UNIVERSIDAD DE OCCIDENTE

UDO – MANAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

LIC. TECNOLOGIA MEDICA

ANALISIS QUIMICO

DIAGRAMA DE LEVEY – JENNINS

METODO ELISA FUNDAMENTO Y APLICACION

Autores:

Erika Susana Arguello Jiménez

Docente: Lic. Sidney Flores

Managua, 16 de Abril del 2023.

REALICE UN DIAGRAMA DE LEVEY – JENNINS
En un estudio de 16 cultivos se obtuvieron los siguientes resultados en el recuento de microorganismos.
N° Xi x̄ x̄ - Xi (x̄ - Xi)2 x̄ - 3S x̄ - 2S x̄ - 1S x̄ + 3S x̄ + 2S x̄ + 1S
1 78 76.25 -1.75 3.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
2 77 76.25 -0.75 0.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
3 69 76.25 7.25 52.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
4 80 76.25 -3.75 14.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
5 85 76.25 -8.75 76.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
6 69 76.25 7.25 52.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
7 78 76.25 -1.75 3.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
8 77 76.25 -0.75 0.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
9 76 76.25 0.25 0.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
10 69 76.25 7.25 52.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
11 65 76.25 11.25 126.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
12 66 76.25 10.25 105.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
13 78 76.25 -1.75 3.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
14 90 76.25 -13.75 189.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
15 81 76.25 -4.75 22.5625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
16 82 76.25 -5.75 33.0625 -70.7500 -21.7500 27.2500 223.2500 174.2500 125.2500
∑ 1220 735.0000

250

200

x̄ = 1220/16
150
x̄ = 76.25

100

50

S= 735/15
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 S= 49.0000

-50

Xi x̄ x̄ - Xi (x̄ - Xi)2 x̄ - 2S
x̄ - 1S x̄ + 3S x̄ + 2S x̄ + 1S
TECNICA ELISA

La técnica ELISA ("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" Ensayo inmunoabsorbente

ligado a enzimas) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida
mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por
ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene
muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su
realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de
una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal

(luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos
ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos : diagnóstico clínico,
detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos
monoclonales, etc.

Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la

cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por
ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo)
de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno.
Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución
analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las
analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno
buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario.
La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular,
como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo
sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

• ELISA sándwich. (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos).

Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de
antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las
actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de
adsorción (fenómeno de superficie) de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros
para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos,
espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y
1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados
(HTS, 'High-throughput system')

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno
de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con
capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua,
los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o
pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la
densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados

Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :

1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina,...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno.

2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos
se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por
proteínas.

3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la

placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o
empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado
(ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir
uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan
diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el
ensayo de competición del antígeno.

4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las

moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático
en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría.

La prueba Elisa de tipo competitivo difiere en que el anticuerpo antivih de la muestra compite
con el conjugado (que es un anticuerpo también dirigido contra el antígeno del VIH) para
ocupar sitios reactivos en el antígeno fijado. En este tipo de prueba, tanto la muestra que
contiene el anticuerpo antivih, como el conjugado se agregan a la fase s?lida (conteniendo el
antígeno del VIH) al mismo tiempo. Si la concentraci?ón de anticuerpos en la muestra es
alta, muy poco del conjugado puede fijarse a los antígenos inmovilizados, ya que muestra y
conjugado compiten por los mismos lugares del antígeno. Habrá ausencia de coloraci?ón
dado que no habrá fijaci?ón de la enzima como para unirse al sustrato.
Inversamente, con muestras que contienen poco o ning?ún anticuerpo antivih, se fijará más
conjugado al antígeno en la fase s?ólida y la consiguiente adici?ón de sustrato provocará la
presencia de color. Por est?o, la cantidad de anticuerpos desconocidos en la muestra analizada
es inversamente proporcional a la cantidad de coloraci?ón que aparezca.

Usos de la técnica ELISA en la industria.

Medicina humana
Mediante esta técnica es posible conocer, entre otras cosas, si un paciente tiene alguna
infección o alguna enfermedad autoinmune. Los laboratorios sanitarios utilizan los tests
ELISA para diagnosticar enfermedades como el cáncer, la hepatitis B, o la presencia en el
organismo humano del VIH o, más recientemente, del COVID-19. Por ejemplo, algunas
pruebas que se realizan mediante esta técnica son las de la proteína TAU; la proteína P-TAU;
la proteína β-amiloide 1, 42; o el análisis de la presencia de anticuerpos IgM e IgG frente al
virus SAR-CoV-2.

Medicina veterinaria
Sin embargo, la utilidad de esta técnica se extiende más allá del diagnóstico de enfermedades
y virus que afectan directamente a los seres humanos. Por ejemplo, en el campo de la
medicina veterinaria, la técnica ELISA es ampliamente utilizada para la detección y
diagnóstico de enfermedades que afectan al ganado, aves o animales de compañía. De este
modo, la detección de anticuerpos frente a la lengua azul, la Brucella, la leucosis enzoótica
bovina, la peste porcina, la glicoproteína gE de la enfermedad de Aujeszky o de la proteína
priónica patógena de las encefalopatías espongiformes transmisibles, son algunos de los
ensayos comunes realizados mediante la técnica ELISA en laboratorios de entidades y
empresas que se dedican al control de la salud animal.

Industria de la alimentación
Por su parte, la industria de la alimentación hace uso habitual de esta técnica para la detección
de alérgenos en alimentos destinados tanto a personas como a animales. Por ejemplo, la
cuantificación de gluten, huevo, β-lactoglobulina, soja, cacahuete o almendra, entre otros
alérgenos, mediante ELISA son ensayos habitualmente realizados por los laboratorios del
sector de la alimentación. En la misma línea, otros ensayos que se realizan mediante esta
técnica en productos alimenticios son, por ejemplo, los de detección de Tobamavirus,
PepMV, LMV o CGMMV, MNSV, SqMV.

Equipos y componentes utilizados para la medición.

¿Qué equipo se utiliza con esta técnica?

Para llevar a cabo esta técnica se utilizan unos equipos ópticos denominados lectores de
microplacas o espectrofotómetros ELISA.
Estos equipos, al igual que los espectrofotómetros UV-visible, miden la cantidad de luz que
transmite o absorbe una muestra para diferentes longitudes de onda. Asimismo, como los
espectrofotómetros UV-visible, también están compuestos por una fuente de iluminación, un
monocromador y un detector.
En primer lugar, un lector de microplacas dispone habitualmente de una fuente de
iluminación de tungsteno con un rango que se extiende desde los 400nm a los 700nm.
En segundo lugar, el monocromador, que es el componente que permite separar el espectro
de iluminación y proporcionar un haz de energía a una longitud de onda determinada, ha
de calibrarse periódicamente en longitud de onda para cuando ésta es crítica o afecta a las
medidas que se realizan.
Finalmente, otro de los componentes que requiere de una calibración periódica es el detector.
Este componente es el que se encarga de transformar la señal recibida (fotones) y convertirla
en señal eléctrica. La intensidad de la señal eléctrica se registra por un sistema que lo traduce
a valores de absorbancia o densidad óptica.