Tema al azar: Aislamiento de ácidos nucleicos de células vegetales

Protocolo de laboratorio:

Materiales:

− Plantas frescas o congeladas (por ejemplo, hojas de espinaca)

− Solución tampón de extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo, tampón CTAB)
− Cloruro de sodio (NaCl)
− Etanol al 100%
− Fenol-cloroformo-isoamílico (PCI)
− Tubos de microcentrífuga
− Pipetas de diferentes tamaños
− Micropipetas
− Balanza
− Licuadora o mortero y pistilo
− Centrífuga de alta velocidad
− Baño de agua a 65°C

Procedimiento:

Preparación de las muestras:

a. Cortar las hojas de la planta en trozos pequeños y pesar 100 mg de muestra.

b. Colocar los trozos de hojas en un tubo de microcentrífuga.

Extracción de ácidos nucleicos:

a. Agregar 500 μl de solución tampón de extracción de ácidos nucleicos y 5 μl de beta-mercaptoetanol.

b. Homogeneizar la muestra con un mortero y pistilo o licuadora hasta que la muestra esté completamente triturada.

c. Incubar la muestra a 65°C durante 30 minutos.

d. Agregar 500 μl de fenol-cloroformo-isoamílico (PCI) y mezclar bien.

e. Centrifugar a 10,000 g durante 10 minutos.

f. Recoger la fase superior (solución acuosa) en un nuevo tubo de microcentrífuga.

g. Agregar 500 μl de cloruro de sodio (NaCl) y 500 μl de etanol al 100% a la solución acuosa y mezclar bien.

h. Centrifugar a 10,000 g durante 10 minutos.

i. Descartar el sobrenadante y lavar el precipitado de ácidos nucleicos con etanol al 70%.

j. Secar el precipitado y resuspender en 100 μl de solución tampón de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).

Evaluación de la calidad y cantidad de los ácidos nucleicos:

a. Medir la concentración de ADN en la solución utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.

b. Calcular la relación A260/A280 para determinar la pureza del ADN (debe ser cercana a 1.8).

c. Evaluar la calidad del ADN en un gel de agarosa utilizando una electroforesis en gel.
Tema: Determinación de la actividad enzimática de la amilasa en la saliva

Protocolo de laboratorio:

Materiales:

− Solución de almidón al 1%
− Solución tampón de fosfato (pH 7,0)
− Saliva fresca
− Tubos de ensayo
− Pipetas
− Cronómetro
− Baño de agua a 37°C
− Solución de yodo al 1%

Procedimiento:

Preparación de las soluciones:

a. Preparar la solución de almidón al 1% en solución tampón de fosfato.

b. Preparar la solución de yodo al 1% en solución tampón de fosfato.

Preparación de la muestra:

a. Pedir al participante que evite comer o beber durante al menos una hora antes de la recolección de la saliva.

b. Pedir al participante que enjuague la boca con agua antes de comenzar la recolección de la saliva.

c. Pedir al participante que recoja la saliva en un tubo de ensayo limpio hasta que se recoja aproximadamente 1 ml de
saliva.

d. Centrifugar la saliva a 1000 g durante 10 minutos para eliminar las células epiteliales y los residuos celulares.

Medición de la actividad enzimática de la amilasa:

a. Preparar una mezcla de 0,5 ml de solución de almidón al 1% y 0,5 ml de solución tampón de fosfato.

b. Añadir 0,5 ml de la solución de saliva recogida a un tubo de ensayo y mantener a 37°C durante 5 minutos para
estabilizar la temperatura.

c. Añadir 0,5 ml de la solución de almidón al 1% y 0,5 ml de solución tampón de fosfato a la saliva y mezclar.

d. Incubar a 37°C durante 10 minutos.

e. Añadir 1 ml de la solución de yodo al 1% y mezclar para detener la reacción enzimática.

f. Leer la absorbancia de la solución a 660 nm en un espectrofotómetro.

g. Repetir el experimento para diferentes tiempos de incubación (por ejemplo, 5, 10 y 15 minutos) y preparaciones de
saliva.

Análisis de datos:

a. Calcular la velocidad inicial de reacción (V0) para cada tiempo de incubación utilizando la fórmula: V0 = ΔA / (Δt
x V x E)

Donde ΔA es el cambio en absorbancia, Δt es el tiempo de incubación, V es el volumen total de la solución y E es la

extensión del camino óptico del espectrofotómetro.

b. Graficar los valores de V0 en función del tiempo de incubación para determinar la actividad enzimática de la
amilasa en la saliva.
Tema: Identificación de bacterias mediante la técnica de tinción de Gram

Protocolo de laboratorio:

Materiales:

− Bacterias desconocidas
− Portaobjetos
− Mechero Bunsen
− Asa bacteriológica
− Solución salina estéril
− Cristal violeta
− Lugol
− Alcohol etílico al 95%
− Safranina
− Microscopio óptico

Procedimiento:

Preparación de la muestra:

a. Tomar una pequeña cantidad de bacterias desconocidas y transferirlas a un tubo de ensayo con solución salina
estéril.

b. Agitar suavemente para suspender las bacterias en la solución salina.

Preparación de la muestra para la tinción de Gram:

a. Colocar una gota de la solución bacteriana en un portaobjetos limpio y seco.

b. Dejar secar al aire.

Tinción de Gram:

a. Fijar la muestra en el portaobjetos sujetándolo por el borde con una pinza y pasándolo por el mechero Bunsen
varias veces.

b. Cubrir la muestra con cristal violeta durante 1 minuto.

c. Enjuagar suavemente con agua corriente.

d. Cubrir la muestra con lugol durante 1 minuto.

e. Enjuagar suavemente con agua corriente.

f. Cubrir la muestra con alcohol etílico al 95% durante 10-15 segundos.

g. Enjuagar suavemente con agua corriente.

h. Cubrir la muestra con safranina durante 1 minuto.

i. Enjuagar suavemente con agua corriente.

j. Secar la muestra suavemente con papel de filtro.

Observación microscópica:

a. Observar la muestra teñida de Gram bajo el microscopio óptico utilizando un objetivo de inmersión de aceite.

b. Identificar la morfología de las bacterias y su tinción (Gram positiva o Gram negativa).

Análisis de datos:

a. Registrar las características morfológicas y la tinción de las bacterias identificadas.

b. Comparar los resultados obtenidos con la base de datos de bacterias conocidas para identificar la especie de la
bacteria desconocida.
Tema: Efecto de la temperatura en la actividad enzimática de la papaína en la carne

Pregunta de investigación: ¿Cómo afecta la temperatura al rendimiento de la papaína en la degradación de las

proteínas de la carne?

Protocolo de laboratorio:

Materiales:

− Carne de res
− Solución de papaína
− Solución de buffer fosfato (pH 6.5)
− Termómetro
− Baño maría
− Tubos de ensayo
− Pipetas
− Espectrofotómetro
− Reactivo de Biuret

Procedimiento:

Preparación de la muestra:

a. Cortar la carne de res en trozos pequeños y homogéneos.

b. Preparar una solución de papaína a una concentración de 0.5% en buffer fosfato (pH 6.5).

Incubación de la muestra:

a. Tomar 2 ml de la solución de papaína y mezclar con 2 ml de carne de res en un tubo de ensayo.

b. Incubar la mezcla a diferentes temperaturas (10°C, 20°C, 30°C, 40°C y 50°C) durante 30 minutos en el baño
maría.

c. Detener la reacción añadiendo 2 ml de reactivo de Biuret a cada tubo de ensayo.

Medición de la actividad enzimática:

a. Registrar la absorbancia de cada muestra a 540 nm utilizando un espectrofotómetro.

b. Calcular la cantidad de proteína degradada por la papaína mediante la curva estándar de absorbancia vs.
concentración de proteína.

c. Calcular la actividad enzimática de la papaína a cada temperatura.

Análisis de datos:

a. Graficar los resultados de actividad enzimática vs. temperatura para visualizar la relación entre ambas variables.

b. Calcular la temperatura óptima de la papaína para la degradación de la proteína de la carne.

Tema: Efecto del ácido salicílico en el crecimiento de raíces de plantas de tomate

Pregunta de investigación: ¿Cómo afecta la aplicación de ácido salicílico en el crecimiento de las raíces de las plantas
de tomate?

Protocolo de laboratorio:

Materiales:

− Semillas de tomate
− Ácido salicílico
− Solución de agua destilada
− Solución de agar al 1%
− Tubos de ensayo
− Papel de filtro
− Pinzas
− Lámpara de crecimiento
− Balanza
− Lupa

Procedimiento:

Preparación de la muestra:

a. Colocar las semillas de tomate en una solución de agua destilada durante 24 horas.

b. Preparar una solución de ácido salicílico al 0.1% en agua destilada.

Preparación del medio de crecimiento:

a. Preparar una solución de agar al 1% en agua destilada.

b. Añadir 1 ml de la solución de ácido salicílico a 99 ml del medio de agar.

Germinación de las semillas:

a. Colocar una capa de papel de filtro en el fondo de cada tubo de ensayo.

b. Añadir 10 ml del medio de agar en cada tubo de ensayo.

c. Colocar 2 semillas de tomate en cada tubo de ensayo y sellar con una tapa de algodón.

d. Colocar los tubos de ensayo en una cámara de crecimiento con una temperatura de 25°C y una iluminación
constante de 12 horas al día.

Observación del crecimiento de las raíces:

a. Después de 7 días, tomar imágenes de las raíces de las plantas de tomate y medir su longitud.

b. Añadir 1 ml de la solución de ácido salicílico al 0.1% en agua destilada a la mitad de los tubos de ensayo y dejar
que continúen creciendo durante otros 7 días.

c. Después de 14 días, tomar imágenes de las raíces de las plantas de tomate y medir su longitud.

Análisis de datos:

a. Comparar la longitud de las raíces de las plantas de tomate en los tubos de ensayo que recibieron la solución de
ácido salicílico con los que no lo recibieron.

b. Analizar si hay alguna diferencia significativa en el crecimiento de las raíces entre los dos grupos de tubos de
ensayo.