ELECTROFORESIS DEL RNA GENOMICO

1. INTRODUCCION

La electroforesis en geles permite el diagnstico, caracterizacin genmica y comparacin de aislamientos individuales, por lo que constituye una tcnica valiosa para estudios moleculares y epidemiolgicos de infecciones a Rotavirus.

1.1 Ventajas

a) Deteccin de Rotavirus con una especificidad del 100% (electroferotipo de 11 bandas caracterstico)

b) Deteccin de Rotavirus del grupo A y de otros grupos (B a G), que presentan una distribucin de bandas caractersticas y para los cuales todava no existen disponibles kits de diagnstico inmunolgico.

c) Discriminacin entre Rotavirus, an de aquellos provenientes de distintas especies.

d) Determinacin de variaciones genmicas entre Rotavirus provenientes de la misma especie.

1.2 Desventajas

Necesidad de equipo especfico.

2. METODOLOGIA

2.1 Extraccin del RNA

Se resuspende 1 ml de materia fecal en 3 ml de TC Buffer.

Agitar en vortex durante 1 minuto.

Clarificar, centrifugando a 2000 r.p.m.

durante 20 minutos a 4C.

Cuidadosamente remover el sobrenadante y transferirlo a otro tubo.

Agregar 1/10 vol. de solucin de SDS al 10%.

Agregar 1/30 vol. solucin de Acetato de sodio 4M.

Agregar igual volumen de mezcla fenol:cloroformo (3:2).

Se agita en vortex durante 1 minuto.

Centrifugar a 11.000 r.p.m. durante 10 minutos.

Se transfiere la fase acuosa superior a otro tubo evitando tocar la interfase.

Se precipita el RNA agregando 2,5 vol. de etanol absoluto fro.

Se deja precipitar 1 hora a -70C o toda la noche a -20 C.

Centrifugar a 11.000 r.p.m. durante 20 minutos a 4C.

Se descarta el sobrenadante y se dejan secar los pellets, colocando los tubos destapados invertidos sobre papel absorvente.

Resuspender en 400 ul de buffer de siembra.

La muestra se conserva a -20C hasta su corrida en el gel.

2.2 Electroforesis en geles de Poliacrilamida

Se usar el mtodo descripto por Laemmli (1970) con modificaciones.

Armar el sandwich de placas de vidrio dentro de la cual se vertir la solucin a polimerizar empleando separadores de 1,5 mm.

Preparar la solucin de gel separador segn el siguiente protocolo:

Gel separador 7,5% Agua destilada Buffer Tris-HCl pH 8,8 Solucin stock de Acrilamida/bis-acrilamida Persulfato de amonio10%300ul TEMED 30 ul 15.00 ml 29.67 ml 15.00 ml

Vertir el gel separador entre las placas de vidrio.

Colocar una capa de agua destilada o agua saturada con isobutalnol sobre el gel para evitar el contacto del mismo con el oxgeno.

Dejar polimerizar durante 1 hora.

Descartar el agua saturada con isobutanol y lavar con agua destilada.

Preparar la solucin de gel concentrador segn el siguiente protocolo:

Gel concentrador 3%: Agua destilada Buffer Tris-HCl pH 6,8 6.30 ml 2.50 ml

Solucin stock de Acrilamida/bis-acrilamida 1.00ml Persulfato de amonio 10% 100 ul TEMED

5 ul

Colocar el gel concentrador y el peine evitando la formacin de burbujas.

Dejar polimerizar durante 45 minutos.

Quitar el peine y lavar las calles con buffer de corrida.

Colocar el gel en la cuba electrofortica y llenar los compartimentos andico y catdico con buffer de corrida.

Sembrar 100 ul de muestra electroforesis.

utilizando micropipeta y tips de

Correr a 13 mA durante 17 horas.

Coloracin de geles:

con

Se utilizar el mtodo de Tincin Argntica de Sammons et al (1981) modificaciones. Se recomienda el empleo de bandeja escrupolosamente lavada y guantes.

Colocar el gel separador en 200 ml de agua.

Descartar el agua y colocar 200 ml de solucin fijadora.

Dejar actuar durante 30 minutos. Realizar 2 lavados con agua destilada.

Colocar 200 ml de solucin de nitrato de plata 0.01 M.

Dejar actuar durante 30 min.-1 hora. Realizar 4 lavados con agua destilada para eliminar completamente el nitrato de plata.

Colocar 100 ml de solucin reveladora.

Al comenzar a ver claramente las bandas se descarta el revelador y se lava rpidamente con agua destilada.

Detener la reaccin con 100 ml de solucin de cido actico al 10%.

Los geles pueden conservarse en una solucin de metanol al 45% y cido actico al 10% en agua destilada o deshidratarse sobre un papel absorvente por calor y vaco.

Se aconseja registrar lo antes posible los resultados por fotografiado.

3. BIBLIOGRAFIA

1. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the assembly of

the head of Bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

2. Sammons, D. W.; Adam L. D. and Nishizawa, E.E.1981. Ultrsensitive silverbased color staining of peptides in poliacrilamide gel electroforesis, 2:135-141.

3. Herring, A. J.; Inglis, N: F.; Ogeh, C. K.; Snodgrass, D. R. and Menzies, J. D. 1982. Rapid diagnosis of Rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver stained poliacrilamide gels . Journal of Clinical Microbiology, 16(3): 43-477.

4. Passini, M. I.; Barrandeguy M. E.; Cornaglia E.; Gottschalk, M.; Gmez Yafal, A.; Fitjman, N. y Schudel, A. A. 1985. Complejos diarreicos neonatales. Manual de tcnicas para la caracterizacin de agentes infecciosos. Red de Cooperacin de Laboratorios Veterinarios de Diagnstico. FAO.

5.Maniatis, T.; Frish E. F.; Sambrook J. 1982. Molecular Cloning A Laboratory Manual - Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor - New York

Reactivos y soluciones

1- Extraccin de RNA

- Tris 1M pH: 8 Tris Base 48,4g

Agua dest. c.s.p. 400 ml

Guardar a 4C

- TC buffer (0,1 M Tris - 10 mM CaCl2 ) pH: 7,4 CaCl2.2H2O Tris 1 M pH 8 0.735g 50 ml

Agua Dest. c.s.p. 500 ml

Guardar a 4C

- Acetato de sodio 4M Acetato de sodio anhidro 16,4g

Agua destilada c.s.p.

50 ml

Guardar a temperatura ambiente

- SDS 10% Dodecil sulfato de sodio Agua destilada c.s.p. 10g

100 ml

Guardar a temperatura ambiente.

- Buffer de siembra y resuspensin de muestra: Agua dest. Tris HCl 0,5 M pH: 6,8 Glicerol 2 ml 2 ml 6 ml

Azul de Bromofenol (0.05% p/v) 400 ul

-Preparacin de mezcla Fenol: Cloroformo

1) Fenol

- Fundir 100 g de cristales de Fenol en bao de agua a 65C. - Agregar 0,1% p/v de 8-hidroxiquinolina para evitar la oxidacin del fenol - Colocar en tubo de centrfuga y agregar igual volumen de buffer Tris pH:8. - Agitar vigorosamente. - Centrifugar a 5.000 r.p.m. durante 15 minutos. - Medir pH de la fase acuosa, repetir los lavados hasta pH: 8-8.5 - Almacenar a 4C 2) Mezcla Fenol - Cloroformo (3:2) - Se prepara en el momento de uso.

2-Electroforesis en gel de poliacrilamida

- Solucin stock Acrilamida/ bis-acrilamida Acrilamida Bis-acrilamida 30g 0.8g

Agua destilada c.s.p. 100 ml

Almacenar a 4C en frasco color caramelo, controlar pH 7 o menor. * Drogas neurotxicas, se absorven por piel y presenta efectos acumulativos. Utilizar guantes y barbijo en su manipulacin.

- Persulfato de Amonio 10% Persulfato Agua destilada 1g 10 ml

Fraccionar en volmenes de uso y almacenar a -20C.

- Buffer gel separador Tris - HCl 1,5 M pH: 8.8

- Buffer gel concentrador Tris - HCl 0.5 M pH: 6.8

- Buffer de Corrida (pH: 8,3) 10X Tris Base Glicina SDS 10% 30 g 144 g 10 ml

Agua destilada c.s.p. 1000 ml

Diluir a 1X en el momento de uso.

Almacenar los tres a 4 C.

3- Tincin Argntica:

- Solucin fijadora 0.5% Ac. Actico glacial 10% Etanol en agua

Ac actico Etanol Absoluto Agua c.s.p.

1 ml 20 ml 200 ml

- Nitrato de plata 0.01 M Nitrato de plata 1.7 g Agua destilada c.s.p. 1 litro

Almacenar a tempetaruta ambiente en frasco color caramelo.

- Solucin reveladora

NaOH 0.75 M

100 ml 750 ul

Formaldehido (37%)

Preparar en el momento de uso.