Efecto Citotóxico y Antibacteriano de Un Colutorio de Propóleo Rojo, Con o Sin Flúor, Sobre El Crecimiento de Una Biopelícula Cariogénica PDF

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Efecto citotóxico y antibacteriano de un colutorio de propóleo rojo, con o
T
sin flúor, sobre el crecimiento de una biopelícula cariogénica
mariana leonel martina , Amanda Souza Nunes Monteiroa, Juli Emily Costa Guimaraesa,
María Bárbara de Carvalho Torres Guimarãesa, Rafael Ferreira da Silvab, Lúcio Mendes Cabralb,
Adriana Farahc , Juliana de Paulac, María Teresa Villela Romanosd, Luciana Cople Maiaa,
Yuri Wanderley Cavalcantie, Andrea FonsecaGonçalvesa,
a
Departamento de Odontopediatría y Ortodoncia, Facultad de Odontología, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
b
Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
C
Instituto de Nutrición, Universidad Federal de Río de Janeiro, RJ, Brasil
d
Instituto de Microbiología, Departamento de Virología, Universidad Federal de Río de Janeiro, RJ, Brasil
mi
Departamento de Odontología Clínica y Social, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brasil
INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO
Palabras clave: Objetivo: Evaluar in vitro la actividad antibacteriana, el efecto antibiopelícula y el potencial citotóxico de enjuagues bucales que
Agentes antibacterianos contienen propóleo rojo brasileño con o sin flúor.
Propóleos Métodos: Se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias y bactericidas (MIC y MBC) contra S. mutans, S. san guinis,
Enjuagues bucales
S. salivarius y L. casei para enjuagues bucales RPE. Se formó un biofilm cariogénico con las bacterias antes mencionadas sobre
biopelículas
discos de membrana de celulosa (N = 30, 13 mm), los cuales fueron sometidos durante 1 min a los siguientes enjuagues: base de
enjuague simple; NaF al 0,05 %; 0,8 % EPR; 0,8% RPE + 0,05% NaF y 0,12% clorhexidina (CHX). Se midió la viabilidad bacteriana
y la producción de polisacáridos extracelulares (EPS). También se evaluó el potencial citotóxico de los colutorios. Para la viabilidad
bacteriana y la producción de EPS, se realizaron pruebas de MannWithney y ANOVA unidireccional seguidas de Tukey, con
resultados considerados significativos cuando p ≤ 0.05.
Resultados: los valores de CIM y CBM de los enjuagues bucales RPE variaron de 7,44 a 29,76 mg/mL y de 7,44 a ≥59,52 mg/mL,
respectivamente, presentando una mejor acción contra S. salivarius. Los enjuagues bucales RPE mostraron un 44% de células
viables después de 1 min de contacto con los fibroblastos. RPE (7,74) tuvo la mayor reducción de microorganismos totales viables
y no difirió de RPE + NaF (7,95) (p = 0,292). CHX (7,54) fue el más eficaz en la reducción de Streptococcus spp, pero no difirió de
RPE (p = 0,521) y RPE + NaF (p = 0,238). No hubo diferencia entre los tratamientos en cuanto a la producción de EPS.
Conclusión: RPE y enjuague bucal RPE + NaF mostraron actividad antibacteriana, nivel de toxicidad y efecto antibiopelícula
similares en comparación con CHX.
1. Introducción Silva et al., 2013; Takahashi y Nyvad, 2011). Streptococcus spp. son los principales
responsables de la fase inicial de la lesión de caries, mientras que Lactobacillus spp. están
La formación de biopelículas cariogénicas es un proceso dinámico, en el que la más involucrados con la progresión de la caries (Brambilla et al., 1999). Los productos con
producción de una matriz rica en exopolisacáridos derivados de bacterias acidogénicas y actividad antibacteriana, como los enjuagues bucales, se pueden utilizar como complemento
ácidas, especialmente del grupo Streptococci mutans, Lactobacillus spp., Actinomyces spp. de las medidas de higiene bucal debido a su capacidad para controlar la formación de
y Bifidobacterium spp. (bueno biopelículas (De Luca et al., 2017).
Abreviaturas: RPE, extracto etanólico de propóleo rojo; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; MIC, concentración inhibitoria mínima; CBM, concentración bactericida mínima; NaF,
fluoruro de sodio; CHX, clorhexidina; GC: control de crecimiento; EPS, polisacárido extracelular; EDTA, ácido etilendiaminotetraacético; SEPS, polisacáridos extracelulares solubles; IEPS,
polisacáridos extracelulares insolubles; CGA, ácidos clorogénicos; diCQA, ácidos dicafeoilquínicos; FQA, ácidos feruloilquínicos; CQA, ácidos cafeoilquínicos
Autor para correspondencia en: 325 – Cidade Universitária, CEP: 21941971, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Correo electrónico: andrea.goncalves@odonto.ufrj.br (A. FonsecaGonçalves).
https://doi.org/10.1016/j.archoralbio.2019.104512 Recibido el
14 de enero de 2019; Recibido en forma revisada el 27 de julio de 2019; Aceptado el 29 de julio de 2019
00039969/ © 2019 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
ML Martins, et al. Archivos de biología oral 107 (2019) 104512
Sustancias como la clorhexidina y el flúor han sido ampliamente estudiadas en el El contenido de ácidos cafeico, ferúlico, pcumárico, benzoico, pOHbenzoico
control del biofilm y la prevención de caries (Alves, Silva, Silva, Medeiros, & Valença, sinápico, así como clorogénico (3cafeoilquínico, 4cafeoilquínico, 5cafeoilquínico, 5
2010; Villa et al., 2018). Sin embargo, la clorhexidina puede presentar potencial feruloilquínico, 3,4dica feoilquínico,
4feruloilquínico,
3,4dica feoilquínico,
dicafeoilquínico
3 ,5dicafeoilquínico,
ácidos numeración
IUPAC)
4,5
citotóxico y efectos adversos cuando se utiliza durante un tiempo prolongado (Varoni, fueron investigados por HPLCDADsistema de gradiente de fase inversa, según
Tarce, Lodi, & Carrassi, 2012). Por lo tanto, un número creciente de estudios sugieren Farah, dePaulis, Trugo y Martin (2005) y Farah, dePaulis, Moreira, Trugo, y Martin
el uso de productos naturales que contienen varias sustancias con actividad (2006), utilizando una columna Magic C30 (150 × 2 mm, 5 μm, 100 Å, Michrom
antibacteriana para el control de biopelículas cariogénicas (Antonio et al., 2011; Bueno Bioresources, Inc., Auburn, CA, EE. UU.) mantenida a una temperatura constante de
Silva et al., 2013; BuenoSilva, Marsola, Ikegaki , Alencar, & Rosalen, 2016; Cardoso 40 °C y metanol y 0,3 % ácido fórmico acuoso como fases móviles. DAD se fijó en
et al., 2016; Freires, Queiroz et al., 2016; Malhotra, Rao, Acharya, & Vasudev, 2011; 280 nm para ácidos fenólicos y 325 nm para ácidos clorogénicos. La identificación se
Martins et al., 2018; Meckelburg et al., 2014; Tiveron et al., 2016). basó en espectros UV y estándares. Los estándares para ácidos fenólicos y ácido 5
cafeoilquínico fueron de SIGMAAldrich, Alemania. Los ácidos dicafeoilquínicos eran
de Roth, Alemania. Los estándares de los ácidos cafeoilquínicos y feruloilquínicos
Entre los productos antibacterianos naturales de origen vegetal, el propóleo es restantes se prepararon mediante alcalinización de sus lactonas (Farah et al., 2005).
un material resinoso producido por las abejas a partir de brotes, cortezas y exudados La cuantificación de ácidos fenólicos y ácido 5cafeoilquínico se realizó en base a la
de plantas para proteger la colmena de invasores y del frío. Tiene una composición curva estándar externa de los respectivos estándares. La cuantificación de los ácidos
química variable, principalmente según la biodiversidad de la región en la que se clorogénicos restantes se realizó con base en la curva estándar externa del ácido 5
recolecta y también según la época del año, pero a pesar de esta variabilidad se cafeoilquínico, asociada a los respectivos coeficientes de extinción molar (Farah et
mantienen sus características funcionales ( Freires, Alencar, & Rosalen, 2016; Veloz al., 2005).
et al. ., 2015). Debido a esta gran biodiversidad, los propóleos brasileños se pueden
clasificar en diferentes tipos, incluidos los propóleos marrones, verdes y rojos, según
su origen botánico (Machado et al., 2016). El propóleo rojo es típico de las regiones
de manglar, teniendo como principal origen botánico Dalbergia ecastophyllum El pH se midió con un pHmetro (DM20 Digitalizado, Santo Amparo, SP, Brasil).
(Daugsch, Moraes, Fort, & Park, 2008). Presenta varias propiedades biológicas, como Los sólidos solubles totales se determinaron utilizando un refractómetro digital
actividad antimicrobiana, antiinflamatoria, antioxidante y anticancerígena (Freires, (ATAGO®, PAL1, Japón) y los resultados se expresaron en ºBrix.
Alencar et al., 2016).
Aunque los fitoterapéuticos a menudo se consideran de bajo costo y con efectos
secundarios reducidos en comparación con otros medicamentos, es necesario evaluar 2.2. Composición de las soluciones de enjuague bucal
su eficacia, eficiencia y eficacia (Freires, Alencar et al., 2016; Jeon, Rosalen, Falsetta
y Koo, 2011). Se ha sugerido que el efecto cariostático del propóleo rojo puede La base del enjuague bucal fue la misma que para todos los grupos de tratamiento
potenciarse cuando se asocia con productos fluorados debido a su acción para reducir y se compuso de acuerdo con Zanin et al. (2007), con las siguientes modificaciones:
la desmineralización y aumentar la remineralización (BuenoSilva et al., 2013; Koo et benzoato de sodio (0,1%), sacarina (0,75%), propilenglicol (15,0%), EDTA disódico
al., 2005). Sin embargo, se necesita más evidencia para verificar esta hipótesis. (0,05%), poloxámero 407 (0,5%) y agua cs (100,0 mL). Se añadió una solución de
hidróxido de sodio al 20% en cantidad suficiente para lograr un pH de aproximadamente
Además, el efecto antibacteriano después de la asociación con flúor no fue evaluado 6,36,6. Se prepararon las siguientes soluciones de enjuague bucal para los
en estos estudios. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar in vitro los tratamientos: (1) base de enjuague bucal simple; (2) 0,05 % de fluoruro de sodio
efectos antibacterianos y antibiofilm, así como el potencial citotóxico de un colutorio (NaF) en la base del enjuague bucal; (3) 0,8% RPE en base de enjuague bucal; (4)
de propóleo rojo, cuando se asocia o 0,8% RPE + 0,05% NaF en base de enjuague bucal. Para el tratamiento estándar de
no con flúor. oro (5), se utilizó clorhexidina (CHX) al 0,12% comercial.
2. Materiales y métodos Para las soluciones, se añadió el 30% de RPE a la base del enjuague bucal para
obtener una concentración final de 0,8% de RPE. Esta concentración fue de
2.1. Preparación y caracterización del extracto de propóleo rojo determinado en base a ensayos antimicrobianos preliminares (Martins et al., 2019).
Se añadió fluoruro de sodio a la base del enjuague bucal para obtener una
El material crudo de propóleo rojo se recolectó en la temporada de verano concentración final de NaF de 0,05%, que es la concentración que se encuentra en
(diciembre de 2015) de la vegetación de la marisma de Magé en el estado de Río de los enjuagues bucales comerciales. Un colutorio de clorhexidina (CHX) al 0,12 %
Janeiro, Brasil (latitud 22° 39′ 10″ S, longitud 43° 02′ 26″ O y 5 m de altitud). ). El estaba disponible comercialmente (Noplak™, Daut Laboratory, Río de Janeiro, Río
extracto se produjo mediante maceración durante 70 días, sometido a filtración para de Janeiro, Brasil) (tratamiento 5).
dar 30% de masa sólida; es decir, 30 g de propóleo crudo para 70 mL de líquido
extractivo (80% de etanol). La mezcla se calentó a 60 °C durante 30 min con agitación.
Luego, se filtró en papel Watman número 2 y se centrifugó a 7500 g por 10 min para 2.3. Cepa bacteriana y preparación de inóculo para la evaluación de la actividad
producir el extracto etanólico (EPR) de propóleo rojo al 30% (Cardoso et al., 2016). antimicrobiana
Se reactivaron cepas de referencia de Streptococcus mutans (ATCC 25175),
Los polifenoles totales en el RPE se midieron mediante un ensayo colorimétrico Streptococcus sanguinis (ATCC 10556), Streptococcus salivarius (ATCC 7073) y
utilizando el método de FolinCiocalteu (Singleton, Orthofer, & Lamuela Raventos, Lactobacillus casei (ATCC 393) a partir de sus cultivos originales en medio de agar
1999), con modificaciones. RPE se diluyó 1:10 en agua destilada; luego se mezclaron Brain Heart Infusion (agar BHI) (Difco™, São Paulo, São Paulo, Brasil) durante 48 h
30 μL de esta dilución con 120 μL de agua destilada, 75 μL de reactivo de Folin a 37 °C, con 5% de CO2.
Ciocalteu (Merck, Alemania) y 75 μL de carbonato de sodio al 20% (p/v). La Después de este período, se recolectó un asa llena de colonias bacterianas y se
absorbancia se midió a 280 nm (UV1800), después de 30 min de incubación a suspendió en 25 ml de medio de caldo BHI (Difco™). La absorbancia de 0,18 se fijó
temperatura ambiente. La concentración de polifenoles se calculó mediante una curva en un espectrofotómetro bajo una longitud de onda de 625 nm, para obtener una
de calibración y se expresó en mg/ml de ácido gálico equivalente. densidad celular equivalente a 1,0 × 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por
mililitro (UFC/mL) (Cardoso et al., 2016; Da Cunha et al. , 2013).
2
2.4. Determinación de la actividad antimicrobiana de los enjuagues bucales soluciones en comparación con el producto disponible comercialmente (0,12% CHX).
Para evaluar la actividad antimicrobiana de los enjuagues bucales se utilizaron la
Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) y la Concentración Mínima Bactericida (MBC), de 2.6. Formación y tratamiento de biopelículas.
acuerdo con el protocolo de referencia del Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI
M100 S22 (CLSI, 2012), con una modificación propuesta por Da Cunha et al. (2013). 2.6.1. Ensayos antimicrobianos con una biopelícula mixta de S. mutans, S. sanguinis, S.
salivarius y L. casei
El dibujo esquemático del modelo experimental con biopelícula cariogénica se representa
Para evaluar la CIM se utilizaron placas de microtitulación de 96 pocillos (ALAMAR™, en la Fig. 1. Se colocaron discos de membrana de celulosa (13 mm de diámetro, N = 24)
Diadema, São Paulo, Brasil). Inicialmente, se colocaron en los pozos 100 μL de caldo Brain (Millipore) en placas de Petri con agar BHI y se usaron para la formación de biopelículas mixtas.
Heart Infusion (BHI) (Difco™, São Paulo, São Paulo, Brasil). A continuación, se colocaron 100 de S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius y L. casei. El inóculo de cada microorganismo se
μL de los enjuagues bucales con o sin RPE al 25 % y con o sin NaF al 1,56 % en la primera estandarizó a una concentración de 1 × 107 UFC/mL (0,1 de absorción bajo una longitud de
columna de la placa de 96 pocillos. Luego, los enjuagues bucales se diluyeron en serie onda de 625 nm). Se colocó una suspensión mixta microbiana (20 μL) compuesta por S. mutans,
transfiriendo 100 μL del contenido del pocillo más concentrado al menos concentrado (Cardoso S. sanguinis, S. salivarius y L. casei en discos de membrana de 0,22 mm sobre placas de agar
et al., 2016; Da Cunha et al., 2013). BHI.
Después de la dilución, se dispensaron 100 μL del contenido de la última columna para igualar El sistema se incubó en condiciones microaerófilas durante 24 h a 37 °C en una estufa
el volumen de todos los pocillos. Finalmente, se introdujeron 5 μL del inóculo bacteriano (5 × microbiológica. Después de este período, los discos fueron colectados y colocados por 1 min en
105 UFC/mL) en cada pocillo y los colutorios presentaron una concentración final de RPE que microtubos que contenían 1 mL de las mismas soluciones (enjuagues bucales) utilizadas para
varió de 119,047 a 0,058 mg/mL y/o concentración final de NaF que varió de 7,440 a 0,0036 mg / la evaluación del potencial de citotoxicidad y presentadas anteriormente. No se trató el control
mL. del crecimiento. La concentración de RPE en enjuagues bucales se determinó después de las
pruebas MIC y MBC. A continuación, los discos se transfirieron a microtubos que contenían 1 ml
Para validar la metodología utilizada en este estudio, utilizamos un control antimicrobiano de solución salina (0,85 % NaCl) y se agitaron durante 1 min (60 Hz) en un vortex (Biomixer™
(CHX 0,12%); un control de crecimiento (suspensión microbiana en desarrollo, sin adición de VTX2500). Luego se realizaron diluciones en serie (101 a 106) para evaluar la viabilidad
antimicrobianos); y un control de esterilidad (medio de cultivo estéril, sin adición de microbiana (UFC/mL).
antimicrobianos ni microorganismos). Las placas preparadas se incubaron durante 24 h a 37 °C,
con 5 % de CO2 (Cardoso et al., 2016; Martins et al., 2018). Luego de esto, se evaluó la Para el conteo de microorganismos viables se utilizó la técnica de esparcimiento por
viabilidad de los microorganismos mediante el método de reducción de sal de resazurina (Martins duplicado en la que se colocaron 50 μL de cada dilución en placas petri de agar mitis salivarius
et al., 2018; Sarker, Nahar, & Kumarasamy, 2007). La MIC se consideró entonces como la (MSA) (Difco™, New Jersey, EE. UU.) y agar rogosa (Difco™, New Jersey, EE. UU.) . Las
concentración más baja a la que no se detectó el crecimiento bacteriano. placas se incubaron en microaerofilia durante 48 h, a 37 °C, para el conteo de Streptococcus
spp. y Lactobacillus casei y los recuentos se expresaron en UFC/mg de biopelícula (Cardoso et
al., 2016).
La Concentración Bactericida Mínima (MBC) se obtuvo subcultivando (20 μL, por triplicado)
las diluciones de los enjuagues bucales correspondientes a la MIC y dos concentraciones
inmediatamente anteriores en placas de agar BHI. La concentración más baja de las sustancias 2.6.2. Cuantificación de polisacáridos extracelulares solubles e insolubles en biopelícula La
que impidieron el crecimiento visible del subcultivo o la formación de hasta tres Unidades suspensión de microorganismos restante (0,9 ml) se utilizó para la cuantificación de polisacáridos
Formadoras de Colonias (UFC) se consideró como CBM (Pozzatti et al., 2009). Las extracelulares, según Aires et al. (2008) con modificaciones. Para ello, los microtubos se
concentraciones en las que se formaron más de tres UFC se consideraron únicamente centrifugaron a 3000 g durante 5 min. El sobrenadante se utilizó para determinar los polisacáridos
inhibidoras del crecimiento microbiano. Todas las pruebas fueron realizadas por triplicado. extracelulares solubles (SEPS), mientras que el precipitado del biofilm se utilizó para determinar
los polisacáridos extracelulares insolubles (IEPS).
2.5. Potencial de citotoxicidad de los enjuagues bucales El sobrenadante del biofilm se transfirió a tubos nuevos que contenían volúmenes iguales
de etanol al 99 % para precipitar SEPS y luego se almacenaron a 6 °C durante 1 h. El
El potencial citotóxico de los enjuagues bucales se evaluó mediante la técnica de absorción precipitado de biopelícula se trató con 0,5 ml de NaOH 1 M y se mantuvo en agitación durante 5
de tinte, según Borenfreund y Puerner (1985). min para extraer el IEPS. A continuación, los tubos se centrifugaron a 3000 g durante 5 min y
Se probaron microplacas de 96 pocillos de poliestireno con monocapas de células de fibroblastos los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos que contenían 0,6 ml de etanol al 99 %. El
L929 (ATCC CCL1 NCTC) confluentes frente a las siguientes soluciones (enjuagues bucales): sedimento restante se solubilizó nuevamente en 0,1 ml de NaOH 1 M, se centrifugó, se recogió
(1) base de enjuague bucal simple, (2) 0,05 % de NaF en base de enjuague bucal, (3) 0,8 % y luego se almacenó a 6 °C durante 1 hora. Después de este paso, se descartó el tubo con el
RPE en base de enjuague bucal; (4) 0,8 % RPE + 0,05 % NaF en base de enjuague bucal; y (5) sedimento. La precipitación de SEPS e IEPS se cuantificó por centrifugación a 3000 g durante 5
enjuague bucal CHX al 0,12%. min y se descartó el sobrenadante.
Como diluyente (medio de mantenimiento celular) se utilizó medio de cultivo DMEM (Dulbecco
Modified Eagle's Medium Cultilab, Campinas, Sao Paulo, Brasil) y las placas se incubaron a 37 Luego se realizó la dosificación de polisacáridos por el método del fenol sulfúrico (Dubois,
°C durante 1, 3 y 5 min con 5% de CO2 . En el presente estudio se utilizaron células L929 ya Gilles, Hamilton, Rebers, & Smith, 1956). El conteo de UFC/mL se utilizó como factor de
que son las recomendadas para el estudio de toxicidad de biomateriales (ISO 109935). corrección de los resultados.
La viabilidad celular se midió utilizando un espectrofotómetro (BioTek, modelo Elx800, 2.7. análisis estadístico
Winooski, EE. UU.) a una longitud de onda de 492 nm. El porcentaje de células viables de cada
solución ensayada se obtuvo mediante valores de densidad óptica. También se investigaron Los análisis de datos descriptivos e inferenciales se llevaron a cabo en el software SPSS
controles de glóbulos blancos (pocillos con células L929 no tratadas) y una reacción de control versión 21 (IBM, Chicago, IL Licencia de la Universidad de Cardiff, Reino Unido). La normalidad
(Tween 20 al 1 %). de los datos se verificó mediante la prueba de ShapiroWilk. Se utilizó la prueba de Mann
Suponiendo que el control medio de glóbulos blancos era equivalente al 100 % de células Whitney para comparar la viabilidad microbiana y, para la producción de polisacáridos
viables, era posible obtener el potencial tóxico de las células analizadas. extracelulares, en función de la
3
Figura 1. Dibujo esquemático del modelo experimental con biofilm mixto de S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius y L. casei realizado con discos de celulosa.
tratamientos (colutorio de propóleos y controles), se utilizó la prueba de ANOVA de una vía La concentración total de CGA ha aumentado ligeramente (2,7%), aunque se ha producido un
seguida de la prueba de Tukey. Todas las pruebas se realizaron con un nivel de significación gran cambio en el perfil individual, con descenso de CQA (83%) y FQA (70%) y aumento de
del 5% (α ≤ 0,05). diCQA (43%). Se observó una reducción del 12,3% en la concentración de ácidos fenólicos,
pero con incrementos del 5% y 16% en ácido cafeico y ácido pOH benzoico, respectivamente.
3. Resultados La concentración de compuestos fenólicos totales, incluidos los compuestos fenólicos libres y
combinados, no cambió.
3.1. Análisis químico
RPE presentó pH 4.8 y 23.6°Brix. La solución RPE + NaF presentó pH 6,6. La
concentración de compuestos fenólicos totales fue de 6,37 ± 2,1 mg de ácido gálico equivalente/ 3.2. Actividad antibacteriana de los enjuagues bucales
mL. Las concentraciones de ácidos clorogénicos (CGA) en RPE y RPE + NaF se presentan en
la Tabla 1 y el cromatograma se presenta en la Fig. 2. Las concentraciones de compuestos Los valores de MIC de los enjuagues bucales RPE y RPE + NaF variaron de 7,44 (0,74
CGA individuales en RPE variaron de 0,39 a 65,80 μg/mL y totalizaron 136,09 μg/mL. %) a 29,76 mg/mL (2,97 %), mientras que MBC varió de 7,44 (0,74 %) a > 29,76 mg/mL (>
2,97 %), variando con la cepas probadas.
En general, los isómeros de ácidos dicafeoilquínicos (diCQA) fueron los AGC más abundantes, Los valores más bajos de MIC (7,44 mg/mL) y MBC (7,44 mg/mL) se observaron para S.
seguidos de los ácidos feruloilquínicos (FQA) y los ácidos cafeoilquínicos (CQA). Entre los salivarius. CHX, el estándar de oro, presentó MIC ≥ 0,00002 mg/mL (≥0,000002%) y MBC ≥
ácidos fenólicos libres identificados en RPE, el ácido pcoumaric (74,6 μg/mL) presentó la 0,0009 mg/mL (≥0,00009%) para los microorganismos probados, exhibiendo una mejor
mayor concentración. Los ácidos fenólicos totalizaron 157,8 μg/mL. Cuando el RPE se combinó actividad antibacteriana en comparación con otros enjuagues bucales (Tabla 2 ) .
con una solución de NaF,
4
Cuadro 1 no difiere del RPE + NaF (7,95) (p = 0,292) (fig. 3A). CHX (7,93) difirió de RPE (p = 0,000),
Contenido de compuestos fenólicos en el extracto etanólico (RPE) de propóleo rojo con o sin flúor pero no fue estadísticamente diferente de RPE + NaF (p = 0,447). El enjuague bucal simple
(NaF) utilizado para la preparación de colutorios. no redujo la viabilidad de los microorganismos en el biofilm, al igual que el control de
EPR EPR + NaF crecimiento (p = 0,485). CHX (7,54) fue el más efectivo en la reducción de Streptococcus spp.,

compuesto fenólico
Ácidos clorogénicos μg/ml ± DE μg/ml ± DE pero no difirió de RPE (p = 0,521) y RPE + NaF (p = 0,238) (Fig. 3B).
3 CQA 0,39 ± 0,01 1,44 ± 0,02

4 CQA 8,00 ± 0,01 2,56 ± 0,03
5 CQA 6,11 ± 0,01 1,80 ± 0,04
4 FQA 17,80 ± 0,10 1,00 ± 0,12
3.5. Producción de polisacáridos extracelulares solubles e insolubles (SEPS e IEPS) después
5 FQA 14,41 ± 0,10 4,40 ± 0,12
de la aplicación de enjuague bucal
3,4 diCQA 13,36 ± 0,10 20,18 ± 1,29
3,5 diCQA 65,80 ± 0,08 87,20 ± 1,66
4,5 diCQA 10,20 ± 0,07 21,22 ± 1,43 Todos los grupos experimentales resultaron en SEPS similares en el biofilm formado,
CCA total 14,50 ± 3,23 5,80 ± 0,46 donde el control de crecimiento (4.59) fue el grupo con mayor producción de SEPS y ambos
Total de CCA 32,21 ± 1,69 5,40 ± 1,70
grupos RPE exhibieron valores iguales (4.32) (Fig. 4 ) .
Total dicQA 89,36 ± 25,49 128,60 ± 31,35
Los grupos CHX al 0,12% (6,47) y control de crecimiento (5,00) produjeron aparentemente la
Ácidos clorogénicos totales 136,09 ± 0,34 139,80 ± 0,28
ácido cafeico 1,02 ± 0,003 1,08 ± 0,01 mayor cantidad de IEPS, aunque no hubo diferencia con los demás grupos (fig. 5).
Ácido benzoico 17,58 ± 0,01 16,40 ± 0,02
Ácido ferúlico 16,62 ± 0,02 12,42 ± 0,04
Ácido sinápico 30,40 ± 0,03 24,38 ± 0,06
74,60 ± 0,06 63,24 ± 0,04 4. Discusión
ácido pcumárico
Ácido pOH benzoico 17,58 ± 0,027 20,92 ± 0,03
Los ácidos clorogénicos son algunos de los principales compuestos fenólicos típicos del
Los resultados se muestran como la media de análisis por triplicado, expresados en μg/mL.
propóleo brasileño. El perfil CGA con mayor concentración de diCQA y ácido pcumárico es
CQA = ácidos cafeoilquínicos; FQA = ácidos feruloilquínicos; diCQA = ácidos dicafeoilquínicos.
típico de la mayoría de los propóleos de la selva tropical atlántica brasileña, incluido el propóleo
DE = Desviación estándar. rojo (Pereira, Farah, de Miranda, Trugo y Aquino Neto, 2003). Todos los ácidos CGA y
fenólicos identificados en el análisis químico del presente estudio se han encontrado
previamente en diferentes tipos de propóleos brasileños: CQA (Coelho, Falcão, Vale, Almeida
3.3. Potencial citotóxico de los enjuagues bucales
Muradian, & VilasBoas, 2017), diCQA (Coelho et al. ., 2017), ácido cafeico (Coelho et al.,
2017; De Mendonça et al., 2015; Freires, Queiroz et al., 2016), ácidos benzoico y pOH
Los enjuagues bucales RPE (con o sin fluoruro) exhibieron una viabilidad de células L929
benzoico (Freires, Queiroz et al., 2016) , ácido ferúlico (BuenoSilva et al., 2016; Coelho et al.,
que variaba de 44.5 a 35.5%. El RPE al 0,8% presentó valores similares al CHX al 0,12%. El
2017; De Mendonça et al., 2015) y ácido pcumárico (Coelho et al., 2017; De Mendonça et al.,
enjuague bucal NaF al 0,05% presentó el potencial citotóxico más bajo, con una viabilidad
2015; Freires , Queiroz et al., 2016; Martins et al., 2018). La presencia de estos compuestos
celular que varió del 80,0% al 72,0% después de 1, 3 y 5 min de contacto (Tabla 3).
fenólicos en el propóleo determina su potencial antimicrobiano, antiinflamatorio, antioxidante,
entre otras propiedades biológicas (Freires, Alencar et al., 2016). En estos estudios, la
identificación de compuestos fenólicos fue variable debido a las diferencias en las
3.4. Actividad antimicrobiana de los enjuagues bucales composiciones químicas de los distintos tipos de
La cantidad más baja de microorganismos totales viables remanentes (Log10UFC/mL) se
observó en el enjuague bucal RPE (7.74), que no
Fig. 2. Cromatograma de fase reversa HPLCDAD para la cuantificación de ácidos clorogénicos y ácidos fenólicos en el extracto de propóleo rojo brasileño. CQA ácidos cafeoilquínicos; FQA – ácidos feruloilquínicos;
Ácidos diCQAdicafeoilquínicos.
5
Tabla 2
Concentración Mínima Inhibitoria y Bactericida (mg/mL) de los enjuagues bucales frente a S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius y L. casei.
microorganismos [Enjuague bucal simple] [NaF] [EPR] [RPE] en RPE + NaF [CHX]
MICRÓFONO CMB MICRÓFONO CMB MICRÓFONO CMB MICRÓFONO CMB MICRÓFONO CMB
S. mutans 238.09 > 476.19 1.86 > 7.44 7.44 > 29.76 7.44 > 29.76 ≤0.00002 0.0009
S. sanguinis 238.09 > 476.19 3.72 > 7.44 7.44 > 29.76 7.44 > 29.76 0.00095 0.0038
S. salivarius 238.09 > 476.19 0,93 > 3,72 7.44 7.44 7.44 7.44 0.00857 0.0171
L. caseí 476.19 > 476.19 1.86 > 7.44 29.76 59.52 29.76 59.52 0.00857 0.0171
Tabla 3
Potencial citotóxico de colutorios en fibroblastos orales por porcentaje de células
viables.
Enjuagues bucales % células viables
1 minuto 3 minutos 5 minutos
Base de enjuague bucal simple 76.0 74.5 72.5

NaF al 0,05 % 77.0 72.0 80.0
0,8 % EPR 44.0 44.0 44.5
0,8% RPE + 0,05% NaF 44.0 39.0 35.5
0.12% CHX 45,0 46.5 47.0
Fig. 4. Producción de Polisacárido Extracelular Soluble (SEPS) por los biofilms
remanentes de S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius y L. casei (μgSEPS/log10UFC),
según el tipo de tratamiento realizado. Las barras indican los valores medios con
los respectivos errores estándar. No se observó diferencia entre los grupos (p >
0,05).
Fig. 5. Producción de Polisacárido Extracelular Insoluble (IEPS) por los biofilms
remanentes de S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius y L. casei (μgIEPS/ log10UFC),
según el tipo de tratamiento realizado. Las barras indican los valores medios con
los respectivos errores estándar. No se observó diferencia entre los grupos (p >
0,05).
materiales que dieron origen a los diversos tipos de propóleos, confiriendo
diferentes potenciales antibacterianos a estos productos (Freires, Alencar et al.,
2016; Veloz et al., 2015). Además, la temporada en que se recolecta el material
contribuye a tales diferencias.
Fig. 3. Viabilidad bacteriana (log10UFC/mL) del biofilm cariogénico de S. mutans, A pesar del gran cambio que se produjo en el perfil de CGA cuando se
S. sanguinis, S. salivarius y L. casei formado durante 24 h y sometido a un único añadió solución de NaF al RPE, la concentración final de CGA total no cambió
tratamiento. Los datos se transformaron logarítmicamente. Letras diferentes indican significativamente. Con respecto a los compuestos de monoacilo, los ácidos
diferencias estadísticas significativas entre grupos (p < 0,05, prueba de Mann orgánicos son más estables en medios protonizados (pH bajo) y el aumento del
Whitney). Las barras indican el rango intercuartílico. La mediana está marcada por
pH (en este caso a 6,6) probablemente desestabilizó los ácidos, lo que provocó
una línea horizontal dentro de la caja. Whisker indica variabilidad fuera de los
la degradación indicada por aumentos del 5 % y 16 % en los ácidos cafeico y p
cuartiles superior e inferior. Los asteriscos (*) y los puntos trazados por separado
son los valores atípicos. OH benzoico . concentración, respectivamente, como productos de degradación.
Además de la degradación, considerando que el fluoruro ha quelado previamente otros
6
sustancias que incluyen polifenoles (Peng et al., 2017), la asociación de CGA y NaF una acción antimicrobiana efectiva contra S. mutans, pero aún menor que un
podría haber llevado a la eliminación de CGA. Otro cambio en el perfil de ácidos enjuague bucal con CHX y sin ninguna ventaja adicional cuando se asocia con NaF
clorogénicos está relacionado con los diCQA que son más estables y cuyas al 0,2% (Malhotra et al., 2011). Estos resultados corroboran en parte los encontrados
concentraciones aumentan considerablemente cuando se asocia RPE con solución en el presente estudio, ya que no hubo un efecto antimicrobiano adicional cuando
de NaF. Una posible explicación podría ser la presencia de ácidos dicafeoilquínicos se asociaron RPE y NaF, pero en el presente estudio, los enjuagues bucales a base
unidos a otras sustancias en el RPE que se liberaron cuando el pH aumentó de 4,8 de propóleos tuvieron un efecto comparable a CHX. Un estudio de validación del
a 6,6. Se necesitan más pruebas químicas para probar estas hipótesis. Se modelo de biopelícula in vitro también mostró que un grupo tratado con NaF al
desconoce cómo cada uno de estos cambios afectaría los efectos antimicrobiano y 0,05% no presentó diferencia en comparación con el grupo control de crecimiento
antidesmineralizante/remineralizante del enjuague bucal, pero el enjuague bucal (CcahuanaVásquez & Cury, 2010), de manera similar a lo observado en una
combinado de RPE y NaF no afectó la concentración total de compuestos fenólicos investigación previa de nuestro grupo de estudio ( Martins et al., 2018). Sin embargo,
y tuvo un efecto similar en la reducción de microorganismos viables en comparación se sabe que el flúor puede presentar un efecto adicional en el proceso de caries
al enjuague bucal RPE. debido a su propiedad de interferir en la remineralización (BuenoSilva et al., 2013;
Koo et al., 2005), pero dado que este análisis no se incluyó en el presente estudio,
La MIC y MBC del RPE contra S. mutans fue superior a los encontrados se necesita más investigación al respecto.
previamente para otro extracto de propóleo rojo que exhibió MIC y MBC iguales a
0.29 mg/mL y 1.17 mg/mL, respectivamente (Martins et al., 2018). La actividad Anteriormente, un dentífrico a base de propóleos (Mohsin, Manohar, Rajesh y
antibacteriana de otro propóleo rojo brasileño, recolectado durante un año, contra Asif, 2015) condujo a una reducción de la carga microbiana in vivo, especialmente
S. mutans, varió de 0,006 a 0,250 mg/mL (MIC) y de 0,125 a 1,00 mg/mL (MBC) contra Streptococcus mutans en la cavidad oral de pacientes jóvenes. Considerando
(BuenoSilva et al., 2016 ). Por lo tanto, estos hallazgos confirman que los propóleos el potencial anticaries del flúor, que actúa para reducir la desmineralización y
del mismo tipo, cuando se recolectan en diferentes estaciones del año y en aumentar la remineralización, se sugiere que su asociación con productos
diferentes regiones, pueden presentar una actividad antibacteriana variable. antimicrobianos naturales, como el propóleo rojo, puede potenciar el efecto
cariostático del flúor (BuenoSilva et al., 2013) . ; Koo et al., 2005). En un estudio
Un estudio previo (Martins et al., 2018) evaluó un extracto de propóleo rojo al previo (Vanni et al., 2015), un enjuague bucal de propóleo (3,3 %) no logró reducir
1% que era capaz de mantener el 41% de fibroblastos viables tras 1 min de el número de UFC/ml de una biopelícula oral mixta formada sobre discos de
contacto, lo que concuerda con nuestro estudio. En un estudio que probó un hidroxiapatita. Sin embargo, un dentífrico de propóleos (0,3%) (Vanni et al., 2015)
enjuague bucal de propóleos en fibroblastos gingivales humanos, no se detectaron fue capaz de reducir los microorganismos viables del mismo biofilm en una
reacciones citotóxicas en ninguna de las concentraciones probadas (5 %, 2,5 % y concentración más baja, lo que sugiere que los diferentes vehículos y formas de
1,25 %), mientras que la CHX al 0,2 % mostró una citotoxicidad moderada (Ozan et administración del producto resultan en un potencial anticariogénico variable.
al., 2007 ) . Nuestros resultados discrepan en parte con este estudio, ya que los
enjuagues bucales probados en el presente estudio mostraron diferentes niveles de En cuanto a la producción de EPS, en el presente estudio no se observó
citotoxicidad, en los que el RPE (con o sin flúor) mostró una alta citotoxicidad, similar reducción de SEPS o IEPS para ningún tratamiento. Este resultado no concuerda
a CHX al 0,12%, mientras que la base de enjuague bucal simple mostró una con un estudio previo (Veloz et al., 2015) en el que el crecimiento de S. mutans en
reacción citotóxica más baja. Esto se puede atribuir al solvente presente en la la biopelícula formada en bloques de esmalte bovino fue estadísticamente diferente
composición del extracto, ya que usamos etanol para la preparación del extracto de del control de crecimiento cuando se expuso a un desafío cariogénico y se trató con
RPE y no al producto natural en sí. Por otro lado, aunque el agua no ofrecería tal un extracto de propóleo rojo. Los diferentes resultados deben deberse a diferencias
toxicidad, las pruebas preliminares de extracción acuosa dieron como resultado una en las metodologías utilizadas. Los discos de membrana se eligieron para realizar
extracción deficiente de compuestos fenólicos del material resinoso de propóleo. pruebas antimicrobianas iniciales de RPE asociado con NaF. Sin embargo,
Otro extracto de propóleo rojo presentó altos niveles de citotoxicidad en todas las planteamos la hipótesis de que los discos de membrana no permitían la
líneas de células tumorales humanas en comparación con el control negativo estructuración del biofilm para una mayor maduración y producción de polisacáridos
(DMSO) después de 72 h (De Mendonça et al., 2015). Otro estudio (De Luca et al., extracelulares, lo que podría verse como una limitación del estudio. Por lo tanto,
2017) probó un barniz de propóleo rojo, en el que la viabilidad de los fibroblastos para este ensayo se deben utilizar otras metodologías, como pruebas microbiológicas
(alrededor del 75 %) fue similar al patrón oro (Duraphat™) después de 24 h y 48 h. en bloques de esmalte/dentina con biopelículas multiespecies y película salival.
La menor citotoxicidad del barniz puede deberse a la diferente forma de presentación, BuenoSilva et al. (2013) también evaluaron los efectos a corto plazo in vitro e in
es decir, extracto o colutorio. Se sugiere realizar más estudios con diferentes formas vivo de aplicaciones tópicas de fracciones aisladas de propóleo rojo sobre el
de presentación del propóleo, como extracto acuoso, para evaluar el potencial de crecimiento de biopelículas de S. mutans, así como el desarrollo de lesiones
citotoxicidad y efecto antibacteriano. cariosas. Reportaron una disminución de aproximadamente 40% en la producción
de SEPS e IEPS. Sin embargo, los autores no observaron una reducción de la
En cuanto a la viabilidad microbiana, los enjuagues bucales RPE (con o sin viabilidad de las células bacterianas en los grupos de tratamiento. Estos resultados
NaF) probados en el presente estudio mostraron reducción de microorganismos también están en conflicto con los observados en el presente estudio. Todavía en el
totales y Streptococcus spp. viabilidad, pero no difirió en comparación con la base estudio de BuenoSilva et al. (2013), el producto fue probado en ratas y pudo reducir
de enjuague bucal simple. Aunque el propóleo rojo tiende a tener una mejor la incidencia y severidad de la caries. Debido a la divergencia de estos métodos y
propiedad antibacteriana que otros tipos de propóleo (Machado et al., 2016), la resultados, se necesitan más estudios para comprender mejor el mecanismo de
concentración utilizada en el presente estudio, en forma de enjuague bucal, no fue acción de este producto vegetal.
suficiente para reducir la biopelícula formada. Sin embargo, una alta concentración
de una sustancia como los productos naturales puede resultar en citotoxicidad Es importante recalcar que a pesar del potencial antimicrobiano de CHX,
celular (Oliveira Filho et al., 2017). Cabe señalar que las biopelículas se sometieron cuando se usa por un tiempo prolongado, puede causar efectos adversos, como
a un solo tratamiento, durante 1 min. Teniendo en cuenta que el estándar de oro pigmentación dental y pérdida de la sensibilidad gustativa (Varoni et al., 2012). Por
(CHX) no mostró una alta eficacia en comparación con los enjuagues bucales base lo tanto, se deben continuar los estudios con productos naturales y posibles
con y sin NaF, se sugiere que varias aplicaciones pueden conducir a un mejor combinaciones, como RPE y NaF, para desarrollar un producto alternativo para el
control del biofilm. control de biopelículas con efecto antimicrobiano potenciado y efectos adversos
mínimos.
Otros enjuagues bucales de propóleo fabricados en laboratorio han demostrado
7
5. Conclusión De Mendonça, ICG, Porto, ICCM, Nascimento, TG, Souza, NS, Oliveira, JMS, Arruda, RES, et al. (2015).
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EPR EPR + NaF crecimiento (p = 0,485). CHX (7,54) fue el más efectivo en la reducción de Streptococcus spp.,

3 CQA 0,39 ± 0,01 1,44 ± 0,02

microorganismos [Enjuague bucal simple] [NaF] [EPR] [RPE] en RPE + NaF [CHX]

1 minuto 3 minutos 5 minutos

Base de enjuague bucal simple 76.0 74.5 72.5

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EPR EPR + NaF crecimiento (p = 0,485). CHX (7,54) fue el más efectivo en la reducción de Streptococcus spp.,

3­ CQA 0,39 ± 0,01 1,44 ± 0,02

microorganismos [Enjuague bucal simple] [NaF] [EPR] [RPE] en RPE + NaF [CHX]

1 minuto 3 minutos 5 minutos

Base de enjuague bucal simple 76.0 74.5 72.5

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