A. Biosíntesis y Procesos Biosintéticos: Síntesis de Componentes Glicosilados Microbianos

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Parte II
Síntesis de componentes glicosilados
microbianos
A. Biosíntesis y procesos
biosintéticos
capítulo
dieciséis
Biosíntesis de peptidoglicano bacteriano
Jean van Heijenoort
Resumen Mur sintetasas; transferasa MraY; transferasa MurG;
Proteínas de unión a penicilina
El peptidoglucano bacteriano ha sido ampliamente
investigado debido a su importancia como componente
estructural esencial de la pared celular. Su biosíntesis es
1. Introducción
un proceso en dos etapas, que es el objetivo de los
antibióticos conocidos y que está estrechamente relacionado Durante los últimos cincuenta años, el
con la morfogénesis celular. Primero, la unidad de monómero peptidoglicano bacteriano ha sido ampliamente
se ensambla mediante una secuencia de reacciones en el
investigado debido a su importancia como
citoplasma y en el lado interno de la membrana
componente estructural esencial de la pared celular
citoplasmática que conducen al intermediario lípido II. La
segunda etapa involucra reacciones de polimerización
(ver Capítulo 2), a su participación en la morfogénesis
extracitoplasmática catalizadas por glicosiltransferasas y
celular (Scheffers y Pinho, 2005; Vicente et al. ,
transpeptidasas que utilizan el lípido II como sustrato 2006 ) . ; den Blaauwen et al., 2008; Zapun et al.,
después de su translocación a través de la membrana. Se 2008a) y
a l hecho de que los pasos de su biosíntesis
describen los diferentes pasos de la vía, así como sus son inhibidos específicamente por antibióticos bien
conocidos y son objetivos potenciales para la
variaciones, su funcionamiento in vivo y su inhibición por antibióticos.
Las áreas que requieren una investigación más exhaustiva búsqueda de nuevos antibacterianos (Gale et al.,
se refieren a los complejos sintetizadores de peptidoglicanos 1981; Green, 2002; Kotnik et al., 2007; Barreteau et
que funcionan en coordinación con el crecimiento celular y al., 2008). Los diversos pasos de la biosíntesis se
la división celular, el papel que desempeñan las hidrolasas
estudiaron en diferentes especies y surgió una vía
de peptidoglicanos y el examen de modificaciones
de dos etapas válida para la mayoría de las
estructurales aún no exploradas de los peptidoglicanos. La
necesidad de comprender mejor los mecanismos de eubacterias (Rogers et al., 1980; Ward, 1984). En
resistencia a los antibióticos y de utilizar dianas específicas primer lugar, la unidad monomérica de peptidoglicano
de peptidoglicanos para la búsqueda de nuevos se ensambla en la forma final de un lípido intermedio
antibacterianos también justifica plenamente el estudio mediante enzimas ubicadas en el citoplasma o en
continuo de la biosíntesis de peptidoglicanos. el lado interno de la membrana citoplasmática
( Bugg y Walsh, 1992; van Heijenoort, 2001b, 2007; Barreteau et
Palabras clave: Uridina difosfato (UDP) Nacetilglucosamina; La segunda etapa consiste en reacciones de
ácido UDPNacetilmurámico; péptidos de ácido UDPN polimerización extracitoplasmática utilizando como
acetilmurámico; intermediarios lipídicos; sustrato el intermediario lipídico después de su translocación a través
Glicobiología microbiana 287 © 200910, Elsevier Inc.

288 16. Biosíntesis de peptidoglicano
la membrana En la polimerización intervienen dos
tipos principales de actividades unidas a la membrana:
glicosiltransferasas que catalizan la formación de Fructosa6P
cadenas lineales de glucano (Goffin y Ghuysen, 1998; GLMS Lglutamina

van Heijenoort, 2001a, 2007) y transpeptidasas que Glucosamina6P
catalizan el entrecruzamiento entre las subunidades
GLM
peptídicas de las nuevas cadenas y la unión a la pared
Glucosamina1P
celular preexistente (Goffin y Ghuysen, 2002;
Macheboeuf et al., 2006; Sauvage et al., 2008; Zapun GlmU AcetilCoA
et al., 2008b). Nacetilglucosamina1P
GlmU UTP
UDPGlcNAc
2. Montaje de la unidad de
MurA
monómero ENERGÍA
UDPGlcNAcenolpiruvato
MurB NADPH
La unidad monomérica se ensambla mediante una
secuencia lineal de reacciones que se extienden desde UDPMurNAc
MurC
la dfructosa 6fosfato hasta el lípido intermedio final Lala
(Figura 16.1). La ruta se estableció caracterizando sus UDPMurNAcLAla
precursores y desarrollando un ensayo enzimático asesinato DGlu
específico para cada paso. Se identificaron los genes
UDPMurNAcdipéptido
implicados en el proceso, se mapearon en unas pocas
Amurallar
regiones del cromosoma bacteriano, se clonaron, se A2pm o LLys
secuenciaron y se demostró que la mayoría eran UDPMurNActripéptido
esenciales. Sus productos fueron sobreproducidos, MurF DAlaDAla
caracterizados y muchos cristalizados. Esto a su vez UDPMurNAcpentapéptido
permitió estudios estructurales y mecanicistas. La
MraY Undecapreny1P
literatura sobre la vía ha sido revisada en detalle
lípido yo
(Rogers et al., 1980; Ward, 1984; Bugg and Walsh,
MurG UDPGlcNAc
1992; van Heijenoort, 2001b; Barreteau et al., 2008;
Bouhss et al., 2008). Por conveniencia, se considerarán Lípido II
las formaciones sucesivas (ver Figura 16.1) de uridina
difosfato (UDP) Nacetilglucosamina (GlcNAc), UDP Peptidoglicano
Nácido acetilmurámico (UDP MurNAc), UDPMurNAc Figura 16.1 Montaje paso a paso de la unidad monomérica
péptidos y lípidos intermedios. de peptidoglicano. Abreviaturas: A2pm, ácido
diaminopimélico; acetilCoA, acetil coenzima A; d, lAla,
d, lalanina; d Glu, ácido dglutámico; lLys, llisina;
NADPH, fosfato de dinucleótido de nicotinamida y
2.1. Formación de UDPGlcNAc adenina; PEP, fosfoenolpiruvato; undecaprenilP,
undecaprenilfosfato; UDP, uridina difosfato; UDP
En las eubacterias, la UDPGlcNAc se usa no solo GlcNAc, UDPNacetilglucosamina; UDPMurNAc, ácido
para la síntesis de peptidoglucano, sino también para UDPNacetilmurámico; UTP, uridina difosfato.
Reproducido, con permiso, de van Heijenoort (2007).
la de otros polímeros de la pared celular (véanse los
Capítulos 17 a 22). Su síntesis a partir de dfructosa6
fosfato (Figura 16.2) requiere cuatro pasos (Dobrogosz, 1968;
II. Síntesis de componentes glicosilados microbianos
2. Montaje de la unidad de monómero 289
Fructosa6P Los dos últimos pasos se refieren a las
gln reacciones de acetilación y uridilación (ver Figura
GLMS
Glú 16.2) llevadas a cabo por el producto del gen
glmU bifuncional (MenginLecreulx y van
Glucosamina6P
Heijenoort, 1994). El dominio Cterminal de GlmU
GLM cataliza la acetilación de dglucosamina1fosfato,
mientras que el dominio Nterminal cataliza la
Glucosamina1P uridilación de la Nacetilglucosamina1fosfato
AcetilCoA formada para producir UDPGlcNAc (Mengin
GlmU
CoA Lecreulx y van Heijenoort, 1994; Gehring et al.,
1996). Los dos dominios son funcionalmente
Nacetilglucosamina1p
UTP
independientes y cada uno es esencial. Las
GlmU determinaciones de la estructura cristalina
PPi
revelaron que los dos dominios están conectados
UDPNacetilglucosamina por un largo brazo helicoidal y que tres
moléculas de GlmU forman una disposición homotrimérica (M
peptidoglicano Otros polímeros de la pared celular
2.2. Formación de UDPMurNAc
Figura 16.2 Biosíntesis de UDPNacetilglucosamina en bacterias.
La formación de UDPMurNAc (ver Figura 16.1)
Abreviaturas: acetilCoA, acetil coenzima A; CoA, coenzima A; gln,
es un proceso de dos pasos. Primero, la
glutamina; glu, ácido glutámico; PPi, pirofosfato inorgánico; UDP,
difosfato de uridina; UTP, difosfato de uridina. transferasa MurA cataliza la adición de enolpiruvato
de fosfoenolpiruvato a la posición 3 de N
acetilglucosamina en UDP GlcNAc para producir
Blanco, 1968). Primero, el producto del gen glmS UDPGlcNAcenolpiruvato. En el segundo paso,
convierte la dfructosa6fosfato en dglucosamina la reducción del resto de enolpiruvato a dlactoilo
6fosfato. El dominio Nterminal de GlmS cataliza es catalizada por la reductasa MurB para producir
la hidrólisis de lglutamina a lglutamato y UDPMurNAc. En general, las bacterias Gram
amoníaco, mientras que el dominio Cterminal negativas tienen sólo un gen murA , mientras que
utiliza el amoníaco liberado para formar d las bacterias Grampositivas con bajo G C
glucosamina6fosfato. Se determinaron las tienen dos. Las enzimas MurA y MurB se
estructuras 3D de los dos dominios y se purificaron a partir de varios organismos y se
propusieron mecanismos catalíticos (Durand et determinaron sus estructuras 3D (van Heijenoort,
al., 2008 y referencias allí). En el segundo paso 2001b; Barreteau et al., 2008 y referencias allí).
(ver Figura 16.2), la interconversión de d La ruta de reacción de MurA se estudió
glucosamina6fosfato y dglucosamina 1fosfato usando cinética rápida, análogos de
es catalizada por la fosfoglucosamina mutasa fosfoenolpiruvato (PEP) y mutagénesis dirigida al
GlmM (MenginLecreulx y van Heijenoort, 1996). sitio (Skarzynski et al., 1998 y referencias allí).
Se demostró que la mutasa es activa solo después Se propuso un mecanismo de sumaeliminación
de la fosforilación de una serina específica y la y procede a través de un intermedio tetraédrico
catálisis procede de acuerdo con un mecanismo (Figura 16.3). El aducto de cetal formado entre
bibi de pingpong que involucra a la d los dos sustratos se une de forma no covalente a
glucosamina1,6difosfato como intermediario la enzima y el curso estereoquímico de la
(Jolly et al., 1999 ) . transferencia enzimática de enolpiruvilo fue
O OH
O
OP O
HO
HO OH
O + OH HO
HNAc
O O O
PAG PAG uridina
O O O
OPEP UDPGlcNAc
OH
O O
PAG O
O HO
O OH
O HO
OH
HNAc
O
O O O
H3C PAG PAG uridina
O O O
FosfolactoilUDPGlcNAc
Pi
OH
O
HO
O OH
OH HO
HNAc
O O O
PAG PAG uridina
O O
O O
UDPGlcNAcenolpiruivato
Figura 16.3 Formación de UDPNacetilglucosaminaenolpiruvato catalizada por MurA . Abreviaturas: PEP, fosfoe nolpiruvato;
Pi, fosfato inorgánico; UDP, difosfato de uridina; UDPGlcNAc, UDPNacetilglucosamina.
determinado. Los estudios estructurales con dinucleótido (FAD) se reduce por la transferencia
Escherichia coli MurA revelaron que puede asumir de dos electrones del fosfato de dinucleótido de
tres estados de conformación correspondientes a nicotinamida y adenina (NADPH) (ver Figura 16.4A).
diferentes etapas del proceso catalítico. En segundo lugar (ver Figura 16.4B), la
La reductasa MurB de E. coli es una flavoproteína transferencia de dos electrones desde EFADH2 al
y su mecanismo (Figura 16.4) implica dos C3 del enol éter de UDPGlcNAcenolpiruvato es
semirreacciones (Benson et al., 1997 y sus seguida por la entrega en C2 de un protón desde
el sitio activo. serina de MurB.
referencias). Primero, la flavina adenina fuertemente unida
A
NADPH + EFAD NADP + EFADH2
B OH
O
HO
O OH
EFADH2 + OH HO
HNAc
O O O
PAG PAG uridina
O O
O O
UDPGlcNAcenolpiruvato
OH
O
HO
CH3 O OH
OH HO + EFAD
HNAc
O O O
PAG PAG uridina
O O
UDPMurNAc O O
Figura 16.4 Reducción catalizada por MurB de UDPNacetilglucosaminaenolpiruvato a ácido UDPNacetilmurámico.
Abreviaturas: FAD, dinucleótido de flavina y adenina (forma oxidada); FADH2, dinucleótido de flavina y adenina (forma reducida);
NAD, dinucleótido de nicotinamida y adenina; NADPH, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma reducida); UDP, difosfato
de uridina; UDPGlcNAc, UDPNacetilglucosamina; UDPMurNAc, ácido UDPNacetilmurámico.
2.3. Formación de los precursores del enlace con la escisión concomitante de trifosfato de
adenosina (ATP) en difosfato de adenosina (ADP) y
péptido UDPMurNAc
fosfato inorgánico (Figura 16.5).
La formación de los precursores del péptido UDP El aislamiento de mutantes letales condicionales,
MurNAc se produce (ver Figura 16.1) mediante la caracterizados por un fenotipo de lisis celular, se
adición gradual de lalanina (con menos frecuencia desarrolló en diferentes organismos. En E. coli, los
glicina), ácido dglutámico, un diaminoácido genes de la sintetasa Mur (murC, murD, murE y
(generalmente llisina o ácido diaminopimélico, menos murF) son únicos, esenciales y están ubicados en el
frecuen te ). frecuentemente otro diaminoácido u grupo dcw que contiene genes de síntesis de
homoserina) y dalanildalanina (con menos peptidoglicano y de división celular. Ahora se conocen
frecuencia d alanildlactato o dalanildserina) en el secuencias del gen mur afines de una amplia variedad
grupo d lactoilo de UDPMurNAc (van Heijenoort, de géneros bacterianos, muchos de los cuales
2001b; Smith , 2006; Barreteau et al., 2008 y también pertenecen a un grupo de división de la
referencias allí). En cada paso, una enzima pared celular. Aunque las Mur sintetasas tienen una
citoplásmica específica, denominada Mur sintetasa, identidad de secuencia general limitada, varios
cataliza la formación de una amida o péptido. motivos específicos con alta identidad revelan la existencia de inva
MurC UDPMurNAc + LAla + ATP UDPMurNAcLAla + ADP + Pi
asesinato UDPMurNAcLAla + DGlu + ATP
UDPMurNAcLAlaDGlu + ADP + Pi
Amurallar
UDPMurNAcLAlaDGlu + LLys (o A2pm) + ATP
UDPMurNActripéptido + ADP + Pi
MurF UDPMurNActripéptido + DAlaDAla + ATP
UDPMurNAcpentapéptido + ADP + Pi
ATP ADP
O R'NH2
O
R R
=
O– PO3
Fosfato de acilo
O–
O
=
R O PO3 R + Pi
+
NH2 NHR'
R'
intermedio tetraédrico
Figura 16.5 Montaje paso a paso de la subunidad peptídica y mecanismo de reacción de las sintetasas Mur, donde R UDP
MurNAc o UDPMurNAcpéptido y R' aminoácido o dipéptido. Abreviaturas: A2pm, ácido diaminopimélico; ADP Difosfato de
adenosina; ATP, trifosfato de adenosina; lAla, lalanina; dGlu, ácido dglutámico; llys, llisina; Pi, fosfato inorgánico; UDPMurNAc,
ácido UDPNacetilmurámico.
Se encontró que las estructuras de las cuatro Todas las sintetasas Mur operan por un
sintetasas Mur comparten la misma topología de mecanismo catalítico similar (ver Figura 16.5)
tres dominios con un dominio Nterminal que implica la activación carboxi de un residuo
responsable de unir el péptido UDPMurNAc, un de aminoácido Cterminal del sustrato de
dominio central de unión a ATP y un dominio C nucleótido a un intermediario de acilo fosfato
terminal asociado con la unión del péptido. seguido por el ataque nucleofílico por el grupo
aminoácido o dipéptido entrante. Los dominios 2 amino del aminoácido condensado. o dipéptido,
y 3 tienen una topología conservada mientras con la eliminación de fosfato y posterior formación
que la del dominio N terminal difiere de una de enlaces amida o peptídicos. Se comprobó la
sintetasa a otra. Las Mur sintetasas también formación reversible del intermedio de fosfato de
tienen una arquitectura de sitio activo similar que acilo y se sugirió la posible presencia de un
se encuentra en la unión de los tres dominios estado de transición tetraédrico después del
estructurales y comprende bolsillos de unión fosfato de acilo. Al ser proteínas estrechamente
específicos para los tres sustratos distribuidos alrededor del centro
relacionadas catalítico.y funcionalmente,
estructural
las Mur sintetasas aparecen así como una aureus y Micrococcus luteus condujeron al
subfamilia bien definida de ligasas dependientes descubrimiento de los intermediarios lipídicos I y
de ATP (Smith, 2006). II y a la determinación de su papel respectivo en
la vía (Chatterjee y Park, 1964; Meadow et al.,
1964; Anderson et al., 1965). El primer paso de la
2.4. Intermediarios lipídicos en membrana implica la transferencia del resto fosfo
MurNAcpentapéptido del UDPMurNAc
la biosíntesis de peptidoglicano
pentapéptido al fosfato de undecaprenilo para
El estudio de sistemas de síntesis de producir lípido I y monofosfato de uridina (UMP)
peptidoglicanos libres de células utilizando UDP (Figura 16.6 ). A continuación, se añade N
GlcNAc, UDPMurNAcpentapéptido radiomarcado acetilglucosamina al lípido I para producir el lípido
y preparaciones de partículas de Staphylococcus II. Las estructuras de los lípidos I y II
OH
O
HO
O
HNAc OH OH
O O O O
PAG
8
PAG
Lala
O O
γDGlu
A14:00
LÍPIDOS I
DAla
DAla
OH
HNAc
HO O
O
HO O
O
HNAc OH OH
OH O O O O
PAG PAG
8
Lala
O O
γDGlu
A14:00
LÍPIDOS II
DAla
DAla
periplasma
Membrana translocación
MraY
PAG PAG PAG
+ MurG
PAG PAG
UDPMurNAc
MurNAc MurNAcGlcNAc
+
energía
energía energía
UMP UDPGlcNAc UDP
Citoplasma
lípido yo Lípido II
Figura 16.6 Estructura de los lípidos I y II y su síntesis por las transferasas MraY y MurG. Pep pentapéptido.
Abreviaturas: UDP, difosfato de uridina; UDPGlcNAc, UDPNacetilglucosamina; UDPMurNAc, ácido UDPN
acetilmurámico; UMP, monofosfato de uridina. Reproducido, con permiso, de van Heijenoort (2007).
(ver Figura 16.6) se establecieron después del (Mahapatra et al., 2005). La purificación de MraY de
Bacillus subtilis (Bouhss et al., 2004) aún no ha llevado
aislamiento de sistemas libres de células (Higashi et al., 1967).
Posteriormente, se caracterizaron a partir de diversos a su cristalización.
organismos. Sus bajos niveles de acumulación, su
acumulación limitada en sistemas libres de células y el
tedioso trabajo de su aislamiento restringieron durante
2.6. Biosíntesis de lípido II por
décadas su disponibilidad para el estudio de los pasos transferasa MurG
de membrana de la vía. Estas dificultades ahora han
sido superadas por su síntesis química o enzimática La transferencia de Nacetilglucosamina desde UDP
(Welzel, 2005; van Heijenoort, 2007; Bouhss et al., GlcNAc al hidroxilo C4 de la unidad MurNAc del lípido I
2008 y referencias allí). está catalizada por la transferasa MurG (Mengin
Lecreulx et al., 1991). La formación del enlace (1→4)
va acompañada de la inversión de la configuración
anomérica de la Nacetilglucosamina (Figura 16.8). La
2.5. Biosíntesis de lípido I por transferasa proteína MurG pertenece a la superfamilia GTB
MraY glicosiltransferasa (GT) (Ünligil y Rini, 2000). Es único
e imprescindible. Se ha estudiado principalmente MurG
La formación de lípido I está catalizada por la de E. coli (van Heijenoort, 2001a, 2007; Bouhss et al.,
proteína de membrana integral MraY, que es esencial 2008 y sus referencias) y se ha demostrado que está
y única (Ikeda et al., 1991; Boyle y Donachie, 1998). asociado con el lado interno de la membrana
Se estableció un modelo de topología de membrana citoplasmática, estableciendo así que la unidad
2D común para E. coli y S. aureus MraYs (Bouhss et monomérica de peptidoglicano completa se ensambla
al., 1999), que tiene diez segmentos transmembrana, dentro de la célula antes de la translocación a través
cinco dominios citoplásmicos y seis dominios de la membrana. Por lo tanto, MurG es una enzima
periplásmicos, incluidos los extremos N y Cterminal. . clave en la unión entre las dos etapas de la síntesis de
Los dominios citoplasmáticos están involucrados en el peptidoglicanos.
reconocimiento y catálisis del sustrato, lo que indica
que el lípido I se forma en la superficie interior de la La estructura cristalina de MurG consta de dos
membrana (Bouhss et al., 1999; Price y Momany, 2005). dominios separados por una hendidura profunda (Ha et
al., 2000). Se propuso que el sitio de unión para UDP
GlcNAc estuviera en el dominio Cterminal y que para
La enzima MraY pertenece a la familia UDPdN el lípido I en el dominio Nterminal en el que un parche
acetilhexosamina: poliprenol fosfato dN hidrofóbico rodeado de residuos básicos podría ser el
acetilhexosamina1P transferasa (Price y Momany, sitio de interacción con la membrana cargada
2005). Se propuso un mecanismo catalítico de varios negativamente.
pasos (Figura 16.7) (Neuhaus, 1971; Ikeda et al., 1991; La comparación de secuencias de varios ortólogos
Lloyd et al., 2004; Price y Momany, 2005). La reacción confirmó los caracteres extrínsecos y catiónicos de
de MraY es totalmente reversible y tiene lugar con MurG y su funcionamiento como una proteína periférica
conservación de la configuración anomérica del moderadamente hidrofóbica. Se llevaron a cabo
residuo de MurNAc. En la mayoría de las eubacterias, estudios enzimáticos detallados con análogos de lípido
se supone que el fosfato de undecaprenilo es el sustrato I. Se estableció la reversibilidad parcial de la reacción,
de MraY. se investigaron las especificidades de los sitios aceptor
Sin embargo, el análisis estructural reciente de los y donante y se demostró un mecanismo bibi ordenado.
lípidos I y II de Mycobacterium smegmatis demostró la
presencia predominante de decaprenol
OH
O
HO
O OH
MraY
R NHAc Áspid
O OH MraY intermedio
MraY Áspid
PAG
O magnesio
Áspid
O
+
O HO fosfato de uridina
O O O OH
UDPMurNACpentapéptido
+ PAG
R NHAc
O
MraY O
uridina MraY Áspid
PAG
O
OH
OH MraY intermedio OH
O O
HO HO
O OH O OH
HO
R NHAc R NHAc
O O O C55
PAG
MraY Áspid MraY Áspid O O

+
PAG PAG
O O
OH OH
Fosfato de undecaprenilo
OH
O
HO
O OH
HO
R NHAc
O O C55
PAG
LÍPIDOS I O O
PAG
O
OH
Figura 16.7 Formación de lípido I catalizada por MraY en varios pasos. Abreviaturas: Asp, ácido aspártico; UDP, uridina difosfato; UDP
MurNAc, ácido UDPNacetilmurámico. Reproducido, con permiso, de van Heijenoort (2007).
2.7. caminos laterales
A (acetilCoA), trifosfato de uridina (UTP), PEP,
Además del péptido UDPMurNAc y los ATP, lalanina, llisina y ácido diaminopimélico,
precursores intermedios de lípidos, el funcionamiento están involucrados en diversas reacciones
de la vía depende de una serie de otros sustratos metabólicas . Otros, como la dalanina, el ácido d
(ver Figura 16.1). Algunos, como la acetil coenzima glutámico, el dipéptido dalanilX, el fosfato de undecaprenilo, so
OH
OH
O
O Aceptor
HO
HO de LÍPIDOS I
HO H
RO
OH OH
NHAc O
NHAc O O O
Donante de UDP
GlcNAc correos
+ PAG PAG
undecaprenilo
OH
O O
O
OH
correos
MurG
uridina
OH OH
HO
O O
+ difosfato de uridina
O H
HO RO
OH OH
NHAc NHAc O O O
LÍPIDOS II PAG PAG
undecaprenilo
O O
Figura 16.8 Formación de lípido II catalizada por MurG. Abreviaturas: UDP, difosfato de uridina; UDPGlcNAc, UDPN acetilglucosamina. Reproducido,
con permiso, de van Heijenoort (2007).
específica de la biosíntesis de peptidoglicano u otros síntesis en células en crecimiento. Más de cuatro
polímeros de la pared celular y su formación se ha décadas después de su descubrimiento, el mecanismo
revisado en detalle (van Heijenoort, 2001b; Barreteau de su translocación sigue siendo desconocido. Los
et al., 2008; Bouhss et al., 2008). experimentos de espectrometría de fluorescencia
llevados a cabo en vesículas de lípidos con un
análogo de lípido II fluorescente mostraron que no
3. Translocación de la unidad hubo un movimiento espontáneo del intermediario
lipídico a través de la bicapa (van Dam et al., 2007).
monomérica Sin embargo, se observó translocación cuando se
usaron vesículas de membrana interna de E. coli , lo
Antes de su uso como sustrato en la polimerización que reveló que estaba presente una maquinaria de
extracitoplasmática, el lípido II se transloca a través translocación intacta y probablemente compuesta por
del entorno hidrofóbico de la membrana citoplasmática proteínas de membrana. Experimentos adicionales
(van Heijenoort, 2001a, 2007; Bouhss et al., 2008 y indicaron que la translocación del lípido II quizás
referencias allí). estaba acoplada a la transglucosilación en curso. Los
Teniendo en cuenta su bajo nivel de reserva, su resultados anteriores habían sugerido que la
translocación debe ser un proceso rápido y translocación del lípido II dependía de la síntesis de
unidireccional para mantener un peptidoglicano estable. fosfolípidos y era probable que fuera más que un simple mecanism
4. Polimerización de la unidad de monómero 297
y Holtje, 1996). Curiosamente, se informaron por inversión de la configuración anomérica del

mecanismos mediados por proteínas para la residuo de MurNAc y, por lo tanto, conduce a
transferencia de unidades de antígeno común cadenas lineales que contienen exclusivamente
enterobacteriano y antígeno O a través de la enlaces (1→4) (van Heijenoort, 2001a y referencias allí).
membrana (van Heijenoort, 2007; Bouhss et al., 2008 yEn varios casos,
referencias allí).se estableció que la reacción tiene
lugar en el extremo reductor de la cadena en
crecimiento que se transfiere como sustrato
donador al hidroxilo C4 de la unidad GlcNAc del
4. Polimerización de la unidad de lípido II que actúa como sustrato aceptor (van
monómero Heijenoort, 2001a ; Perlstein et al., 2007 y sus
referencias).
Los GT responsables de la reacción de
4.1. Formación de cadenas de glicanos
polimerización se presentan en dos formas (Goffin
por transglicosilación y Ghuysen, 1998; van Heijenoort, 2001a, 2007 y
Las cadenas de peptidoglicano glicano se sus referencias), a saber, como un módulo N
ensamblan por polimerización de la unidad GlcNAc terminal en proteínas de unión a penicilina (PBP)
(1→ 4)MurNAcdisacáridopéptido del lípido II bifuncionales de clase A, que también contienen un
con formación de enlaces (1→4) (Figura 16.9) . módulo de transpeptidasa Cterminal (TP) y como
La reacción de transglicosilación se acompaña glicosiltransferasas monofuncionales. Ellos
OH Aceptador OH
O O
HGT O O H
HO RO
NHAc NHAc O
Donante Lípido II
OH OH PAG OH
O
O O O
O O OH
RO
PAG
HO O
NHAc NHAc O O
GTOH
Extender la cadena de glicanos OH
O
PAG
undecaprenilo
O
OH
PAG
periplasma O
undecaprenilo
Membrana
Figura 16.9 Mecanismo de transglicosilación con elongación de cadena en el extremo reductor. R dlactoilpéptido.
Abreviatura: GT, glicosiltransferasa. Reproducido, con permiso, de van Heijenoort (2007).
muestran una alta similitud de secuencia, pertenecen camino a estudios más sistemáticos del sitio
a la familia GT51 en la clasificación basada en catalítico GT y el mecanismo de reacción. PBP2a
secuencias de GT y poseen cinco motivos de S. aureus tiene un pliegue bilobular con los
conservados (Goffin y Ghuysen, 1998; Coutinho et dominios GT y TP separados por una región
al., 2003). En la actualidad, se han purificado más enlazadora corta rica en (Lovering et al., 2007).
de 15 GT y la mayoría se ha analizado en cuanto a
su actividad con lípido II o análogos como sustrato
(van Heijenoort, 2007; Sauvage et al., 2008 y 4.2. Formación de puentes cruzados
referencias allí).
por transpeptidación
El análisis de los productos de reacción formados
por PBP1b purificada de E. coli reveló una longitud El entrecruzamiento entre las subunidades
de cadena de glucano promedio de más de 25 peptídicas de las cadenas de glicano es esencial
unidades de disacárido y casi el 50 % de péptidos para la formación de la estructura 3D del
entrecruzados (Bertsche et al., 2005). La reciente peptidoglicano (ver Capítulo 2). Implica dos tipos
resolución de las estructuras cristalinas de PBP2 de reacciones de transpeptidización (Goffin y Ghuysen, 2002).
de S. aureus (Lovering et al., 2007) y del dominio El tipo (4→3) o transpeptidación dd (Figura 16.10)
es el principal y conlleva la formación de un
GT de Aquifex aeolicus (Yuan et al., 2007) abre el camino
Donante
GlcNAcMurNAc GlcNAcMurNAc GlcNAcMurNAc
Lala Lala Lala
DiGlu DiGlu DiGlu
mA2pm mA2pm mA2pm
PBPSerOH DAla DAla DAla DAla

DAla
DAla PBPSerO CO CO DAla

DAla
NUEVA HAMPSHIRE
mA2pm
H2N mA2pm
DIGlu
DIGlu
Lala
Lala
GlcNAcMurNAc
GlcNAcMurNAc
Aceptador
Figura 16.10 Entrecruzamiento por transpeptidación dd entre subunidades peptídicas donadoras y aceptoras. Abreviaturas: A2pm, ácido
diaminopimélico; d, lAla, d, lalanina; dGlu, ácido dglutámico; diGlu, ácido disoglutámico; GlcNAc, Nacetil glucosamina; MurNAc, ácido N
acetilmurámico; PBP, proteína fijadora de penicilina; ser, serina. Reproducido, con autorización, de Zapun et al. 2008b. Proteínas fijadoras de
penicilina y resistencia a lactámicos. FEMS Microbiol. Rev. 32, 361–385.
6. Funcionamiento in vivo del ensamblaje de la unidad de monómero 299
enlace peptídico entre el grupo carboxilo de la d 5. Variaciones en la
alanina en la posición 4 de una subunidad peptídica biosíntesis de peptidoglicanos
donadora y el grupo N amino de la llisina o del
ácido diaminopimélico en la posición 3 de una
subunidad peptídica aceptora, concomitantemente En la mayoría de las eubacterias se encuentran
con la liberación de la donante Cterminal dalanina. modificaciones de la estructura básica del
Las ddtranspeptidasas responsables de esta péptidoglicano (ver Capítulo 2; Vollmer, 2008;
reacción pertenecen a la familia de las PBP. Las Vollmer et al., 2008). Además, se observan
PBP son aciltransferasas específicamente inhibidas variaciones en una bacteria determinada en muchas
por la unión covalente de antibióticos lactámicos circunstancias (fase de crecimiento, condiciones
a su sitio activo (Goffin y Ghuysen, 2002; de c recimiento, tratamientos con antibióticos,
Macheboeuf et al., 2006; Sauvage et al., 2008; mutaciones, e tc.). El significado fisiológico de
Zapun et al., 2008b). Vienen en dos formas: como muchas m odificaciones estructurales aún no se
módulos de terminal C en PBP de clase A en comprende bien. Se introducen en los precursores
asociación con un módulo GT de terminal N o sin de la unidad monomérica o durante y después de
él como en PBP de clase B. Además, están unidos las reacciones de polimerización. Implican una
a la membrana citoplasmática con la mayor parte cierta variabilidad de las especificidades de las
de la cadena polipeptídica expuesta al exterior. enzimas de la vía o la presencia de actividades
Como todas las PBP, las ddtranspeptidasas tienen adicionales. Dado que las especificidades
los tres motivos conservados de la superfamilia de enzimáticas no son exactamente las mismas de un
enzimas serina SXXK. En las estructuras 3D paso a otro, cualquier cambio en un paso dado
conocidas de los dominios TP, los tres motivos debe ser aceptado por los siguientes. Por lo tanto,
están cerca uno del otro cerca del límite del centro el
efecto acumulativo de las diferentes
catalítico. La serina del sitio activo del motivo SXXK especificidades a lo largo del camino determina el
es el nucleófilo catalítico que da lugar a un grado d e
f lexibilidad de la biosíntesis de pepti
intermedio de aciloenzima con la subunidad dogglicano y
e l
d e s u variabilidad estructural. Cabe
peptídica donante antes de la formación del señalar q ue l as r eacciones responsables de las
entrecruzamiento con la subunidad aceptora (ver modificaciones n o s on n ecesariamente completas.
Figura 16.10) . En c onsecuencia, l a
p resencia d e
p recursores
La transpeptidación tipo (3→3) o ld funciona en homólogos puede dar lugar al funcionamiento en
paralelo con la transpeptidación dd en varios paralelo de más de una vía (van Heijenoort, 2001b,
organismos (Goffin y Ghuysen, 2002). Esto implica 2007; Barreteau et al., 2008 y referencias allí).
la formación de un enlace peptídico entre el También cabe destacar que determinados
carboxilo de llisina o ácido diaminopimélico en la mecanismos de resistencia a los antibióticos
posición 3 de una subunidad tetrapeptídica lactámicos y g lucopéptidos implican modificaciones en la biosín
donadora y el grupo amino de la cadena lateral del
diaminoácido en la posición 3 de la subunidad
peptídica aceptora, junto con la liberación del 6. Funcionamiento in vivo del ensamblaje de la
donante Cterminal dalanina. A excepción de los unidad de monómero
carbapenémicos, las ldtranspeptidasas son
insensibles a los lactámicos. Presentes en
muchos organismos, juegan un papel crítico en los Los mecanismos que regulan la expresión de
mecanismos de resistencia a los antibióticos los genes de la vía se han estudiado de forma
(Mainardi et al., 2008) y en la unión covalente de limitada. La expresión de los genes murC, murD,
proteínas a peptidoglicano (Dramsi et al., 2008). murE, murF, murG y mraY de
Se demostró que el grupo dcw de E. coli depende (Rogers et al., 1980; Ward, 1984; van Heijenoort, 2001a
principalmente de un promotor, a saber, Pmra (Mengin y referencias allí). En las células en crecimiento, están
Lecreulx et al., 1998). Más recientemente se han estrechamente acoplados de acuerdo con la
descrito diferentes mecanismos riboreguladores en B. bifuncionalidad de las PBP de clase A. Sin embargo, la
subtilis y E. coli para el control de la expresión del gen
transglicosilación puede proceder independientemente
glmS responsable de la síntesis de dglucosamina6 de la transpeptidación, como se ejemplifica, por ejemplo,
fosfato (Winkler et al., 2004; Urban et al. , 2007). en la formación de material soluble después de la
inhibición de la transpeptidación por lactámicos. Esto
Al comparar los niveles de la reserva de precursores, sugiere claramente que la transpeptidación es necesaria
las actividades enzimáticas específicas y las tasas de para la unión de nuevo material al peptidoglicano
síntesis de peptidoglucano, se estableció una visión preexistente. No se observó transpeptidación cuando la
general del funcionamiento in vivo de la ruta de E. coli moenomicina inhibió específicamente la cosilación
(revisado en van Heijenoort, 2001b). Se encontró que transgly (van Heijenoort, 2001a y referencias allí) o
muchas enzimas eran más o menos constitutivas, su cuando se usó PBP1a inactivada con GT de E. coli en
actividad específica variaba poco con la tasa de un ensayo de polimerización con lípido II (Born et al.,
crecimiento y solo hasta cierto punto con la fase de crecimiento.
2006).
Las actividades específicas están en exceso o al menos
ajustadas a los requerimientos de las células de rápido Dado que el peptidoglicano es un componente
crecimiento. Se propusieron posibles mecanismos de estructural continuo esencial de la envoltura celular, la
control por inhibición de la retroalimentación que incorporación de nuevo material está necesariamente
involucran efectores celulares específicos para estrechamente relacionada con las complejas
diferentes pasos. Además, se demostró que el maquinarias del crecimiento celular y la división celular
funcionamiento de la ruta de UDPGlcNAc a UDP y, por lo tanto, implica restricciones tanto espaciales como temporales
MurNAcpentapéptido (ver Figura 16.1) depende de la La localización de la incorporación se analizó mediante
tasa de síntesis de UDPGlcNAc. La formación de lípido varios métodos de etiquetado y microscopía (den
I está limitada por la reserva de fosfato de undecaprenilo Blaauwen et al., 2008; Zapun et al., 2008a y referencias
y la reversibilidad de la reacción de MraY (ver Figura allí). Los resultados son consistentes con la presencia
16.6). Durante el crecimiento de muchos organismos, de diferentes sistemas de síntesis de péptidoglicanos.
se observa un recambio de peptidoglicano con liberación En los organismos con forma de bastón, uno está
de fragmentos solubles en el medio. asociado con el alargamiento celular mientras que el
Sin embargo, en algunas bacterias Gramnegativas, la otro está involucrado en la tabicación celular (den
renovación va acompañada de un proceso de reciclaje Blaauwen et al., 2008). En los cocos, la mayor parte del
mediante el cual los fragmentos liberados se incorporan material se incorpora durante la tabicación, pero se
nuevamente a la célula y se reutilizan en el ensamblaje propusieron sistemas adicionales para dar cuenta de
de la unidad monomérica ( Park y Ueharan, 2008 y los procesos preseptales, periféricos y de engrosamiento
referencias allí). (Zapun et al., 2008a). Una dificultad importante con el
estudio de los complejos sintetizadores de
peptidoglicanos es la presencia en muchos organismos
7. Funcionamiento in vivo del proceso de de una multiplicidad de actividades GT y TP de
peptidoglicanos (Goffin y Ghuysen, 1998, 2002).
polimerización
Se hace un esfuerzo por especificar a qué sistema se
asocia cada actividad y se han propuesto varios
La correlación entre las reacciones de modelos de su funcionamiento in vivo (Scheffers y
transglicosilación y transpeptidación se investigó con Pinho, 2005; Sauvage et al., 2008; Zapun et al., 2008a
numerosos organismos y células libres. y referencias allí).
Reconocimiento 301
8. Inhibición de la explica en parte su uso eficiente como blancos. En las
biosíntesis de peptidoglicanos células en crecimiento, la inhibición de un paso
específico de la ruta provocará una acumulación de
los precursores aguas arriba y una disminución de las
Un aspecto históricamente importante de la reservas de precursores aguas abajo con la detención
biosíntesis de pepti dogglicanos es su inhibición de las reacciones de polimerización. Esto a su vez
específica por antibióticos, algunos de los cuales son conduce a la bacteriostasis oa un efecto bactericida a
fármacos bien conocidos en uso clínico ( lactámicos, menudo acompañado de cambios morfológicos y lisis celular.
glicopéptidos, fosfomicina, bacitracina, etc.) o en uso
como promotores del crecimiento animal (moenomicina,
etc.). La elucidación de los mecanismos de acción de
estos fármacos y de muchos otros inhibidores 9. Observaciones finales
sintetizados a menudo fue paralela al estudio de los
pasos individuales de la vía. Ya se han descrito
Aunque se han estudiado muchos aspectos de la
inhibidores para prácticamente cada paso y actúan
biosíntesis de peptidoglicano, áreas importantes
dirigiéndose a una enzima o un precursor.
requieren investigaciones más exhaustivas.
Se observó unión no covalente con una enzima en
Comprender la organización de los complejos de
muchos pasos del ensamblaje de la unidad de
síntesis de peptidoglicanos y su funcionamiento en
monómero (Dini, 2005; Barreteau et al., 2008; Bouhss
coordinación con el crecimiento celular y la división
et al., 2008 y referencias allí) y también con la
celular es, sin duda, el problema más desafiante y
inhibición de las actividades de GT por moenomicina
requerirá muchos años de esfuerzos sostenidos.
(Welzel, 2005 y referencias en el mismo). La unión
Estrechamente relacionado con este aspecto está la
covalente a una enzima con formación de intermedios
presencia en la mayoría de los organismos de
estables se ejemplifica con fosfomicina y dcicloserina
numerosas hidrolasas de peptidoglicano específicas.
(Gale et al., 1981; Barreteau et al., 2008) y, sobre
Solo se han estudiado en algunos casos y se requiere
todo, con lactámicos que actúan como sustratos
un trabajo más sistemático para determinar los roles
suicidas de la PBP (Goffin y Ghuysen, 2002;
que desempeñan. Además, la genética, la bioquímica
Macheboeuf et al., 2006; Sauvage et al., 2008; Zapun
y el significado fisiológico de muchas modificaciones
et al., 2008b). La formación de complejos no covalentes
estructurales del peptidoglicano (amidación, metilación,
entre ciertos antibióticos (glucopéptidos, lantibióticos,
fosforilación, etc.) siguen sin explorarse. Finalmente,
ramoplanina y otros) y el lípido II o peptidoglucano varios mecanismos de resistencia a los antibióticos
naciente interfiere en las reacciones de polimerización
implican modificaciones en la síntesis de
(Kahne et al., 2005; Walker et al . , 2005 ; Chatterjee
peptidoglicanos, varios de los cuales aún no se
et al . ., 2005; Mainardi et al., 2008 y referencias allí). comprenden claramente. La necesidad de superar los
mecanismos de resistencia y utilizar objetivos
específicos para la búsqueda de nuevos antibacterianos
El efecto celular de un inhibidor de peptidoglicano
también justifica plenamente el estudio continuo de la biosíntesis de
depende de la accesibilidad del objetivo. Por su
tamaño y/o estructura polar, muchos inhibidores
potentes de enzimas aisladas no pueden penetrar la
Agradecimientos
membrana citoplásmica. La eficacia de fosfomicina y
dcicloserina se debe al uso de sistemas de transporte
endógenos (Gale et al., 1981). La localización Este trabajo fue apoyado por la subvención
extracitoplasmática de las actividades GT y TP, así UMR8619 del Centre National de la Recherche
como la del lípido II o peptidoglicano naciente, Scientifique.
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cadenas lineales de glucano (Goffin y Ghuysen, 1998; GLMS Lglutamina

MurC UDPMurNAc + LAla + ATP UDPMurNAcLAla + ADP + Pi

PAG PAG PAG

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y Holtje, 1996). Curiosamente, se informaron por inversión de la configuración anomérica del

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cadenas lineales de glucano (Goffin y Ghuysen, 1998; GLMS L­glutamina

MurC UDP­MurNAc + L­Ala + ATP UDP­MurNAc­L­Ala + ADP + Pi

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MraY Áspid MraY Áspid O O

y Holtje, 1996). Curiosamente, se informaron por inversión de la configuración anomérica del

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cadenas lineales de glucano (Goffin y Ghuysen, 1998; GLMS Lglutamina

MurC UDPMurNAc + LAla + ATP UDPMurNAcLAla + ADP + Pi

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