Cromatografía

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 ¿Qué es?
• La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas
complejas cuyo objetivo es separar los distintos componentes que tiene una mezcla o una
disolución

• La separación se lleva a cabo según la distinta interacción que presenta cada uno de los
componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y otra móvil que fluye sobre
ella

• Esta interacción puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintas subclases de
cromatografía: de absorción, de reparto, la cromatografía ascendente sobre papel, de
intercambio iónico, de afinidad, de capa fina(CCF O TLC), cromatografía liquida que deriva en
la cromatografía de liquidos en alta resolución (HPLC), etc

“Principio de la cromatografía de liquidos

en alta resolución(HPLC)”
 • Prueba de biuret
Sirve para reconocer las uniones peptídicas. La positividad se
manifiesta por la aparición de una coloración violeta, debido a la
formación de un complejo de coordinación entre los cationes
cúpricos en medio alcalino con las uniones peptídicas.
• Solución proteica en
concentraciones de 0,0,
0,1, 0,4, 2 y 10 mg/dm3
• Prueba de los grupos azufrados
Identifica aminoácidos azufrados y las proteínas que los contienen, se
reconocen por la formación de una coloración negra o gris.
• Prueba de Sakaguchi
Identifica arginina por lo tanto se usa para identificar
proteínas, ya que casi todas las proteínas poseen ese
aminoácido. El desarrollo de un color rojo marca la reacción
positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que
caracteriza la arginina.
N P
Grupo guanidina
• Prueba de coagulación
Identifica albúminas, globulinas y protaminas. La positividad se
manifiesta por la formación de un coágulo.
 • Prueba de Millon
Es específica para aminoácidos que tengan grupos fenólicos. En una
primera instancia se procede a la nitración del anillo fenólico con el
ácido nitroso del reactivo. La tirosina nitrada forma complejos con los
iones mercurio Hg (I) y Hg (II) del reactivo produciendo un precipitado
rojo o una solución roja, ambos resultados positivos (a veces se
observa un precipitado blanco, que debe calentarse para que vire a
la coloración roja).
Grupo fenol en la
cadena lateral de la
tirosina
Compuesto Rojo
• Prueba de Hopkins-Cole
Es específica para el grupo indol, característico del triptofano.
El anillo indol reacciona con el ácido glioxálico en presencia
de ácido sulfúrico concentrado para formar un compuesto
violeta en la interfase entre la solución del aminoácido y del
ácido sulfúrico. El triptofano puro en solución no da positivo a
menos que se agreguen oxidantes, por lo que es de suponer
que el triptofano de las proteínas no se libera como tal, por lo
cual la reacción presentada es sólo parcialmente correcta
Grupo indol
 • Prueba de sulfato de amonio
Se usa para fraccionar y purificar proteínas
Las proteínas son precipitadas por soluciones concentradas
[NaCl. (NH4)2SO4 y NaSO4] la precipitación se debe a la
neutralización y deshidratación de la molécula
• Prueba Xantoproteica
Es una reacción que reconoce los aminoácidos
que poseen el grupo bencénico (tirosina,
fenilalanina, triptófano). Las proteínas que tienen
en su composición estos aminoácidos también
darán la reacción. La positividad se reconoce por
la aparición de un color amarillo o naranja debido
a la formación de nitrocompuestos.

Grupo fenilo
muy estable
• Prueba de la Ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno)

1er

2 do
Analizador de aminoácidos(Cromatografía de intercambio iónico)
• Se identifica que aminoácidos están presentes
• Cuanta cantidad de cada aminoacido hay en la muestra

• Pasos
1. La cadena de péptido se hidroliza por completo hirviéndola por 24 horas en
presencia de HCl 6 M.
2. La mezcla resultante de los aminoácidos (el hidrolizado) pasa por la columna de
intercambio iónico. La disolución que emerge de la columna se trata con
ninhidrina y se registra su absorbancia en función del tiempo

3. La intensidad del color es detectada por un espectometro y da como resultado

una grafica

Bradicinina humana

• Las identidades de los aminoácidos en un péptido se • La cantidad de cada aminoácido en la

identifican gracias a la cantidad de tiempo requerido muestra se determina midiendo la intensidad
para que un aminoácido dado eluya de una columna del color que resulta de su reacción con
estándar, pueden determinarse ninhidrina.
Resumen
GRACIAS POR SU
ATENCIÓN