ARTÍCULO INVESTIGACIÓN
Actividad angiogénica comparada de líquido cefalorraquídeo de pa-
cientes con tumores primarios del Sistema Nervioso Central.
Compared angiogenic activity of cerebrospinal fluid of patients with primary Central
Nervous System tumors.
Pablo Michel S.1, Emilio Medina M.1, David Lemus A.2, Mariana Sinning O.3
(1) Estudiante de Medicina. Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
(2) Programa de Anatomía y Biología del Desarrollo, Instituto de Ciencias Biomédicas. Facultad de Medicina, Universidad de Chile,
Santiago, Chile.
(3) Médico Neuróloga. Hospital Clínico de la Universidad de Chile, Santiago, Chile.
Recibido el 24 de agosto de 2011. Aceptado el 10 de octubre de 2011.
RESUMEN
INTRODUCCIÓN: Los tumores cerebrales continúan siendo una
patología de mal pronóstico, lo que se refleja en la baja expectativa
de vida de quienes los padecen. La angiogénesis es un proceso car-
dinal en el crecimiento tumoral y en la producción de metástasis.
No obstante el conocimiento de los mecanismos subyacentes a la
oncogénesis, las terapias continúan obteniendo resultados modes-
tos. Está demostrado que el parénquima tumoral secreta factores
que estimulan la cascada angiogénica. Sin embargo, no existen
trabajos que evalúen el efecto angiogénico del líquido cefalorraquí-
deo (LCR). La hipótesis propuesta en este trabajo es que el LCR de
los pacientes con tumores primarios del sistema nervioso central
(SNC), posee en sí mismo propiedades angiogénicas. MATERIAL
Y MÉTODO: Estudio experimental preclínico. Se utilizó, en ciento
ochenta huevos de gallina White Leghorn, el modelo de membra-
na alantocoriónica (MAC) de pollo. Estos huevos fueron incubados
y sobre la membrana se implantaron filtros de metilcelulosa con
líquidos cefalorraquídeos de pacientes con diferentes tumores ce-
rebrales. Al grupo control se le adicionó suero fisiológico. Tras diez
días de incubación se realizaron cortes histológicos de las mues-
tras y se procedió al conteo de vasos sanguíneos en un microscopio
con rejilla graduada. RESULTADOS: Se demostró con significancia
estadística (p<0,05) que existe efecto angiogénico en el LCR de
pacientes con tumores primarios del SNC. DISCUSIÓN: A partir
de los resultados obtenidos, podemos proyectar futuros trabajos
hacia nuevas terapias enfocadas en la angiogénesis diferencial. Los
factores angiogénicos presentes en el LCR podrían constituir un
nuevo blanco terapéutico contra los tumores cerebrales.
PALABRAS CLAVE: Neovascularización Patológica, Neoplasias
Encefálicas, Líquido Cefalorraquídeo.
INTRODUCCIÓN
La vasculogénesis corresponde a la formación de vasos sanguí-
neos provenientes de angioblastos, es decir, células endotelia-
les diferenciadas que proliferan desde la tercera semana de vida
intrauterina (1,2). La angiogénesis es un complejo proceso de
generación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya exis-
tentes. Está asociada a diferentes procesos fisiológicos y patoló-
gicos tales como la inflamación, reparación tisular, crecimiento
tumoral y metástasis (3).
La angiogénesis se considera un mecanismo crítico en el desa-
rrollo de procesos neoplásicos, existiendo una correlación im-
portante entre el número y la densidad de los vasos sanguíneos
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ABSTRACT
INTRODUCTION: Nowadays, brain tumors remains being a
poor-prognosis pathology, which is reflected in the low life ex-
pectancy of the patients. The angiogenesis, is a fundamental
process in the tumoral growing and the metastatic feasibility.
In spite of knowing of the underlying mechanism of the oncoge-
nesis, therapies still get poor results. It is demonstrated that tu-
moral parenchyma secretes factors that enhance the angiogenic
cascade. However, any work has ever evaluated the angiogenic
effect in the cerebrospinal fluid (CSF) itself. We hypothesize that
CSF belonging of patients with primary central nervous system
(CNS) brain tumors, presents angiogenic properties on their
own. MATERIAL AND METHOD: Preclinical experimental trial.
In 180 eggs of White Legorn chicken it was used the chorioallan-
toic membrane (CAMA) assay. This eggs were incubated for ten
days and over the membrane were implanted methylcellulose fil-
ters containing cerebrospinal fluid coming from patients affec-
ted by different brain tumors. The control group was instilled
with saline solution. It was performed different histological sec-
tions of the samples and then proceeded to the counting of the
vessels in a microscope with a squared grille inside it. RESULTS:
We demonstrated with statistical significance (p<0.05) that CSF
from primary brain tumor’s affected patients presents angioge-
nic effect. DISCUSSION: Owing the presented results, we can
plan future investigations targeting new therapies focused on
the differential angiogenesis. The angiogenic factors in the CSF
could represent a new therapeutic target against brain tumors.
KEY WORDS: Pathologic Neovascularization, Brain Neoplasms,
Cerebrospinal Fluid.
y los estados metastásicos, tamaño del tumor, tipo histológico y
grado de malignidad tumoral (4). La ausencia de vasos sanguí-
neos detiene el crecimiento tumoral, hecho que motiva la inves-
tigación actual de mecanismos para aumentar la efectividad en
la regulación de este proceso.
La angiogénesis es regulada por dos clases de moléculas: an-
tiangiogénicas y proangiogénicas. En condiciones fisiológicas
predominan las inhibidoras, bloqueando el crecimiento. Si surge
la necesidad de desarrollar nuevos vasos sanguíneos, se trans-
criben los genes de las proteínas activadoras de la angiogénesis,
en tanto que las inhibidoras son reprimidas. Esto provoca el cre-
Actividad angiogénica comparada de líquido cefalorraquídeo de pacientes con tumores primarios del Sistema Nervioso Central.
cimiento y la división de células vasculares endoteliales y, final-
mente, la formación de nuevos vasos sanguíneos (1), los que son
estructural y funcionalmente anormales (5), lo que se expresa
en vasos tortuosos y altamente permeables a proteínas, contri-
buyendo a elevar la presión intersticial dentro del tumor. Se han
identificado una serie de proteínas con capacidad angiogénica,
de las cuales las más comunes son el factor de crecimiento bási-
co de fibroblastos (bFGF) y el factor de crecimiento del endote-
lio vascular (VEGF)(6,7). Este último es el factor de crecimiento
angiogénico más estudiado hasta el momento (8), estimulando
el crecimiento y quimiotaxis de células endoteliales durante la
angiogénesis in vivo e in vitro (9). El VEGF, se expresa abun-
dantemente en el parénquima de tumores de origen epitelial y
asociado con otros estados clínicos como isquemia del miocardio
y enfermedades retinianas, en las cuales su elevación es estimu-
lada por la isquemia tisular. En los tejidos neoplásicos su sínte-
sis es promovida por las propias células tumorales (8,10,11), con
el objetivo de proveer el transporte de nutrientes a las células
neoplásicas (12). No obstante lo anterior, su presencia no se ha
estudiado en el líquido cefalorraquídeo (LCR).
El concepto de tumor cerebral se refiere a una colección de neo-
plasias intracraneanas, cada cual con su propia biología, pro-
nóstico y tratamiento. Sin embargo, su presentación clínica,
diagnóstico y tratamiento inicial son similares en la mayoría de
los casos. Si bien no existen registros nacionales, se sabe que en
USA fueron diagnosticados 16.800 nuevos casos de tumores ce-
rebrales primarios durante 1999, causando la muerte de 13.100
personas (13). Las metástasis cerebrales son aún más comunes,
causando la muerte de más de 100.000 pacientes al año en ese
país (13).
Por otro lado, una vez instalado el proceso neoplásico, el aspec-
to crítico para el crecimiento tumoral es la formación de nuevos
vasos sanguíneos, razón por la cual las terapias antiangiogénicas
han surgido como una alternativa razonable a las terapias están-
dares actuales. En consonancia con lo anterior, los inhibidores
de la angiogénesis fueron aprobados desde mayo de 2009 por
la FDA y por otras veintiocho naciones para el tratamiento de
tumores primarios del sistema nervioso central. Sin embargo, el
entusiasmo inicial se vio reducido por reportes que vinculaban la
terapia anti-VEGF con hemorragias intracraneanas fatales (14).
No obstante la abundante información en gliomas, es decir,
aquellos cánceres originados en las células de la glía (astrocito-
mas, oligodendrogliomas y oligoastrocitomas) persisten siendo
una enfermedad de mal pronóstico (15,16). De hecho, la sobre-
vida actual de pacientes adultos con glioblastomas tratados con
el esquema estándar de radio-quimioterapia con temozolomida
es de sólo 14,6 meses (17).
El problema que presenta el tratamiento de modelos cancerosos
es la conocida variabilidad de la expresión de los distintos meca-
nismos en los diferentes tumores de una misma categoría, por lo
que el énfasis internacional actual está en buscar marcadores es-
pecíficos que permitan determinar cuáles pacientes presentarán
respuesta a una determinada terapia (12).
En la búsqueda de moléculas específicas involucradas en la an-
giogénesis se han probado distintos fármacos, solos o asociados
a citotóxicos. Los resultados revelan una respuesta heterogénea
en los pacientes, mostrando algunos una estabilización de la en-
fermedad y otros una progresión bajo el tratamiento (18). De
ARTÍCULO INVESTIGACIÓN
estas nuevas terapias, los datos preliminares indican que las te-
rapias anti-VEGF son potencialmente efectivas en el glioblasto-
ma, el tumor cerebral primario más frecuente (5,19).
Un modelo ampliamente validado en la actualidad para realizar
el análisis in vivo del efecto angiogénico es el de la membrana
alantocoriónica (MAC) de pollo (20-21), cuya génesis intraovu-
lar se da al cuarto día de incubación, cuando se fusionan el alan-
toides con el corion. La ventaja de este modelo es que permite
observar directamente la formación de nuevos vasos, así como
también permite la experimentación con diversas moléculas.
El objetivo general del presente trabajo es determinar la capa-
cidad de inducir angiogénesis del LCR proveniente de pacientes
con tumores primarios del SNC. Los objetivos específicos son
relacionar el efecto angiogénico del LCR con las características
histopatológicas del tumor y relacionar el efecto angiogénico del
LCR con el origen tisular y/o embriológico del tumor.
MATERIAL Y MÉTODO
Previo consentimiento informado, se obtuvo historia clínica de
cuatro pacientes admitidos en el Servicio de Neurología y Neu-
rocirugía del Hospital Clínico de la Universidad de Chile con
diagnóstico de tumor cerebral. Se extrajo líquido cefalorraquí-
deo de tres pacientes durante el acto quirúrgico, mientras que en
el paciente restante se extrajo a través de punción de derivativa
ventrículo peritoneal. Se almacenó el LCR a una temperatura de
-20°C. Para determinar la capacidad angiogénica del LCR prove-
niente de pacientes con tumores primarios del SNC, se utilizó
la membrana alantocoriónica (MAC) de huevos fecundados de
pollo como modelo de estudio. Se analizó el desarrollo angiogé-
nico durante el período de incubación, mediante la implantación
de filtros de metilcelulosa con líquidos cefalorraquídeos prove-
nientes de distintos tumores cerebrales, así como también suero
fisiológico como control. Las muestras fueron donadas por el
Servicio de Neurología y Neurocirugía de Hospital Clínico de la
Universidad de Chile.
Se realizó una aleatorización en bloque de la muestra, de modo
que los huevos que pertenecerían a los diferentes grupos de es-
tudio fueron elegidos al azar, incluyendo al control entre éstos.
PREPARACIÓN DE LA MEMBRANA ALANTOCORIÓNICA
Para realizar este estudio se incubaron 180 huevos recién fecun-
dados de gallinas White Leghorn, en una cámara a 37°C con aire
humedecido. Los huevos fueron comprados en el bioterio del
Instituto de Salud Pública de Chile.
Los huevos fueron incubados en posición horizontal y, para te-
ner una referencia de la posición del embrión, fueron marcados
con una cruz en la superficie superior del huevo.
A las 48 horas de incubación, se procedió a realizar un orificio en
el polo agudo del huevo, del cual se extrajeron 2 mL de albúmina
para permitir el descenso de la yema.
Luego se abrió una pequeña ventana sobre el polo previamente
marcado, la que fue posteriormente sellada con cinta adhesiva,
continuando el desarrollo de los huevos en la cámara de culti-
vo. Al octavo día de incubación, se abrió la ventana inicial y se
depositaron filtros de metilcelulosa sobre la MAC. Un grupo de
huevos (n=60) fue instilado con 10 µL de suero fisiológico (con-
trol), y otro (n=120) con 10 µL de LCR de pacientes con distintos
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tumores primarios del SNC (muestras 0,01, 0,02, 0,04 y 0,08).
Una vez insertado el filtro de metilcelulosa se selló e incubó por
otras 48 horas.
Los investigadores desconocían qué líquidos pertenecían al
grupo control y cuáles a los distintos tumores. La muestra 0,01
correspondió al LCR del paciente con meduloblastoma, 0,02 de
ependimoma, 0,04 oligodendroglioma y 0.08 astrocitoma pilo-
cítico. El control utilizado fue suero fisiológico por la dificultad
de obtener LCR de un paciente sano. En la Tabla 1 se detallan las
características epidemiológicas de cada uno de los grupos.
dros instalada en el lente del microscopio. El registro del número
de vasos sanguíneos fue realizado por cuatro personas en forma
ciega, sin conocer a qué grupo correspondían las membranas cu-
yos vasos se estaban contando.
El número de datos, entendido como el número de filas micros-
cópicas diferentes contadas en total, para cada grupo fue: con-
troles: 416; 0,01 = 259; 0,02 = 156; 0,04 = 519 y 0,08 = 322. Lue-
go, los resultados se sometieron a análisis estadístico con una
significancia de p<0,05; teniendo como base los cinco diferentes
grupos de análisis.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS A continuación, mediante el programa estadístico Stata 11®, se

A las 48 horas de depositado el filtro de metilcelulosa, se proce-
dió a preparar las muestras histológicas, siguiendo el siguiente
protocolo.
Fijación: Se realizó en formalina al 10%. Lavado: Se realizó con for-
malina y agua destilada. Deshidratación: a) Alcoholes ascendentes
(80°C - 96°C - 100°C), b) Paso por líquido intermedio (xilol). In-
clusión: Embebido en parafina líquida, cuyos puntos de ebullición
son: 40°C - 50°C - 60°C. Corte y montaje: Se utilizó un micrótomo
para cortar pequeñas bandas de 5 micrómetros que fueron las
muestras puestas en el portaobjetos. Tinción: Las muestras se su-
mergieron en azul alcián por ocho minutos. Posteriormente, se
sumergieron en hematoxilina por 5 minutos. Luego se bañaron
nuevamente en alcoholes, primero de 80°C y posteriormente de
96°C. Al finalizar esta etapa se sumergió el contenido en eosina.
Se deshidrataron las muestras en alcoholes ascendentes y final-
mente se procedió al montaje con albúmina de los cortes en por-
taobjetos de vidrio.
realizó la prueba t de Student para cada una de las muestras de
análisis. Una vez probada la validez de éstas, se graficó la media
aritmética de vasos sanguíneos de cada una de las muestras. Las
medias comparadas correspondieron al promedio de vasos san-
guíneos por celda, una vez reunidos los datos de los distintos
contadores de vasos.
RESULTADOS
El grupo expuesto a LCR de tumor neuroepitelial primitivo
(0,01) presentó en promedio 12,0±6,7 vasos sanguíneos. Aquel
sometido a LCR de ependimoma (0,02) mostró tener 11,0±4,1
vasos sanguíneos. La MAC infundida con LCR de oligodendro-
glioma (0,04) tuvo 6,1±2,8 vasos. El grupo de LCR de astrocito-
ma pilocítico (0,08) presentó 9,5±4,9 vasos. Finalmente, el gru-
po control, al que se le adicionó suero humano promedió 5,3±4
vasos. Una vez realizadas las comparaciones múltiples de Bon-
ferroni post-ANOVA, se demuestra diferencia estadísticamente
significativa (p≤0,05) entre los pares de grupos 0,01-0,04; 0,01-
0,08; 0,02-0,04; 0,02-0,08 y finalmente entre 0,04 y 0,08.

Finalmente, se obtuvieron doscientos cuarenta cortes para cada
tumor, de los cuales se hizo un chequeo seriado tal que el pri-
mer corte de una serie de diez fue seleccionado para fijarse en el
portaobjeto, en donde se continuó con el recuento de capilares
y vasos mayores bajo el filtro. Para esto se utilizó el microscopio
óptico con aumento 40x. El conteo válido para la expresión esta-
dística es el de una fila de la rejilla graduada de diez por diez cua-
TABLA 1. Caracterización de los grupos de la muestra.
En la Tabla 1, se resume el efecto angiogénico comparado entre
el control y las distintas muestras de LCR. En la primera colum-
na se detalla el número de las celdillas contadas. Para cada una
se obtuvo el promedio de vasos sanguíneos (columna dos). Asi-
mismo, al procesar los datos se calculó la desviación estándar
(DE) para cada grupo, así como también los valores mínimos y
máximos de vasos sanguíneos encontrados en el total de celdas.

TIPO HISTOLÓGICO GRADO OMS EDAD (AÑOS) GÉNERO SITIO

TOMA MUESTRA
0,01 Meduloblastoma IV 49 Masculino Craneotomía
0,02 Ependimoma II 37 Masculino Punción de derivación ventriculoperitoneal
0,04 Oligodendroglioma II 37 Femenino Craneotomía
0,08 Astrocitoma pilocítico I 63 Femenino Craneotomía

TABLA 2. Análisis estadístico de los grupos de la muestra.

OBSERVACIONES PROMEDIO DESVIACIÓN ESTÁNDAR MÍNIMO MÁXIMO

Control 416 5,3486 4,0504 0 23
0,01 260 12,0000 6,7364 0 41
0,02 156 11,0000 4,1757 0 25
0,04 519 6,1329 2,8092 0 28
0,08 322 9,5683 4,9524 0 28

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FIGURA 1. Promedio de vasos sanguíneos por grupo muestral.
benigno, grado I OMS, tiene la característica de ser altamente
vascularizado, por lo que era esperable encontrar dichos resulta-
dos; aún más, es concordante que tenga significativamente más
vasculatura que un tumor de mayor grado como es el oligoden-
droglioma (0,04, grado II OMS). Esta característica morfológica
del astrocitoma pilocítico se correlacionó con una presentación
clínica aguda y rápida progresión del tumor en la paciente afec-
tada. Otro elemento a considerar, es que no existe diferencia
estadísticamente significativa en la capacidad angiogénica entre
0,01 (meduloblastoma de alto grado: IV OMS) y 0,02 (ependi-
moma de grado II), lo cual es concordante con que el grado tu-
moral es influido por la angiogénesis, pero está lejos de ser el
único mecanismo causal(12).

Por último, si bien los datos fueron sacados de tumores únicos

La Figura 1 resume el efecto angiogénico de cada una de las
muestras, medido en base al promedio de vasos sanguíneos por
fila microscópica. El gráfico muestra en el eje de las ordenadas el
promedio de vasos sanguíneos de cada una de las muestras tras
la administración de LCR tumoral. El asterisco (*) sobre cada una
de las barras refleja un p<0,05 del control respecto a las mues-
tras. Se observa el promedio de vasos sanguíneos de cada grupo
sobre las barras. (Control: suero fisiológico sobre la MAC; mues-
tra 0,01: LCR de tumor neuroepitelial primitivo sobre la MAC;
muestra 0,02: LCR de ependimoma sobre la MAC; muestra 0,04:
LCR de oligodendroglioma sobre la MAC; muestra 0,08: LCR de
astrocitoma pilocítico sobre la MAC).
DISCUSIÓN
Como ya fue mencionado, las investigaciones previas se basaban
únicamente en el rol del tejido tumoral sobre la neoformación de
vasos sanguíneos, no tomando en cuenta el papel del LCR(21).
He ahí la originalidad del presente trabajo. De hecho, estudios
previos sólo se han limitado a sugerir la presencia de actividad
proangiogénica en el LCR de pacientes con tumores primarios
del sistema nervioso central(22). Sin embargo, hasta ahora nin-
guno había medido la actividad biológica del líquido per se, es
por esto que este trabajo permite la apertura de un nuevo sus-
trato de estudio de posibles mediadores proangiogénicos que
pudiesen tener un valor pronóstico o predictivo.
para cada tipo, lo que reduce en parte la posibilidad de extrapo-
lar los resultados al subtipo tumoral en su conjunto, no hay que
olvidar que este sólo es el primer paso en el estudio e identifi-
cación de futuros marcadores para posibles terapias antiangio-
génicas.
En suma, al menos uno de los responsables de este efecto angio-
génico se encuentra en el líquido cefalorraquídeo mismo, lo que
abre nuevas ventanas terapéuticas para mejorar la pobre sobre-
vida actual de los tumores cerebrales. La identificación de esta
sustancia es un punto crítico posterior para el avance en el cono-
cimiento y eventual tratamiento de este grupo de enfermedades.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Sra. Irma Orellana, asistente de laboratorio,
por su excelente disposición en todo momento, y al profesor En-
rique Hernández, académico de la división de Bioestadística y
Demografía de la Escuela de Salud Pública, por su compromiso
permanente en lograr la incorporación de la epidemiología como
parte del campo del saber médico.

La ventaja de la utilización del LCR es que se prescinde de la uti-

lización del tejido mismo, lo cual representa una vía mucho más
directa, segura y con opción de realizarse en distintos tiempos
de la enfermedad. Dentro de las limitantes del proyecto están el
bajo número de muestras disponibles, dado principalmente por
la baja actividad quirúrgica de este tipo de neoplasias en nuestro
país.

Los grupos cuya MAC fue sometida a LCR de pacientes con tu-
mores cerebrales presentaron mayor cantidad de vasos sanguí-
neos respecto al grupo control (p<0,05), es decir, existen facto-
res presentes en el LCR que estimulan el proceso angiogénico.

No se observa una relación directa entre potencial angiogénico

y grado de malignidad según clasificación de la OMS. Si bien,
cabe destacar que el astrocitoma pilocítico (0,08) es un tumor

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CORRESPONDENCIA
Pablo Michel Sánchez
Email: pf_michel@med.uchile.cl