Respuestas de la planaria de agua dulce Girardia tigrina a un insecticida a base de

fipronil: Supervivencia, comportamiento y parámetros fisiológicos

Eloisa Borges dos Reis 1, Fernanda S. Farnese 1, Marilene S. Oliveira 1, Andreia C. M. Rodrigues 2,
Aline S. P. Dornelas 3, Renato A. Sarmento 4, João C. P. de Souza 1, Erika C. Resende 5 y Althiéris
S. Saraiva 6,*

1 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano—Campus Rio Verde-GO, Rio Verde
75901-970, GO, Brazil

2 CESAM—Centre for Environmental and Marine Studies, Department of Biology, University of

Aveiro, 3810-193 Aveiro, Portugal

3 Programa Nacional de Cooperação Acadêmica na Amazônia, Estagio Pós-Doutoral—

Universidade Federal do Tocantins, Campus Universitário de Gurupi, Gurupi 77402-970, TO,
Brazil

4 Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, Universidade Federal do Tocantins,

Campus Universitário de Gurupi, Gurupi 77402-970, TO, Brazil

5 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano—Campus Iporá-GO, Iporá 76200-

000, GO, Brazil

6 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano—Campus Campos Belos

(Conservation of Agroecosystems and Ecotoxicology—CAE Group), Campos Belos 73840-000,
GO, Brazil

* Correspondencia: althieris.saraiva@ifgoiano.edu.br

Resumen: El fipronil es un insecticida pirazólico utilizado para controlar poblaciones de insectos

indeseables. Debido a su aplicación a gran escala, existe la posibilidad de contaminación de las
aguas superficiales, con acción tóxica para los organismos no objetivo, y el consiguiente impacto
en los ecosistemas acuáticos. Las planarias son invertebrados acuáticos no objetivo potenciales
de estos insecticidas. Están muy extendidos en las aguas dulces tropicales y se han propuesto
como buenos candidatos para evaluar los efectos tóxicos de los sistemas de agua dulce
contaminados por insecticidas. Así, el presente estudio pretende evaluar las concentraciones
subletales de un insecticida a base de fipronil que pueden afectar a la fisiología de las planarias.
Tras la exposición crónica a Regent 800 WG®, se observó una disminución significativa de la
velocidad locomotora (LOEC—6.25 mg·L−1), la regeneración de las aurículas y los fotorreceptores
(LOEC—3.13 mg·L−1) y la reproducción (fecundidad—LOEC 12.5 mg·L−1). Los resultados de
nuestro estudio demuestran que la exposición a largo plazo a un insecticida pirazol puede
comprometer a los invertebrados acuáticos no objetivo, al tiempo que refuerzan la necesidad
de una mejor investigación de los parámetros complementarios (como el comportamiento, la
regeneración y la reproducción) para una evaluación de riesgos más precisa de la toxicidad de
los plaguicidas comerciales en los sistemas de agua dulce.

Palabras clave: reproducción; regeneración; ecosistemas de agua dulce; turbelaria;

exposiciones crónicas
1. Introducción

La industrialización y la modernización de la agricultura han permitido aumentar la

productividad y reducir las pérdidas en el proceso de producción, al tiempo que pueden dar
lugar a un sistema dependiente del uso de plaguicidas [1]. Estos compuestos, especialmente
cuando se utilizan de forma incorrecta y sin el apoyo técnico adecuado, pueden afectar
negativamente a los ecosistemas naturales y a su biodiversidad (agua, suelo, aire y salud
humana) [2-5].

Se ha informado de que numerosos ingredientes activos y metabolitos de plaguicidas

llegan o se han encontrado en ecosistemas de agua dulce, y la toxicidad de estos compuestos
puede afectar a la salud del ecosistema acuático. Por ejemplo, el insecticida fipronil pertenece
al grupo químico de los fenilpirazoles y se utiliza en el sector agrícola para controlar las plagas
de insectos. Los insecticidas a base de fipronil utilizados en la agricultura y la ganadería pueden
llegar a los ecosistemas de agua dulce, y se han registrado concentraciones de hasta 465 µg·L−1
en aguas superficiales [6]. En agricultura, se aplican diferentes dosis de fipronil a distintos
cultivos, como el algodón (48 g de producto compuesto·ha-1), la patata (175 g de producto
compuesto·ha-1), la caña de azúcar (408 g de producto compuesto·ha-1), el maíz (100 g de
producto compuesto·ha-1) y la soja (40 g de producto compuesto·ha-1) [7]. Estas dosis son
considerablemente altas y pueden filtrarse a las aguas superficiales.

Se han desarrollado investigaciones científicas para cuantificar los plaguicidas con

ingredientes activos a base de fipronil en los ecosistemas acuáticos. Algunos estudios informan
de que la elevada toxicidad de los insecticidas a base de fipronil contamina los sistemas acuáticos
y promueve efectos letales y subletales en organismos acuáticos no objetivo, como peces,
reptiles y artrópodos [8,9]. Estos hechos provocan un desequilibrio en estos ecosistemas [10-
12].

El fipronil es un insecticida neurotóxico que actúa causando parálisis y excitación

neuronal, lo que provoca la muerte de los insectos. El compuesto entra en contacto con el
organismo a través de la piel y/o por ingestión. Cuando se une al canal del cloro, este insecticida
impide su activación por el ácido gamma-aminobutírico (GABA) (una sustancia que controla la
entrada de iones cloruro a través de la membrana de las células nerviosas). Cuando no hay
inhibición sináptica, se provoca una hiperexcitación del sistema nervioso central que causa la
muerte del organismo [13]. La toxicidad del fipronil varía de una especie a otra. Varias especies
de peces son bastante sensibles a los efectos del fipronil; por ejemplo, las branquias del pez
blanco del Caspio se ven afectadas por este compuesto [14]. Además, se analizaron cambios en
la fisiología y el comportamiento en Daphnia magna por exposición al fipronil [15]. Además, el
fipronil se acumula en los tejidos de la tilapia del Nilo, lo que provoca toxicidad para las células
y los genes, y mortalidad, lo que caracteriza al compuesto como muy tóxico para esta especie
[16].

Las planarias pertenecen al grupo de los turbelarios y se reproducen tanto asexual como
sexualmente (en algunas especies, la reproducción se produce de ambas formas). Las planarias
de lagos y arroyos tienen una gran capacidad de regeneración. Los turbelarios poseen
características únicas, como un sistema nervioso similar al cerebro de los vertebrados, lo que los
convierte en organismos esenciales para diversas áreas de investigación, debido a los variados
parámetros que pueden evaluarse en respuesta al estrés químico y a la alta sensibilidad a los
compuestos tóxicos [17].
 Las planarias se encuentran de forma natural en diversos entornos de agua dulce (lagos,
arroyos y ríos) que suelen estar situados cerca de zonas agrícolas, y pueden estar expuestas
directamente a insecticidas, además de mostrar sensibilidad a diversos agentes tóxicos [18].
Estos platelmintos desempeñan funciones importantes en las redes tróficas de agua dulce al ser
invertebrados depredadores, así como alimento de otros organismos (presas). Además, las
planarias son organismos fáciles de mantener en el laboratorio, lo que reduce el coste y facilita
la recogida de datos ecotoxicológicos [19]. Debido a estos factores, las planarias se convierten
en candidatos adecuados como organismos de ensayo en ecotoxicología [20,21]. Los estudios
indican que los organismos expuestos a contaminantes han mostrado cambios en el sistema
reproductivo, así como en la fecundidad [22]. En el campo de la ecotoxicología de agua dulce,
las planarias de la especie Girardia tigrina (Paludicola, Dugesiidae) se han utilizado
recientemente como organismos bioindicadores de contaminación ambiental. Estos
invertebrados acuáticos permiten medir parámetros conductuales (locomoción y alimentación),
regenerativos (regeneración de cabeza, aurículas y fotorreceptores) y reproductivos
(fecundidad) para evaluar la toxicidad de los plaguicidas [23-26]. Así, este estudio tiene como
objetivo evaluar los efectos potencialmente subletales del producto comercial Regent 800 WG
(insecticida a base de fipronil) utilizando parámetros sensibles a nivel conductual, regenerativo
y reproductivo en la planaria de agua dulce no objetivo G. tigrina.

2. Materiales y Métodos

2.1. Girardia tigrina

Las planarias (G. tigrina) se obtuvieron de cultivos establecidos en el Laboratorio de

Estudios Aplicados en Fisiología Vegetal, en colaboración con el grupo CAE (Conservación de
Agroecosistemas y Ecotoxicología), en el Instituto Federal de Educación, Ciencia y Tecnología
Goiano-Campus Rio Verde. Las planarias se cultivaron en medios acuosos American Standard
Test and Materials (ASTM) (un medio compuesto por soluciones de bicarbonato de sodio, sulfato
de magnesio, cloruro de potasio, sulfato de calcio y agua destilada), bajo una temperatura
controlada de 22 ± 1 °C, en la oscuridad [27].

Una vez a la semana, las planarias fueron alimentadas, ad libitum, con hígado bovino, y
el medio se renovó dos horas después de la alimentación. Una semana antes de los
experimentos, se privó a los organismos de alimento para evitar la contaminación por digestión
de alimentos y garantizar la homogeneidad del estado fisiológico entre organismos [28].

Para los ensayos, se midieron las planarias en una malla cuadriculada y se seleccionaron
los animales sin signos de lesiones. Para el ensayo de toxicidad crónica (locomoción y
regeneración), se seleccionaron organismos de 1.0 ± 0.2 cm. Para el ensayo crónico
(reproducción), las planarias medían 1.5 ± 0.1 cm.

2.2. Preparación del insecticida a base de fipronil

Se preparó una solución stock de insecticida a base de fipronil utilizando 6250 mg·L−1 del
Regent 800 WG® granulado del compuesto equivalente de fipronil/L (con una concentración
final de 5000 mg·L−1), en agua destilada. Esta proporción se realizó mediante el cálculo de
proporciones. Se eligió el compuesto formulado debido a la relevancia medioambiental, ya que
en las zonas agrícolas es más común utilizar el compuesto comercial que el ingrediente activo
en estado puro.
 La solución stock se mantuvo en ausencia de luz a 4 ◦C para evitar la degradación del
ingrediente activo. Las soluciones experimentales se prepararon diluyendo la solución stock en
medio ASTM. Esta solución se preparó basándose en una regla de proporcionalidad, de modo
que la solución tuviera el 100% de los ingredientes activos del fipronil.

2.3. Exposición de planarias para evaluar su locomoción y regeneración

La evaluación de la locomoción y la regeneración se realizó utilizando planarias, que

fueron expuestas previamente durante ocho días a diferentes concentraciones nominales de
insecticida fipronil: 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25 mg (ingrediente activo)·L−1, y el experimento de
control (ASTM). Las pruebas se realizaron a una temperatura de 22 ± 1 °C, en un sistema estático
y en ausencia de luz. La exposición se llevó a cabo con 30 organismos por tratamiento, divididos
en tres réplicas (con 10 planarias por réplica), en vasos de vidrio que contenían 100 mL de
solución experimental. Después del cuarto día de exposición, se renovaron las soluciones
experimentales. Al final del período de exposición, se evaluaron los efectos sobre la locomoción
y la regeneración (adaptado de [28-30]).

2.3.1. Velocidad locomotora de las planarias-ρLMV

La velocidad locomotora de las planarias (ρLMV) se evaluó utilizando una forma redonda
(25 cm de diámetro) cubierta con papel milimetrado (líneas espaciadas a 0,5 cm) y pegada con
papel adhesivo transparente. Después de 8 días de exposición al ρLMV, se evaluaron las
planarias en todas las concentraciones. El fondo del molde fue cubierto con medio ASTM, y el
comportamiento de las planarias fue evaluado individualmente. Después de treinta segundos
de adaptación, se monitorizó el comportamiento locomotor de las planarias contando los
milímetros recorridos durante dos minutos. Cada vez que las planarias cruzaban una línea, se
contaban 5 mm (adaptado de [28-30]).

2.3.2 Regeneración

En la etapa de regeneración, se decapitaron quince planarias por concentración

mediante un único corte preciso detrás del pabellón auricular, utilizando una hoja de bisturí
previamente esterilizada. Después de la decapitación, las planarias se transfirieron
individualmente a un matraz de tereftalato de polietileno (PET) que contenía 20 mL de medio
ASTM. A continuación, se analizó la regeneración controlando el número de horas (cada 24 h)
hasta la formación de nuevos fotorreceptores y aurículas, así como la regeneración completa de
la cabeza utilizando una lámpara de lupa (adaptada de [28-30]).

2.3.3. Reproducción

Al comienzo de la fase reproductiva (1.5 ± 0.1 cm de longitud total), las planarias adultas
fueron expuestas a diferentes concentraciones de fipronil (Regent 800 WG) durante 3 semanas
para evaluar la fecundidad, y durante 4 semanas para evaluar la eclosión de los capullos
(fertilidad). Se expusieron a cinco concentraciones diferentes de fipronil (1.56, 3.13, 6.25, 12.5
y 25 mg·L−1), y al tratamiento de control (sólo medio ASTM), por triplicado, conteniendo cada
réplica 10 organismos. Estos organismos se expusieron a 100 mL de solución experimental en
matraces PET. Semanalmente, después de alimentar los organismos con hígado bovino (ad
libitum), las soluciones de cada concentración fueron sustituidas por nuevas soluciones. El
experimento se llevó a cabo a una temperatura de 22 ± 1 °C, en ausencia de luz, y los animales
fueron observados diariamente. Cada capullo depositado se colocó en un recipiente PET con 20
mL de solución experimental. La fertilidad se evaluó por el número de capullos producidos por
día dividido por el número de planarias expuestas. La tasa de fecundidad se determinó por el
número de crías (planarias nacidas de los capullos), dividido por el número de capullos
depositados (adaptado de [28,31]).

2.4 Análisis estadístico

Los datos de toxicidad subletal se evaluaron mediante análisis de la varianza (ANOVA),

y se aplicó la prueba post hoc de Dunnett para evaluar si había diferencias significativas entre
tratamientos. Para comprobar si los datos se ajustaban a los supuestos del ANOVA, se analizó la
homogeneidad de las varianzas y la normalidad de los datos mediante las pruebas de Bartlett y
Kolmogorov-Smirnov, respectivamente. Los datos obtenidos en las pruebas de regeneración no
cumplían los supuestos del análisis ANOVA, por lo que fue necesario utilizar estadística no
paramétrica mediante la prueba de Kruskal-Wallis (prueba post hoc de Dunn). El análisis
estadístico se realizó con el programa GraphPad Prism versión 7.0 (GraphPad Software, La Jolla,
CA, EE. UU.).

3. Resultados

3.1. Velocidad locomotora de las planarias-ρLMV tras la exposición al Regent 800 WG®.

La velocidad locomotora de las planarias (ρLMV) disminuyó significativamente tras la

exposición a Regent 800 WG®, en comparación con el tratamiento de control (F(5,84) = 11.1; ρ <
0,0001, R = 0.3979), presentando una NOEC (concentración sin efecto observado) de 3.13
mg·L−1, y una LOEC (concentración con el menor efecto observado) de 6.25 mg·L−1 (Figura 1).

Figura 1. El ρLMV de la G. tigrina, tras ocho días de exposición a concentraciones subletales del
Regent 800 WG®. Las concentraciones se refieren al ingrediente activo del fipronil. Los datos se
presentan como media ± error estándar, n = 15. * Se observan diferencias significativas en
comparación con el tratamiento de control (prueba post hoc de Dunnett, ρ < 0,05).

3.2. Regeneración de las planarias tras la exposición a Regent 800 WG®.

Como resultado del aumento de las concentraciones de Regent 800 WG®, las planarias
expuestas sufrieron un retraso significativo en la regeneración de las aurículas (F(5,84) = 87.89; ρ
< 0.0001; R = 0.8394; Figura 2b) en comparación con el tratamiento de control. Del mismo modo,
la regeneración de los fotorreceptores se retrasó significativamente con el aumento de las
concentraciones de insecticida (H = 77.5; ρ < 0,0001; Figura 2a). La NOEC se fijó en 1.56 mg·L−1,
y la LOEC en 3.13 mg·L−1 para la regeneración de fotorreceptores y aurículas.

Figura 2. Efectos de concentraciones subletales del insecticida Regent 800 WG® en la

regeneración de G. tigrina. (a) Regeneración de fotorreceptores. (b) Regeneración de aurículas.
Las concentraciones se refieren al ingrediente activo fipronil. El tiempo de exposición fue de
dieciséis días. Los datos se presentan como media ± error estándar, n = 15. * Se observan
diferencias significativas en comparación con el tratamiento de control (prueba post hoc de
Dunn).

3.3. Reproducción de planarias expuestas al Regent 800 WG®

La tasa de fecundidad de G. tigrina disminuyó significativamente con el aumento de las

concentraciones de Regent 800 WG® (F(5,10) = 4.875; ρ < 0.05; R = 0.7187; Figura 3a). La NOEC
para la tasa de fecundidad se estableció en la concentración de 6.25 mg·L−1, y la LOEC en la
concentración de 12.5 mg·L−1. Sin embargo, la exposición a las concentraciones ensayadas del
plaguicida no afectó significativamente a la tasa de fertilidad de G. tigrina (F(5,9) = 1.886; ρ > 0.05;
R = 0.213; Figura 3b).

Figura 3. Efectos de concentraciones subletales de Regent 800 WG® en la reproducción de G.

tigrina. (a) Tasa de fecundidad. (b) Tasa de fertilidad. Las concentraciones se refieren al
ingrediente activo fipronil. Los datos se presentan como media ± error estándar, n = 30. * Se
observan diferencias significativas en comparación con el tratamiento de control (prueba post
hoc de Dunn).

4. Discusiones

Aunque los estudios sobre el impacto del fipronil en organismos no objetivo han sido
más notorios en los últimos años, todavía hay pocos estudios que aborden los efectos subletales
de los insecticidas a base de fipronil en invertebrados acuáticos [32-37]. Sin embargo, cabe
destacar que, en lo que respecta a los invertebrados acuáticos, hay una pronunciada falta de
datos sobre los efectos del fipronil tanto a corto como a largo plazo, lo que pone de relieve la
novedad y la importancia de este estudio.

En cuanto a los efectos crónicos sobre organismos no objetivo, el fipronil alteró la

reproducción de la especie de colémbolo Folsomia candida a concentraciones inferiores a las
recomendadas para su uso en agricultura [38]. También resultó muy tóxico para las abejas,
alterando el comportamiento de aprendizaje de la especie Apis mellifera [39]. Además,
organismos acuáticos como anfibios, cladóceros y oligoquetos mostraron efectos nocivos
relacionados con la exposición al fipronil [40].

Comprender y conocer en profundidad los cambios debidos a la toxicidad crónica a nivel

de organismo es importante para entender la toxicidad a largo plazo de los xenobióticos para
las poblaciones y la estructura y función de las comunidades naturales. En este estudio, el
comportamiento locomotor se evaluó mediante un método tradicional, en el que el usuario
realizaba las observaciones a simple vista y no mediante un sistema de seguimiento por vídeo.
A pesar de las conocidas limitaciones de este método, evaluar sólo los movimientos directos de
las planarias es un método muy sencillo, rápido y barato de aplicar con una buena sensibilidad
para detectar los efectos subletales de los diversos tóxicos reportados [41]. El comportamiento
locomotor de las planarias se vio afectado con una LOEC de 6.25 mg·L−1. Este efecto negativo se
produjo posiblemente debido a que el fipronil afectó al sistema nervioso de las planarias. De
hecho, el comportamiento locomotor de las planarias está relacionado con el buen
funcionamiento del sistema nervioso que controla la contracción muscular [42]. Además, la
actividad alimentaria de las planarias está directamente relacionada con su capacidad
locomotora. Las planarias ocupan una posición intermedia en las cadenas tróficas de agua dulce;
por lo tanto, los cambios en su comportamiento depredador y de escape pueden comprometer
la supervivencia del individuo, generando en última instancia desequilibrios tanto descendentes
como ascendentes en estas cadenas tróficas [19,23].

La regeneración de G. tigrina fue el parámetro más sensible tras la exposición al fipronil

en comparación con los demás parámetros evaluados. Hubo un retraso significativo en la
regeneración de fotorreceptores y aurículas a partir de la concentración de 3.13 mg·L−1 de
fipronil. Estos resultados refuerzan la potencial acción tóxica del fipronil sobre el sistema
nervioso de las planarias. La regeneración de las planarias depende de la contracción muscular
y de la extensión de la epidermis en la herida, proceso que conduce al cierre de la lesión. Como
resultado de estos cambios, las células identificadas como blastema se organizan bajo la
epidermis y se inicia la sustitución de los segmentos perdidos [43,44]. Como consecuencia del
retraso en la regeneración de los fotorreceptores, las planarias pueden sufrir cambios en la
percepción de la intensidad y dirección de la luz. Del mismo modo, el retraso en la regeneración
de las aurículas puede limitar la percepción de la detección química del medio circundante,
incluidas las pistas químicas para detectar presas y depredadores [18].
 También se observó una reducción de la tasa de fertilidad de las planarias, presentando
una LOEC de 12.5 mg·L−1. En un estudio realizado con Danio rerio, se encontró que cuando se
expone a concentraciones de 2.5 mg·L−1, su capacidad de incubación (en la etapa de embrión)
se ve afectada [45]. Se observó esta acción tóxica del fipronil a través de daños neuronales,
efectos hepatotóxicos, nefrotóxicos, citotóxicos y reproductivos tanto en vertebrados como en
invertebrados [46].

Las aguas superficiales pueden contaminarse con plaguicidas como resultado de la

filtración y la escorrentía superficial, debido a la sobredosis y el uso indebido de estos productos.
Estos hechos facilitan la propagación de los insecticidas al medio acuático y pueden causar
impactos en los ecosistemas acuáticos y, en consecuencia, afectar a organismos no objetivo
(como las planarias) [47]. En resumen, nuestro estudio destaca que exposiciones prolongadas a
insecticidas basados en fipronil podrían perjudicar el comportamiento, la capacidad de
regeneración y la reproducción de G. tigrina en rangos de concentración similares, a pesar de
que la regeneración es el parámetro más sensible. Además, estos parámetros son el resultado
visible de una serie de cambios bioquímicos y fisiológicos en respuesta a la exposición a factores
estresantes, indicando por tanto cambios a niveles superiores de la organización biológica [48].
En el presente estudio, utilizamos la fórmula comercial que contiene alrededor de un 80% de
fipronil y un 20% de otros componentes. La presencia de este 20% de una mezcla de compuestos
puede suscitar cierta discusión sobre su posible acción tóxica sobre las planarias. Sin embargo,
al evaluar la toxicidad de la fórmula comercial, presentamos datos más relevantes para una
evaluación realista del riesgo de los insecticidas a base de fipronil para los animales de agua
dulce no diana cercanos a las zonas agrícolas. Aunque el fipronil tiene una solubilidad en agua
de baja a moderada, debido a su uso generalizado, el insecticida está actualmente presente en
suelos y aguas superficiales y subterráneas, y cabe esperar efectos directos o indirectos sobre
los organismos acuáticos [49]. Así, especulamos sobre los posibles efectos deletéreos del
compuesto comercial Regent 800 WG® en planarias tropicales de agua dulce, considerando que
en un medio acuático, sin presencia de luz (lugares habitados por planarias), la vida media del
fipronil puede ser relativamente larga -con una vida media que oscila entre 36 h y 7,3 meses
dependiendo del sustrato y las condiciones [50]. Además, el fipronil tiene una ligera movilidad
en el suelo, un factor de bioconcentración dentro del límite de preocupación, un índice de
lixiviación-GUS de 2.06 (considerado rango de transición) y una alta toxicidad para los
organismos acuáticos que habitan en los sedimentos [51]. Por lo tanto, estos resultados son
preocupantes en relación con la dinámica de las poblaciones naturales, ya que el desarrollo y el
éxito reproductivo de las planarias podrían disminuir, lo que provocaría cambios en las
comunidades de agua dulce.

5. Conclusiones

Se ha demostrado que el insecticida a base de fipronil causa efectos crónicos en

planarias (G. tigrina), como retraso en la locomoción (a partir de la concentración 6.25 mg·L−1),
regeneración (a partir de la concentración 3.13 mg·L−1) y reproducción (fecundidad, a partir de
la concentración 12.5 mg·L−1). Estos resultados contribuirán sin duda, con importantes datos
ecotoxicológicos, a la investigación sobre los efectos crónicos del fipronil en invertebrados
tropicales de agua dulce, contribuyendo a un enfoque más sensible del análisis del riesgo
ecológico que en estos climas representa el fipronil u otros insecticidas del grupo de los
pirazoles. Además, este estudio refuerza la importancia de los ensayos subletales y las
evaluaciones de parámetros individuales (locomoción, regeneración y reproducción sexual de
planarias), que suelen ser mucho más sensibles que los bioensayos de supervivencia.
Contribuciones de los autores: E.B.d.R. realizó los experimentos; E.B.d.R. y A.S.S. analizaron los
datos y redactaron el manuscrito (redacción-borrador original, revisión y edición); F.S.F., M.S.O.,
A.C.M.R., A.S.P.D., R.A.S., J.C.P.d.S. y E.C.R. analizaron los datos, revisaron y editaron el
manuscrito; A.S.S. y F.S.F. concibieron (adquisición de fondos) y diseñaron la investigación.
Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiación: Esta investigación fue financiada por el Programa de Apoio à Pós-Graduação-

PROAP/CAPES IF Goiano-Programa de Mestrado em Agroquímica, 2020.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional: Se renunció a la revisión y aprobación éticas

para este estudio debido a RAZÓN (La legislación vigente sobre el bienestar de los animales de
experimentación no es aplicable a los organismos utilizados en este estudio. Además, este
estudio no implicaba la recogida de especies animales en peligro de extinción o protegidas).

Declaración de disponibilidad de datos: No procede.

Agradecimientos: Agradecemos al Programa de Mestrado em Agroquímica del Instituto Federal

de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano-Campus Rio Verde y al Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia Goiano-Campus Campos Belos y Campus Iporá por el apoyo y colaboración.
Agradecemos al Programa de Apoio à Pós-Graduação-PROAP/CAPES IF Goiano- Programa de
Mestrado em Agroquímica 2020. Centro Analítico Multiusuarios (CeMA) del Programa de
Mestrado em Agroquímica (PPGAq) y M.S.O por la beca PNPD/CAPES No. 88887.342460/2019-
00. A.C.M.R agradece el apoyo financiero al CESAM por parte del FCT/MCTES (UIDP/50017/2020
+ UIDB/50017/2020 + LA/P/0094/2020), a través de fondos nacionales. A.S.P.D agradece a
Capes, por la Subvención PNPD, No. 88887.666008/2022-00. Finalmente, agradecemos al Pró-
Reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação-Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia Goiano, por la ayuda financiera para la elaboración del artículo.

Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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