exclusiva de los retrovirus; ocu- mretambién en las células y frecuentemente es responsable de la transposicion 4 secuencias de ADN de una localizacién cromosémica a otra, como se discu- teen e! Capitulo 5. Segundo, las enzimas que catalizan la sintesis de ADN Atigida por ARN (Ir2nscriptasas inversas) se utilizan experimentalmente para generar copias de ADN a partir de una molécula de ARNm. El uso de la trans- ciplasa inversa ha permitido el estudio del ARNm de céiulas eucaristicas por medio de los métodos moleculares de manipulacién del ADN utiliza Particula de retrovirus seamen came S18 © arom a G: some ; iS ADN recombinante Las experimentos clasicos en bi logia molecular fueron llamativa inente exitosos en el desarrollo de les conceptos fundamentales so- biela naturaleza y expresién de los genes. Dado que estos estudios se tasaron en el andlisis genético, su 4ailo dependia en gran medida en lasleccién como modelos de orga- rismos simples y de rapida replica- Provirus de ADN Fura 3.15 Trenscripcién inversa y replicacién de retrovirus. Los Iwuovius contienen genamas de ARN en sus particulas v- ides. Cuando un rotrovius infecta una célula huésped se Stieiza una copia de ADN de! ARN viral por medio de a Innsctasa inversa. Esto ADN viral se integra en el ADN omosémice dal huésped para constitu un prowrus de DN, que se transcribe para dar lugar a vitus ARN hijos. Capitulo 3 ¢ Fundamentos de biologia molecu 103 Transeripeiin inversa104 @ Seccién i Introduccion cién (como las bacterias y los virus). Sin embargo, no estaba claro cémo se podrian generalizar estos principios fundamentales para proporcionar un enten- dimiento molecular de la complejidad de las células eucaridticas, teniendo en cuenta que los genomas de la mayoria de los eucariotas (p. ej., el genoma humano) son hasta mil veces mas complejos que el de E. col A principios de los afios 70 el panorama de estudiar dichos genomas a un nivel molecular era desalentador. En particular, no parecia haber una manera de aislar y estudiar genes individuals. Este obstaculo para el progreso de Ia biologia molecular fue superado por el desarrollo de la tecnologia del ADN recombinante, que proporcioné a los. cientiticas la posibilidad de aislar, secuenciar y manipuiar genes individuales derivados de cualquier tipo celular. La aplicacién del ADN recombinante ha permitido el estudio molecular detallado de la estructura y funcion de los {genes eucariéticos, revolucionando nuestro entendimiento de la biologia ce lular. Endonucleasas de restric El primer paso en el desarrollo de la tecnologia de! ADN recombinante fue la caracterizacion de las eviionucloe sas do reetriceisn —enzimas que cortan el ADN en lugares concretos y especiticos de su secuencia—. Fueron identifica i 108 © Seccion | * Introduccion Figura 3.19 Inserto de AON. DN dol vector Union de moléculas de ADN. E| ADN EcoRI ‘EooRI ppasajero y a! del vector se digieren con tna endonucleasa de resinecién (como I g(a yf Eco), que conta en sitios escalonados dejando extremos complementarios do ‘eationa simple. EL ADN que se desea in Ssertar y al del vector se asocian por apa- desert, Dado que ios genes eucarictioos estén haoitalmente intrrumpidos por Clonee AON = secuencias no codicantes (nrones; véase Cap, 4), que se elminan del ARNm a. por corte y empalmado o splicing, la posiblidad de clonar ADNe ademas del ADN roamiento complemertaria de bases ya S sos tngn covalonte ce las habras de ADN por ‘ ] medio do una ADN ligasa produce una J id moiéeula recombinante, —— eal | cone EcoRt | Conte Eco [El oore con Eco | : 5 3 produce dos extemos z Echexvos do cadena a 2 s Aoareamiento Compemenaio dobases sz 2 | Union por ADN gone Figura 320 Glonacisn de AON complementario Aan CED | Molécula recombinante Se za rencartesa cca | Los extremos complementaros emparejados pueden conectarse de forma defn: ele generar una copie. tiva por medio de una 40! jigs, una enzima que repara roturas en las hebras pare ee {do ADN (véase Cap. 5). De esta forma dos tragmentos distntos do ADN (p. 6 } tin ADN humano y un ADN del vactor 2) acondicionados tras digestion por la misma endonucleasa de restrccién pueden ser unidos para crear una molscula do ADN recambinante SRE Los fragmentos de ADN que pueden ser elonados nose limitan a aquellos que errr bt torminan en sitios do corte do enzimas de restriccion. Es posible anadir a los lSipeucltos cxtromos de cualquier fragmento do ADN adaptadores o linkers, que son secu: aceptaores 0 inkers 1B cias sintéticas que contienen sos de corte de endonucleasas de restriccon. Los [ave contienen sitios de adaptadores son oligonuclestidos cortos que se obtienen con facilidad por sinte- caper uees sis quimica, permitiendo preparar prdcticamente cualquier fragmento de ADN para ser igado a un vector ‘Ademas del ADN, es posible clonar también secuencias de ARN (Fig. 3:20) | El primer paso es sintetizar una copia de ADN a partir del ARN por medio de la ! oi Tae hoes transcrptasa inversa, El ADN producido (danominado /0!c porque es comple- | ~ rmentario al ARN utlizado como molde) se liga al vector de ADN del modo antesCapitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 109 ‘genémico ha sido critica para el entendimiento de la estructura y funcién de los genes. Vectores para el ADN recombinante Dependiendo del tamario del ADN que se inserta y del propésito del experimento. s posible ulilizar distintos vectores de clonacién para generar moléculas recom: binantes. Los sistemas mas basicos para a! aislamiento y propagacién de ADN clonado se exponen aqui. Otros tipos de vectores desarrollados para expresar ADN clonado ¢ introduccir moléculas recombinantes en células eucaridticas se \iscuten en secciones posteriores, Los bacteridfagos / son frecuentemente ulilizados como vectores para ol ais lamientoinicial de ADN genémico o de clones de ADNe de células eucaridticas (Fig.3.2). En los vectores de cionado / se han eliminado secuencias prescindi- bles del genoma viral y han sido reemplazadas por sitios de restriccion para inser- la ADN clonado. Para conseguir un genoma recombinante que pueda ser empa- uetaco dentro de los fagos jos fragmentos de ADN que se inserten pueden ser de hasta 15 kb. Para aislar clones gensmicos de ADN humano, por ejemplo, se ligan ragmentos al azar de ADN humano de un tamiario medio de 15 kb al ADN Gelos vectores /. Estas moléculas recombinantes de ADN se empaquetan dentro e particulas de fago mezclandolas con las proteinas del / (denominadas extrac- ‘os de empaquetamiento) in vitro, Las particulas obtenidas se utilizan para infec fa cutvos de E.coli, Dado que cada fago recombinante forma una calva tinica, pueden aislarse recombinantes portadores de un Unico ADN humano. Con méto- Fragmentos de ADN human a NES La Econ atgiore viga Empaquetamiento en tagos Fago recombinante Figuia 3.21 ‘Clonacién con bacteriéfagos / como vectores. EI vocior contiene un sitio de restriecion (pe), un sitio. Eco) para la insercidn de ADNe. Adicionaimente el Vector contiene en ambos extremos de su ADN sitios ‘0s (extremos cohesivos). que son necesaios para lempaquetar el ADN en los fagos. EI ADN pasaiero (p. fj, ADN humano) se liga al vector, y as moléculas Bcombinantes se empaquetan en fagos mezclandose ‘con proteinas virales. Los fagos recombine se ut (Capa bacteriana caren ig = ie Sear eae aaa aes Nay * thice Ue ABN so puede alr de una cata mht = y Ser cultivada en grandes cantidades.110_@ Seccién | * Introduccion cs dos de hibridacion de dcidos nucleicos y otras técnicas es posible identificar fagos recombinantes portadores de determinados genes de interés, como sera expues- to en la siguiente seccion, Los piasmiios (Fig. 3.22) son vectores que permiten una manipulacion més sencilla de las secuencias de ADN clonado que los fagos. Los plasmidos son peguefias moléculas de ADN circular que se replican en el interior de las bacte ras de forma independiente (sin necesidad de asociarse al ADN cromosémico), Lo tnico que se necesita es que en el ADN plasmidico exista un origen de rep! ©acien —la secuencia de ADN que sefializa el inicio de replicacién a la ADN polimerasa de la célula huésped—. Los plésmidos portan genes que confieren Fragmentos de ADN para insertar & Gz vs ADM aera pas | ‘Transformacién de E.coli con plismidos tecombinanies| Cultivo de las bacterias en un mecto con ampieaina Figura 3.22 Clonacién con vectores plasmidicos. — Medio de cultvo Elvector es una pequeria molécuia circu Colonia de bacteries —— ‘con ampiciina lar que contiene un origen de replicacion resistertes a ampictina (om), un gen que confire resistoncia a ampiciina (Amp) y un sitio de restriccién {. eh. EcoRI) que puede utlizarse para Ingenar ADN extrafio, E| ADN pasajero 0 liga al vector y los plasmidos recombi nantes son usados para transtormar E. coli Las bacterias se cultivan en un me= {dio que contione ampiciina, por lo que tinictmente forman colonies ins bacte. —-ADNe Fias que contenen el plasmido y son re- E cot sistertes a ampiclina. Cada colonia do bacterias conteniendo el plasmide puede fontonces alslarse y hacerse crecer en grandes cantidades, para aislar ios plas ‘midos recombinantes, Bactorias conteniendo ‘el pasmido recombinarteS Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 111 resistencia a antibiéticos (p. ej, resistencia a la ampicilina), por lo que las bacte- vias que portan los plasmidos pueden ser seleccionadas. El ADN de los plasm’ os contiene tinicamente entre 2 y 4 kb de ADN, en contraste con las 30 a 45 Kb del ADN de los fagos /, faciltando e! andlisis del fragmento de ADN insertado, Para clonar utiizando un plasmid como vector, se liga el fragmento de ADN (ue se desea insertar 0 pasajero a un sitio de restriccién apropiado en el vector y lamolécuia recombinants se usa para transformar un cuttivo de E.coli Las colonias. resistentes, que contienen el plésmido, son seleccionadas, Estas bacterias posee- horas del piésmido se hacen crecer en grandes cantidades y se extrae su ADN. Ls pequenias moléculas circulares de ADN plasmidico, de las que hay centenares e copias por bacteria, se separan del ADN cromosomico bacterian; el resultado 8 ADN plasmicico punficado apropiado para ol analisis del fragmento insertado, En determinados estudios de andlisis de ADN genémico es preciso clonar ‘ragmentos de ADN mayores de lo que un fago / puede portar. Para este propési- to se utizan como vectores cssinidios y cromosomas artificiaies de levaduras (WAG, yeast artificial chromosome). Los césmidos (Fig. 3.23) acomodan frag- mmentos de ADN pasajero de unas 45 kb. Estos vectores contienen secuencias del ago / que permiten un empaquetamiento eficiente del ADN clonado dentro de particulas de fago. Ademas los césmidos contienen origenes de replicacién ygenes de resistencia a antibidticos caracteristicos de los pkismidos, por lo que soncapaces de replicarse como plésmidos en bacterias. Es posible clonar fragmentos de ADN de mayor tamario (miles de kilobases) ullzando césmidos como vectores, que se replican como cromo- somas en cultivos de levaduras. Estos vectores son particularmento itles para mapear cromosomas, como se discute en el Capitulo 4, Secuenciacién de ADN La clonaci6n molecular de un fragmento individual de ADN permite ol aisiamiento de las grandes cantidades sg de material genético necesarias para su estudio deta: lado, ncluyendo la determinacion de su secuencia de ‘uclestidos, La determinacion de las secuencias nu- ledliicas de un gran nimero de genes ha permitido ‘estuciar no solo la estructura de sus productos protel- AON que so tows, sno también las propiedades de las secuencias desea nootay Se AON que requlan fa expresion genic. Adem, las =? | Digestion por Bom secuencias codificantes de genes de reciente descu- Ligamionto del insarta de ADN (#5 kb) brmiento estan relacionadas frecuentemente con las de genes previamente estudiados, y la funcién de los genes aislados de novo se puede con frecuencia dedu- Grr correctamente basdndose en dichas similitudes, Empaquotamiento en particulas de fago Figura 3.23 Fe com cearce cats atts. ps oe cease gee oe esses came cle as ot eo peraer enya a AEN en -ADN (aproximadamente 45 kb) & un sitio de clonado Infecoién de E. colt (0.0), Bat!) para obtener una molécula aproxima- Bee eee err Seas Se eee i Be ee le te giants _ Sth = ee gee ieeesrs| Loans ismido de ADN vuelve a su forma circular dentro —_y se replica como jet at Se ceerucremenmas sues Z rte ce see eet NST Nea Colenias resistentes ‘ ampeilina seleccionadasi. 112_@ Seccidn | + Introduccion add Sinless de ADN en presencia de didesoxinuclesticos terminadores de cadena Eoctrotorose | Autorasiogratia Migracion 4 do los fragments a © | secuencia de A | aneora A | complamentaria 2,9’ ddesoxinuceotao @ | c | 6 Figura 3.24 ; qeermaciacton de ADN por el método _-_ LOS Métodos actuales de secuenciacién de ADN son répidos y precisos, y la de Sanger. Los dideroxiuclostidos, _determinacion de una secuencia de varias kilobases es una tarea sencilla para que carecen de os grupos OH enlas po: a mayoria de los laboratorios de biologia molecular. De este modo, es mucho eicions 2'y 3) se usan para inorumpit mas facil clonar y secuenciar ADN que determinar la secuencia de aminodcidos la ginsis de ADN on bases espectoas. Ge una proteina, Dado que la Secuencia do nucledids de un gen puede tad formal ala hebrade ADN; Sin embargo, citSe facilmente a la secuencia de aminoacidos de la proteina codificada, la {dado que carecen del OH 3. elsiguente manera mas sencilla de determinar la Secuencia de una proteina es secuenciar fnucledido no puede ser ahadido y 5° su gen una vez clonado. pare inte be ek teairpac ON aa El método mas comiin de secuenciacién de ADN se basa en la interrupcién mmonza con uncebadoroprmerredoec- satura de ln sintesis do ADN por la inclusion do dese xnuclesti¢os (Ue Sistintes, cada una con un didesoxiny. no contienen el grupo hidroxiloen 3} terminadores de cadena en reacciones de cledtido mezelado con su homolog nor- la ADN polimerasa (Fig. 3.24). Se inicia la sintesis de ADN a partir de un inicia- ‘mal ars es rucestdos normales. dor o eebador que ha sido marcado con un radioisdlopo en su extremo 5, en Guano se ncopora ol desoxnucles- Gat medias ala vez. Cada medio do incubacion coniene, ademas de los Sear Baction produce una sere daag, Cuatro desoxirribonucleotidos trifosfato, e! andlogo didesoxi de uno de ellos. La mentor que ompiezan en el ineador y _incorporacion de un didesoxinucleotido paraliza la sintesis porque no hay grupo acaban en la base sustiuida por el cide- 3° al que aladir oro nucledtido. Se genera entonces una serie de moléculas de Soxnucleoto, Los podurlon de cada ADN marcado de dstinta ongitad que contienen en ol extrem 3 el analogo ae reee eee eects pora.se, didesoxi de la base que estaba codificada. Estos fragmentos se separan por torminar la Secuencia de ADN. electroforesis seatin su tamano y se detectan por la exposicién del gel a una pelicula radiografica (autoyraciogratia). El tamaro de cada fragmento esta deCapitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular © 113 ‘AON de simple cadena para ser secuenciado3" JROURORAA 5 Flezcciones de secuenciacién utlizando inicadores marcados con etiquelas fluorescens disinias para cada didesoxinucledtido Conjunto de productos Electroloresis Migracion de FFotomutiticador Jos fragmentos | Haz do laser (Ordenador Four 3.25 Secvencincion automates de ADN. Se ‘ealzan cua reacoones soparades do Souoriaen, cada ura con in esos mules teminado de cadena un co acer mareado con una enqucta tna ts prodits se unany se soreten biccooret Aa ver quo ins horas SADN'mgran en eg pasa taves Gn nade ero one f maeacor terminado por su desoxinucledtido terminal, por lo que la secuencia de ADN se _luorescente. La luz emitida es detectada coresponde con el orden de os Fragmentos en el gel Por un folombpeadorconeciado a un Lasecuenciacion de ADN a gran escala se realiza frecuentemente con sis ae a temas automatics, que ulizanriciadoreso cebadores fuorescentss on rea cones de secuenciacion con didesoxinucledtidos (Fig. 925), Las nebras de ADN snsizadas se someton a electoforesisy se van pasande aavés de un haz de laser que excita ©! marcadorirescemte, La liz emia es dotectada porn flomutipeador yun ordenador ecoge y analiza os datos. Este tipo de Sensenciacin automatica de ADN na permite el andliis a gran escalanece- sare para determinar las secuercias completas del noma de bacteria, lever dues, C. elegans y Drosophila. y se espera que aporte pronto la secucncia conplts dl genoma human Expresidnr de genes clonados ‘Ademis de permitirla determinacién de la secuencia de nuclestides de los go- es —y porlo tanto la Secuencia de aminoacidos de las proteinas codificadas— la clonacion molecular ha proporcionado nuevas posibilidades en la obtencién e grandes cantidades de proteinas para su caracterizacion estructural y fun- ‘ional. Muchas proteinas de interés estan presentes a muy baja concentracion ‘encélulas eucaristicas y por lo tanto no pueden punicarse en cantidades signi- ‘eatvas por técnicas bioquimicas convencionales. Sin embargo una vez clona-114_@ Seccién | * Introduccion Figura 3.26 Promotor bacteriano y secuencias Expresién en bacterias de genes clonados. Los vectores de ‘de union a ibesoma ‘xpresién contienen as secuencias promotoras (pro) que digen la transcripcion del ADN insertado en bacterias y las secuencias necesarias para la unién dol ARNm a ls ribosomas (secuencias Shine-Delgemo [SD). Es posible expresar de forma elciente un [ADNe eucariotico insertado junto a estas secuencias, obtenién- dose proteinas eucarilicas a partir de bacterias transformadas. {F053 _ Sto de clonacién vector Ane de expresion on Insoreln de! ADNe eucaritica fr z ‘ADNe inserado Ame “Transtormacion de Ecol) peg @0l-s do su gen este problema puede ser solucionado con el desarrollo de vectores que consigan altos niveles de expresién genética en bacterias o células eucaridticas, Para expresar un gen eucaridtico en E. coliel ADNc de interés se clona con un fago 0 un plasmido (denominados veciore= «ie expresion) que contenga las, ssecuencias que dingen la transcripci6n y traduccién del gen insertado en bacte- fias (Fig. 3.26). Los genes insertados se logan a expresar a niveles tales que la proteina codificada por el gen clonado supone el 10% del total de la produccién de proteina bacteriana. La purificacién posterior de cantidades sulicientes de la proteina para estudios bioquimicos o estructurales es una tarea sencila En ocasiones es mas util expresar un gen clonado en una célula eucariotica, ‘en lugar de hacerlo en una bacteria. Este modo de expresion es importante, por ejemplo, para asegurarse de que las modificaciones postraduccionales de la proteina (como la adicién de carbohidratos 0 lipides) se producen de forma normal. La expresién de proteinas en células eucariéticas se consigue insertando ‘91 gon clonado en un vector (habitualmente derivado de un virus) que induce unaCapitulo 3 ¢ Fundamentos de biologia molecular @ 115 expresién génica de alto nivel. Un sistema ullizado a menudo para expresar pro- teinas en célules eucaridticas os la infeccién de células de insecto por un vector baculovirus, que induce altos niveles de expresién de genes insertados en el lugar de una proteina estructural viral. Altemativamente es posible obtener altos niveles de expresién proteinica usando vectores adecuados en células de mami- ‘ro. La expresion de genes clonados en levaduras es particularmente itil por- que se pueden emplear técnicas genéticas sencillas para identilicar proteinas que interactuan con otras proteinas clonadas 0 con secuencias de ADN espectticas. Amplificacién de ADN con ta reaccion en cadena de ta polimerasa Laclonacién molecular permite produciry aistar grandes cantidades de un ADN en particular. La reaccion en cadena de ia polinnerase (PCR), desarrolada porary Muls en 1988, es un método alternativo para conseguir un gran niime- 10 de tragmentos de material genético a partir de una dnica copia de ADN Siempre que se conozca parte de la secuencia de la molécula de ADN, la PCR puede conseguir una gran ampiticacion del ADN por medio de reacciones lleva- 2s acavo completamente in vitro. La ADN polimerasa se emplea para replicar ‘epelidamente un segmento determinado de ADN. El numero de secuencias de ADN va incrementando de modo exponencial, dobléndose con cada ciclo de ‘eplcacion, por lo que se puede obtener una cantidad sustancial de copias a pert de un pequerio numero de moides de ADN iniciales. Por ejemplo, una trica molécula de ADN sometida a 30 cictos de amplficacion da lugar a 2° co- fis (aproximadamente mil millones). Por tanto se pueden amplficar moléculas Uricas de ADN para producircantidades fécilmente detectables de ADN, que ueden aislarse por clonacién molecular o ser analizadas directamente por di gestén con endonucieasas de restriccidn o secuenciacién de nuctetidos E proceso de ampificacién de ADN por PGR se muestra en la Figura 3.27 Eimateral de partida puede ser bien un fragmento de ADN clonado o una mez- ‘6a de moléculas de ADN —por ejemplo, todo el ADN de células humanas—. A patirde esta mezcia es posible ampiticar una region especifica de ADN, siom- {re que conazcamos la secuencia de nuclestidos que rodea dicha regién para poder disenar cobadores 0 primers que comiencen la sintes's de ADN en el punto deseado, Los cebadores son habitualmenta oligonuciedtidos sintotizados ‘uiicamente compuestos de 15 2 20 bases de ADN. Dos iniciadores comien: zan a sintesis de ADN en direcciones opuestas desde hebras opuestas. La ‘eaccién empieza calentando el ADN diana a altas temporaturas (p. ¢., 95°C) lpcual separa las hebras. Se desciende la temperatura para que los cebadores Se emparejen con sus secuencias complementarias en las hebras del ADN. La ADN polimerasa uiliza los cebadores para sintetizar una nueva hebra comple mmeniaria sobre cada hebra de ADN preexistente. En un ciclo de ampiiicacion se ctienen dos moléculas de ADN nuevas a partir de la orginal. El proceso se puede repetir multiples veces, dobndose el nlimero de maléculas de ADN en ¢aa ciclo de ampiticacién. Los miitiples ciclos de calentamiento y entriamiento se llevan a cabo por Ineto de sistemas térmicos progtamables denominados termocicladores. Las AON polimerasas empleadas son enzimas termoestables de bacterias como Thermus aquaticus, que viven en manantiales calientes a temperaturas de unas 75°C. Estas polimerasas son estables incluso a las altas temperaturas emplea- das para separar las hebras del ADN de doble hebra, porlo que la amplficacién 8 ADN se puede realizar de modo rapido y automatico. Es posibie ampiificar seevencias de ARN por este método, sintetizando una copia de ADNe por me- Gio dela transcriptasa inversa previamente a la ampiicacion por PCA, Sie conoce suficiente de la secuencia de una gen como para especificar fos cebacores, la ampificacion por PCR proporciona un metodo extremada- mente potente para obtener canlidades facilmente detectables y manipulables { ADN a partir de un material nical que puede contener inicamente unas pocasp———- 116 © Seccién | * Introduccion ADN inicial | CCalentamiento a 95°C ree La polmerasa Tag atarga las heoras de ADN ZS —— m 1 * = 7 ote. L Dos nuevas moléeul ‘de ADN santas Figura 327 ‘Amplificacién del ADN por PCR. La Fegién de ADN que se desea ampiiicar ‘esd flanqueada por dos secuencias ut zadas para cabar la sintesis de AON. El ‘AON de doble cadena inicial se calionta para separarlas hebras y después se on- Inia para permitr que los cebadores (ha- bitualmente oigonuciestidas de entre 15 ¥y 20 bases) se unan a cada hebra de AON. La AON polmerasa de Thermus ‘aquaticus (aolimerasa Taq) se usa para Sintel.zar nuevas hebras de ADN ompe- Zzando on los cobadores, produciéndose la formacién de dos nuevas moléculas de ADN. 1 proceso se puede repetir ru ples veces, consiguisndose en cada ciclo ‘una ampliicacién del dobie do ADN. a3 5 Dos nuevas moléculas de ADN Sa ee Se ‘ovnereeereeas ate copias de la secuencia de ADN deseada mezcladas con otras muchas moléculas de ADN. Por ejemplo, es posible amplficar secuencias definidas de ADN de va- rias klobases a partir del ADN genémico completo, ose puede ampiticar un deter- minado ADNe parliendo del ARN celular completo. Después estos segmentos de ‘ADN ampiticado pueden ser manipulados oanalizados para, por ejemplo, detectar mutaciones en un gen concreio. La PCR es una potente aportacion al arsenal de técnicas de ADN recombinante, Su potencia se pone particularmente de mani- fiesto en aplicaciones tales como el diagndstico de enfermedades hereditarias Jos estudios de la expresion génica durante el desarrollo y la medicina forense. Deteccién de acidos nucleicos y proteinas El desarrollo de la clonacién molecular ha permitido elaislamiento y caracteriza- clon de genes individuales de células eucarioticas. Sin embargo, la compren- sién de la funcién de los genes en las células precisa de! analisis de la organiza-dn y expresion intracelular de los genes y las proteinas que coaitican. En esta seccién se discuten los procedimientos basicos disponibles para la deteccion de acides nucleicos y proteinas. Estas técnicas son importantes en una amplia variedad de estudios, incluyendo el mapeo de genes y cromosomas, el analisis: de la expresion genica y la localizacién de proteinas y organelas subcelulares. Esios mismos procedimientos generales se usan para aisiar gones especificos para ser clonados. Hibridacion de dcidos nucleicos Laciave para a deteccion de secuencias especiticas de acidos nucleicos es e! apareamiento de bases entre hebras complementarias de ARN o ADN. Someti- das a altas temperaturas (p.€}., 90 a 100°C) las hebras complomeniarias de DN se separan (desnaturalizacién) dando mokéculas de cadena simple. Sid: has hebras desnaturalizadas de ADN se incuban en condiciones adecuadas (65°O), renaturalzaran para formar moléculas de doble cadena por aparea- mento complementario de bases —un proceso denominado 'oVisacisr ve feidos nucle cos—. Pueden hibridar entre si dos hebras de ADN, dos hebras ‘de ARN y una de ADN con otra de ARN. La hibridacién de dcidos nucleicos proporciona un método para detectar se- ‘uencias de ADN o ARN complementarias a cualquier cido nucleico conocido, ‘2mo un genoma viral 0 una secuencia de ADN clonada (Fig, 3.26). El ADN onado se marca radiactivamente, habitualmente siendo sintetizado en pre- fencia de nuclestidos radiactivos. Este ADN radiactivo se utiliza como 8°!= pera la hibridacién de secuencias complementarias de ADN o ARN, que se do- fectan en virtud dela radivactividad de las moléculas hibridas de doble cadena. La vansierencis Souther 0 Southern blotting (técnica desarrollada por E. Southern) se utiliza de modo generalizado para la deteccién de genes espe- tifcosen el ADN celular (Fig. 3.29). EI ADN problemas digerido por una endo- uciesa de estriccién, y os fragmentos obtenidos se separan por electroforo- $3, gel se adhiere a un filtro de ritrocelulosa.o nylon, al cual se transfieren los, Agx*XrAtragmentos de ADN, para dar una réplica del gel. El filtro se incuba pesterormente con una sonda marcada, que hibrida con los fragmentos de ADN que contienen la secuencia complementaria. Los fragmentos se visvalizan tas exposicién de! fitro a una pelicula raciogratica La ansterenc 2 Yorther 9 Nerthem blotting es una variante de la técnica de trensierencia de Southern, utilizada para la deteccién de ARN en vez de ADN, La totalidad del ARN celular es extraida y fraccionada segun su tamano for electoforesis en gel. De igual forma que en la transferencia de Southern, bbs ARNs se transfieren a un fitro y se detectan por hipridacién con una sonda ‘adactva. La transterencia de Northem se usa con frecuencia en estudios So tre expresién génica —por ejemplo para determinar la presencia de ARNm es- pecicos en dstintos tipos celulares. La hibidacién de acidos nucieicos se emplea para detectar secuencias de ADNo ARN homélogas no sélo en extactos celulares, sino también en cromoso- mas. células intactas —un proceso denominado i>" ici" Ws (Fig, 3:30), (Con esta técnica se analiza la hibridacion de sondas radiactivas o fluorescentes Jormedo del microscopic. Por ejemolo, se emplean sondas marcadas para hin {ar con cromesomas intactos con ol fin de identificar la regién del cromosorna ‘qe contiene un gen determinado. La hibridacién in situ puede también emplear- separa detectar ARNm especiticos en los distintos tipos celulares de un tejido. Deteccién de pequeitas cantidades de ADN 0 ARN por PCR La amplticacién de ADN por medio de la reaccién en cadena de la polimerasa #3 una técnica mucho mas sensible que las transferencias de Southern o de Northem en la deteccién de secuencias de ADN o ARN colular. Se precisan _aprximadamente unas 100,000 copias de una secuencia de ADN o ARN para Capitulo 3 + Fundamentos de biologia molecular © 117 ADN celular total, mezela «e dterentes mmoléeulas de ‘able cadena AA Desnatural- ‘So anade la sonda de ADN radiactva, esc Complementaria de Reenaturalza Seterminada on secuencia dol AON celular La sonda Fadiactva se hibrida con las Figura 3.28 Deteccién de ADN por hibridacién de 4cidos nucleicos. Puede detectarse una secuencia especitica entre todo el ADN, bolulr por hibridacién con una sonda de |ADN marcada radiactivamente. Se des- nnaturaiza el ADN calentindolo hasta 95 C, obteniéndose moléculas de cadena Unica! Se aface la sonda mareada raciac- tivamente y se baja la temporatura hasta los 65 C, permitiendo que las cadenas de ADN complementarias se apareen entre si, La sonda marcada se hibrida con las Secuencias complementarias del ADN co- lular, que pueden sor detoctadas enton- ‘ces como moléculas radiactivas de coble cadena,118 © Seccidn | * Introduccion SEES ‘Tranaferencia Southern, Los fragmentos de ADN Coton con una endonuceaea de resistin soy PON OVOVONODDL | Inaendonscuasa ton contr sone epoca {de testrecion ‘Se separan oa fragmentes {de restrocion de estate amano mediante Migraciéa | electroforesis en gel Toallas de papel ‘Se desnaturaliza ol ADN y Fro | Se anshare aun fito Get___| mediante el paso por una Esponja | solveion salina a raves, Solucion saina Radogata Fragmentos L- wayyy wan | Goan | ~ | ——— ee |< j Fitto: Se hibrida el fitro con ‘La Gonda adherida al | | ateonda moan nn fro ex detectaca L (queso une sla J | mediante | Sevens bo AON Secor, ve complomentaias fevela ol agmento de ‘ADN con el cual 80 ha Inbridad la sonda Figura 320 Hibridacién in situ por fluerescencia. Hibridacién de los cromosomas hu: ‘manos oon sondas fliorescontes especificas para los cromosomas, que mar ‘can eada uno de los 24 eromasomas de un colar diferente. (Cortesia de Tho mas Reid y Hesed Padila-Nash, Nationa/ Cancer institute).Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 119 ‘ser detectada por hibridacién por transferencia, mientras que la PCR puede ampificar una Unica copia de ADN (o de ARN tras transcripcién inversa) hasta niveles fécilmente detectables, ‘Como fue expuesto con anterioridad, la especificidad de la amplificacién por PCR viene dada por la utiizacion de oligonuclestidos cebadores que hibridan ‘con secuencias complementarias del molde de ADN. Por lo tanto, la PCR puede amplficar de modo selectivo una molécula de ADN especifica a partir de una mezcla compleja, como el ADN o ARN celular total. Es posible utilizar la amplif- ‘cacién por PCR para detectar moléculas de ADN o ARN especiticas a partir de ‘cantidades muy pequenias de material inicial, como extractos o células Gnicas. Esta extraordinaria sensibilidad ha convertido la PCR en un método fundamen: talen muchos procedimientos, incluyendo el analisis de la expresién génica en Ccélulas cisponibles en limitadas cantidades. Sondas de anticuerpos para proteinas Los estucios acerca de la expresion y funcion génica requieren no sélo la detec con de ADN y ARN, sino también de proteinas espectticas. En dichos estudios los ontioverpos ocupan el lugar de las sondas de acidos nucleicos como reac- fanles que interaocionan de modo selectivo con moléculas proteinicas. Los anti- ‘uerpos son proteinas sintetizadas por determinadas células del sistema inmune {os infoctos B) que reaccionan con moléculas (9i\genes) que el organismo hhuésped ha reconocido como extraias —por ejemplo, la cubierta proteinica de inuius. Los sistemas inmunes de los vertebrados son capaces de sintetizar millo- nes de anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales reconoce de forma especiti- a un antigeno en particular, que puede ser una proteina, un hidrato de carbon 0 una molécula no biol6gica. Cada linfocito produce un nico tipo de anticuerpo, pero ‘as genes responsables de la coditicacién de anticuerpos varian de un linfocito a ‘to como resultado de un proceso programado de reordenamiento génico que tiene lugar durante el desarrollo del sistema inmune (véase Cap. 5). Esta varia- .06n da lugar'a un amplio espectro de lintocitos con distintos genes codificantes se anticuerpos, programados para responder contra distintos antigenos. Los anticuerpos se generan mediante Ia inoculacién de una proteina extrafa en narimal. Por ejemplo, frecuentemente se obtienen anticuerpos contra proteinas humanas a partir de conejos. El suero de estos animales inmunizados contiene una mnezcia de antcuerpas (producidos por distintos linfocitos) que reaccionan contra 2128 cstintas del mismo antigono. Sin embargo, es posible obtener el mismo tipo de antouerpo (snitiowerpos monoclonetes) cuttivando lineas clonales de linfoci- ‘ns B de animales inmunizados (habitualmente ratones). Dado que cada linfocito 234 programado para producir un tipo tnico de anticuerpo, una linea clonal o clon ‘elinfoctos produce un anticuerpo monaclonal que reconace un nico detemninan- fe antigénico, proporcionando un reactante inmunol6gico de alta espectticidad, Pueden utilizarse otros materiales para producir inmunizacion y sintetizar anti- ‘uerpos, aparte de proteinas celulares purticadas. Por ejemplo, es posible inmuni- Zar animales con células intactas para crear anticuerpos contra proteinas descono- ‘is expresadas por una linea celular especttica (p. ej, una célula neoplasica). Dichos anticuerpos se utilzan para identificar proteinas especificas expresadas orlalinea celular utlizada en la inmunizacidn, Es frecuente producir anticuerpas ‘mntraproteinas expresadas en bacterias como clones recambinantes. La clona- ‘86n molecular permite la obtencian de anticuerpos dirigidos contra proteinas euca- ‘ices de dificil aislamiento. También es posible crear anticuerpos contra péptidos ‘intétcos de entre 10 y 15 aminodcidos, en vez de contra la proteina completa. Porlotanto, una vez que se conace la secuencia de un gen, se pueden producir aniouorpos dirigidos contra péptides que constituyen parte de la Secuencia pro- tsinica. Dado que os anticuerpos contra estos péptidos sintéticas habitualmente: Jambién reaccionan contra la proteina completa, es posible producir anticuerpos. ‘mitra una proteina partiondo Unicamente de la secuencia de un gen clanado,120 © Seccidn | «Introduccion °@ 05° go ast @ Herne [sso toy bee |= @6e@ eoo a transtre al fire > Bandas ce proteinas ! Yr + 7 eE specifica Anticuerpo —~- unde ala provira unde mediante rachoactvdad o tincién | Se delecta el anicuerpo Figura 3.31 Transferencia Western, Se soparan las proteinas segun su tamaflo por electrolowss «en gel de SOS-polactlamida y se transfieren desde el gel a unfit. Se incuba eifitro con Un anticuerpo dirigido contra a proteina de interés, El anticuorpo unio al filo se puede ‘cctectar mesiante la reaccién con varios agentes, como una sonida radioactva quo se une al anticuarpo. Los anticuerpos pueden ser utlizados de distintas maneras para detectar proteinas en extractos celulares. La jin! avs erence (también denomina- da {ransterencia Western © Westem blotting) y la inmunoorecipitecisn son dos métodos habituales. La transferencia Western (Fig. 3.31) es otra variacion de la transferencia Southern, Las proteinas procedentes de extractos celulares ‘son separadas por electroforesis en gel segun su tamano. Dado que las prot: nas tienen formas y cargas eléctricas diferentes este proceso requiere una me- ificacion del método ullizado para la electroforesis de acidos nucleicos. Las proteinas se separan por una técnica denominada electroforesis en gel de poliserilamie (SS-PAGI -potiacrylamice gel electroforesis), en la cual on disueltas en una solucién con el detergente dodecil sulfaio sédico (SDS) cargado negativamente, Cada proteina se une a muchas moléculas del detergen- te, que desnaturaliza y da a la proteina una carga resultante negativa. Bajo estas circunstancias, todas las proteinas migran hacia el electrode positivo —estando sus tasas de migracion Unicamente determinadas (como en el caso de los acids rnucieicos) por el tamano—. Tras la electroforesis las proteinas se transtieren a un filtro, que se incuba con los anticuerpos que reaccionan con la proteina de inte r6s. El anticuerpo unido al filtro puede ser detectado de varias maneras, identi- cando de este modo la proteina contra la cual esta dirigido el anticuerpo. En la inmunoprecipitacisn los anticuerpos son utilizados para aislar las pro teinas contra las que reaccionan (Fig. 3.32). Las células son incubadas con aminodcidos radiactivos para marcar sus proteinas. Al extracto celular marcado se le ariade un anticuerpo, que se une a su antigeno proteinico diana. Los com plojos antigeno-anticuerpo resultantes se aislan y se someten a electroforesis, permitiendo la deteccién del antigeno radiactivo por autorradiogratia. ‘Coma fue expuesto en el Capitulo 1 los anticuerpos pueden ser ulilizados para visualizar proteinas en el interiar de las células, asi como en células lisa das. Las células se tifien con anticuerpos marcads con pigmentos fluorescen- tes, tras lo cual al ser examinados con e! microscopic de fluorescencia se visua- liza la localizacién subcelularde las proteinas antigénicas (véase Fig. 1.28). Los, anticuerpos pueden ser eliquetados con marcadores visibles al microscopic electrénico, como metales pesados, permitiendo la visualizacién de antigenos a nivel ultraestructural Sondas de biisqueda en bibtiotecas de ADN recombinante En la identiicacién de clones moleculares con ADN celular especttico insertado 50 utilzan basicamente los mismos métodos que en la deteccién de acidos nucleicos y proteinas en extractos celulares. Por ejemplo, se uliliza la hibrida- clon de acidos nucleicos para identiticar clones gendmicos 0 de ADNe que con- tengan secuencias de ADN para las que exista una sonda. El ADNc clonado en veclores de expresién puede también ser identificado con el uso de anticuerpos contra las proteinas que codifique, El primer paso en el aislamiento de clones de genoma o de ADNc es frecuen- ‘temente la creacion de una b/diofeca de ADN recomburante —eonjunto de clones que contienen toda el genoma a todas las secuencias de ARNm de un tipo celular (Fig. 3.83)—. Una bb tes gence/2e humana, por ejemplo, se prepara lonande fragmentos al azar de ADN con un tamanio medio de 15 kb en un vector 2, Dado que el tamafio del genoma humano es aproximadamente de 3 x 10° kb, 1 ADN equivalente a un genoma estaria representado por unos 200,000 clones de /. Sin embargo, dada la fluctuacion estadistica en el muestreo, muchos ge-Capitulo 3 * Fundamentos de biologia molecular @ 121 e eo ar E E E E E E, ago recombinants — ‘que bane nseriado ‘Se agrupan tos complajos Incubacion con et antigeno-anieverpo anticuorpo diigido Conia la proteina = @ 30 7 Sao versio peta Je) rmaroadas raoscivamente i} ° ee Uunen al anticverpo °} Eanioverpo se une Bla potena espectica Anticuerpo " Autorradiogratia para detectar la protoina marcada Fragmentos Es oD ceilar =. Insect enol vector 2 Ermpaquotamient en paniesas eat tago se Fegorecombinante (ps5) (ys) (gas) geese (| (eX Giferentes fragmentos ee de ADN cellar B B & 1 Inleccién en E. cos - cate srmen ATED at — Calva del tago ‘Transterenela aun fro AADN del ago —_ Sona cet AADN mareada sence Hibrdacién con una eonca aepesitica Se lava el roy se reaiza Bon. autotadiogratia | : | @ oe IADN collar seats rmaciante la incubacién ‘on particulas que se Se dsocian las proteinas mediante \ebulieian Complejos antigeno-antioverpo Unis a las partculas Parteula ‘Go do lector ©OG _ |Misracion TAY Figura 3:32 Inmunoprecipitacién. Se incuban las proteinas mareadas radioactivamente can {un anticuerpo, que forma compiejos con la proteina conta la cual va dirigida (ol anti- geno). Estos complajos antigeno-anti- Cuerpo se adhieren a particulas que se lunen al anticuerpo. Se hierve el conjunto para disolver los complejos antigeno-ant- ro, y $e analizan las proteinas recu- eradas con e! gel de electrotoresis ce SDS-polacrilamia. Se detect la prote'- na radioactiva que inmunoptecipitd me: dante una autorradiogratia joteca recombinante. Los fragments {Je ADN celular son clonades en un vector bactoriotago 2 y son ompaquotados on particulas del fago, dbteniéndose una serie Je fagos recombinantes que contonen ci- Ferentes ADNs oalulares insertados. Los fagos infectan bacterias, y el ultivo se cu bre con un fro. Algunos de los fagos de cada calva se transteren al fro, que en: tonces se hibrida con una sonda marcada radioactivamente para identifica la placa de fagos que contiene el gen buscado. En ese momento se puede aislar la calva de fags centro dl euitivo original122_@ Seccién | Introduccion nes no estarian representados en una biblioteca de 200.000 clones recombi- nantes, mientras que otros genes estarian representados por varios clones. Por lo tanto es preferible crear bibliotecas de mayor tamatio, formadas por aprox: madamente 1 millén de fagos recombinants, para asegurarse una alta probe: bilidad de que cualquier gen de interés esté representado. Cualquier gen puede ser aislado con facilidad a partir de dicha biblioteca recombinante siempre que exista la sonda correspondiente, Los fagos recom ‘nantes se siembran en un cultivo de E.coli donde cada fago se replica y produce tna calva en la extension de bacterias. Las calvas se transfieren a filtros de un modo similar a como se pasa el ADN del gel al fio durante la transterencia Southern, y ls filtros son hibridados con una sonda marcada para identificaria calva del fago que contiene el gen buscado. Puede entonces aisiarse la caiva apropiada de la placa original con el fin de propagar el fago recombinante que porta el gen buscado. Existen procedimientos similares para explorar colonias bacterianas portadoras de clones de ADN plasmidicos, por lo quo es posible aislar clones especiticos por hibridacién a partir de bibliotecas de fagos y de pldsmidos, En la exploracién de bibliotecas recombinantes se emplean varios tipos de sondas. Por ejemplo, se puede utlizar un ADNe como sonda para aislar el clon

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