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Revista sudafricana de botánica 106 (2016) 238–243

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Revista sudafricana de botánica

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Micropropagación de Stevia rebaudiana Bert. en sistemas de inmersión

temporal y evaluación de la fidelidad genética
MA Ramírez-Mosqueda ÿ, LG Iglesias-Andreu ÿ, G. Ramírez-Madero, EU Hernández-Rincón
Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana, Av. de las Culturas Veracruzanas No. 101, Campus para la Cultura, las Artes y el Deporte, Col. Emiliano Zapata, CP 91090, Xalapa, Veracruz, México

información del artículo resumen

Historial del artículo: Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae) contiene en sus hojas edulcorantes como esteviósido y rebaudiósido, por lo que es comercialmente
Recibido el 30 de mayo de 2016 valioso. Los métodos ineficientes de propagación sexual y asexual no satisfacen la demanda actual de propágulos necesarios para el
Recibido en forma revisada el 15 de julio de 2016
cultivo comercial. Por lo tanto, la propagación in vitro es una alternativa prometedora para resolver este problema. Sin embargo, los
Aceptado el 19 de julio de 2016
protocolos actualmente disponibles implican un bajo número de brotes micropropagados y altos costos de producción. Por lo tanto, este
Disponible en línea xxxx
estudio propone establecer un protocolo comercial de micropropagación de S. rebaudiana utilizando Recipiente para Inmersión Temporal

Editado por J Van Staden

Automatizado (RITA®) con el objetivo de implementar este proceso de propagación masiva a bajo costo y en una modalidad automatizada.
Nuestros hallazgos revelaron que el mayor número de brotes (18,37) se obtuvo utilizando 1 mg lÿ1 de benciladenina (BA) a una frecuencia
Palabras clave: de inmersión de 2 min cada 8 h en 20 ml de medio por explante. Se logró un 100% de enraizamiento de los brotes utilizando medio MS
fidelidad genética sin reguladores del crecimiento vegetal (PGR). El 90 % de las plántulas regeneradas se aclimató con éxito en condiciones de invernadero.
Micropropagación Las plantas regeneradas presentaron un bajo porcentaje de variación genética (10,4%). Este protocolo se puede aplicar en la
RITA®
micropropagación comercial de esta especie.
Biorreactor de inmersión temporal
Marcadores ISSR
© 2016 SAAB. Publicado por Elsevier BV Todos los derechos reservados.

1. Introducción
Stevia rebaudiana (Asteraceae) es una hierba perenne originaria del norte
de Paraguay y América del Sur que crece en climas tropicales y subtropicales
(Soejarto et al., 1983). Las hojas de Stevia rebaudiana contienen glucósidos
como esteviósidos y rebaudiósidos, que son de 200 a 300 veces más dulces
que la sacarosa o el azúcar de caña (Geuns, 2003).
La propagación convencional de la stevia está restringida por la baja
viabilidad de sus semillas debido a la autoincompatibilidad, lo que provoca la
producción de semillas estériles (Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu, 2016a).
La propagación vegetativa se limita a un bajo número de individuos que pueden
obtenerse de una sola planta y adaptarse con éxito al suelo. Las técnicas de
micropropagación in vitro son una opción atractiva para propagar un gran número
de plantas en poco tiempo (Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu, 2016b).
Existen diferentes reportes de micropropagación de S. rebaudiana (Ibrahim
et al., 2008; Ali et al., 2010; Das et al., 2011; Modi et al., 2012; Nower, 2014;
Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu , 2016a;
Abreviaturas: BA, benciladenina; ISSR, repetición de secuencia intersimple; medio MS, Murashige y Skoog; PGR,
reguladores del crecimiento vegetal; RITA®, recipiente para inmersión temporal automatizada. ÿ Autores para correspondencia.
Correos electrónicos: marcoa.rm.07@gmail.com (MA Ramírez-Mosqueda), xliglesias@gmail.com
(LG Iglesias-Andreu).
Ramírez-Mosqueda et al., 2016). Sin embargo, han reportado bajas tasas de
propagación y reproducibilidad, así como largos tiempos de cultivo.
Tiempos de cultivo prolongados pueden conducir a múltiples malformaciones
en plántulas propagadas in vitro (Ibrahim et al., 2008; Jiménez, 2011).
Estos problemas se pueden superar mediante el uso de sistemas de
inmersión temporal (TIS). Estos sistemas permiten el contacto intermitente y de
corta duración del explante con el medio de cultivo líquido, lo que renueva el
ambiente y asegura un adecuado aporte de nutrientes (Etienne y Berthouly,
2002; Welandera et al., 2014). RITA® (Recipiente para Inmersión Temporal
Automatizada) fue reportado como el sistema más eficiente (Alvard et al., 1993).
Se ha utilizado con éxito en diferentes especies vegetales, entre ellas la vainilla
(Vanilla planifolia) (Ramos-Castellá et al., 2014; Ramírez-Mosqueda e Iglesias-
Andreu, 2016b), pistacho (Pistacia vera) (Akdemir et al., 2014) , ñame africano
(Dioscorea rotundata cayenensis) (Polzin et al., 2014) y roble (Quercus suber)
(Pérez et al., 2013).
El uso de RITA® en S. rebaudiana fue reportado por diferentes autores
(Jiménez, 2011; Noordin et al., 2012; Alvarenga y Salazar, 2015; Oviedo-Pereira
et al., 2015; Sacco et al., 2015). Sin embargo, estos estudios no consideraron
algunos parámetros clave, como la frecuencia y duración de la inmersión, o el
volumen de medio por explante. Además de no evaluar la fidelidad genética de
las plantas generadas.
Los ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) son un método simple, rápido y
reproducible para detectar loci polimórficos presentes en el ADN nuclear y el
ADN organelar (Pradeep et al., 2002). Determinado por

http://dx.doi.org/10.1016/j.sajb.2016.07.015
0254-6299/© 2016 SAAB. Publicado por Elsevier BV Todos los derechos reservados.
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MA Ramírez-Mosqueda et al. / Revista sudafricana de botánica 106 (2016) 238–243
por adición o deleción de unidades repetidas o por mutación puntual que permita
evaluar la variación somaclonal que se presenta en la planta cultivada de tejido a
nivel genético (Jarne y Lagoda, 1996).
Este estudio proporciona un protocolo para la micropropagación de S. rebaudiana
utilizando RITA® y la evaluación de la variación somaclonal de las plantas
regeneradas.
2. Materiales y métodos
2.1. Material vegetal
Esta investigación utilizó plántulas in vitro de S. rebaudiana variedad Morita II
establecidas en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Instituto de
Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA) de la Universidad Veracruzana
(Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu, 2016a). Las plántulas in vitro se cultivaron
en medio Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 1
mg lÿ1 de benciladenina (BA), 30 g lÿ1 de sacarosa y 2,2 g lÿ1 de Gelrite™ (Sigma
-Aldrich, St. Louis, MO). El pH se ajustó a 5,8 antes de esterilizar en autoclave a 1,2
kg cmÿ2 durante 15 min a 120 °C. Todos los cultivos se incubaron a una temperatura
de 25 ± 2 °C, con un fotoperíodo de luz/oscuridad de 16/8 h, bajo una intensidad de
luz de 50 ÿ mol mÿ2 sÿ1 utilizando lámparas de luz blanca. Después de dos
subcultivos de 30 d cada uno, los explantes cultivados se utilizaron para diferentes
evaluaciones.
2.2. Efecto de diferentes métodos de cultivo y concentraciones de BA
Los explantes (segmentos nodales, 1–2 cm de longitud) se cultivaron en dos
sistemas de cultivo diferentes: semisólido y sistema de inmersión temporal (RITA®
1000 ml, 150 × 130 mm) (VITROPIC, Saint-Mathieu de-Tréviers). Ambos sistemas
utilizaron medio MS suplementado con 30 g l-1 de sacarosa y 2,2 g l-1 de Gelrite™
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como agente gelificante (excepto en TIS). Se
dosificaron veinte mililitros de medio en cada recipiente “G” en el sistema semisólido
y 200 ml en el biorreactor. Se evaluó el efecto de varias concentraciones de BA (0,
1, 2 y 3 mg lÿ1 ) en ambos sistemas. El pH de los medios se ajustó a 5,8 ± 0,2. Los
recipientes de cultivo se esterilizaron en autoclave a 1,5 kg cmÿ2 y 121 °C durante
15 min. Para TIS, la frecuencia de inmersión fue de 2 min cada 4 h.
Todos los cultivos se incubaron a 25 ± 2 °C bajo un fotoperíodo de luz/oscuridad
de 16/8 h y una intensidad de luz de 50 ÿmol m-2 s-1 utilizando lámparas de luz
blanca. Se utilizaron un total de 50 explantes por tratamiento. En el sistema
semisólido se utilizaron 10 contenedores con 50 explantes cada uno por tratamiento.
Para RITA® se utilizaron 5 contenedores con 10 explantes cada uno por tratamiento.
Después de 4 sem. de cultivo, se determinó el número y longitud de raíces y el
número de hojas.
2.3. Efecto de diferentes frecuencias de inmersión en RITA®
Se evaluaron tres frecuencias de inmersión: 4, 8 y 12 h (2 min por inmersión).
Los cultivos se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Se
utilizaron un total de 50 explantes por tratamiento, utilizando cinco contenedores
con 10 explantes cada uno. Después de 4 sem. de cultivo, se determinó el número
y longitud de raíces y el número de hojas.
2.4. Efecto del volumen de medio por explante en RITA®
Se evaluaron tres volúmenes diferentes de medio por explante: 20, 28,5 y 50 ml
(cinco, siete y 10 explantes por RITA®, respectivamente). En todos los casos se
utilizó medio MS suplementado con 1 mg lÿ1 de BA junto con una frecuencia de
inmersión de 2 min cada 8 h. Los cultivos se incubaron en las mismas condiciones
descritas anteriormente. Después de 4 sem. de cultivo, se determinó el número y
longitud de raíces y el número de hojas.
239
2.5. Enraizamiento y aclimatación
Se requirió el enraizamiento de brotes en medio semisólido, debido a que las
raíces de S. rebaudiana se enredaban en los poros de la malla de soporte RITA®.
Para inducir el enraizamiento, se transfirieron brotes de 2 cm de longitud a medio
MS sin reguladores de crecimiento vegetal (PGR). El porcentaje de brotes enraizados
se determinó después de tres semanas de cultivo.
Brotes individuales (10–15 cm), previamente enraizados in vitro, se enjuagaron
con agua del grifo y se sembraron en condiciones de invernadero en macetas
separadas (5 × 5 × 8 cm) que contenían un sustrato estéril que consistía en una
mezcla 1:1 de peat moss™ y agrolite™. Las plántulas se mantuvieron en condiciones
de sombra al 50%. El riego se realizó de forma manual mediante aspersión de agua
del grifo tres veces por semana para mantener una humedad relativa entre 80 y
95%.
2.6. Evaluación de la variación somaclonal
2.6.1. Extracción de ADN genómico
El ADN total se extrajo por duplicado a partir de 0,2 g de tejido foliar de dos
plantas madre y 28 plantas micropropagadas en TIS siguiendo el método de Stewart
y Via (1993). La calidad del ADN genómico se examinó mediante electroforesis en
gel de agarosa (1 %) y se cuantificó mediante espectrofotometría a una relación de
DO de 260/280 utilizando un Invitrogen®
(Qubit 2.0) fluorómetro.
2.6.2. Análisis ISSR
Se probaron 12 cebadores ISSR (UBC, UBC, Biotechnology Laboratory,
University of British Columbia). Las reacciones de amplificación de ISSR por PCR
se realizaron en un volumen total de 25 ÿl que contenía 0,4 mM de dNTP, 2,5 mM
de MgCl2, 25 pM de cebador, 0,5 U de Taq polimerasa (Bioline®) y 25 ng de moldes
de ADN. La amplificación de ADN se realizó en un termociclador AXIGEN® (Applied
Biosystem, CA, EE. UU.).
Las condiciones de PCR fueron: una desnaturalización inicial a 94 °C por 1 min,
posterior desnaturalización a 94 °C por 30 s, recocido a Tm °C por 45 s, extensión
a 72 °C por 1 min, 35 ciclos y la extensión final a 72 °C durante 10 min.
Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en gel de
agarosa al 1,5% (p/v) utilizando tampón TAE 19 (Tris 40 mM, acetato 40 mM, EDTA
1 mM y pH 8,4), a 100 V durante 1,5 h. Posteriormente, los geles se tiñeron con 1
mg m lÿ1 de bromuro de etidio. Como marcador de ADN se utilizó Gene Ruler DNA
Plus™ 100 pb (Fermenteas®). Las bandas se visualizaron en un sistema de
documentación en gel (GelDoc-It® Imager, UVP).
Todas las reacciones para cada cebador ISSR se repitieron dos veces, solo se
usaron bandas reproducibles entre réplicas para establecer una base binaria,
puntuando 1 para presencia y 0 para ausencia. Sobre estas bases, se calcularon el
número total de bandas, el número medio de bandas por cebador, el porcentaje de
loci monomórficos y el porcentaje de loci polimórficos.
2.7. Análisis estadísticos
Todos los experimentos se realizaron utilizando un diseño aleatorio con 5
repeticiones cada uno. Se utilizaron cincuenta explantes por tratamiento. Los datos
obtenidos fueron procesados estadísticamente con el software IBM SPSS Statistics
(versión 21). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de
Tukey (p ÿ 0.05).
3. Resultados
3.1. Efecto de diferentes métodos de cultivo y concentraciones de BA
Se observaron diferencias significativas entre los diferentes sistemas de cultivo
y las concentraciones de BA evaluadas a las 4 semanas de cultivo (Cuadro 1). En
RITA® se observó una mayor tasa de multiplicación con respecto al medio
semisólido (Cuadro 1). Sin embargo, los brotes obtenidos en RITA® mostraron
hiperhidricidad y un ligero color rojizo (Fig. 1E-H). Sin embargo, estas anormalidades
no fueron evidentes en el medio semisólido (Fig. 1A-D).
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240 MA Ramírez-Mosqueda et al. / Revista sudafricana de botánica 106 (2016) 238–243

tabla 1 Tabla 2
Evaluación de diferentes métodos de cultivo y BA sobre formación de brotes en Stevia rebaudiana en Efecto de diferentes tiempos de inmersión y volumen de medio en el cultivo in vitro de Stevia
cuatro semanas de cultivo. rebaudiana a las cuatro semanas de cultivo.

Concentración de reguladores de crecimiento Número de brotes Duración del disparo Número de hojas Inmersión Número de brotes Duración del disparo Número de hojas
(mg lÿ1 ) por explante (cm) por sesión tiempo (h) por explante (cm) por disparo

Semisólido Frecuencia de inmersión en RITA® (h) con 2 min de inmersión

BA 0 1,50 ± 0,20b 1,37 ± 0,14ab 4,8 ± 0,45a 0,25a 11,76 ± 0,73b 3,599,18
± 0,26a
± 0,78b 1,79 ± 0,06b 4 18,60 ± 1,31a 3,76 ± 4,81 ± 0,13a
4,00 ± 0,50a 2,05 ± 0,14a 0,94 4,4 ± 0,48a 5,20 ± 0,26a
1 4,60 ± 0,40a ± 0,08b 0,80 ± 4,4 ± 0,25a 8 12 4,55 ± 0,29a
23 1,60 ± 0,49b 0,16b 4,8 ± 0,88a
Los números representan la media ± SE (error estándar). Las medias con diferente letra son
TIS significativamente diferente (Tukey, p ÿ 0.05).
BA 0 2,00 ± 0,00c 1,46 ± 0,08a 3,7 ± 0,09a
11,80 ± 0,74a 1,20 ± 0,14a 5,3 ± 0,11a
1 6,30 ± 0,70b 5,20 1,08 ± 0,08a 4,0 ± 0,07a fueron producidos con una frecuencia de inmersión de 8 h (Fig. 2B), seguidos
23 ± 0,41bc 1,02 ± 0,07a 3,4 ± 0,03a por 3,59 y 1,79 cm con frecuencias de 12 h (Fig. 2C) y 4 h
Los números representan la media ± SE (error estándar). Las medias con diferente letra son (Fig. 2A), respectivamente. En cuanto al número de hojas, no se observaron
significativamente diferente (Tukey, p ÿ 0.05). PGR = reguladores del crecimiento vegetal y BA = diferencias estadísticas. Para el volumen de medio de cultivo por explante, no
benciladenina. se observaron diferencias significativas en las variables evaluadas.

El mayor número de brotes (11,8 brotes por explante) se obtuvo
usando RITA® suplementado con 1 mg lÿ1 BA (Fig. 1F), en comparación con
4,6 brotes en medio semisólido suplementado con 2 mg lÿ1 BA
(Fig. 1C). Sin embargo, el medio semisólido alcanzó los valores más altos en
longitud del brote (2,05 cm) (Fig. 1B). No se observaron diferencias en la
número de hojas (Cuadro 1).
3.2. Efecto de las diferentes frecuencias de inmersión y volumen de medio por
explante en RITA®
3.3. Enraizamiento y aclimatación
Se observó un 100% de enraizamiento de los brotes después de tres semanas de cultivo.
(Fig. 3A) usando medio MS sin PGR. Se observó una supervivencia del 90%
durante el proceso de aclimatación tres semanas después de transferir el
plántulas de S. rebaudiana in vitro a condiciones de invernadero (Fig. 3B).
Las plántulas aclimatadas se trasplantaron al campo (Fig. 3C).
3.4. Análisis ISSR

Se observaron diferencias significativas entre las frecuencias de inmersión y
el número y longitud de brotes a las 4 semanas de cultivo (Cuadro 2). Él
El mayor número de brotes/explante (18,60) se obtuvo en una frecuencia de
inmersión de 2 min cada 8 h (Fig. 2B), seguido de 2 min cada 8 h.
12 h (11,76) (fig. 2C) y 2 min cada 4 h (9,18) (fig. 2A). Además,
no se observaron diferencias en la calidad morfológica ni en el vigor
de los brotes obtenidos en sistema RITA®. Los brotes más largos (3,76 cm)
De un total de 12, solo seis cebadores, a saber, 829, 848, IS-15, IS-17, IS-19
e IS-20, produjo bandas claras y bien definidas; estos fueron seleccionados
para análisis ISSR (Tabla 3).
Los seis cebadores seleccionados produjeron un total de 48 bandas discretas
con un tamaño de 112 a 1596 pb (Tabla 4). El número de bandas por cebador.
osciló entre 3 y 12, con un promedio de 8 bandas por cebador
(Cuadro 4). De las 48 bandas producidas a partir de las 28 plántulas regeneradas

Fig. 1. Efecto de diferentes métodos de cultivo in vitro de Stevia rebaudiana. A–D) MS semisólido suplementado con 0, 1, 2 y 3 mg lÿ1 BA (izquierda–derecha), respectivamente, E–H) Biorreactor:
MS complementado con 0, 1, 2 y 3 mg l-1 BA (izquierda-derecha), respectivamente (barra de escala = 1 cm).
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MA Ramírez-Mosqueda et al. / Revista sudafricana de botánica 106 (2016) 238–243 241

Fig. 2. Efecto de diferentes tiempos de inmersión en el cultivo in vitro de Stevia rebaudiana en RITA®. A) frecuencia de inmersión cada 4 h, B) frecuencia de inmersión cada 8 h, y C) inmersión
frecuencia cada 12 h (barra de escala = 2,5 cm).

Fig. 3. Plantas de Stevia rebaudiana regeneradas in vitro. A) Plantas enraizadas, B) aclimatación de plántulas de stevia, C) plantas después de tres semanas de aclimatación (barra de escala = 5 cm).

en RITA® y dos muestras de plantas donantes, 5 bandas fueron polimórficas
(10,4%) y 43 eran bandas monomórficas (89,6%). La Fig. 4 muestra el perfil
de bandas obtenido con el cebador IS-19 ISSR en las 30 S. rebaudiana
plantas in vitro evaluadas.
Solo dos de los seis cebadores probados no produjeron polimórficos.
bandas (UBC 829 e IS-15). Se detectó una banda polimórfica (519 pb)
con primer IS-20 en solo dos sujetos evaluados, más 6 monomórficos
bandas de tamaños que oscilan entre 383 y 669 pb (Fig. 4).
4. Discusión
Los resultados de nuestro estudio demostraron la utilidad del RITA®
sistemas de inmersión temporal para micropropagación de S. rebaudiana,
Tabla 3
Lista de cebadores ISSR.
con mayor número de brotes por explante en comparación con el sistema de
cultivo semisólido. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en el
micropropagación de otras especies vegetales mediante sistemas RITA®
(Akdemir et al., 2014; Polzin et al., 2014; Ramos-Castellá et al., 2014;
Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu, 2016b).
La eficacia de los sistemas RITA® en la micropropagación
S. rabaudina fue reportada por diferentes autores (Jiménez, 2011;
Noordin et al., 2012; Alvarenga y Salazar, 2015; Oviedo-Pereira
et al., 2015; Sacco et al., 2015). Sin embargo, estos estudios no consideraron
algunos parámetros clave, como la frecuencia y la duración de la inmersión, o
volumen de medio por explante además de evaluar la fidelidad genética
de las plantas generadas.
Nuestros resultados muestran la efectividad de BA como PGR en el
micropropagación de stevia. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en
S. rabaudina utilizando sistemas RITA® (Jiménez, 2011; Sacco et al., 2015)

*
Nombre Secuencia Ana. temperatura (°C)

818 5ÿ-CACACACACACACACAG-3ÿ 52 Tabla 4

827 5ÿ-ACACACACACACACACG-3ÿ 52 Detalles del análisis ISSR de plántulas de S. rebaudiana micropropagadas en RITA® utilizando seis
829 5ÿ-TGTGTGTGTGTGTGTGC-3ÿ 52 cebadores
848 5ÿ-CACACACACACACACARG-3ÿ 55
Nombre Total Nº bandas polimórficas % polimórfico Tamaño (pb)
ES-11 5ÿ-GATAGATAGATA-3ÿ 35
bandas polimórficos bandas
ES-14 5ÿ-GACAGACAGACAGACA-3ÿ 40
ES-15 5ÿ-GACAGACAGACARG-3ÿ 45 829 3 0 0 710-1592
IS-16 5ÿ-YRGACAGACAGACA-3ÿ 40 848 6 1 16 364–836
ES-17 5ÿ-GACACGACAC-3ÿ 35 ES-15 10 0 0 322–734
ES-18 5ÿ-ACTGACTGACTG-3ÿ 40 ES-17 9 1 11,1 112–670
S-19 5ÿ-ACTGACTGACTG-3ÿ 45 ES-19 12 2 16,6 204–691
ES-20 5ÿ-AÑO ACTGACTGACTG-3ÿ 40 ES-20 7 1 14,2 383–669

* Total 48 5 10,4 112-1592

Y: C/T; R: A/G.
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242 MA Ramírez-Mosqueda et al. / Revista sudafricana de botánica 106 (2016) 238–243
Fig. 4. Patrón de bandas ISSR para plántulas de Stevia rebaudiana y plantas micropropagadas en TIS, amplificadas con el cebador IS-20. M = marcador de peso molecular, líneas 1–2 plantas madre y 3–
30: plantas micropropagadas en RITA®.
pero contrasta con otros reportes (Noordin et al., 2012; Alvarenga y Salazar, 2015).
Por otro lado, uno de los principales inconvenientes en los protocolos de micropropagación
de diferentes especies vegetales son las anomalías morfológicas y fisiológicas que se
presentan en los brotes y explantes (Ruffoni y Savona, 2013). Los sistemas RITA® no fueron
recomendados para la propagación de S. rabaudina, ya que provoca hiperhidricidad y color
rojizo claro en los brotes (Jiménez, 2011). Sin embargo, en nuestros estudios estos problemas
se resolvieron utilizando frecuencias de inmersión menos constantes (2 min cada 8 h).
Nuestros resultados indican que la duración y la frecuencia de la inmersión aparentemente
determinan las respuestas morfológicas de los explantes de S. rabaudina e influyen en el
número de brotes obtenidos en los sistemas RITA®. Estos resultados concuerdan con los
obtenidos en la micropropagación de S. rabaudina utilizando sistemas RITA® (Alvarenga y
Salazar, 2015; Sacco et al., 2015). En este contexto, Sacco et al. (2015) determinaron que una
frecuencia de inmersión de 3 min cada 8 h es efectiva en la micropropagación de stevia en
RITA®. Sin embargo, en nuestro estudio también se evaluó el efecto del volumen de medio por
explante y la fidelidad genética de las plantas generadas.
Para el enraizamiento in vitro, nuestro estudio logró un 100 % de enraizamiento de los
brotes de stevia utilizando medio MS sin regulador de crecimiento. En contraste, algunos
autores han agregado auxina al medio MS para aumentar el porcentaje de enraizamiento de
los brotes de S. rebaudiana (Nower, 2014). Este estudio confirmó los hallazgos de Ramírez-
Mosqueda e Iglesias-Andreu (2016a), quienes mencionaron que bajas concentraciones de
sales MS sin PGR contribuyen al enraizamiento in vitro de S. rabaudina.
Las tasas de supervivencia observadas en la aclimatación in vitro de plántulas de S.
rebaudiana son consistentes con la supervivencia (80-95%) reportada por varios autores
(Hwang, 2006; Modi et al., 2012). Algunas especies de plantas muestran una alta tasa de
mortalidad durante el proceso de aclimatación debido a la disfunción estomática, sistemas de
raíces débiles y/o desarrollo deficiente de la cutícula (Mathur et al., 2008). Por lo tanto, para
lograr buenos resultados en el proceso, es necesaria una aclimatación constante en condiciones
de invernadero o campo (Hazarika, 2003). El protocolo aquí establecido aseguró una tasa de
supervivencia adecuada en esta especie de interés comercial.
Este trabajo estudia una notable uniformidad genética en las plántulas in vitro estudiadas;
esto está de acuerdo con los hallazgos de Soliman et al. (2014), quienes detectaron una
notable similitud genética entre plántulas de S. rebaudiana micropropagadas por organogénesis
indirecta en sistemas semisólidos. Sin embargo, Solimán et al. (2014) reportaron un incremento
en la variabilidad genética de plántulas micropropagadas de esta especie luego de realizar al
menos cinco subcultivos en este tipo de sistema de cultivo, los cuales evitan el uso de RITA®.
De manera similar a los informes de varios autores, este estudio confirmó la utilidad de los
marcadores ISSR para evaluar la estabilidad genética de los micropropagados.
plántulas de varias especies de plantas, incluida la hortensia (Hydrangea macrophylla) (Liu et
al., 2011) y la vainilla (Vanilla planifolia)
(Ramírez-Mosqueda e Iglesias-Andreu, 2015) De acuerdo con los resultados, este protocolo
se considera útil para la propagación masiva de S. rebaudiana con fines comerciales. También
asegura la producción de plantas con alta estabilidad genética.
Los sistemas de inmersión temporal RITA® dan como resultado un gran número de plantas
de Stevia rebaudiana con alta fidelidad genética. Por tanto, el uso de este procedimiento parece
útil para la micropropagación comercial de S. rebaudiana, así como para la multiplicación rápida
de nuevas variedades de Stevia o genotipos élite.
Conflicto de intereses
El autor MARM, el autor LGIA, el autor GRM y el autor EUHR declaran no tener ningún
conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al “Programa para el Desarrollo Profesional Docente”
(PRODEP), SEP Conv. 2011 (CA-UVER-234), por el apoyo financiero al proyecto. Agradecemos
a Diana Pérez Staples por sus sugerencias y comentarios por escrito.
Referencias
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