UNIVERSIDAD DE OVIEDO

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Relevancia de los dominios

citoplasmáticos del canal de potasio
h-ERG en sus propiedades cinéticas y en
su regulación hormonal

Carlos Alonso Ron

Memoria de Tesis Doctoral
Oviedo, 2009
 AUTORIZACIÓN PARA PRESENTACIÓN DE TESIS DOCTORAL

Datos del alumno: Curso: 2008/2009

Apellidos: ALONSO RON Nombre: CARLOS
DNI: 76942119N Domiciliado en: OVIEDO Teléfono: 620887800
Calle: ILLAS, 3, 2-I C.P. 33012

Datos Académicos:
Programa de Doctorado cursado: Biología Funcional y Molecular
Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL
Departamento en que presenta la tesis doctoral: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
Título definitivo de la Tesis: RELEVANCIA DE LOS DOMINIOS CITOPLASMÁTICOS DEL CANAL DE POTASIO
H-ERG EN SUS PROPIEDADES CINÉTICAS Y EN SU REGULACIÓN HORMONAL

Autorización del director/es de la tesis

FOR-OFE-VCE-024

D/Dª: FRANCISCO BARROS DE LA ROZA

Departamento: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
D/Dª: MARIA DEL PILAR DE LA PEÑA CORTINES
Departamento: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

Resolución
El Departamento BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR en su reunión de fecha 10 de Octubre de 2008, acordó dar su conformidad
para la presentación de la tesis doctoral a la Comisión de Doctorado, en cumplimiento de lo establecido 35.2 de la “Modificación del
Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtención y expedición del título de doctor y otros cursos de postgrado”, aprobada
por el Consejo de Gobierno, en su sesión del día 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).

Asimismo el director/directores de la tesis doctoral, cumplen con el requisito establecido en el artículo 2 de la “Modificación del
Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtención y expedición del título de doctor y otros cursos de postgrado”,
aprobada por el Consejo de Gobierno, en su sesión del día 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).

Oviedo, 10 de Octubre de 2008

El Director del Departamento

Fdo.: Pilar de la Peña Cortines

SR./SRA. PRESIDENTE/A DE LA COMISIÓN DE DOCTORADO DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO

 Vicerrectorado de Ordenación Académica y Nuevas Titulaciones

AUTORIZACIÓN PARA LA PRESENTACIÓN DE LA TESIS DOCTORAL

Curso: 2008/2009
Datos personales:
Apellidos: ALONSO RON Nombre: CARLOS
D.N.I. 76942119N Dirección: Illas, 3, 2-1
C.P. 33012 Localidad : OVIEDO Teléfono: 620887800

Datos Académicos:
Programa de Doctorado cursado: Biología Funcional y Molecular
Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL
Departamento en el que presenta la tesis doctoral: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
FOR-OFE-VCE-021

Título definitivo de la Tesis: RELEVANCIA DE LOS DOMINIOS CITOPLASMÁTICOS DEL

CANAL DE POTASIO H-ERG EN SUS PROPIEDADES CINETICAS
Y EN SU REGULACION HORMONAL

Autorización del director/es de la tesis

D/Dª: FRANCISCO BARROS DE LA ROZA
Departamento: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
D/Dª: MARIA DEL PILAR DE L PEÑA CORTINES
Departamento: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

Autoriza la presentación de la tesis doctoral en cumplimiento de lo establecido en el Art. 35.1a

de la “Modificación del Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtención y
expedición del título de doctor y otros cursos de postgrado”, aprobada por el Consejo de
Gobierno, en su sesión del día 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).

Oviedo, 02 de febrero de 2009

Director de la Tesis Director de la Tesis

Fdo: FRANCISCO BARROS DE LA ROZA Fdo: MARIA DEL PILAR DE L PEÑA CORTINES

SR. DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

 Resumen
Los canales ERG pertenecen a la familia eag de canales de K+ dependientes de
voltaje, englobada dentro de la superfamilia de canales iónicos “relacionados con los
operados por voltaje” o “de lazo en el poro”, y se expresan en diferentes tejidos y especies
de mamífero. En el caso de la isoforma humana ERG1 (denominada h-ERG), su
comportamiento como “rectificador anómalo” le permite desempeñar un papel
fundamental en diversos tipos de células nerviosas, endocrinas y tumorales, aunque sin
duda su función más conocida sea su contribución a la finalización del potencial de acción
ventricular cardíaco. Además, se han descrito distintos mecanismos de regulación de este
canal mediante hormonas y mensajeros intracelulares, así como su bloqueo por
diferentes fármacos.
Si bien el sensor de voltaje y los elementos de apertura y cierre localizados en la
región central transmembranal han sido foco de numerosos estudios, el papel de los
dominios intracelulares de la proteína en el control del mecanismo de apertura y cierre
ha sido frecuentemente ignorado. El canal h-ERG posee un extremo amino
excepcionalmente largo que se ha demostrado participa en el mantenimiento de las
características cinéticas del canal. El trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral se ha
centrado en el estudio de la relevancia de regiones intracelulares del canal, como el
extremo amino, en sus propiedades cinéticas y en su regulación hormonal. Para ello, se
han tratado de localizar los determinantes estructurales necesarios para el control de los
parámetros de apertura y cierre, así como para su regulación por TRH. La hipótesis de
partida, ya anticipada, presupone la existencia de interacciones intramoleculares entre
el extremo amino y el cuerpo central del canal a nivel del lazo intracelular S4-S5,
cruciales para la funcionalidad del canal y para su regulación hormonal.

El trabajo de Tesis ha sido dividido en tres partes. En la primera, se ha estudiado

el papel funcional de diferentes dominios del extremo amino y del lazo S4-S5 de h-ERG,
mediante el análisis del impacto que alteraciones estructurales de estos dominios
producen sobre la propiedades cinéticas y termodinámicas del canal analizadas bajo
condiciones de auténtico estado estacionario.
En la segunda parte, hemos ampliado los trabajos precedentes de nuestro
laboratorio, localizando regiones del dominio proximal del extremo amino de h-ERG que
influyen en la capacidad del canal para ser regulado hormonalmente. Además, se ha
analizado la relevancia del lazo intracelular S4-S5 de h-ERG y el papel de su posible
interacción con el extremo amino, sobre los efectos hormonales de la TRH.
Finalmente, en la tercera parte, se han analizado las posibles interacciones
intramoleculares entre el extremo amino y el lazo citoplasmático S4-S5. Por un lado,
dicha interacción se ha estudiado de forma indirecta comparando el papel de regiones del
extremo amino y del lazo S4-S5 en la modulación del cierre de h-ERG inducida por la
acidificación extracelular. Por otro lado, se han buscado aquellos residuos del extremo
amino y del lazo S4-S5 que se encuentren físicamente próximos y, por ello, sean capaces
de formar puentes disulfuro cuando son substituidos por cisteínas y sometidos a
condiciones oxidantes.

Este trabajo ha permitido identificar a los primeros 16 residuos del extremo amino
del canal y a la región N-terminal del lazo intracelular S4-S5 como protagonistas de la
interacción entre ambos dominios, que constituye un factor determinante de las
peculiares características cinéticas de h-ERG, así como para su capacidad de ser
regulado hormonalmente.
 “En igualdad de condiciones la solución
más sencilla es probablemente la más correcta”.
(Guillermo de Ockham, 1280/1288-1349).

“El gran libro de la Naturaleza

está escrito en símbolos matemáticos”.
(Galileo Galilei, 1564-1642).

“La imaginación es más

importante que el conocimiento”
(Albert Einstein, 1879-1955).
 Agradecimientos
El poeta cubano José Martí dijo que “hay tres cosas que cada persona
debería hacer durante su vida: plantar un árbol, tener un hijo y escribir
un libro”. Hace algunos (bastantes) años que planté junto a mi padre mi
primer árbol y tener un hijo es algo que me queda pendiente, así que, de
momento, ya he escrito este libro y antes de que el lector se enfrente a él
quisiera que tuviese en cuenta estas líneas.
En primer lugar, me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento a
los “senior” del grupo de investigación: los Dres. Pilar de la Peña y
Francisco Barros, directores de esta Tesis, y el Dr. Pedro Domínguez (por
cierto, gran jugador de mus). Les doy las gracias por su inicial y ciega
confianza en mí, que se ha ido consolidando durante estos más de cinco
años. Me han dado la oportunidad de unirme al gran grupo humano que
encabezan, formándome como científico y ayudándome a evolucionar como
persona.
En segundo lugar, agradecer a los “junior” del grupo: el Dr. David
Gómez Varela, por ayudarme en los comienzos; el Dr. Diego García Manso, por
pasar de compañero de trabajo a un gran amigo fuera del laboratorio; el Dr.
Pablo Miranda, por toda su sabiduría, y el “siguiente” que presentará la
Tesis, Luis Carretero. No quisiera tampoco olvidarme de “las técnicos” del
grupo, Noelia Sánchez y Silvia González, que construyeron y construyen los
pilares sobre los que sustentan nuestros experimentos.
También he de agradecer el apoyo y ánimo constante de todos mis
conocidos y amigos del Departamento. La gente con la que compartí planta y
servicios comunes, del laboratorio 3.18 y 3.3. Alberto García Manso,
compañero de fatigas y aventuras desde los últimos años de Licenciatura,
dentro y fuera de los laboratorios (y por varios países). Y Marian, que no
me olvido de ti, por recordarme de vez en cuando lo que verdaderamente es
importante en esta vida.
Un especial agradecimiento a la gente ajena al mundo de la Ciencia. A
mis padres, que desde que era un niño me han apoyado en mi sueño de llegar
a ser un científico. A mi hermana Marta, para la que no tengo palabras
suficientes de agradecimiento por todo lo que me ha dado durante toda la
vida. A mis abuelas, porque se sienten orgullosas de mí. A mi chica,
Patricia, la que desde más cerca ha compartido mis estreses, miedos y
alegrías. A Ángel, por dibujar esa sonrisa en mi cara cuando más lo
necesitaba. Por último, al resto de personas cercanas a mí y que por
motivos de espacio no puedo enumerarlas pero que, espero, se sientan
identificadas con estas líneas.
Finalmente, me gustaría dar las gracias a los desaparecidos Ministerio
de Ciencia y Tecnología y Ministerio de Educación y Ciencia por la beca
F.P.I. que me ha permitido subvencionarme durante 4 años, y al Gobierno del
Principado de Asturias y la Universidad de Oviedo por subvencionar parte
del material que me ha permitido realizar este trabajo.
 Índice

Abreviaturas i

Introducción 1
I. Características generales del canal h-ERG. 1
I.1. El canal h-ERG (Kv 11.1): un canal iónico
dependiente de voltaje. 1
I.2. Características e structurales de los canales ERG. 3
I.3. Características biofísica s del canal h-ERG. 6
I.4. Importancia fisiológica de lo s canales ERG. 8
I.4.1. Papel de lo s canales ERG en la repolarización
del potencial de acción cardiaco . 9
I.4.2. Papel de lo s canales ERG en el sistema nervio s o
y en las células neuroendocrinas. 11
I.4.3. Papel de lo s canales ERG en las células tumorales. 12
II. Relacione s e structura-función en h-ERG
y otros canales Kv , CNG y HCN. 13
II.1. El proce s o de inactivación en h-ERG y otros canales Kv . 14
II.2. El proce s o de apertura y cierre en h-ERG
y otros canales Kv , CNG y HCN. 15
II.2.1. El sens or de voltaje de lo s canales Kv , CNG y HCN. 15
II.2.2. El sens or de v oltaje de h-ERG. 17
II.2.3. El papel del extrem o a mino de h-ERG
en la apertura y el cierre. 17
II.2.4. Papel de otras regione s de h-ERG
en la apertura y el cierre. 20
II.3. Estudio de la propiedade s cinéticas y term odinámica s
de h-ERG bajo condicione s de auténtico e stado e stacionario. 21
III. Regulación horm onal de h-ERG. 22
III.1. Regulación de lo s canales ERG. 22
III.2. Regulación horm onal de los canales ERG por TRH. 24
III.3. El papel del do minio proximal en la regulación horm onal
de h-ERG por la TRH. 26
IV. Los o o cito s de Xenopu s laevis
c o m o siste ma de expresión heteróloga. 27

Objetivos 29
Materiales y Métodos 31
I. Medio s , disolucione s y reactivo s . 31
I.1. Medio s para el cultivo de Escherichia coli. 31
I.2. Medio s utilizado s para la obtención, mantenimiento
y registro electrofisiológico de lo s oo cito s de Xenopu s laevis. 31
II. Técnicas de Biología Molecular. 32
II.1. Transformación de células co mpetentes
de Escherichia coli. 32
II.2. Purificación y se cuenciación de DNA. 32
II.3. Reac ción en Cadena de la Polimerasa (PCR). 33
II.4. Mutagéne sis dirigida mediante PCR. 33
III. Plás mido s y variantes de h-ERG. 36
III.1. Plás mido s rec o m binantes . 36
III.2. Generación de variantes de h-ERG. 36
III.2.1 Variantes c on delecione s . 36
III.2.2. Mutantes puntuales y co m binado s . 38
III.2.3. Variantes c on sub stitucione s
en el do minio proximal. 40
IV. Síntesis in vitro de cRNA. 42
V. Expresión en oo cito s de Xenopu s laevis. 43
VI. Registro electrofisiológico de lo s oo cito s. 44
VII. Análisis mate mático. 45
VII.1. Ajuste s mate mático s . 45
VII.2. Análisis e stadístico. 46
VIII. Modelo s de ho m ología e structural. 47

Resultados 49
I. Relevancia del extrem o amino y del lazo S4-S5 de h-ERG
en las propiedade s cinéticas y termodinámica s del canal. 49
I.1. Efecto de la modificación e structural del extrem o a mino
de h-ERG sobre la dependencia de v oltaje de activación
del canal en estado e stacionario. 50
I.2. Efecto de la modificación e structural del extrem o a mino
de h-ERG sobre la velocidad de activación. 55
I.3. Efecto de las m odificacione s a minoterminales de h-ERG
en la cinética de cierre. 57
I.4. Influencia de las mutacione s en el laz o S4-S5 de h-ERG
s o bre las propiedade s de activación del canal
en e stado e stacionario. 59
I.5. Influencia de las mutacione s en el lazo S4-S5 de h-ERG
s o bre la velocidad de activación. 63
 I.6. Influencia de las mutacione s en el lazo S4-S5 de h-ERG
s o bre la cinética de cierre. 65
I.7. Alteracione s en el proce s o de apertura y cierre de h-ERG
inducidas por mutacione s en el laz o S4-S5 en canales
carentes del extrem o amino. 67
II. Regulación horm onal de h-ERG por TRH:
relevancia de los do minios citoplas mático s del canal. 73
II.1. Efecto de la eliminación de regione s del extrem o a mino
s o bre la regulación horm onal de h-ERG. 73
II.2. Efecto de la modificación de la secuencia 326-332
(RYRTISK) so bre la regulación hormonal de h-ERG. 78
II.3. Mantenimiento de la regulación horm o nal
en canales h-ERG carentes del seg mento 362-366
de aminoácido s bá sico s ( se cuencia KIKER). 82
II.4. Reduc ción de lo s efecto s horm onales inducido s por la TRH
en canales h-ERG carentes del seg mento 155-209. 87
II.5. Supresión de lo s efecto s horm onales inducido s por la TRH
en canales h-ERG con mutacione s puntuales en el lazo S4-S5. 89
III. Estudio de las interaccione s intramoleculares en el canal h-ERG. 94
III.1. Análisis de po sibles interaccione s intram oleculares
m ediante el estudio de la modificación del cierre de h-ERG
por el pH extracelular. 94
III.1.1. Efecto de la eliminación de regione s N-terminales
en la modulación del cierre de h-ERG
por la acidificación extracelular. 94
III.1.2. Efecto de las mutacione s del lazo S4-S5
en la modulación del cierre de h-ERG
por la acidificación extracelular. 98
III.2. Análisis de las interaccione s intramolec ulares en h-ERG
m ediante la óxido-reducción de cisteínas . 102
III.2.1. Introducción de cisteínas al inicio del extrem o a mino
y en el lazo S4-S5 de h-ERG para el análisis
de la proximidad entre amba s regione s. 103
III.2.2. Efecto de la oxidación de cisteínas introducidas
en el inicio del extrem o amino y el lazo S4-S5
s o bre las corrientes de h-ERG. 104
III.2.3. Reversión del efecto de la oxidación de cisteínas
introducidas en el inicio del extrem o amino
y el lazo S4-S5 de h-ERG. 106
III.2.4. Efecto de la óxido-reducción de cisteínas introducidas
en el extrem o a mino y el lazo S4-S5 de canale s h-ERG
carentes de do minios citoplas mático s . 107
 III.2.5. Cinética y dependencia de e stado de la oxidación
de cisteínas introducidas en el extrem o amino
y el lazo S4-S5 de h-ERG. 110
III.2.6. Especificidad de lo s efecto s de la oxidación
para el par de cisteínas 3 y 542 introducidas en h-ERG. 111

Discusión 115
I. Relevancia del extrem o amino y del lazo S4-S5 de h-ERG
en las propiedade s cinéticas y termodinámica s del canal. 115
II. Regulación horm onal de h-ERG por TRH:
relevancia de los do minios citoplas mático s del canal. 121
III. Estudio de las interaccione s intramoleculares en el canal h-ERG. 124

Conclusiones 135

Referencias bibliográficas 137

Publicaciones
Abreviaturas
 Abreviaturas - i

AC: A denilato C iclasa. I Ca : corriente de C a 2+.

CAP: 7-metil(ribo)guanosina trifosfato. I Na : corriente de N a +.
cAMP: riboadenosín monofosfato cíclico. I K l : corriente de K + rectificadora anómala.
cDNA: DNA c opia. I K r : componente rápido (“rr apid") de la corriente
Ca v : canales de C a 2+ dependientes de v oltaje. de K + rectificadora retardada cardíaca.
CHO: línea celular de ovario de hámster chino I K s : componente lento (“ss low") de la corriente de
(“cc hinese h amster o vary”). K + rectificadora retardada cardíaca.
CMV: C itom m egalov v irus. IP 3 : inositol 1,4,5-trisfosfato.
CNG : “C C yclic N ucleotide G ated”. K Ca : canal de K + activado por C a 2+.
CTX: toxina del cólera. K ir : canal de K + rectificador anómalo (“ii nward
cRNA: RNA sintetizado a partir de cDNA. rectifier”).
cNBD: Dominio de Unión a Nucleótidos cíclicos K v : canal de K + dependiente de v oltaje.
(“cc yclic N ucleotide B inding D omain”). K 2P : canal de K + con 2 dominios p oro.
DAG: 1,2-d d ia
a cilg g licerol. LB: L uria-B B ertani.
DEPC: d ie e tilp
p irocc arbonato, dietildicarbonato, MAP: Proteína Activada por Mitógeno (“M M itogen
dietiloxidiformato; ácido etoxi-fórmico anhidro. Activated P rotein”).
dNT P: desoxirribonucleótidos trifosfato. MES: ácido 4-m m orfolinee tanoss ulfónico; ácido 2-(N-
d ATP : desoxirriboadenosina trifosfato. morfolino)e e tanoss ulfónico.
d TTP: desoxirribotimina trifosfato. m 7 G(5’ )p p p(5’ )G: 5’ 7-metilguanosina trifosfato
d GTP : desoxirriboguanina trifosfato. 5’ guanosina.
d CTP : desoxirribocitosina trifosfato. MLS-9: línea celular que proviene de la microglía
DTT: DL-D D itt iott reitol o threo-1,4-dimercapto-2,3- cerebral de rata.
butanodiol. Na v : canal de N a + dependiente de v oltaje.
EDTA: ácido e tilend d iaminott etraa a cético. PAS: “P P er-A
A rnt-S
S im”.
ERG/ erg : “e e ther-a-go-go r elated g ene”. PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
h-ERG /h -erg : “h h uman e ther-a-go-go r elated (“P P olymerase C hain R eaction”).
gene”. PIP 2 : fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato.
r-ERG /r- erg : “rat ether-a-go-go r elated PKA, B , C : Protein Quinasa A, B, C.
gene”. PLC: Fosfolipasa C.
m-E RG/ m- erg : “m m ouse e ther-a-go-go r elated PMA:
-forbol-12-miristato-13-acetato.
gene”. PRL: P roll actina.
m- ergb1 : variante de m-erg generada por PP 2A : Proteín Fosfatasa 2A.
procesamiento alternativo del transcrito RNasa : R NA hidrola a sa .
primario. (r)NTP: (ribo)nucleótidos trifosfato.
EAG/ eag : “e e ther-a a -gg o-go”. (r)ATP : (ribo)adenosina trifosfato.
r-EAG /r- eag : “rr at e ther-a a -g
g o-go”. (r)TTP : (ribo)timina trifosfato.
h-EAG /h - eag : “h h uman e ther-a a -g
g o-go”. (r)GT P: (ribo)guanina trifosfato.
ELK/ elk : “e e ag-ll ikk e”. (r)CTP : (ribo)citosina trifosfato.
ERK: Quinasa Regulada por Señales r.p .m.: r evoluciones p or m inuto.
Extracelulares (“E
E xtracellular S ignal s.e. m. : error estándar de la media (“ss tandard
Regulated K inase”). error of the m ean”).
FRET: Transferencia de Energía de SHP : Proteína Homóloga a Src (“S S rc H omology
Fluorescencia por Resonancia (“F F luorescence Protein”).
Resonance E nergy T ransfer”). SK: canal de K+ dependiente de Ca2+ de baja
GFP: Proteína Fluorescente Verde (“G G reen conductancia (“ss mall K ”).
Fluorescence P rotein”). Src: S arr coma.
GH 3 : línea celular de la hipófisis anterior de rata. tbHO 2 : tert-butilhidroperóxido.
GH 4 /C 1 : línea celular de la hipófisis anterior de T h : T emperatura de h ibridación.
rata derivada de la GH3. TRP: “T T ransient R eceptor P otencial”.
HCN : “H
H yperpolarization-activated C yclic TRH: Hormona Liberadora de Tirotropina
Nucleotide-modulated”. (“T T hyrotropin-R R eleasing H ormone”).
HEK-293 : línea celular embrionaria de riñón R-TR H: r eceptor de T R H.
humano; (“h h uman e mbrionary k idney”). TSH : Tirotropina u Hormona Estimulante del
HEPE S: ácido N-(2-h p iperazina-N’-(2-
h idroxiee til)p Tiroides (“T T hyroid S timulating H ormone”).
etanoss ulfónico); ácido 4-(2-h
h idroxietil) Tris: tris (hidroximetil)aminometano; 2-amino-2-
piperazina-1-e e tanoss ulfónico. hidroximetil-propano-1,3-diol.
VSD : Dominio Sensor del Voltaje (“V V oltage
Sensor D omain”).
ii - Abreviaturas

CÓ DIGO AM INO ACÍD ICO

-L-aminoácido Código de una letra Código de tres letra s

Alanina A Ala
Arginina R Arg
Asparragina N Asn
Aspartato D Asp
Cisteína C Cys
Fenilalinina F Phe
Glicina G Gly
Glutamato E Glu
Glutamina Q Gln
Histidina H His
Isoleucina I Ile
Leucina L Leu
Lisina K Lys
Metionina M Met
Prolina P Pro
Serina S Ser
Tirosina Y Tyr
Treonina T Thr
Triptófano W Trp
Valina V Val
Introducción
 Introducción - 1

I. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL CANAL h-ERG

I.1. El canal h-ERG (Kv11.1): un canal iónico dependiente de voltaje.

El canal h-ERG (“human ether-à-go-go related gene”) es un canal de K+ dependiente

de voltaje codificado por el locus h-erg (ó KCNH2) y que pertenece a la superfamilia de
canales iónicos “relacionados con los operados por voltaje” (VGL, “Voltage-Gated-Like”;
revisado por Yu et al., 2005) y denominados “de lazo en el poro” (“pore loop”; revisado por
Ashcroft, 2006). La seña de identidad común a todos los componentes de esta superfamilia
es la presencia de un lazo hidrofóbico denominado H5, intercalado entre las dos últimas
hélices transmembranales de la proteína, que contribuye a la formación del poro de
permeación y/o el filtro de selectividad del canal.

Como se muestra en la Figura 1, la superfamilia de canales “de lazo en el poro”

engloba varias familias de canales que median el flujo de cationes mono y/o divalentes y
que son selectivos para Na+ (i.e. NaV), K+ (i.e. Kir, Kv, K2P y KCa), Ca2+ (i.e. CaV y ciertos
TRP), o bien con una selectividad mezclada a mono y divalentes (i.e. CNG, HCN y ciertos
TRP). En general, todos ellos adoptan una estructura tetramérica de cuatro subunidades

que se ensamblan en la membrana plasmática, configurando un poro hidrofílico central a
través del cual difunden pasivamente los iones. Aún cuando esta estructura básica es
mantenida en todos los casos, existen dos excepciones a esta configuración: en miembros
de las familias K2P, ensamblados como un dímero que presenta dos dominios “de lazo en el
poro” en cada uno de los polipéptidos, y por los NaV y CaV, en los que la estructura
correspondiente al tetrámero está contenida en un único polipéptido con cuatro módulos
análogos a cada una de las subunidades de los otros canales, generados por la duplicación
sucesiva de un gen ancestral hasta constituir el gen codificante del tetrámero completo
(revisado por: Yu et al., 2005; Ashcroft, 2006).

Todos los canales “de lazo en el poro” parecen haber evolucionado de un antepasado
común con una estructura equivalente a la de los actuales Kir (“ir” de “inward rectifier”)
constituidos por un tetrámero de subunidades, cada una con sólo dos segmentos
transmembranales entre los que se sitúa el lazo del poro. A este canal ancestral único se
agregó un módulo proteico formado por las hélices transmembranales S1-S4 que conforma
el llamado dominio sensor de voltaje (VSD, “Voltage Sensor Domain”), dando lugar en
conjunto a la típica estructura de seis hélices transmembranales (S1-S6, con S1-S4 del VSD
y S5-S6 del dominio poro) de cada subunidad
. Una interesante excepción a esta
organización con 6 hélices se presenta en los componentes de la familia slo [e.g. KCa1.1
(BK) y KCa5.1] en los que la presencia de un segmento hidrofóbico adicional aminoterminal
da lugar a una séptima hélice transmembranal (denominada “S0”), que sitúa
excepcionalmente al extremo amino del polipéptido en la cara extracelular de la membrana,
y no en la cara interna en la que se localizan tanto el extremo amino como el carboxilo del
resto de los canales “de lazo en el poro”.
A las subunidades
que constituyen el cuerpo central del canal iónico pueden
asociarse otros polipéptidos que, por contraposición y de modo general, suelen denominarse
2 - Introducción

subunidades . La asociación entre el tetrámero de subunidades
y la(s) subunidad(es) 

puede ser relativamente promiscua y variada, modulando en muchos casos la función del
canal y modificando así sus propiedades biofísicas y/o su regulación fisiológica (revisado
por: Yellen, 2002; Yu et al., 2005; Ashcroft, 2006).

Figura 1. Superfamilia de canales iónicos “de lazo en el poro” o “relacionados con los operados por
voltaje” (VGL).
Se muestra la representación gráfica de las relaciones entre los “canales relacionados con los operados por
voltaje” (VGL) adaptada de Yu et al., 2005. Se destaca en color rojo la posición de los canales ERG (Kv11). La
topología estructural característica de los canales prototípicos de las diferentes familias se esquematizan en el
exterior.

Es interesante indicar que, dentro del dominio sensor de voltaje (VSD) constituido por
las hélices S1-S4, el segmento transmembranal S4 presenta una secuencia aminoacídica
aparentemente poco frecuente en una hélice transmembranal, en la que cada dos residuos
hidrofóbicos se alterna uno con carga positiva (lisina o arginina). Este segmento S4
constituye precisamente un motivo central para la detección del campo eléctrico, cuyas
 Introducción - 3

variaciones determinan la activación/desactivación de los canales dependientes de voltaje.

Las hélices S1-S4 del VSD junto con los lazos intracelulares S2-S3 y S4-S5 están muy
conservados en canales como los Kv, CNG y HCN; por contra, los lazos extracelulares
S1-S2 y S3-S4 presentan una gran variabilidad (Warmke & Ganetzky, 1994).
Se ha comprobado que el VSD no sólo aparece en canales iónicos sino también en
otras proteínas de membrana sin dominio poro, como fosfatasas e intercambiadores Na+/H+,
aportando sensibilidad al voltaje a la actividad enzimática de alguna de las mismas.
Asimismo, se ha observado la operación de dominios VSD como poros aislados capaces de
mediar el flujo transmembranal de H+ (revisado por: Okamura, 2007; Bezanilla, 2008). Sin
embargo, es interesante indicar que no todos los canales que contienen VSD operan como
dependientes de voltaje. Este es el caso de los canales tipo SK (“small K”) de la familia KCa,
activados exclusivamente por las elevaciones del calcio intracelular; los canales CNG
(“Cyclic Nucleotide Gated”), operados por nucleótidos cíclicos; o varios de los canales TRP
(“Transient Receptor Potencial”), modulados por distintos estímulos sensoriales de forma
independiente de voltaje. Las razones para el mantenimiento del VSD en estas proteínas y
la implicación funcional del mismo permanecen aún por dilucidar.
Notablemente, mientras la presencia del VSD en la práctica totalidad de los canales
dependientes de voltaje confiere a éstos la capacidad de ser activados por despolarización,
la operación del VSD en los canales de la familia HCN (“Hyperpolarization-activated Cyclic
Nucleotide-modulated”) supone su apertura a potenciales negativos. Por último, si bien la
activación de los canales Kir carentes de VSD se produce tan sólo a voltajes
hiperpolarizantes, tal comportamiento es debido a un bloqueo dependiente de voltaje del
poro a potenciales positivos, mediante una partícula inhibitoria constituida por iones Mg2+ o
una poliamina (revisado por Lu, 2004).

Dentro de las varias familias englobadas en los canales “de lazo en el poro” operados
por voltaje se encuentra la familia denominada eag (“ether-à-go-go”), en la que se incluye
h-ERG. El prototipo de esta familia de canales es el codificado por el locus eag de
Drosophila y cuya denominación proviene del peculiar fenotipo que exhiben las moscas
mutantes en el mismo, con una agitación característica de las patas bajo anestesia con éter.
En la nomenclatura actual para los canales dependientes de voltaje selectivos para iones K+,
esta familia comprende los canales Kv10-12 y agrupa tres subfamilias: Kv10,
correspondiente a eag; Kv11, correspondiente a los erg (“eag-related gene”); y, Kv12 ó elk
(“eag-like”). Hace algunos años se identificaron 3 tipos del locus erg en rata, erg1, erg2 y
erg3 (Shi et al., 1997) y, posteriormente, sus homólogos humanos h-erg1, h-erg2 y h-erg3
(Bauer et al., 2003). Se ha venido utilizando la nomenclatura genérica de “h-erg” para
referirse a la isoforma génica h-erg1, aunque en los últimos años se está utilizando también
el término KCNH2. En esta Memoria utilizaremos “h-ERG” para referirnos al canal codificado
por el gen h-erg1 ó KCNH2 y correspondiente a Kv11.1 en la actual nomenclatura.

I.2. Características estructurales de los canales ERG.

Como hemos comentado, h-ERG, al igual que muchos otros canales “de lazo en el
poro”, presenta la estructura cuaternaria básica de cuatro subunidades
, cada una de las
4 - Introducción

cuales con seis hélices
transmembranales S1-S6 (Figura 2). Es interesante hacer notar
que desde la última hélice del VSD (S4) a la primera del dominio poro (S5), se extiende el
lazo conector intracelular S4-S5. Debido a su situación, este lazo es considerado como el
elemento que transfiere las reorganizaciones del VSD en respuesta a variaciones en el
potencial de membrana hasta el dominio poro, para que la compuerta del canal cambie de
conformación y permita el acceso de los iones al conducto de permeación. De hecho, este
papel del lazo S4-S5 como acoplador entre el sensor de voltaje y la compuerta ha sido
propuesta para varios tipos de canales como los Kv, CNG y HCN (Chen et al., 2001; Lu et
al., 2002; Latorre et al., 2003; Decher et al., 2004; Soler-Llavina et al., 2006) así como en el
propio h-ERG (Sanguinetti & Xu, 1999; Tristani-Firouzi et al., 2002; Piper et al., 2005; Ferrer
et al., 2006). También es interesante indicar que dentro del polipéptido, la parte
correspondiente al cuerpo central hidrofóbico es la más conservada filogenéticamente entre
los canales Kv, CNG y HCN. En el caso de h-ERG, la secuencia en esta región central
mantiene un 49% de identidad con el canal EAG de Drosophila (Warmke & Ganetzky, 1994)
que alcanza un 96% respecto a su homólogo de rata r-ERG (Bauer et al., 1998).

Como cualquier proteína de membrana con un número par de hélices

transmembranales, los dos extremos amino y carboxilo de h-ERG están orientados hacia la
misma cara de la membrana plasmática. Así, cuando la proteína está en su estado funcional
ensamblada e insertada en la membrana, ambos extremos son citoplasmáticos. Estos
segmentos citoplasmáticos son los que presentan una mayor heterogeneidad entre los
diferentes canales. De hecho, según la función que desempeñen en el ensamblaje del
tetrámero, se pueden distinguir dos patrones fundamentales en los canales Kv, CNG y HCN
(revisado por Yellen, 2002). Por un lado, estarían aquellos canales [e.g. canales tipo Shaker
(Kv1.x) y Kv4.x] que poseen en el extremo amino una región de tetramerización conocida
como dominio T1, implicada no sólo en el ensamblaje de las subunidades del tetrámero,
sino también en su interacción con subunidades  y/o en otras interacciones proteína-
proteína. En otros casos, en el extremo carboxilo suele aparecer un motivo PDZ que
determina la localización subcelular del canal y su unión a ciertos complejos proteicos. En el
caso de los canales de la familia eag, incluido h-ERG, así como los CNG o los HCN por
ejemplo, éstos carecen de dominio T1 en su extremo amino, considerándose por ello que es
el extremo carboxilo el segmento que alberga los determinantes para el ensamblaje del
tetrámero funcional.

El grupo de canales que engloba a los EAG, CNG y HCN muestra una gran homología
en su región C-terminal, presentando todos un Dominio de Unión a Nucleótidos cíclicos
(cNBD, “Cyclic Nucleotide Binding Domain”). Se ha sugerido que el cNBD estaría implicado
en la regulación de h-ERG por cAMP, bien mediante una unión directa del nucleótido al
mismo o mediante fosforilación del dominio vía Proteín Quinasa A (Cui et al. 2000, 2001). En
lo que respecta a la región final del extremo carboxilo, ésta se ha relacionado con la
expresión del canal en la membrana, tanto con su tránsito hacia ella (Kupershmidt et al.
1998, 2002) como con su ensamblaje en forma de tetrámero y su inserción en la membrana
(Jenke et al., 2003). La obtención de la estructura tridimensional de parte del extremo
carboxilo del canal HCN2 por difracción de rayos X (Zagotta et al., 2003) ha resultado de
gran relevancia debido a su homología entre este grupo de canales. Así, es posible que en
 Introducción - 5

el extremo carboxilo de este grupo de proteínas haya tres regiones que puedan participar en
la tetramerización de las cuatro subunidades del canal: la región que une el final de la hélice
S6 con el cNBD denominada “C-linker”, el propio cNBD y la región final del extremo
carboxilo.

Figura 2. Estructura cuaternaria básica y topología de una de las subunidades
de h-ERG.

En el esquema superior izquierdo se muestran las cuatro subunidades
co-ensambladas en la membrana
plástica limitando en el centro el poro hidrofílico que constituye el canal iónico. Una de las cuatro subunidades

aparece de forma separada para una mayor claridad. En cada subunidad, los segmentos transmembranales
S1-S6 se representan como óvalos en la parte superior, con la hélice S4 en color rojo.
En el parte inferior derecha se muestra la topología de una de las subunidades
, con las seis hélices
transmembrana representadas como cilindros en los que de nuevo se resalta en color rojo la S4. El lazo
intracelular S4-S5 se muestra en color violeta. La región H5 implicada en el poro hidrofílico para los cationes K +
se resalta en color amarillo. Dentro del extremo amino, se distinguen el dominio proximal en color verde oscuro
y el dominio eag/PAS en color verde claro. El extremo carboxilo se representa de color magenta destacando el
Dominio de Unión a Nucleótidos cíclicos (cNBD). En la parte superior se señalan las hélices pertenecientes al
dominio sensor de voltaje (VSD) y al dominio poro.

Por su parte, en la porción inicial N-terminal de h-ERG, se encuentra una región

altamente conservada en todos los miembros de la familia eag, denominada por ello dominio
eag, y que comprende desde el residuo 1 al 135 de la proteína. Dentro de esta región, los
residuos 16-135 constituyen a su vez un dominio PAS (acrónimo de “Per-Arnt-Sim”), por lo
6 - Introducción

que los primeros 135 aminoácidos suelen denominarse dominio eag/PAS. El dominio PAS,
con estructuras del tipo “hélice-lazo-hélice”, que está presente en algunas proteínas
procarióticas y eucarióticas, está implicado en interacciones proteína-proteína para factores
que funcionan como sensores (e.g. fotorreceptores) o transductores de señales. Hace
tiempo que se ha resuelto la estructura tridimensional del dominio PAS de h-ERG, no
habiéndose podido determinar la disposición de los primeros 16 residuos, al estar
desorganizados en la estructura cristalina (Morais-Cabral et al., 1998). A este dominio
eag/PAS del extremo amino de h-ERG se le ha atribuido un papel esencial en el control del
proceso de cierre del canal (Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al., 1998, 2000).

Una peculiaridad estructural distintiva de h-ERG es que posee el extremo N-terminal

más largo de todos los miembros de la familia eag y del resto de canales Kv, CNG y HCN
conocidos. Ello es debido a la presencia de una región de unos 260 aminoácidos (residuos
135-397), que es exclusiva y genuina de este canal, situada tras el dominio eag/PAS.
Debido a su proximidad a la primera hélice transmembranal (S1), en nuestro laboratorio
hemos denominado a esta región dominio proximal (Viloria et al., 2000). Nuestro trabajo ha
demostrado el papel esencial de este dominio exclusivo de h-ERG en la característicamente
lenta apertura del canal (Viloria et al., 2000; Gómez-Varela et al., 2002), que ha sido
confirmado en trabajos posteriores (Saenen et al., 2006). Además, también hemos
comprobado que el dominio proximal es necesario para la regulación hormonal de h-ERG
por receptores acoplados a proteínas G, como el de la Hormona Liberadora de Tirotropina
(TRH, “Thyrotropin-Releasing Hormone”), y el de otras hormonas capaces también de
activar la Fosfolipasa C (PLC; Gómez-Varela et al. 2003a).

I.3. Características biofísicas del canal h-ERG.

Al igual que la mayoría de los canales Kv, h-ERG presenta al menos tres estados
básicos: cerrado, abierto e inactivo, de los cuales sólo el estado abierto es conductor de
iones K+ (Figura 3A). En la población de canales de la célula existe un equilibrio entre las
tres conformaciones que es desplazado hacia un lado u otro por el potencial de membrana,
dado que las transiciones entre los estados son dependientes de voltaje. Así, un potencial
de membrana más positivo en el interior que en el exterior tiende a desplazar el equilibrio
hacia la(s) conformación(es) de abierto e inactivo, mientras que un potencial más negativo
en el interior tiende a desplazar el equilibrio en sentido opuesto hacia la conformación de
cerrado.
Según este equilibrio conformacional, para un potencial de membrana negativo (en
reposo), la población de canales se encuentra en su mayoría en estado cerrado. Si por
cualquier circunstancia (e.g. un voltaje aplicado), la membrana plasmática es despolarizada
hacia un potencial menos negativo o positivo, los canales pasan en su mayoría al estado
abierto. Este proceso se conoce como “activación” o “apertura” y ocurre en casi todos los
canales Kv de forma muy rápida en cuestión de milisegundos. Como consecuencia, la
conductancia global de la membrana a K+ aumenta originándose corrientes macroscópicas
de potasio. Cuando los canales Kv se activan por despolarización se dice que presentan una
“rectificación normal”. En canales como h-ERG, si la despolarización se mantiene en el
 Introducción - 7

tiempo, se produce un cambio de conformación al estado inactivo no conductor,

reduciéndose de nuevo la conductancia de la membrana y la corriente macroscópica, en un
proceso conocido como “inactivación”. Como todo equilibrio, esta secuencia es reversible de
modo que, cuando la membrana vuelve al estado de reposo o se le aplica un voltaje
repolarizante, los canales salen de su estado inactivo para volver al estado abierto en un
proceso denominado “recuperación de la inactivación”, tras lo cual el equilibrio se desplaza
de nuevo a la conformación cerrada, reduciéndose las corrientes en un proceso conocido
como “desactivación” o “cierre” del canal.
Es importante indicar que el desarrollo temporal del proceso de apertura de h-ERG
presenta una cinética sigmoide caracterizada por un cierto “retraso”. Por ello, esta lenta
apertura del canal se ha ajustado a modelos cinéticos lineales en los que la activación del
canal se presenta como un proceso multisecuencial que pasa por varios estados cerrados
antes de llegar al estado de abierto, siendo la transición entre al menos dos de estos
estados dependiente de voltaje (Wang et al., 1997a; Kiehn et al., 1999; Gómez-Varela et al.,
2002).

Figura 3. Características biofísicas del canal h-ERG.

(A) Esquema del equilibrio conformacional entre los tres estados básicos de h-ERG. “C”, “O” e “I” representan
respectivamente los estados de cerrado, abierto e inactivo. El mayor tamaño de las flechas entre el estado
abierto e inactivo indica que las transiciones entre ambos son mucho más rápidas que entre los estados de
cerrado y abierto. (B) Registro representativo de una corriente de h-ERG expresada en oocitos de Xenopus,
obtenido mediante el protocolo de voltaje mostrado en la parte inferior. El tamaño de las flechas y las letras
“C”, “O” e “I” tienen el mismo significado que en el panel A.

Desde el punto de vista estructural, h-ERG se clasifica dentro de los canales Kv que se
activan por despolarización y que presentan por ello una rectificación normal. Sin embargo,
debido a su particular cinética, h-ERG se caracteriza por tener una “rectificación anómala” al
ser las corrientes mayores para potenciales negativos que positivos (Figura 3B).
8 - Introducción

Este comportamiento rectificador anómalo es debido a una combinación particular de

velocidades de transición entre los estados abierto, inactivo y cerrado. Así, la activación es
un proceso muy lento en comparación con el de otros canales Kv (e.g. Shaker), llegando a
durar incluso decenas de milisegundos. Debido al solapamiento de la activación lenta con el
rápido proceso de inactivación durante la despolarización, la corriente observada a voltajes
muy positivos es mínima. Cuando seguidamente el potencial de membrana vuelve a ser
negativo, el proceso se revierte y los canales sufren una rápida recuperación de la
inactivación desplazándose hacia la conformación abierta para, posteriormente, cerrarse
muy lentamente manteniéndose así más tiempo activos (Trudeau et al., 1995; Sanguinetti et
al., 1995; Smith et al., 1996; Schönherr & Heinemann, 1996; Spector et al., 1996; Wang et
al., 1997a). Por ello h-ERG, a pesar de activarse por despolarización, da lugar a corrientes
mucho mayores durante la repolarización incluso a concentraciones fisiológicas de potasio a
las que la fuerza ión-motriz para el K+ a voltajes negativos es menor.
Evidentemente, la modificación de las velocidades de transición entre los distintos
estados del canal puede alterar sus propiedades de rectificación. Así, la eliminación del
proceso de inactivación de h-ERG por mutagénesis dirigida (mutante h-ERG S620T, Viloria
et al., 2000) convierte al canal en un “rectificador normal”. De un modo análogo pero en el
extremo contrario, también se han descrito mutaciones en el segmento S4 de Shaker que,
en este caso, transforman dicho canal con rectificación normal en un “rectificador anómalo”
(Miller & Aldrich, 1996).
Es importante destacar en este punto que el comportamiento de h-ERG como
rectificador anómalo es esencial para llevar a cabo su papel fisiológico en numerosos tipos
celulares como se comentará a continuación. Así, cualquier modificación que afecte a sus
características cinéticas puede ser determinante en la fisiología celular. De hecho, se han
descrito numerosos mediadores endógenos, como neurotransmisores y hormonas, capaces
de activar mecanismos de señalización que alteran las características cinéticas de h-ERG
modificando, por tanto, su función fisiológica. Por otro lado, también se han estudiado
multitud de fármacos que por bloquear la función de h-ERG alteran el funcionamiento normal
de las células que lo expresan (e.g. antiarrítmicos de clase III; Spector et al., 1996a).

I.4. Importancia fisiológica de los canales ERG.

El primer cDNA codificante de un canal ERG aislado fue el de la variante humana

h-erg, obtenido de una genoteca de hipocampo y sirviéndose de la homología parcial de su
secuencia con la del locus eag de Drosophila (Warmke & Ganetzky, 1994). Desde entonces,
se ha descrito la expresión de canales ERG en multitud de tejidos de especies de mamíferos
y en Drosophila (Shi et al., 1997; Titus et al., 1997; Wang et al., 1997b; Wymore et al., 1997;
Bauer et al., 1998; Zehelein et al., 2001). Las características cinéticas de los canales ERG
se han podido estudiar tras su expresión heteróloga en sistemas como los oocitos de
Xenopus laevis o en células de mamífero. Gracias a la comparación de estas características
con las observadas en sistemas en los que el canal se expresa de forma nativa, se ha
podido conocer el importante papel desempeñado por estos canales en diferentes procesos
fisiológicos como los que se enumeran a continuación.
 Introducción - 9

I.4.1. Papel de los canales ERG en la repolarización del potencial de acción cardíaco.

Desde hace un tiempo se ha descrito una abundante expresión de canales ERG en

tejido cardíaco humano y de varias especies de mamíferos (Wymore et al., 1997; Zehelein et
al., 2001). También se ha descrito que el locus humano h-erg codifica para el canal
responsable de la corriente IKr, fundamental en la repolarización que finaliza el potencial de
acción de los cardiomiocitos ventriculares (Sanguinetti et al., 1995; Trudeau et al., 1995).

Figura 4. Características de un potencial de acción ventricular y su correspondencia con las distintas

fases del electrocardiograma.
(A) A la derecha se muestran de forma esquemática los gradientes iónicos de un cardiomiocito, según los
cuales el Na+ y el Ca2+ tienden a fluir hacia el interior mientras que el K+ tiende a fluir hacia el exterior durante
las variaciones del potencial de membrana. A la izquierda se muestra la evolución temporal del potencial de
acción ventricular, con una despolarización inicial debida a la corriente de entrada de Na+ (INa), seguida de una
fase de meseta que se debe a un balance controlado entre corrientes, principalmente de Ca2+ hacia el interior
(ICa) y de K + hacia el exterior (IKr é IKs). La finalización del potencial de acción se debe a la lenta aparición de
IKs, el aumento de IKr, debido a sus particularidades cinéticas, y la aparición de la corriente IKl con rectificación
anómala. (B) Representación esquemática de un electrocardiograma ventricular humano en el que se remarca
que el “intervalo QT” entre la onda QRS y T coincide en el tiempo con la duración del potencial de acción.

El potencial de acción de las células ventriculares cardíacas se caracteriza por su larga

duración, con una amplia meseta durante la cual la membrana plasmática se mantiene
despolarizada el tiempo suficiente para permitir la entrada del Ca2+ extracelular necesario
para la contracción muscular (Figura 4A). Esta meseta es mantenida debido a un equilibrio
controlado entre corrientes de entrada de Ca2+ y de salida de K+. El flujo limitado de K+ se
debe fundamentalmente a dos corrientes de salida, una de aparición muy lenta, denominada
por ello IKs (“s” de “slow”), y otra de aparición más rápida, denominada IKr (“r” de “rapid”). La
corriente IKs es mediada por el canal KvLQT1 (Kv CNQ1 ó Kv7.1) al cual se asocia la
subunidad
minK (KCNE1 ó IsK) para regularlo, modificando sus características cinéticas
(Barhanin et al., 1996; Sanguinetti et al., 1996). Por su parte, la corriente IKr es mediada por
10 - Introducción

h-ERG (KCNH2 ó Kv11.1), asociado con otra subunidad
reguladora que podría ser MiRP1
(KCNE2; Abbott et al., 1999; Weerapura et al., 2002) y/o minK (MacDonald et al., 1997). A
pesar de la rápida aparición de IKr, su contribución al mantenimiento de la meseta se basa
en la limitación de esta corriente durante la despolarización debido a las características
cinéticas de h-ERG. De hecho, el comportamiento de h-ERG como rectificador anómalo
hace que la corriente IKr sea mayor al comienzo de la repolarización del potencial de acción.
Por ello, para la finalización del potencial de acción cardíaco es fundamental la corriente IKr,
es decir, el correcto funcionamiento de h-ERG (revisado por Tristani-Firouzi et al., 2001),
junto con la lenta aparición de IKs y la activación de otra corriente tipo rectificador anómalo
denominada IKl.

Debido a este papel fundamental de h-ERG en el control de la duración del potencial

de acción cardíaco, un mal funcionamiento del mismo, bien por el bloqueo mediante agentes
químicos o por la mutación de la proteína, puede producir un alargamiento de dicho
potencial y, como consecuencia, arritmias, fibrilación ventricular y muerte súbita (Curran et
al., 1995; Sanguinetti et al., 1995; Spector et al., 1996b; Witchel & Hancox, 2000). Esta
prolongación del potencial de acción cardíaco se manifiesta en el electrocardiograma (Figura
4B) por un aumento del intervalo entre las ondas QRS y T, las cuales reflejan precisamente
el inicio y la terminación del potencial de acción ventricular. El alargamiento del intervalo Q-T
da lugar al denominado “síndrome QT largo”, que puede ser debido no sólo al mal
funcionamiento de h-ERG sino también de otros canales cardíacos y/o sus subunidades
reguladoras, y que puede ser hereditario (por mutaciones) o adquirido (por el uso de
determinados fármacos). Se han identificado numerosas mutaciones en distintos loci que se
expresan en miocardio y que producen diversos tipos de síndromes QT largo (Tabla 1; ver
revisión de Moss & Kass, 2005). Cuando el síndrome QT largo se produce por un mal
funcionamiento de h-ERG se clasifica como tipo II y, si su origen es hereditario, los cambios
genómicos se localizan en la región q35-36 del cromosoma 7 (Curran et al., 1995), en la que
se encuentra el locus h-erg (Warmke & Ganetzky, 1994).

Síndrome Proteína/gen Corriente cardiaca

QT largo alterada/o
LQT 1 KvLQT1 (KCNQ1 ó Kv7.1) IKs
LQT2 h-ERG(KCNH2 ó Kv11.1) IKr
LQT3 SCN5A (hH1) INa
LQT4 ANK (Ankyrina
) desconocida
LQT5 minK (KCNE1 ó IsK) subunidad
en IKs
LQT6 MiRP1 (KCNE2) subunidad
en IKr
LQT7 Kir2.1 (KCNJ2) IKl
LQT8 Cav1.2 (CACNA1C) ICa

Tabla 1. Tipos de síndrome QT largo.

Se relacionan los tipos de síndrome QT largo con las proteínas y/o genes implicados así como con las corrientes
iónicas a las que éstos contribuyen.
 Introducción - 11

Dada la importancia de h-ERG en la fisiología cardiaca, este canal constituye la diana

molecular de agentes antiarrítmicos de clase III, tales como las metanosulfonoanilidas
“E-4031”, “Dofetilide” y “MK-499” (Spector et al., 1996a). La acción antiarrítmica de estos
fármacos se basa en su capacidad de prolongar la duración del potencial de acción cardíaco
y con ello de alargar el periodo refractario entre las despolarizaciones. Desafortunadamente,
algunos de estos fármacos pueden resultar pro-arritmogénicos bajo ciertas situaciones y
provocar síndromes QT largo de tipo II “adquiridos”, al inducir una prolongación excesiva del
potencial de acción, propiciando la producción de ondas de re-entrada prematuras que
pueden acabar en la aparición de una arrítmica severa denominada “torsión de puntas”
(“torsade de pointes”; Roden, 1998) por la peculiar y distorsionada apariencia del
electrocardiograma asociado a la misma. Es importante recalcar que no sólo estos
compuestos antiarrítmicos pueden bloquear h-ERG y producir síndrome QT largo II, sino
que otros muchos fármacos, incluidos ciertos antihistamínicos y antidiabéticos, pueden tener
consecuencias análogas como un efecto secundario indeseable basado en el bloqueo del
canal.

Es importante notar asimismo que aparte de h-ERG, en los distintos tipos de células
cardíacas se expresan otros varios canales Kv. Además, aparte de su expresión bien
conocida en el ventrículo, h-ERG también es particularmente abundante en otras zonas del
corazón como el nódulo sinoatrial o la aurícula (Schram et al., 2002). Aunque no se conoce
la contribución exacta in vivo de cada corriente a la conductancia total al K+ durante el
potencial de acción cardíaco, es lógico pensar que pequeñas variaciones en el patrón de
expresión de IKr, así como en su cinética y/o magnitud producidas por cualquier proceso
regulador, pueden alterar significativamente las características del potencial de acción de los
cardiomiocitos (Jurkiewicz & Sanguinetti, 1993).

I.4.2. Papel de los canales ERG en el sistema nervioso y las células neuroendocrinas.

Desde hace algunos años se ha descrito la abundante expresión de erg en el tejido

neuronal de muchos mamíferos (Wymore et al., 1997), sugiriendo que estos canales podrían
desempeñar una importante función en la fisiología del sistema nervioso. Esta posible
función es apoyada por la observación de que mutaciones en el locus erg de Drosophila
producen un fenotipo caracterizado por una hiperexcitabilidad neuronal (Titus et al., 1997;
Wang et al., 1997b). Se ha demostrado que las isoformas erg2 y erg3 se expresan en el
tejido nervioso y no en el cardiaco (Shi et al., 1997), y aunque no se conoce el significado
fisiológico de esta expresión diferencial, se ha descrito su expresión en distintas zonas del
sistema nervioso central de rata, relacionándolas con el control de la actividad eléctrica de
los distintos tipos neuronales (Papa et al., 2003).
También se ha detectado la expresión de erg en microglía (Zhou et al., 1998) y
astrocitos de hipocampo, donde se sugiere que desempeñan un papel fundamental en la
homeostasis del K+ y la excitabilidad neuronal (Emmi et al., 2000). Por otro lado, se ha
descrito también una corriente de características cinéticas y farmacológicas semejantes a la
codificada por erg en una línea celular de ganglio dorsal de rata (Favarelli et al., 1996) y
cuyo bloqueo produce una disminución en la adaptación de la frecuencia de producción de
12 - Introducción

potenciales de acción de estas células (Chiesa et al., 1997), sugiriendo que la expresión de
erg podría contribuir a la excitabilidad de algunas células neuronales de mamíferos.
Por otro lado, en el sistema nervioso, los canales ERG se han implicado no sólo en la
excitabilidad y actividad eléctrica, sino también en la neuritogénesis y la diferenciación
neuronal (Arcangeli et al., 1993, 1995; Faravelli et al., 1996). Este papel se debe a la
contribución de ERG al mantenimiento del potencial de membrana basal. Así, los canales
rectificadores anómalos harían que, en células como las neuronas o las musculares, el
potencial basal se mantenga entre los -60 y -80 mV. Sin embargo, en algunos tipos
celulares, al no expresarse los rectificadores anómalos “clásicos” y hacerlo en su lugar
canales ERG, el potencial basal se mantiene entorno a -50 mV. De esta manera, en ciertos
tejidos del sistema nervioso se produce una expresión transitoria de erg durante los estadios
más tempranos de diferenciación neuronal, mientras que en los más tardíos se expresan
otros rectificadores anómalos clásicos (IRK1). La expresión secuencial de las corrientes
codificas por erg y por IRK1 provoca dos niveles de potencial basal de membrana: un
potencial más positivo durante las primeras etapas, que se desplaza hacia valores más
negativos a medida que se progresa en la diferenciación (Arcangeli et al., 1995, 1997).
Además de haberse involucrado la expresión de erg en el desarrollo del sistema nervioso,
también se le ha implicado en el del tejido muscular (Crociani et al., 2000). Por último, se ha
descrito la expresión de erg en células neuronales periféricas, detectándose una corriente
con las características de la codificada por este locus en células intersticiales de Cajal de
intestino delgado, proponiéndose su participación en el control del potencial de membrana
basal así como en la actividad marcapasos de las mismas (Zhu et al., 2003).

El papel de los canales ERG en células endocrinas es más conocido que en las
neuronas, contribuyendo tanto a la exicitabilidad como al mantenimiento del potencial de
membrana basal. Así, son varios los trabajos en los que se ha descrito el relevante papel de
ERG en la excitabilidad necesaria para que las células adenohipofisarias,
-pancreáticas o
cromafines desempeñen su función fisiológica de secreción de neurotransmisores y
hormonas (Corrette et al., 1995; Bauer et al., 1999; Rosati et al., 2000; Lecchi et al., 2002;
Gullo et al., 2003). De hecho, fue precisamente en nuestro laboratorio donde por primera
vez se describió que la corriente inhibida por la TRH para incrementar la frecuencia de
producción de potenciales de acción (y con ello la concentración de Ca2+ intracelular y los
niveles de secreción) era precisamente ERG (Barros et al., 1997). Ello ha enfatizado
asimismo la importancia fisiológica de las corrientes codificadas por erg en las células
adenohipofisarias en la excitabilidad y mantenimiento del potencial de membrana basal
(Barros et al., 1992, 1994; Bauer et al., 1999; Schäfer et al., 1999).

I.4.3. Papel de los canales ERG en las células tumorales.

Se ha descrito que la inhibición de canales de K+ afecta a la proliferación de muchos

tipos celulares. De hecho, hace algún tiempo se comprobó que las células en fase G0
muestran un potencial más negativo que las tumorales o las que ya han entrado en el ciclo
celular (Binggeli & Weinstein, 1986). Posteriormente se ha indicado que la actividad de los
canales de K+ podría servir para regular el potencial de membrana en las distintas fases del
 Introducción - 13

ciclo celular (Wonderlin & Strobl, 1996), comprobándose que una gran variedad de
bloqueantes de canales de K+ son capaces de detener dicho ciclo en diferentes puntos
(Pardo, 2004; Felipe et al., 2006).

En base a estos y otros antecedentes, se ha postulado que el potencial de membrana

permanentemente despolarizado, propio de las células tumorales, puede deberse a la
pérdida de expresión de rectificadores anómalos clásicos y la aparición de corrientes
codificadas por erg (Arcangeli et al., 1995; Faravelli et al., 1996; Bianchi et al., 1998). Así,
debido a las características cinéticas de los canales ERG, su probabilidad de apertura se
hace máxima entre -50 y -30 mV, contribuyendo a mantener este potencial de membrana
más positivo. De hecho, se ha descrito una sobre-expresión de h-ERG en varios tipos de
células tumorales, demostrándose cómo su inhibición bloquea de forma drástica la
proliferación de las mismas (Arcangeli et al., 1995; Bianchi et al., 1998; Cherubini et al.,
2000; Crociani et al., 2003). Todo ello ha llevado a proponer que h-ERG juega un papel
relevante en el desarrollo y supervivencia de las células tumorales. Así, la expresión del
canal mejoraría la supervivencia de las células neoplásicas en dos aspectos: manteniendo
un potencial de membrana basal más positivo, que proporciona una entrada más rápida en
mitosis, y facilitando la supervivencia en el ambiente isquémico propio del crecimiento
tumoral, con unos altos niveles de K+ extracelular, situación en la que la actividad de los
canales ERG está muy favorecida (Bianchi et al., 1998).
Se ha descrito que en las células de neuroblastoma en condiciones de hipoxia las
características cinéticas de h-ERG están modificadas. Así, se produce una ralentización del
cierre, un desplazamiento de la dependencia de voltaje de activación hacia potenciales más
positivos y un retraso en la recuperación de la inactivación. Estas alteraciones hacen que la
corriente h-ERG aumente su magnitud para potenciales de membrana negativos próximos al
de reposo, contrarrestando la despolarización que se produce en los entornos hipóxicos
propios del desarrollo tumoral (Fontana et al., 2001). A su vez, se ha descrito el papel de
h-ERG en la regulación de la proliferación y apoptosis de distintas líneas celulares (Pillozzi
et al., 2002; Smith & Yellen, 2002; Wang et al., 2002). Finalmente, se ha observado que
h-ERG se sobre-expresa en cánceres de endometrio (Cherubini et al., 2000), colorectales
(Lastraioli et al., 2004) y leucemias mieloides (Pillozzi et al., 2002). Dado que los canales
iónicos son proteínas accesibles desde el exterior celular, estos estudios han convertido
tanto a h-ERG como a otros canales de la familia eag, también sobre-expresados en células
tumorales (Pardo et al., 2005; Hemmerlein et al., 2006), en excelentes candidatos como
marcadores moleculares para distinguir las células tumorales de las normales o las
simplemente hiperplásicas.

II. RELACIONES ESTRUCTURA-FUNCIÓN EN h-ERG Y

OTROS CANALES Kv, CNG y HCN

Desde los primeros trabajos de Hodgkin y Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952) hasta
nuestros días, el avance en las técnicas de Biología Molecular y Celular, la Electrofisiología
y el perfeccionamiento de técnicas de determinación estructural como la Cristalografía de
14 - Introducción

Rayos X, la Resonancia Magnética Nuclear, la Microscopía Electrónica y la Fluorimetría, han

permitido establecer relaciones entre una estructura y su función, identificando algunos de
los determinantes moleculares de los distintos parámetros biofísicos de los canales iónicos.
Algunos de estos avances referidos a h-ERG y ciertos canales similares se recogen a
continuación.

II.1. El proceso de inactivación en h-ERG y otros canales Kv.

El proceso de inactivación es una característica de ciertos canales que determina el

tiempo que éstos pueden conducir corriente, una vez alcanzado el estado de abierto, en
respuesta a la despolarización de la membrana. En base a sus características y a los
determinantes estructurales que participan en este proceso, se han descrito dos tipos de
inactivación: la “inactivación tipo N” y la “inactivación tipo C”.

La inactivación tipo N generalmente se considera un proceso rápido y sus

determinantes estructurales fueron inicialmente estudiados en el canal Shaker (Hoshi et al.,
1990; Zagotta et al., 1990). Su mecanismo molecular es conocido como de “bola y cadena” y
se basa en la oclusión del poro iónico desde su cara interna, por medio de la región inicial
del extremo amino con estructura globular y caracterizado por su densidad de carga
positiva. Esta “bola” actuaría como una partícula inactivante unida al canal por una larga
“cadena” polipeptídica y se acercaría al poro por atracción electrostática con los residuos
negativos del lazo intracelular S4-S5 (Isacoff et al., 1991; Holmgren et al., 1996; Manuzzu et
al., 1996). Por su parte, la “cadena” desempeñaría un importante papel en la modulación de
la inactivación tipo N, facilitando el posicionamiento de la “bola” respecto al cuerpo central
del canal (Hoshi et al., 1990). Sin embargo, la correlación entre la longitud de la “cadena” y
la modulación de la inactivación no es general, ya que en otros canales se han identificado
secuencias que modulan dicho proceso (Chiara et al., 1999). Por último, este tipo de
inactivación puede ser conferida por subunidades
reguladoras que aportan la “bola”
inactivante a canales heteromultiméricos (Heinemann et al., 1994; Retting et al., 1994).
La inactivación tipo C (término proviniente de ser insensible a la eliminación del
extremo amino y atribuído sin ninguna base sólida al extremo carboxilo) generalmente ha
sido asociada a un proceso lento, aunque en muchos casos no es así. Los determinantes
estructurales implicados en este tipo de inactivación son la región extracelular del poro y el
segmento S6 (Hoshi et al., 1991; López-Barneo et al., 1993; Herzberg et al., 1998; Zou et
al., 1998). El mecanismo de inactivación tipo C propuesto conlleva una serie de cambios
conformacionales que culminan en una oclusión del poro conductor por su cara externa, la
cual puede ser revertida por una elevación de la concentración externa de iones permeantes
como el K+.

El canal h-ERG muestra una inactivación tipo C, pero con algunas peculiaridades. En
primer lugar, es un proceso extremadamente rápido que, a diferencia de la inactivación tipo
N ó C clásicas, es dependiente de voltaje en el rango en el que también lo es la activación.
En segundo lugar, la recuperación de la inactivación en h-ERG es un proceso sumamente
rápido y puede ser ralentizada al aumentar la concentración de iones K+ externos, al
 Introducción - 15

contrario de lo que ocurre con la inactivación tipo C “clásica” (Rasmusson et al., 1998).
Finalmente, las altas concentraciones extracelulares de Cs+ también ralentizan la
recuperación de la inactivación, al contrario de lo que ocurre en canales como Shaker
(López-Barneo et al., 1993; Zhang et al., 2003).
Los determinantes moleculares de la particular inactivación tipo C de h-ERG aún están
por esclarecer. En algunos trabajos se ha demostrado que se pueden transferir las
características de inactivación de h-ERG al canal codificado por m-eag (homólogo de ratón
de eag) al introducirle a éste la región del poro y parte de la hélice S6 del primero (Herzberg
et al., 1998), indicándose asimismo que el lazo entre el segmento S5 y el poro, el cual
presenta una secuencia muy diferente en h-ERG respecto a otros canales Kv, desempeña
una función importante en la inactivación del canal (Liu et al., 2002; Torres et al., 2003). Por
otro lado, se ha sugerido que existe un sensor de voltaje independiente del que activa al
canal (el VSD) para la inactivación, haciendo este proceso también dependiente de voltaje
(Wang et al., 1996; Johnson et al., 1999). También se ha postulado que la hélice S4 actúa
como sensor para la activación y la inactivación, moviéndose lentamente en el primer
proceso y rápidamente en el segundo (Smith & Yellen, 2002; Piper et al., 2003, 2005).
Como ya se ha indicado anteriormente, la inactivación tipo C rápida y dependiente de
voltaje de h-ERG, es un determinante esencial para su comportamiento como rectificador
anómalo, debido al solapamiento de ésta con la lenta activación, que limita enormemente las
corrientes a voltajes positivos (Smith et al., 1996). De hecho, se podrían obtener niveles
notables de corriente al despolarizar si la activación fuese, al igual que la inactivación, un
proceso rápido, como ocurre en los canales Shaker de Drosophila. Por último, recordar que
este comportamiento como rectificador anómalo es fundamental para el papel de h-ERG en
los procesos fisiológicos en los que interviene.

II.2. El proceso de apertura y cierre en h-ERG y otros canales Kv,

CNG y HCN.

II.2.1. El sensor de voltaje de los canales Kv, CNG y HCN.

En los primeros trabajos de Hodgking y Huxley ya se predecía que el proceso de

activación de los canales dependientes de voltaje debía de estar regido por un movimiento
de cargas en el seno de la membrana plasmática. Inicialmente se propuso que los
movimientos de carga durante la activación se debían a cambios conformacionales en el
segmento S4, que presenta una peculiar densidad de carga positiva y se encuentra muy
conservado en todos los canales dependientes de voltaje (Larsson et al., 1996). La peculiar
densidad de carga positiva de la hélice S4 está determinada por la presencia de residuos de
arginina o lisina, intercalados cada dos aminoácidos hidrofóbicos. Alteraciones de la
secuencia del segmento S4, no sólo en los residuos básicos sino también en los apolares,
hacen que se modifique la sensibilidad al potencial de membrana, así como la dependencia
de voltaje de activación (Papazian et al., 1991; Miller & Aldrich, 1996; Ledwell & Aldrich,
1999; Marten & Hoshi, 1998; Zei & Aldrich, 1998).
16 - Introducción

En un primer momento, se indicó que la hélice S4 sufriría un desplazamiento

perpendicular a la membrana en respuesta a la despolarización (Larsson et al., 1996;
Mannuzzu et al., 1996; Baker et al., 1998), de forma que el mecanismo de apertura del canal
se basaría en un movimiento de los cuatro segmentos S4 de las subunidades
, que
configuran el tetrámero, por separado, hasta llegar a un paso cooperativo en el que se abre
el canal (Baker et al., 1998; Schoppa & Sigworth, 1998; Pathak et al., 2005). Este
mecanismo aportaría una base molecular para la cinética sigmoide que muestra la
dependencia de voltaje durante la activación.

Desde hace un tiempo se considera que no es sólo el segmento S4, sino todo el VSD
en conjunto (S1-S4), el que sufre cambios conformacionales en respuesta a variaciones en
el potencial de membrana (Durell et al., 1998) y que serán transmitidos subsiguientemente al
módulo S5-S6 que configura el poro (dominio poro). El movimiento de la hélice S4 es hoy en
día objeto de gran controversia. Algunos autores apoyan el modelo de “paletas”, que se
basa en considerar a la segunda mitad de la hélice S3 y la S4 como una unidad funcional,
constituyendo un motivo “hélice-giro-hélice” que actúa como una “paleta” que abre el canal.
Así, en el estado cerrado la “paleta” se situaría en la hemicapa lipídica interior y, cuando el
canal se abre, ésta se trasladaría a la hemicapa exterior, quedando parte de ella expuesta al
medio extracelular. De esta forma, el segmento S4 pasaría de una posición horizontal
paralela a la membrana a una posición vertical, experimentando un largo movimiento de
traslación a través de la bicapa lipídica que tiraría del lazo S4-S5, produciendo un
desplazamiento del segmento S5 que culminaría con una apertura de la “compuerta” del
canal a nivel de la hélice S6. Además, el movimiento de las cargas positivas (residuos
básicos) del segmento S4 sería asistido por cargas negativas (residuos ácidos) en el
segmento S2 (Jiang et al., 2003a, 2003b; Long et al., 2007).
Sin embargo, una mayoría de autores apoyan un modelo tipo “transportador”, basado
en el mecanismo por el cual algunas de estas proteínas (e.g. bomba Na+/K+) responden a
cambios en el potencial de membrana. Así, en la región que rodea a la hélice S4 existirían
profundas hendiduras por las cuales el medio acuoso penetraría en la bicapa lipídica,
determinando alrededor de dicha hélice un campo eléctrico muy diferente al del resto de la
membrana, confiriendo a esta región la máxima sensibilidad a cambios de voltaje. Por ello,
la hélice S4 no efectuaría movimientos de traslación tan largos, sino que experimentaría un
movimiento longitudinal corto, acompañado de una rotación sobre su eje y un cambio en su
inclinación (traslación-rotación-torsión), de forma que las hélices S4 y S5 se mantendrían
próximas entre sí, produciéndose contactos entre ellas (Cha et al., 1999; Glauner et al.,
1999; Broomand et al., 2003: Ghandhi et al., 2003; Lee et al., 2003; Neale et al., 2003; Laine
et al., 2003; Posson et al., 2005; Soler-Llavina et al., 2006; revisado por Bezanilla, 2008).
Por último, en un trabajo relativamente reciente, utilizando un modelado molecular de Kv1.2
y KvAP basado en el método computacional “Rosetta”, se ha propuesto que el movimiento
de la hélice S4 y de todo el VSD puede tener diferentes amplitudes según el tipo de canal
que se trate (Yarov-Yarovoy et al., 2006).
 Introducción - 17

II.2.2. El sensor de voltaje de h-ERG.

El mecanismo molecular responsable de la lenta cinética de apertura de h-ERG no se

ha podido determinar con exactitud. En un trabajo utilizando técnicas fluorimétricas en
condiciones de “clamp de voltaje” (Smith & Yellen, 2002) se ha descrito cómo la hélice S4
realiza dos tipos de movimientos: uno lento asociado a la activación y otro rápido asociado a
la inactivación, movimientos que han sido constatados también en trabajos midiendo las
“corrientes de compuerta” (corrientes capacitivas asociadas con la activación; Piper et al.,
2003, 2005). Los motivos por los cuales el segmento S4 de h-ERG se mueve de forma tan
lenta pueden ser varios según los diferentes autores: la interacción electrostática entre los
residuos positivos del segmento S4 y otros negativos del VSD (Liu et al., 2003), la baja
contribución de las cargas positivas de la hélice S4 a las “corrientes de compuerta” (Zhang
et al., 2004) o una posible interacción de ciertos residuos del segmento S4 con los lípidos de
la membrana (Subbiah et al., 2004, 2005). La posibilidad de que otros dominios de h-ERG,
incluidos los presentes en las regiones citoplasmáticas, puedan también contribuir a este
lento comportamiento del sensor, no ha sido explorada en profundidad hasta el momento.
Algunos estudios han relacionado variaciones en la secuencia de la hélice S4 de ERG
con cambios cinéticos que afectan a su función fisiológica. Así, al expresarse en oocitos de
Xenopus la isoforma de erg del músculo liso de colon de rata (“erg1-sm”), se observó que
las corrientes presentaban diferencias cinéticas respecto a aquellas codificadas por la
isoforma cardiaca. Sorprendentemente, los canales ERG1-sm se caracterizan por presentar
cinéticas de apertura y cierre rápidas, atribuidas a la presencia de una alanina en lugar de
valina en el segmento S4, comprobándose efectivamente que al revertir este cambio de
residuo se recuperaba la cinética de ERG cardíaco (Shoeb et al., 2003). Por otra parte,
también se han encontrado en individuos con síndrome QT largo tipo II mutaciones en el
segmento S4 de h-ERG que producen alteraciones cinéticas en el proceso de apertura y
cierre (Nakajima et al., 1999).

II.2.3. El papel del extremo amino de h-ERG en la apertura y el cierre.

Como se indicó anteriormente, en los canales Kv con inactivación tipo N, el extremo

amino está directamente implicado en la activación debido a su interacción con el cuerpo
central del canal. En otros canales Kv que no presentan este tipo de inactivación, como el
caso de los canales ERG, se ha relacionado al extremo amino con la modulación del
proceso de apertura y cierre. Hace algunos años, en un trabajo con r-EAG [homólogo de
rata del canal EAG humano (h-EAG)] en el que se analizaron las alteraciones que se
producen al eliminar regiones N-terminales, se comprobó que al eliminar los residuos 7-12
se altera la cinética y dependencia de voltaje de activación y se enlentece el cierre (Terlau et
al., 1997). También se ha estudiado la participación en el proceso de apertura y cierre del
extremo amino de KAT1, el rectificador anómalo de vegetales relacionado con la familia eag
y con ERG, relacionándose deleciones N-terminales del mismo con una aceleración del
cierre y con un desplazamiento en la dependencia de voltaje de activación hacia potenciales
más negativos (Marten & Hoshi, 1997, 1998).
18 - Introducción

Según lo mencionado previamente, el extremo amino de h-ERG consta de dos

dominios: el dominio eag/PAS en los primeros 135 residuos, con una secuencia muy
conservada en todos los miembros de la familia eag, y el dominio proximal en la región 135-
397, que es exclusivo de h-ERG. Desde hace años se ha implicado a estos dominios
N-terminales de la proteína en los procesos de apertura y cierre del canal. Así, en un primer
momento se comprobó que canales h-ERG carentes de prácticamente todo el extremo
amino, mostraban una drástica aceleración de la cinética de cierre sin verse afectados de
forma notable ni el proceso de activación ni el de inactivación (Schönherr & Heinemann,
1996; Spector et al., 1996b; Wang et al., 1998). Esta aceleración del cierre también se
observó en el canal homólogo de ratón m-ergb1, que carece de los primeros 340
aminoácidos, debido en este caso al procesamiento alternativo de su transcrito primario
(London et al., 1997). En este mismo trabajo se demostró que la modulación del cierre del
canal m-ERG residía en los primeros 59 residuos N-terminales, ya que la variante carente
de los mismos presentaba las mismas características cinéticas que el canal sin
prácticamente toda la región N-terminal. Posteriormente, también se observó que la
aceleración del cierre de h-ERG inducida por la acidificación extracelular, se reducía en
variantes carentes del extremo amino (Jiang et al., 1999).
Análisis más exhaustivos han demostrado que los efectos sobre el cierre producidos al
eliminar el extremo amino de h-ERG, se deben específicamente a la eliminación del dominio
eag/PAS (Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al, 1998, 2000). Además, al introducir en
oocitos que expresaban el canal carente del extremo amino el péptido eag/PAS, se recupera
el lento cierre característico de h-ERG (Morais-Cabral et al., 1998). Notablemente, ocho
mutaciones puntuales presentes en individuos con el síndrome QT largo tipo II se localizan
en el dominio eag/PAS, las cuales al ser expresadas en oocitos muestran un cierre
acelerado y, algunas de ellas, presentan alterados también ciertos parámetros de activación
(Chen et al., 1999). Otros trabajos han delimitado más la región N-terminal responsable de
la modulación del cierre de h-ERG (Wang et al., 1998, 2000), ubicándola en los primeros 16
residuos, al comprobar que el canal carente de estos primeros aminoácidos presentaba una
cinética de cierre igual que la del canal carente de extremo amino. Posteriormente, también
se comprobó que aplicando el péptido con los primeros 16 residuos a macroparches de
membrana de oocitos que expresan la variante carente de la región N-terminal, se recupera
en parte la lenta cinética de cierre propia del canal nativo. Curiosamente, no se conoce la
estructura de esta región 1-16, ya que se encuentra desorganizada en la estructura
cristalizada del dominio eag/PAS (Morais-Cabral et al., 1998).

Inicialmente, todas las mutaciones y deleciones estudiadas se centraron en el extremo

amino completo o exclusivamente en el dominio eag/PAS de h-ERG. Hace algunos años, en
un estudio realizado en nuestro laboratorio, se demostró que la presencia del exclusivo
dominio proximal del extremo amino constituye un determinante molecular esencial en la
lenta apertura de h-ERG (Viloria et al., 2000). Así, se demostró que, al eliminar
específicamente dicho dominio, la velocidad de apertura se acelera drásticamente y que la
dependencia de voltaje de activación se desplaza hacia valores mucho más negativos. Sin
embargo, no se afectan ni la cinética de inactivación (y recuperación de la inactivación) ni la
de cierre. Es decir, que la eliminación del dominio proximal hace que h-ERG comience a
abrir tras despolarizaciones menos intensas y, además, a mucha mayor velocidad a un
 Introducción - 19

voltaje dado. En este trabajo también se demostró que al eliminar tan sólo 19 aminoácidos
del dominio proximal (región 355-373) se produce cerca de la mitad de estos efectos
observados sobre la apertura (Viloria et al., 2000). En conjunto, nuestro trabajo ha permitido
demostrar que la presencia del dominio proximal exclusivo de h-ERG es un determinante
esencial de su lenta apertura, lo que junto con su rápida inactivación contribuye a su
operación como un rectificador anómalo. En trabajos posteriores hemos propuesto un
modelo cinético según el cual el dominio proximal actuaría como un freno molecular que
ralentiza el proceso de apertura (Gómez-Varela et al., 2002).

Puesto que la modulación del cierre de h-ERG por la región inicial del extremo amino
ha de implicar alguna interacción directa o indirecta con el cuerpo central del canal, desde
hace años y por analogías con el mecanismo de “bola y cadena” implicado en la inactivación
tipo N, aunque sin ningún dato directo que lo sustente, se ha postulado una interacción del
extremo amino de h-ERG con el lazo S4-S5 (Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al., 1998;
Chen et al., 1999; Sanguinetti & Xu, 1999; Gómez-Varela et al., 2002). De hecho, tras la
resolución de la estructura del dominio eag/PAS de h-ERG y al comprobarse que éste
contenía un dominio PAS eucariótico, relacionado en otros sistemas con interacciones
proteína-proteína, se postuló que dicho dominio podría interaccionar con el cuerpo central
del canal para regular el cierre, probablemente a nivel del lazo S4-S5 (Morais-Cabral et al.,
1998). No obstante, es importante recordar que dentro del dominio eag/PAS no es el PAS el
que ha sido relacionado con la maquinaria de apertura y cierre, sino los primeros 16
residuos sin estructura definida (Wang et al., 1998, 2000). Por otra parte, se ha comprobado
que la mutación a cisteína de ciertos residuos del lazo S4-S5 ocasiona una aceleración del
cierre semejante a la que tiene lugar al eliminar los 16 primeros aminoácidos N-terminales,
proponiendo a dicho lazo S4-S5 como el sitio de interacción con el extremo amino (Wang et
al., 1998, 2000; Sanguinetti & Xu, 1999). Asimismo, se ha sugerido que la aceleración del
cierre inducida por la acidificación extracelular podría deberse precisamente a una
interrupción de las interacciones entre el domino eag/PAS y el cuerpo central del canal,
probablemente a nivel del lazo S4-S5 (Liu et al., 2003).
Igualmente, en nuestro trabajo demostrando que la eliminación del dominio proximal
facilita la apertura de h-ERG, ya postulamos que ello era debido a que se favorecía la
interacción del dominio eag/PAS con el cuerpo central del canal (Viloria et al., 2000). En
estudios posteriores de nuestro laboratorio centrados en la secuencia DRY del lazo S4-S5
(muy conservada en otras proteínas de membrana y con dos de los tres residuos cargados
del lazo S4-S5), se comprobó que mutaciones en dicha secuencia eran capaces de
compensar el efecto producido por la eliminación del dominio proximal (Cristina Gutiérrez
Viloria, 2000, Tesis Doctoral). A raíz de estos resultados, en el modelo cinético propuesto
por nuestro laboratorio, sugerimos que la función del dominio proximal como freno molecular
de la activación de h-ERG se debía al entorpecimiento de la interacción entre el dominio
eag/PAS y el cuerpo central del canal, probablemente a nivel del lazo S4-S5 (Gómez-Varela
et al., 2002). Esta hipótesis ha resurgido hace poco tiempo, tras un trabajo en el que se
comprobó que los efectos del dominio proximal se deben fundamentalmente a una
secuencia con alta densidad de carga positiva situada en la región terminal próxima al
segmento S1 de dicho dominio, lo que de nuevo ha llevado a postular que estos residuos
20 - Introducción

positivos del dominio proximal podrían interaccionar con el lazo S4-S5, interrumpiendo la
normal interacción de dicho lazo con el dominio eag/PAS (Saenen et al., 2006).

II.2.4. Papel de otras regiones de h-ERG en la apertura y el cierre.

Desde hace algunos años se ha propuesto que, en los canales “de lazo en el poro” ó
VGL, la segunda mitad de las hélices S6 de las cuatro subunidades
del tetrámero estarían
dirigidas hacia la hemicapa lipídica inferior, empaquetadas y entrelazadas hacia la derecha,
constituyendo una “compuerta” que da paso a una cavidad hidrofílica previa al filtro de
selectividad del canal (revisado por Yellen, 2002). En un trabajo reciente se ha estudiado el
papel de dos residuos de glicina de la hélice S6 en la apertura de h-ERG, ya que para otros
canales estos residuos en posiciones equivalentes se han propuesto como “bisagras” para
la apertura de la “compuerta”. Tras el análisis por mutagénesis dirigida de estas glicinas, se
concluyó que las hélices S6 en h-ERG tienen la suficiente flexibilidad como para no
necesitar dichos residuos para la activación del canal, lo que explicaría en parte la tendencia
natural del mismo a mantenerse abierto (Hardman et al., 2007).

En el apartado anterior se han enumerado una serie de estudios en los que se propone
al lazo S4-S5 como el sitio de interacción con el extremo amino de h-ERG, y concretamente
con el dominio eag/PAS. Debido a la localización de dicho lazo en los canales Kv, CNG y
HCN, siempre conectando la parte de la proteína que siente el voltaje (región S1-S4, VSD)
con la que constituye el poro y la “compuerta” (región S5-S6, dominio poro), este lazo S4-S5
se ha considerado también como el elemento que acopla los cambios en el potencial de
membrana a la apertura de los canales (Lu et al., 2002; Soler-Llavina et al., 2006; Latorre et
al., 2003; Chen et al., 2001; Decher et al., 2004; Sanguinetti & Xu, 1999; Tristani-Firouzi et
al., 2002; Piper et al., 2005; Ferrer et al., 2006). En un primer momento se describió que las
mutaciones en el lazo S4-S5 no sólo afectan al cierre (Wang et al., 1998) sino también a la
activación de h-ERG, proponiendo a dicho lazo como fundamental en el mecanismo de
apertura y cierre, al interaccionar probablemente con la “compuerta” del canal a nivel de la
hélice S6 (Sanguinetti & Xu, 1999). Posteriormente, se ha indicado que la interacción entre
el lazo S4-S5 y la hélice S6 ocurre entre los residuos 540 y 665, ya que al introducir cargas
positivas en ambas posiciones el canal es capaz de “reabrirse” a potenciales muy negativos
(Tristani-Firouzi et al., 2002). Finalmente, se ha propuesto que en el estado cerrado de
h-ERG existe una proximidad física entre el aspartato 540 y la arginina 665 y/o leucina 666,
ya que se ha podido inducir la formación de puentes disulfuro en dicha conformación entre
cisteínas introducidas en esas posiciones mediante mutagénesis (Ferrer et al., 2006).

Aparte del reconocido papel del extremo amino de h-ERG en la modulación del
proceso de apertura y cierre, se han publicado algunos trabajos acerca del papel del
extremo carboxilo en las características cinéticas del canal. Así, hace algunos años se
encontró una variante de h-ERG, originada por “splicing alternativo” y carente de
aproximadamente la mitad del extremo carboxilo, con una expresión el doble de abundante
que el transcrito normal y denominada “h-ERGUSO”. Esta variante no produce canales
funcionales, pero tras su co-expresión con el canal nativo genera corrientes, aunque con
 Introducción - 21

una activación acelerada y una dependencia de voltaje desplazada hacia valores negativos
(Kupershmidt et al., 1998). También se ha estudiado la mutación S818L, presente en algún
caso de síndrome QT largo II, comprobándose que dicha mutación hace que los canales
mutantes tampoco sean funcionales, pero al co-expresarlos con el canal nativo se producen
corrientes h-ERG con un desplazamiento de la dependencia de voltaje de activación hacia
potenciales negativos y con un cierre acelerado (Nakajima et al., 2000). Por último, se ha
indicado que las influencias del extremo carboxilo sobre los parámetros de apertura y cierre
precisan de la interacción entre éste y el extremo amino (Aydar & Palmer, 2001).

II.3. Estudio de las propiedades cinéticas y termodinámicas de

h-ERG bajo condiciones de auténtico estado estacionario.

Al ser h-ERG un canal con una relevante función fisiológica en distintos tipos celulares,
para interpretar correctamente dicha función es importante conocer los parámetros cinéticos
y termodinámicos que gobiernan su apertura y cierre. La única forma de obtener dichos
parámetros de forma precisa e independiente de las condiciones experimentales es
mediante su estudio bajo condiciones de equilibrio o estado estacionario. Además, los
parámetros así obtenidos permiten comparar adecuadamente el impacto que produce la
mutación de un determinado residuo o dominio proteico en la funcionalidad del canal. De
hecho, los valores publicados de voltaje de activación semimáxima (V1/2) para los mismos
mutantes de h-ERG varían incluso decenas de milivoltios al usar condiciones consideradas
erróneamente de estado estacionario (Wang et al., 1997a; Kupershmidt et al., 1998; Chen et
al., 1999; Aydar & Palmer, 2001; Paulussen et al., 2002, 2005; Liu et al., 2003; Subbiah et
al., 2004, 2005; Zhang et al., 2005; Saenen et al., 2006).
Puesto que una de las características distintivas de h-ERG es su lenta cinética de
apertura y cierre, para voltajes cercanos al V1/2, las tasas de apertura y cierre son
característicamente lentas (Schönherr et al., 1999; Viloria et al., 2000; Miranda et al., 2005),
haciendo necesarios pulsos de muy larga duración para alcanzar las condiciones de
equilibrio. Es importante recordar que la generación de curvas I/V en condiciones de estado
estacionario permite la obtención no sólo de valores de V1/2 reales, sino de una serie de
parámetros termodinámicos que nos permiten conocer el equilibrio conformacional de la
apertura y el cierre del canal. Así, podemos obtener el valor de “energía libre” (
G0) que
dirige el proceso de activación y que nos permite conocer el potencial químico que gobierna
los cambios conformacionales del canal, en ausencia de un potencial eléctrico que los dirija
(i.e. a 0 mV). Por otro lado, se puede conocer el número de cargas traslocadas a través del
campo eléctrico durante la activación (zg) y con él el potencial electrostático (-zgEF) que
dirige la apertura del canal, definiendo la contribución del potencial eléctrico en dicho
proceso. De esta manera, cuando un canal posea una modificación estructural que cambie
sus propiedades de apertura, mostrará valores particulares de
G0 y zg de manera que, para
un mismo valor de potencial eléctrico, el potencial electroquímico total [-(
G0-z gEF)] que
dirige la activación será distinto. Por eso, es de suma importancia comparar las tasas de
apertura de un canal no sólo en función del voltaje aplicado a la membrana, sino también en
función del potencial químico y eléctrico total que dirige la activación. Dado que el
conocimiento de la velocidad de apertura aporta una idea de la barrera energética del
22 - Introducción

estado de transición (
G‡) entre la conformación abierta y cerrada del canal, cuando esta
barrera energética es reducida, la transición entre ambas conformaciones procederá
rápidamente y, por tanto, la tasa de activación será rápida. Sin embargo, cuando la barrera
entre los dos estados es alta, la transición procederá lentamente y la tasa de activación será
por ello lenta.

III. REGULACIÓN HORMONAL DE h-ERG

III.1. Regulación de los canales ERG.

Durante los últimos años se han descrito distintos procesos de regulación de los
canales tipo ERG, estudiándolos tanto en líneas celulares que expresan el canal de forma
nativa como en sistemas de expresión heteróloga. Los procesos de regulación se han
analizado preferentemente mediante la utilización de agentes farmacológicos, o tras la
sobre-expresión de los componentes reguladores. Así, se han implicado en la regulación
hormonal de los canales ERG diferentes componentes de varias cascadas de señalización
intracelular, como proteín quinasas, proteín fosfatasas, proteínas adaptadoras de
señalización como las de la familia 14-3-3 e, incluso, segundos mensajeros que se unen
directamente al canal como el cAMP o el fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2). A
continuación se comentan algunos de los múltiples trabajos publicados sobre la regulación
de h-ERG que pudieran ser relevantes para los resultados que se describirán en esta
Memoria.

Hace unos años se describió en nuestro laboratorio que el éster de forbol
-forbol-12-
miristato-13-acetato ó PMA inhibía la función de h-ERG expresado en oocitos de Xenopus,
anulándose este efecto por el compuesto “GF109203X”. Teniendo en cuenta que el PMA y
el GF109203X son un activador y un inhibidor, respectivamente, de la Proteín Quinasa C
(PKC), concluimos que h-ERG era regulado por esta proteín quinasa (Barros et al., 1998).
Sin embargo, tras comprobar en oocitos de Xenopus que el efecto del PMA era mimetizado
y anulado, respectivamente, por activadores e inhibidores específicos de la Proteín Quinasa
A (PKA), se propuso a este enzima como el regulador de h-ERG en dicho sistema,
argumentándose un efecto inespecífico del PMA en la activación de proteín quinasas (Kiehn
et al., 1998). Posteriormente, se reafirmó el papel de la Proteín Quinasa A tras comprobar
incrementos y decrementos inducidos por el cAMP en la corriente, que eran similares a los
observados con activadores e inhibidores de esta quinasa, y tras identificar en h-ERG cuatro
residuos potencialmente fosforilables por la misma (Thomas et al., 1999; Kiehn, 2000).
Finalmente se ha reconocido que los efectos del PMA eran debidos a la activación tanto de
la PKA como de la PKC, aunque se ha propuesto que esta última no fosforilaba
directamente h-ERG, sino algunos mediadores de la señalización (Thomas et al., 2003).
En relación con la posible regulación de h-ERG por la PKA y el cAMP, también se han
hecho estudios en células CHO y HEK-293 transfectadas, en las que se ha propuesto un
mecanismo dual de regulación por cAMP, según el cual el nucleótido, por un lado, se uniría
 Introducción - 23

directamente al cNBD del canal y, por otro, activaría la PKA, la cual fosforilaría a h-ERG en
sus cuatro residuos fosforilables (Thomas et al., 1999; Kiehn, 2000). La actividad de h-ERG
sería entonces modificada en direcciones opuestas por la unión del cAMP y la fosforilación
por la PKA (Cui et al., 2000, 2001; Kiehn, 2000). Por último, utilizando estudios de doble
híbrido, se ha sugerido un mecanismo alternativo para la regulación de h-ERG por el cAMP
y la PKA, por el cual el nucleótido activaría al enzima y éste fosforilaría a h-ERG en las
serinas 283 (del dominio proximal) y 1137 (del final del extremo carboxilo), haciendo que al
canal se puedan unir dímeros de proteínas de la familia 14-3-3, produciendo un aumento de
la corriente (Kagan et al., 2002). Mas recientemente también se ha propuesto que existen
proteínas adaptadoras interaccionando con h-ERG que dirigen las subunidades reguladoras
de la PKA hacia el canal. Estos complejos moleculares regularían los canales ERG vía
cAMP/PKA durante la respuesta adrenérgica cardíaca (Li et al., 2008).
En cardiomicitos ventriculares de cobaya se ha comprobado que la estimulación de
receptores
-adrenérgicos activaba tanto a la PKA como a la PKC, regulando IKr (Heath &
Terrar, 2000). De esta forma se describió que la estimulación de estos receptores

-adrenérgicos, así como de su cascada de transducción, producía un aumento en las
corrientes ERG mediado por la PKA y la PKC, al modificar la inactivación de los canales
cambiando su rectificación. Sin embargo, se postuló que la activación de la PKC se debía a
una activación previa de la vía de la PKA. En un trabajo mas reciente en células HEK-293
transfectadas, se ha descrito que la estimulación de receptores M3-muscarínicos produce
una ralentización de la apertura de h-ERG y un desplazamiento de su dependencia de
voltaje de activación, proponiéndose que estos efectos son debidos a la PKC. En este caso,
esta alteración cinética se debería a la fosforilación de h-ERG por parte de dos tipos de
PKC, la activada por Ca2+ y la activada por 1,2-diacilglicerol (DAG), para la cual sería
necesaria la presencia del extremo amino del canal (Cockerill et al., 2007).
Tanto la PKA como la PKC y la Proteín Quinasa B (PKB) son serín/treonín quinasas
que se consideran relacionadas entre sí y que presentan una alta homología de secuencia
(Jones et al., 1991). Al igual que se ha descrito la regulación de canales ERG por las Proteín
Quinasas A y C, también se ha estudiado su modulación por la PKB (Zhang et al., 2003). Se
pudo comprobar así que, para un normal funcionamiento de h-ERG en células HEK-293, se
necesita una actividad basal de la PKB por vías dependientes e independientes de la
Fosfoinosítido 3-Quinasa, proponiéndose como sitios de fosforilación por esta quinasa las
serinas 331 (localizada en el dominio proximal) y 890 (del extremo carboxilo).

Además de la modulación de canales ERG por serín/treonín quinasas, también se ha

descrito que estos canales pueden ser regulados por tirosín quinasas. Así, se ha sugerido
que el canal ERG puede formar un complejo macromolecular con la Tirosín Quinasa Src y la
Tirosín Fosfatasa SHP-1 en células de microglía de rata MLS-9. La actividad quinasa
produciría una ganancia en la función de los canales, mientras que la actividad fosfatasa
produciría el efecto contrario (Cayabyab et al., 2002; Cayabyab & Schlichter, 2002). En un
trabajo reciente se ha constatado el papel de la Tirosín Quinasa Src en la modulación de
h-ERG en células HEK-293 transfectadas, describiéndose además una regulación por
receptores con actividad tirosín quinasa (e.g. el Receptor del Factor de Crecimiento
Epidérmico) que son otro tipo de tirosín quinasa diferente de las Src (Zhang et al., 2008).
24 - Introducción

Por último, también se han publicado trabajos sobre la regulación de h-ERG por
segundos mensajeros sin actividad enzimática. Ya se han comentado anteriormente los
trabajos acerca de la unión directa del cAMP al cNBD de h-ERG (Cui et al., 2000, 2001), así
como de proteínas adaptadoras de la familia 14-3-3 cuando el canal ha sido fosforilado por
la PKA (Kagan et al., 2002). Hace unos años se describió que el aumento del estrés
oxidante por incrementos en especies reactivas de oxígeno alteraba la dependencia de
voltaje de inactivación de h-ERG, expresado en oocitos de Xenopus, haciendo que el canal
perdiese sus propiedades de rectificación anómala. Posteriormente, se demostró que el
óxido nítrico (NO) ejercía el efecto contrario, proponiéndose que esto era debido a su
capacidad para neutralizar dicho estrés oxidante. Esta posible regulación de h-ERG se
relacionó con los cambios en la excitabilidad celular en situaciones fisiológicas y patológicas
de isquemia, acompañadas de estrés oxidante, postulándose que el NO producido en estas
situaciones podría contrarrestar dicho efecto (Taglialatela et al., 1997, 1999).
Por otra parte, en ciertos trabajos también se ha descrito que, en células CHO
transfectadas con h-ERG, las elevaciones intracelulares de PIP2 producen un aumento de
la corriente, una aceleración de la activación junto con un desplazamiento de su
dependencia de voltaje hacia potenciales más negativos, así como una ralentización de la
inactivación. Se ha propuesto una unión del fosfolípido al canal a través de interacciones
entre la carga negativa del grupo fosfato del fosfolípido y las cadenas laterales de residuos
positivos de h-ERG. Se han señalado dos regiones C-terminales, con densidad de carga
positiva, como las implicadas en la unión del PIP2 : los aminoácidos 883 a 894, responsables
de los efectos sobre la activación, y los aminoácidos 672 a 697, responsables de los efectos
sobre la inactivación. Finalmente, en estos trabajos también se demostró que la estimulación
de receptores
1A-adrenérgicos produce una disminución de la densidad de la corriente
mediada por canales ERG, tanto en células HEK-293 transfectadas como en un sistema
nativo de cardiomiocitos ventriculares de ratón. Esta regulación se ha propuesto que es
debida precisamente al descenso del PIP2 causado por la activación de la PLC (Bian et al.,
2001, 2004; Bian & McDonald, 2007).

III.2. Regulación hormonal de los canales ERG por TRH.

Uno de los mecanismos de regulación fisiológica de canales ERG mejor conocido es el

ejercido por la hormona TRH en células de adenohipófisis. Dicha hormona es un tripéptido
(piro-Glu-His-Pro-NH2) que funciona como hormona y como neurotransmisor, estimulando la
síntesis y secreción de Prolactina (PRL) en células lactotrofas (Lamberts & MacLeod, 1990)
y la liberación de Tirotropina (TSH, “Thyroid Stimulating Hormone”) en células tirotrofas
(Reichlin, 1985).

Entre los modelos experimentales más utilizados para el estudio de los mecanismos de
acción de la TRH, se encuentra la línea celular lactotrofa/somatrofa GH3 derivada del cultivo
primario de un tumor de hipófisis de rata (Tashjian et al., 1968). En estas células que, al
igual que los lactotrofos normales, generan espontáneamente potenciales de acción, la TRH
produce una modificación bifásica de la actividad eléctrica, de los niveles intracelulares de
Ca2+ y de la secreción de PRL y hormona de crecimiento. La unión de la TRH a su receptor
 Introducción - 25

de membrana desencadena una serie de acontecimientos que comienzan con la interacción

del complejo hormona/receptor con una proteína G de tipo Gq/11 (Aragay et al., 1992) y la
posterior activación de la PLC, la cual hidroliza al PIP2 en dos segundos mensajeros: DAG e
inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3). Este último induce la liberación de Ca2+ desde depósitos
intracelulares (e.g. retículo endoplásmico), lo cual provoca un rápido aumento de los niveles
citoplasmáticos del catión. Este rápido aumento del Ca2+ intracelular causa la activación de
canales de K+ dependientes de Ca2+ y, la subsiguiente salida de K+ al medio extracelular,
produce una hiperpolarización transitoria de la membrana celular, durante la cual cesa la
producción de los potenciales de acción. Tras esta fase inicial transitoria (fase I), se produce
una segunda fase (fase II), durante la cual se ocasiona una reducción de la conductancia
basal de la membrana al K+, así como un incremento de la frecuencia y duración de los
potenciales de acción (Corrette et al., 1995). Ya que los potenciales de acción de las células
GH3 son de Ca2+, la fase II conlleva un aumento de la entrada del catión desde el exterior
celular y una elevación de los niveles intracelulares de Ca2+, que se mantiene durante varios
minutos. Estas dos fases de respuesta hormonal se correlacionan con una alteración
secretora de la célula, también bifásica. Así, en la fase I, se produce una secreción rápida y
aguda de PRL y hormona del crecimiento (Ozawa & Sand, 1986; Bjøro, 1990), mientras que,
en la fase II, estos niveles permanecen elevados debido a la entrada de Ca2+ del medio
extracelular (Ozawa & Sand, 1986; Bjøro, 1990; Villalobos & García-Sancho, 1995).
En la producción de la fase II de actuación de la TRH, caracterizada por el incremento
en la actividad eléctrica, juega un papel esencial una corriente de K+ con características de
rectificador anómalo regulada por la TRH (Bauer et al., 1990) y que participa en el
mantenimiento del potencial de membrana basal y, con ello, en el control de la tasa de
producción de los potenciales de acción (Barros et al., 1992, 1993, 1994, 1996). Antes de
que fuese clonado el canal que media esta corriente rectificadora anómala (Bauer et al.,
1998), en nuestro laboratorio se obtuvieron evidencias cinéticas y farmacológicas que
demostraron que, en las células GH3, dicha corriente se debía precisamente a un canal
equivalente al canal humano h-ERG (Barros et al., 1997).
Así pues, la fase II de la respuesta a TRH en células adenohipofisarias es producida a
través de la inhibición de la corriente codificada por r-erg. Este efecto inhibitorio de la TRH
está mediado por la activación de una proteína G sensible a la toxina del cólera (CTX) y, por
ello, del tipo Gs (Barros et al., 1994; Bauer et al., 1994). Si bien ya se había descrito que en
células GH3 el receptor de TRH activa la Adenilato Ciclasa (AC) a través de una proteína del
tipo Gs, aumentando los niveles de cAMP (Paulssen et al., 1992), el hecho de que los
incrementos de cAMP intracelular no ocasionan ningún efecto sobre la respuesta a la
hormona ni en la inhibición que ésta produce sobre r-ERG, ha llevado a algunos autores a
proponer que la proteína G implicada es distinta de la Gs, aunque también sensible a CTX
(Bauer et al., 1994). La participación de una proteína Gs en los efectos de la TRH sobre el
canal h-ERG, mediados por la activación de la PLC, ha sido demostrada posteriormente de
forma directa en oocitos de Xenopus, en nuestro laboratorio (de la Peña et al., 1995).
La ausencia de inhibición de r-ERG por la TRH, en células inundadas con un análogo
de ATP (ATP-NH-P) incapaz de ceder el fosfato
en reacciones de fosforilación, ha llevado
a concluir que, en dicha inhibición, participa un mecanismo de fosforilación (Barros et al.,
1993). Aunque se ha descrito que la activación del receptor de TRH de las células GH3
produce una activación transitoria de una PKC sensible a ésteres de forbol (Martin et al.,
26 - Introducción

1990), se ha demostrado claramente que la inhibición de r-ERG por TRH es completamente

independiente de la PKC y de la PKA (Bauer et al., 1990; Barros et al., 1992, 1993; Schäfer
et al., 1999; Schledermann et al., 2001). Finalmente, en nuestro laboratorio se ha
demostrado la irreversibilidad de los efectos de la TRH sobre r-ERG en presencia de
inhibidores de proteín fosfatasas, así como la reversión de dichos efectos por la aplicación
de la subunidad catalítica de la Proteín Fosfatasa 2A purificada (PP2A), demostrando así que
el postulado proceso de fosforilación es revertido por esta proteín fosfatasa (Barros et al.,
1993). Posteriormente y mediante el uso de fármacos inhibidores de PKC, se ha constatado
que el efecto de la TRH sobre ERG en células GH3 es revertido no sólo por la PP2A, sino con
la participación de la propia PKC (Gómez-Varela et al., 2003b).

Además de los descritos hasta ahora, la TRH produce diversos efectos intracelulares
que podrían estar implicados en la secreción a corto o largo plazo, como son la activación
de la MAP Quinasa ERK (Palomero et al., 1998), la producción de NO (Tsumori et al., 1999)
o la liberación de ácido araquidónico (Judd et al., 1986). Si bien ya se ha mencionado la
existencia de un mecanismo de regulación de h-ERG por NO (Taglialatela et al., 1999), así
como de otros canales Kv por la ERK (Adams et al., 2000), ninguna de estas vías parece
participar en la cascada de señalización que acopla la activación del receptor de TRH a la
regulación de ERG en células adenohipofisarias (Schledermann et al., 2001).
Se ha propuesto una vía alternativa para la regulación de r-ERG por TRH en células
adenohipofisarias de rata GH4/C1, en la que la cascada de transducción acoplada al receptor
de TRH participan la proteína G13 y la proteína G pequeña RhoA (Storey et al., 2002). A
pesar de ello, y aunque se ha sugerido que en esta vía podría estar implicada la Rho
Quinasa, en nuestro laboratorio se demostró, mediante el uso del inhibidor específico de
esta quinasa “Y-27632”, que este enzima no está implicado en la inhibición por TRH de la
corriente r-ERG en las células GH3 (Gómez-Varela et al., 2003b).
Por último, en un trabajo mas reciente de nuestro laboratorio, estudiando la
especificidad de acoplamiento del receptor de TRH para la regulación de los canales ERG,
mediante el bloqueo funcional de proteínas G con cDNAs codificantes de mutantes
dominantes negativos de subunidades
, se ha demostrado que, si bien el receptor se
acopla a proteínas Gq/11 en la transducción de la señal de Ca2+ durante la fase I de
respuesta hormonal, esta proteína G no está involucrada en la inhibición de las corrientes
r-ERG por la TRH en células GH3. Además, se identificó a las proteínas Gs y G13, así como
las proteínas G pequeñas de la familia Rho, como piezas clave en la regulación hormonal de
ERG por la TRH, sugiriéndose además que los dímeros  liberados de estas proteínas
podrían participar en la modulación de los canales expresados tanto en células GH3 como
en células HEK-293 transfectadas (Miranda et al., 2005).

III.3. El papel del dominio proximal en la regulación hormonal

de h-ERG por la TRH.

Hace años se identificó y clonó en nuestro laboratorio el cDNA codificante del receptor
de TRH de las células GH3 (de la Peña et al., 1992a, 1992b). Mediante la co-expresión en
oocitos de Xenopus de los cRNAs codificantes del receptor de TRH y del canal h-ERG, se
 Introducción - 27

demostró de forma directa que la activación del receptor por la hormona ocasionaba la
regulación del canal, modificando sus parámetros cinéticos (Barros et al., 1998). Al estudiar
los parámetros cinéticos específicos que eran regulados por la TRH, se pudo comprobar que
la adición de la hormona a los oocitos producía una ralentización de la apertura de h-ERG y
un desplazamiento de su dependencia de voltaje de activación hacia potenciales más
positivos, así como una aceleración del cierre, mostrándose sin embargo inalteradas la
inactivación y la recuperación de la inactivación del canal.
Teniendo en cuenta que la eliminación del dominio proximal, exclusivo de h-ERG,
produce alteraciones de los parámetros cinéticos de activación del canal contrarias a las
inducidas por la regulación hormonal por TRH, se estudiaron en este sistema los efectos
hormonales en canales h-ERG carentes del dominio proximal. Al analizar la regulación
hormonal de canales con diferentes deleciones seriadas en el citado dominio proximal, se
comprobó que los efectos de la TRH sobre la activación de h-ERG eran anulados en
canales carentes de todo el dominio proximal (variante
138-373), así como al eliminar las
regiones 223-373, 284-373 y 326-373 del dominio, pero que los efectos reguladores eran
completamente normales en un canal carente de la región 346-373. A la vista de estos
datos, se concluyó que la regulación hormonal del canal parecía depender de la presencia
de la región 326-346 del dominio proximal (Gómez-Varela et al., 2003a). Por otro lado,
también se comprobó que la regulación hormonal del proceso de cierre de h-ERG dependía
de una región diferente de la implicada en la activación, ya que los efectos hormonales
sobre el cierre del canal se reducen al ~20% eliminando todo el dominio proximal, pero se
recuperan hasta el ~50% en canales carentes de la región 223-373 y hasta el ~90% en los
carentes de la región 284-373 (Gómez-Varela et al., 2003a).

IV. LOS OOCITOS DE Xenopus laevis COMO SISTEMA DE

EXPRESIÓN HETERÓLOGA.

Los oocitos de Xenopus laevis constituyen un sistema de expresión heteróloga de

enorme utilidad para el estudio de la funcionalidad de diferentes proteínas, especialmente
las de membrana. Así, son utilizados para el estudio de la actividad de receptores de
membrana y la cascada de transducción acoplada a los mismos, así como para el estudio
de las propiedades funcionales y parámetros cinéticos de los canales iónicos.
Debido a su activa maquinaria de biosíntesis, pueden alcanzar un alto grado de
expresión de proteínas exógenas tras la microinyección citoplásmica de RNA ó intranuclear
de DNA. Además, su fácil manipulación permite realizar diversas medidas de análisis
funcional aplicando variedad de técnicas y, en particular, las de registro electrofisiológico
como el “clamp de voltaje” de dos electrodos. En lo que respecta a los canales iónicos, una
de las principales ventajas de los oocitos es la escasa magnitud de sus corrientes
endógenas, en comparación con la magnitud que pueden llegar a alcanzar las corrientes
expresadas de forma heteróloga, anulando prácticamente el problema de la contaminación
por otro tipo de corrientes ajenas a las del canal que se quiere estudiar. Además, mediante
la expresión de canales alterados en su secuencia mediante mutagénesis, es posible
realizar estudios de las relaciones estructura-función atendiendo a las diferencias
28 - Introducción

observadas entre las correspondientes entidades nativas y mutadas (Rudy & Iverson, 1992;
de la Peña & Barros, 1999).

En los oocitos de Xenopus laevis se han identificado receptores acoplados a dos de

los sistemas más conocidos de producción de segundos mensajeros: la Adenilato Ciclasa
(AC) y la Fosfolipasa C (PLC). Esta segunda vía de señalización intracelular es la mejor
caracterizada en los oocitos y es la que utilizan sus receptores muscarínicos de acetilcolina
endógenos. El receptor de TRH, y otros muchos receptores que en su sistema nativo
también se acoplan a PLC, pueden utilizar este mismo sistema de transducción de señales,
cuando se expresan en la membrana del oocito. En el caso de la TRH, la activación de su
receptor y la subsiguiente activación de la PLC se produce a través de una proteína Gs (de
la Peña et al., 1995), ocasionando la hidrólisis del PIP2 de la membrana en los
correspondientes mensajeros IP3 y DAG. El IP3 se une a receptores intracelulares (e.g. del
retículo endoplásmico) desencadenando la liberación de Ca2+ al citosol, un hecho que causa
a su vez la activación de canales de Cl- dependientes de Ca2+ y que origina un flujo del
anión al exterior de la célula. La aparición de esta corriente de Cl- puede dificultar el estudio
de otras corrientes como las inducidas por la expresión heteróloga de un canal iónico. Sin
embargo, la contaminación con la corriente de Cl- es transitoria, ya que desaparece
gradualmente en un corto periodo de tiempo, permitiendo abordar los estudios de regulación
de canales iónicos incluso a través de receptores acoplados a PLC, siempre y cuando los
efectos moduladores persisten durante un tiempo más largo al de la duración de dicha
corriente de Cl- (Barros et al., 1998).
Es importante destacar que todos los componentes moleculares de la cascada de
transducción, a excepción del receptor microinyectado, son endógenos del oocito. Por tanto,
las posibles diferencias observadas tras la activación de los receptores hormonales, tanto en
la magnitud como en la cinética de las corrientes producidas por la expresión de algún canal
iónico, son atribuibles a diferencias en dichos canales o receptores, permitiendo establecer
correlaciones entre las variaciones estructurales que portan y las alteraciones funcionales
que exhiben.
Objetivos
 Objetivos - 29

El objetivo general de esta Tesis es comprender la relevancia funcional de dos

regiones citoplasmáticas de h-ERG, su extremo amino y el lazo S4-S5. Basándonos en la
hipótesis de una posible interacción entre ambas regiones intracelulares, esencial para sus
características funcionales y su regulación hormonal, se intentó demostrar la existencia de
dicha interacción así como el papel que juega en la modulación de la apertura y el cierre del
canal h-ERG.

Para ello, en este trabajo se han abordado los siguientes objetivos concretos:

1. Conocer el impacto real de la alteración estructural del extremo amino y del lazo
intracelular S4-S5 de h-ERG sobre la funcionalidad del canal. Para ello, se estudiarán las
características cinéticas y las propiedades termodinámicas de variantes de h-ERG
modificadas en ambos dominios bajo condiciones de auténtico estado estacionario.

2. Identificar las secuencias del dominio proximal de h-ERG necesarias para su

regulación hormonal. Con este propósito, se modificarán mediante mutagénesis secuencias
concretas del citado dominio y se analizará la influencia de dichas alteraciones sobre la
regulación del canal por TRH.

3. Estudiar la importancia del lazo S4-S5 de h-ERG y de su posible interacción con el

extremo amino en su regulación hormonal por TRH, comparando los efectos de la hormona
sobre diferentes variantes de h-ERG mutadas en el citado lazo intracelular.

4. Comprobar la existencia de una interacción intramolecular entre el extremo amino y

el lazo S4-S5 de h-ERG, bien indirectamente estudiando el papel de estos dominios en los
la modulación del proceso de cierre del canal inducida por la acidificación extracelular, o de
forma más directa localizando residuos que puedan interaccionar físicamente por
encontrarse muy próximos y ser, por tanto, capaces de establecer entre sí puentes disulfuro.
30 - Objetivos
Materiales y
Métodos
 Materiales y Métodos - 31

I. MEDIOS, DISOLUCIONES Y REACTIVOS

I.1. Medios para el cultivo de Escherichia coli.

Las células de Escherichia coli se cultivaron en medio “Luria-Bertani” (medio LB)

modificado, compuesto de 20 g/L de triptona (“Pronadisa”), 10 g/L de extracto de levadura
(“Pronadisa”) y 10 g/L de NaCl, ajustando a pH 7.5 con NaOH. El medio se esterilizó a
120ºC durante 20 min en un autoclave. A partir de este medio se obtuvo el medio sólido
LB-agar añadiendo agar (“Pronadisa”), para una concentración final de 15 g/L.
Para el crecimiento de las bacterias transformadas con plásmidos recombinantes se
añadió a los medios ampicilina 100 mg/L (“Sigma-Aldrich”) como el antibiótico de selección.

I.2. Medios utilizados para la obtención, mantenimiento y registro

electrofisiológico de los oocitos de Xenopus laevis.

Los oocitos de Xenopus laevis, obtenidos tras la extracción y raspado de un fragmento

de ovario, se mantuvieron en medio OR-2 estándar (de la Peña & Zasloff, 1987) de
composición: NaCl 82.5 mM, KCl 2 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, Na2HPO4 1 mM y
HEPES 10 mM, ajustando a pH 7.5 con HCl. Para la esterilización se utilizaron filtros de
vacío de 0.22 μm de tamaño de poro (“Stericup®, Millipore”). Para evitar posibles
contaminaciones, se añadió a los pocillos con los oocitos en OR-2 ampicilina a una
concentración final de 100-200 mg/L.
Para los registros electrofisiológicos de los oocitos microinyectados se utilizó
sistemáticamente un medio OR-2 con alta concentración de potasio (OR-2 50 mM K+), con
la misma composición que el medio estándar, pero sustituyendo parte del NaCl con KCl, de
manera que las concentraciones de ambas sales se sitúan en 34.5 y 50 mM,
respectivamente, manteniendo constante la osmolalidad. En los casos en los que la
expresión de h-ERG y sus variantes era muy alta, se utilizó medio OR-2 estándar.

En los experimentos para el estudio de la regulación hormonal de h-ERG por TRH, la

hormona (“Sigma-Aldrich”) se añadió al medio OR-2 para dar una concentración final de 1
μM. Dicho medio con hormona se preparó en pequeños viales de 5 mL cada 2-3 h.

En estudios como los diseñados para comprobar el efecto de la acidificación

extracelular sobre la cinética de cierre de los canales, se utilizó medio OR-2 50 mM K+ al
que se agregó MES 10 mM, además de HEPES. Este medio se ajustó a pH 7.5 o a pH 6.5
con NaOH.

Para los experimentos de óxido-reducción de cisteínas y el estudio de la posible

formación de puentes disulfuro, se utilizó como oxidante tert-butilhidroperóxido (tbHO2). Este
compuesto orgánico se preparó directamente en OR-2 cada 2-3 h a una concentración final
2 mM, utilizando una solución acuosa comercial del mismo al 70% (“Sigma-Aldrich”). Por su
parte, el medio reductor empleado se preparó fresco diariamente a partir del medio OR-2 50
32 - Materiales y Métodos

mM K+, en el que se sustituyó parte del NaCl con DTT (“Fluka”), a fin de mantener la
osmolalidad. Para ello se añadió DTT sólido hasta una concentración final de 20 mM,
reduciendo concomitantemente la concentración final de NaCl hasta 24.5 mM.

II. TÉCNICAS DE BÁSICAS BIOLOGÍA MOLECULAR

II.1. Transformación de células competentes de

Echerichia coli.

Para la propagación de los plásmidos recombinantes se empleó la cepa de Escherichia

coli XL1-Blue, cuyas características genotípicas son: recA1, lac-, endA1, gyrA96, thi-1,
hsdR17, supE44, relA1, lac {F’ proAB, lacqZ
M15, Tn10 (TetR)}. En determinadas
ocasiones, la cepa fue de origen comercial, crecidas a partir de “NovaBlue® Singles
Competent Cells” (“Merk/Novagen”).
Las células competentes se prepararon siguiendo el método descrito por Inoue et al.
(1990) y se conservaron a -80ºC hasta el momento de su utilización.
El método elegido para la transformación de las células competentes fue el del
“choque térmico”. Para ello se mezcla en una proporción adecuada el DNA plasmídico a
transformar con las células competentes, que se mantienen en hielo durante 30 min. A
continuación, se somete la mezcla a un choque térmico de 42-45ºC durante 1 min y se
vuelve a introducir en hielo. Tras ello, se añade medio LB y se incuban las bacterias a 37ºC
en agitación orbital a 250 r.p.m. durante 1-2 h. Finalmente, la suspensión se extiende en
placas de Petri con LB-agar y ampicilina, o bien se inocula directamente en medio LB con el
antibiótico, incubándose a 37 ºC durante 12-18 h.

II.2. Purificación y secuenciación del DNA.

Para purificar el DNA plasmídico, las colonias aisladas se picaron y se inocularon en

medio LB con ampicilina, dejando a las células crecer durante 12-36 h a 37ºC en agitación
orbital. Cuando los cultivos alcanzaron un crecimiento adecuado, el DNA se extrajo de las
células por el método de lisis alcalina descrito por J. Sambrook y D. Russell (1989). En la
mayoría de los casos se requirió un DNA de gran pureza que se purificó con los siguientes
preparados comerciales: “QIAprep® Spin Miniprep Kit” (“Quiagen”), “Perfectprep® Plasmid
Mini” (“Eppendorf”) y “NucleoSpin® Plasmid QuickPure” (“Macherey-Nagel”). En todos estos
casos se siguió el protocolo descrito por la casa comercial.
La purificación de fragmentos de PCR o de restricción de DNA se realizó a partir de
geles de agarosa, o a partir de los medios de reacción, empleando los preparados
comerciales “Geneclean® III kit” (“Q·BIOgene”) o “NucleoSpin® Extract II” (“Macherey-
Nagel”). En ambos casos se procedió siguiendo las indicaciones de las respectivas casas
comerciales.
 Materiales y Métodos - 33

La secuenciación del DNA plasmídico se realizó en la “Unidad de Secuenciación de

ADN de los Servicios Científico-Técnicos de la Universidad de Oviedo”. El método utilizado
fue una secuenciación automática capilar en un equipo de análisis genético “ABI Prism®
3100 Genetic Analyzer” (“Applied Biosystem”).

II.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La amplificación del DNA mediante la “Reacción en Cadena de la Polimerasa” (PCR),

se realizó en reacciones que contenían 50-100 ng del DNA molde y 10 pmol de cada uno de
los oligonucleótidos (o cebadores), sentido y antisentido, previamente desnaturalizados
(“Sigma-Genosys”, “Thermo Fisher Scientific”). El resto de componentes necesarios para la
reacción fueron aportados por el preparado comercial “ReadyMix® REDTaq® PCR Reaction
Mix with MgCl2” (“Sigma-Aldrich”). Así, al agregar esta mezcla, al 2X, las concentraciones
finales de los reactivos son: Tris-HCl 10 mM (pH 8.3), KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.001 %
de gelatina, “dNTP mix” (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 0.2 mM y 30 U/mL de la DNA
Polimerasa Taq. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador “Mastercycler
personal®” (“Eppendorf”).

En las reacciones estándar, las muestras se sometieron a una primera fase de

desnaturalización a 98ºC durante 5 min. Después, y hasta completar un total de 35 ciclos,
las muestras se sometieron a sucesivas fases de desnaturalización a 98ºC durante 1 min,
hibridación a la Th correspondiente durante 2 min y extensión a 72ºC durante 2 min. Por
último, se efectuó un ciclo final de extensión adicional a 72ºC durante 5 min.
Para cada oligonucleótido, la Temperatura de hibridación (Th) se calculó a partir de la
siguiente ecuación:

Th = 70 + 41 [(G + C)/L] – 675/L

donde G y C corresponden al número de nucleótidos de guanina y citosina y L es el número
total de nucleótidos del cebador.

Previamente y para el diseño de los oligonucleótidos, así como para optimizar el

rendimiento de las reacciones de PCR, minimizando la probabilidad de que los pares de
oligonucleótidos hibriden entre sí dando cebadores diméricos, o bien hibriden además en
otras zonas del molde distintas a las deseadas, se simularon virtualmente dichas reacciones
utilizando el programa informático “Amplify 1.2®” (Universidad de Wisconsin-Madison).

II.4. Mutagénesis dirigida mediante PCR.

El método utilizado fue el descrito por Ho et al. (1989) y permite la generación de
variantes con mutaciones puntuales o con pequeñas inserciones. La generación de
mutantes consta de tres etapas sucesivas, que se corresponden con tres reacciones de
PCR.
34 - Materiales y Métodos

En una visión general, para llevar a cabo este tipo de mutagénesis se requieren cuatro
oligonucleótidos. Dos de estos oligonucleótidos (sentido y antisentido) contienen la mutación
a introducir y han de hibridar con las dos hebras de DNA molde en la posición donde se
desea efectuar dicha mutación. Los otros dos cebadores (sentido y antisentido) han de
hibridar en posiciones alejadas y más o menos equidistantes a la mutación. Además, estos
oligonucleótidos “externos” han de hibridar en zonas cercanas a sitios de restricción de
interés en el DNA molde.

En la primera etapa se amplifican dos fragmentos de DNA mediante dos reacciones de

PCR independientes utilizando uno de los oligonucleótidos mutados y uno de los externos.
Estos dos fragmentos, 5’ y 3’, obtenidos, son parcialmente solapantes entre sí, ya que sus
extremos son coincidentes en las secuencias que portan la mutación. Una vez finalizadas
las reacciones de PCR se purifican los fragmentos 5’ y 3’ a partir de geles de agarosa, para
evitar contaminaciones del DNA molde nativo, según los métodos anteriormente citados.
La segunda etapa consiste en una reacción de PCR en ausencia de oligonucleótidos,
incluyendo solamente 100-300 ng de cada fragmento 5’ y 3’, obtenidos en la etapa anterior.
Así, debido a que ambos fragmentos hibridan entre sí por la secuencia común, uno sirve
como cebador para la amplificación del otro, y viceversa. Debido al menor grado de
solapamiento entre ambos, la reacción estándar de PCR se ha de variar. Así, se somete a
las muestras a un primera fase de desnaturalización a 98ºC durante 5 min, seguida de 10
ciclos en los que se alternan las siguientes fases: desnaturalización a 98ºC durante 1 min,
hibridación a 52ºC durante 10 min y extensión a 72ºC durante 15 min, con una fase final de
extensión a 72ºC durante 5 min. Al final de esta etapa se obtendrá un fragmento amplificado
de DNA de cadena doble con la mutación deseada y cuyo tamaño corresponderá a la
distancia entre los oligonucleótidos externos.
La tercera y última fase consiste en una reamplificación del fragmento, obtenido en la
etapa anterior, utilizando los cebadores externos. Para ello, se realiza una nueva reacción
de PCR en la que se añade como molde 1 μl de la reacción de PCR anterior junto con los
oligonucleótidos externos.
El fragmento final resultante es purificado a partir de geles de agarosa, o directamente
de la mezcla de PCR, y finalmente digerido con las endonucleasas de restricción
adecuadas. Por último, se reemplaza este fragmento, que contiene la mutación deseada,
por el fragmento tipo silvestre en el DNA nativo.
 Materiales y Métodos - 35

Construcción Plásmido recombinante

Deleciones N-terminales extremo amino al completo pSP64A+ h-ERG 2-370
región inicial del extremo pSP64A+ h-ERG 2-16
amino
dominio eag/PAS pSP64A+ h-ERG 2-135
dominio proximal al pSP64A+ h-ERG 138-373
completo
interior del dominio pSP64A+ h-ERG 155-209
proximal pSP64A+ h-ERG 223-273
pSP64A+ h-ERG 326-373
pSP64A+ h-ERG 326-341
pSP64A+ h-ERG 333-373
pSP64A+ h-ERG 345-373
pSP64A+ h-ERG 363-373
(doble deleción) pSP64A+ h-ERG 326-341/363-373
Mutaciones puntuales región inicial del extremo pSP64A+ h-ERG V3C
amino
dentro del dominio proximal pSP64A+ h-ERG YTS-A
(triple) pSP64A+ h-ERG KKR-A

(doble triplete) pSP64A+ h-ERG YTS-A/KKR-A

lazo S4-S5 pSP64A+ h-ERG D540C
pSP64A+ h-ERG R541H
pSP64A+ h-ERG R541A
pSP64A+ h-ERG Y542C
pSP64A+ h-ERG S543C
pSP64A+ h-ERG E544C
pSP64A+ h-ERG Y545C
pSP64A+ h-ERG G546C
dobles mutantes en el pSP64A+ h-ERG V3C/Y542C
extremo amino y el lazo S4- pSP64A+ h-ERG V3C/G546C
S5
Combinación de deleción interior del dominio pSP64A+ h-ERG YTS-A/363-373
con mutaciones puntuales proximal (mutación triple) pSP64A+ h-ERG 326-341/KKR-A
mutación puntual en el lazo pSP64A+ h-ERG R541A/2-370
S4-S5 y deleción del pSP64A+ h-ERG Y542C/2-370
extremo amino al completo pSP64A+ h-ERG G546C/2-370
mutación puntual en el lazo pSP64A+ h-ERG Y542C/864-1010
S4-S5 y deleción en el
extremo carboxilo
mutación puntual en la pSP64A+ h-ERG V3C/864-1010
región inicial del extremo
amino y deleción en el
extremo carboxilo
Substituciones en el dominio proximal pSP64A+ h-ERG 326-341/SubA
pSP64A+ h-ERG 326-341/SubB

Tabla 2. Plásmidos recombinantes derivados de pSP64A+ h-ERG.

Las construcciones se han clasificado según el tipo de variación que tiene frente al canal nativo y se nombran
según el código aminoacídico y/o la posición que ocupan los aminoácidos modificados.
36 - Materiales y Métodos

III. PLÁSMIDOS RECOMBINANTES Y VARIANTES DE

h-ERG

III.1. Plásmidos recombinantes.

Los plásmidos utilizados para la síntesis de cRNA y la expresión funcional en oocitos

de Xenopus laevis, mediante la microinyección del mismo, fueron los siguientes:

pSP64A+ h-ERG. Plásmido que contiene la secuencia codificante del canal h-ERG,
cedido por el Dr. Enzo Wanke (Universidad de Milán). Fue obtenido por la subclonación del
cDNA de h-ERG entre los sitios HindIII y BamHI del vector plasmídico comercial pSP64A+
(“Promega”). Dicho vector contiene el gen de resistencia a ampicilina (AmpR), un sitio de
reconocimiento para la RNA Polimerasa del virus bacteriófago SP6 y una cola de poli A+, lo
que permite la transcripción in vitro del inserto, produciendo un transcrito poliadenilado. Las
variantes del canal h-ERG utilizadas en este trabajo (y que aparecen recogidas en la Tabla
2) se generaron a partir de este plásmido recombinante.

pcDNA3B R-TRH. Plásmido generado por la clonación de la secuencia codificante del

receptor de TRH de células GH3 (de la Peña et al., 1992a) entre los sitios HindIII y EcoRI del
vector pcDNA3B. Dicho vector proviene a su vez del vector plasmídico comercial pcDNA3
(“Invitrogen”), modificado de manera que se eliminó el sitio de reconocimiento para BglII
mediante mutagénesis. Este plásmido comercial contiene los sitios de reconocimiento para
las RNA Polimerasas de los bacteriófagos SP6 y T7, permitiendo la transcripción in vitro del
inserto, y el gen AmpR. Además, este vector contiene el promotor de CMV para la expresión
en células de mamífero, el gen de resistencia a neomicina (NeoR), para la selección de las
células transfectadas y un origen de replicación del virus SV40, que permite su replicación
extracromosómica.

III.2. Generación de variantes de h-ERG.

Todas las variantes de h-ERG que se describen a continuación se generaron mediante

reacciones de PCR según lo descrito en los apartados II.3. y II.4. Las secuencias de los
oligonucleótidos que se utilizaron para la construcción de los recombinantes de h-ERG con
deleciones o con mutaciones aparecen recogidas en la Tabla 3.

III.2.1. Variantes con deleciones.

La estrategia seguida para generar las deleciones N-terminales
2-370,
138-373,

223-373,
326-373,
333-373,
345-373 y
355-373 ha sido descrita previamente (Viloria
et al., 2000; Gómez-Varela et al., 2003; David Gómez Varela, 2004, Tesis Doctoral).
 Materiales y Métodos - 37

pSP64A+ h-ERG
2-16.

Para la construcción de la variante 2-16 se diseñó un oligonucleótido sentido con un
sitio de restricción HindIII acompañado del codón iniciador ATG y 44 pb, correspondientes a
los aminoácidos 17-26 de la secuencia de h-ERG. El cebador antisentido empleado hibrida
con la secuencia correspondiente a los residuos 400-407 del canal. El producto resultante
de la reacción de PCR se purificó, se digirió con las endonucleasas de restricción HindIII y
BstEII y se volvió a purificar. Tras ello se ligó a un fragmento, purificado a partir de un gel
agarosa, de pSP64A+ h-ERG, previamente digerido con HindIII y BstEII, utilizando la DNA-
polimerasa del bacteriófago T4 (“Roche”, “Fermentas”, “Takara”).

pSP64A+ h-ERG
2-135.

La variante 2-135 de h-ERG se generó de forma similar a la 2-16. En esta ocasión,
en el oligonucleótido 3’
5’ se situó, tras el codón ATG, la secuencia codificante para los
aminoácidos 136-145 del canal.

pSP64A+ h-ERG
155-209.

El oligonucleótido 5’
3’ utilizado para generar la construcción 155-209 contiene la
secuencia codificante para los residuos 152-154 y 209-215, además de un sitio de
reconocimiento para BstXI, el cual se solapa con la secuencia de los aminoácidos 152-154 y
209. El cebador antisentido contiene, por su parte, la secuencia codificante correspondiente
a los residuos 365-372 que se solapa con el sitio de restricción único para BstEII. El
fragmento de PCR fue finalmente digerido con los enzimas BstXI y BstEII, y se substituyó
por el correspondiente fragmento nativo de pSP64A+ h-ERG.

pSP64A+ h-ERG
326-341.

La construcción h-ERG 326-341 se realizó mediante la combinación de dos
construcciones independientes. La primera contenía la secuencia codificante del canal
desde el residuo 1 al 325, con un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de
restricción SalI. La segunda construcción contenía la secuencia del aminoácido 342, con un
sitio SalI, hasta el aminoácido 698 del canal.
Para conseguir la segunda construcción se amplificó el fragmento correspondiente,
mediante PCR, utilizando un oligonucleótido sentido que contenía el sitio SalI, las
secuencias codificantes de los residuos 325 y 342, seguida de la secuencia de los residuos
341-348. Como cebador 3’
5’ se empleó un oligonucleótido con la secuencia de los
aminoácidos 694-701 y que contiene el sitio único en h-ERG XhoI. Este fragmento resultante
se digirió con los enzimas SalI y XhoI, se purificó y se subclonó en el vector plasmídico
pBluescript KS+ (“Stratagene”) para generar la construcción pBKS+ 342-698.
La primera construcción, que contiene la secuencia codificante correspondiente a los
residuos 1-325 de h-ERG, se realizó también mediante la amplificación de dicho fragmento
por PCR. Para ello, se utilizó el oligonucleótido 5’
3’, descrito anteriormente, que contiene
el sitio HindIII y los primeros residuos del canal y, como cebador antisentido, un
oligonucleótido que contenía la secuencia correspondiente a los aminoácidos 319-325 y
342-343, así como el sitio SalI, que se solapa con los aminoácidos 325 y 342. El producto
amplificado se digirió con los enzimas SalI y XhoI, se purificó y se subclonó en la
construcción parcial pBKS+ 342-698 para dar la construcción pBKS+ 1-698, que contiene la
38 - Materiales y Métodos

deleción 326-341. Finalmente, el fragmento digerido con HindIII y XhoI de esta última
construcción se substituyó por el correspondiente fragmento nativo del plásmido pSP64A+
h-ERG.

pSP64A+ h-ERG
363-373.

La variante del canal 363-373 se generó de manera semejante a las construcciones
138-373, 223-373, 326-373, 333-373, 345-373 y 355-373. Así, se diseñó un
cebador 3’
5’ de 30 pb que contenía la secuencia del sitio único de h-ERG BstEII, el cual
se solapa con la secuencia de los residuos 375-374, seguido de las secuencias
complementarias de los residuos 361-354. Como oligonucleótido sentido se utilizó el
cebador que contiene el sitio HindIII, el codón iniciador y la secuencia de los primeros
aminoácidos de h-ERG.
Tras amplificar el fragmento por PCR, digerirlo con los enzimas HindIII y BstEII, y
purificarlo, se substituyó por el mismo fragmento nativo en pSP64A+ h-ERG para dar la
variante 363-373.

pSP64A+ h-ERG
326-341/
363-373.

Para la construcción de la variante del canal con la doble deleción 326-341/363-
373, se amplificó un fragmento de DNA utilizando los mismos cebadores utilizados en el
caso anterior pero, en esta ocasión, se empleó como molde de la reacción de PCR el
plásmido recombinante pSP64A+ h-ERG 326-341. De igual forma que en casos anteriores,
finalmente se substituyó por el fragmento HindIII/BstEII nativo de pSP64A+ h-ERG.

III.2.2. Mutantes puntuales y combinados.

pSP64A+ h-ERG V3C.

Para el mutante en la región inicial del extremo amino del canal, V3C, se diseñó un
oligonucleótido sentido de 34 pb que contiene el sitio HindIII y la secuencia codificante de
los residuos 1-7, conteniendo la mutación puntual sustitutiva de valina por cisteína.
Utilizando como cebador 3’
5’ aquel que contiene el sitio único BstEII, descrito
anteriormente, se amplificó un fragmento que, posteriormente, tras digerirlo con los enzimas
HindIII y BstEII, substituyó al fragmento nativo en pSP64A+ h-ERG.

pSP64A+ h-ERG V3C
864-1010.

La variante combinada de la mutación V3C con la deleción en el extremo carboxilo
h-ERG V3C/864-1010, se generó substituyendo el fragmento XhoI/BamHI obtenido del
plásmido pSP64A+ h-ERG 864-1010 (Diego García Manso, 2006, Tesis Doctoral) y que
contiene la deleción, por el mismo fragmento en pSP64A+ h-ERG V3C.

pSP64A+ h-ERG D540C, R541H, R541A, Y542C, S543C, E544C, Y545C, G546C.
Los canales con las mutaciones puntuales en el lazo intracelular S4-S5 D540C,
R541H, R541A, Y542C, S543C, E544C, Y545C y G546C se generaron siguiendo la
estrategia basada en el método descrito por Ho et al. (ver apartado II.5). Los
 Materiales y Métodos - 39

oligonucleótidos empleados que contienen las mutaciones puntuales, al igual que el resto de
oligonucleótidos que introducen variaciones en h-ERG, se recogen en la Tabla 3.
En los mutantes R541H, R541A, Y542C y G546C, el cebador externo 5’
3’ empleado
cubre la secuencia codificante para los residuos 368-376 de h-ERG, en la que se solapa el
sitio único BstEII con las secuencias de los residuos 374-375. Por otro lado, el cebador
externo antisentido empleado en estos mutantes R541H, Y542C y G546C contiene la
secuencia complementaria a la codificante para los residuos 694-701, en la que se solapa,
en las secuencias de los residuos 697-698, el sitio XhoI, único en la secuencia de h-ERG.
En ocasiones, también se utilizó como oligonucleótido externo 3’
5’ uno que contiene la
secuencia complementaria de los residuos 666-673 de h-ERG.
Para generar los mutantes D540C, S543C, E544C e Y545C, se emplearon como
oligonucleótidos externos 5’
3’ una serie de cebadores semejantes entre sí, con una
longitud de 25-33 pb y que cubren la secuencia codificante de los residuos 320 al 334. Estos
cebadores, empleados anteriormente, portan mutaciones puntuales, para mutagénesis, que
son eliminadas al sustituir los fragmentos resultantes en el plásmido nativo. Además,
también se utilizó como oligonucleótido externo en la tercera PCR el cebador sentido que
contiene el sitio BstEII, citado anteriormente.
En el caso del cebador externo 3’
5’ de la primera PCR, se utilizó un oligonucleótido
que hibrida con las secuencias codificantes de los residuos 756-764 y que, además,
contiene una diana para el enzima SalI. Dicha diana, inexistente en h-ERG, la cual se
empleó en otros trabajos, fue eliminada en la construcción final según lo descrito
anteriormente. A su vez, en la tercera PCR se cambió este cebador externo antisentido por
el mismo que ya ha sido descrito y que cubre la secuencia del sitio XhoI.
Finalmente, los fragmentos amplificados tras la última fase del método de mutagénesis
dirigida fueron purificados y, posteriormente, digeridos con los enzimas BstEII y BglII. Tras
ello, los fragmentos fueron nuevamente purificados para reemplazar al correspondiente
fragmento nativo en el plásmido pSP64A+ h-ERG.

pSP64A+ h-ERG R541A/
2-370, Y542C/
2-370, G546C/
2-370, Y542C/
864-1010.

Los canales en los que se combinan mutaciones puntuales en el lazo S4-S5 y la
deleción del extremo amino Y542C/2-370, R541A/2-370 y G546C/2-370, se
construyeron substituyendo el fragmento BstEII/BglII, portando las respectivas mutaciones,
por el correspondiente fragmento en pSP64A+ h-ERG 2-370. Por su parte, la variante en la
que se combina la mutación Y542C con la deleción en el extremo carboxilo Y542C/864-
1010, se generó substituyendo el fragmento XhoI/BamHI obtenido del plásmido pSP64A+
h-ERG 864-1010 y que contiene la deleción, por el mismo fragmento de pSP64A+ h-ERG
Y542C.

pSP64A+ h-ERG V3C/Y542C, V3C/G546C.

Las variantes que combinan dos mutaciones puntuales en la región inicial del extremo
amino y otra en el lazo intracelular S4-S5, h-ERG V3C/Y542C y V3C/G546C, se
construyeron de forma análoga a la anteriormente descrita. Así, se substituyó el fragmento
HindIII/BstEII, que porta la mutación V3C, por el correspondiente fragmento en los
plásmidos recombinantes pSP64A+ h-ERG Y542C y pSP64A+ h-ERG G546C,
respectivamente.
40 - Materiales y Métodos

pSP64A+ h-ERG KKR-A.

La estrategia seguida para la construcción del mutante triple de h-ERG que porta en el
dominio proximal las mutaciones puntuales K362A, K363A y R366A (denominado en lo
sucesivo KKR-A), fue muy parecida a la seguida para la generación de los mutantes
delecionados. Así, se diseñó un oligonucleótido antisentido, que hibrida con la secuencia de
los residuos 360-375, con la diana BstEII y que porta las mutaciones puntuales citadas.
Como cebador 5’
3’ se utilizó el mismo que el empleado en la construcción de las
deleciones con el sitio HindIII y la secuencia de los primeros residuos del canal. El
fragmento amplificado purificado fue digerido con HindIII y BstEII y, finalmente, sustituido por
el nativo en pSP64A+ h-ERG.

pSP64A+ h-ERG
326-341/KKR-A.

Para generar la variante combinada h-ERG 326-341/KKR-A se amplificó un
fragmento de DNA empleando los mismos cebadores que en el caso anterior pero, esta vez,
utilizando como molde el plásmido recombinante pSP64A+ h-ERG 326-341. También en
este caso, el fragmento digerido HindIII/BstEII se utilizó para reemplazar al fragmento nativo
en pSP64A+ h-ERG.

pSP64A+ h-ERG YTS-A/
363-373, YTS-A/KKR-A.

De igual forma que en el caso anterior, para el mutante triple de h-ERG que porta en el
dominio proximal las mutaciones Y327A, T329A e S331A, utilizaremos la nomenclatura
YTS-A. La estrategia seguida para la construcción de este mutante fue semejante a la
utilizada con el mutante KKR-A y ya ha sido descrita previamente (David Gómez Varela,
2004, Tesis Doctoral). Utilizando como cebadores los oligonucleótidos descritos para la
generación de la variante delecionada 363-373 y, como molde, el plásmido con la triple
mutación YTS-A, se amplificó un fragmento de DNA. Posteriormente, este fragmento
digerido con HindIII y BstEII se utilizó para reemplazar al fragmento nativo en pSP64A+
h-ERG, originándose la variante YTS-A/363-373. De forma análoga, se construyó la
variante con las dos mutaciones triples YTS-A/KKR-A pero, esta vez, se utilizaron en la
reacción de PCR los cebadores descritos para el mutante KKR-A y, como molde, pSP64A+
h-ERG YTS-A.

III.2.3. Variantes con substituciones en el dominio proximal.

pSP64A+ h-ERG 326-341/SubA, 326-341/SubB.

Para la construcción de las variantes h-ERG 326-341/SubA y 326-341/SubB, en las
que se substituyen los 15 residuos del segmento 326-341 por otras secuencias no
relacionadas con la secuencia nativa del canal, se subclonó en el sitio de restricción SalI de
la construcción 326-341 el oligonucleótido de doble cadena [(5’)TCGACCGCTACCCGTAC
GACGTTCCGGACTACGCCACCCTAACTTTG(3’)], que contiene en sus extremos sitios de
reconocimiento para SalI además de un sitio de restricción interno para BsiWI. Para la
formación del oligonucleótido de doble cadena, los oligonucleótidos (sentido y antisentido,
cuyas secuencias se muestran también en la Tabla 3) se fosforilaron con ATP y
Polinucleótido Quinasa del bacteriófago T4 (“Fermentans”). Posteriormente, ambos
 Materiales y Métodos - 41

oligonucleótidos, de cadena sencilla, se hibridaron tras ser desnaturalizados a 95ºC, para

generar el oligonucleótido de doble cadena.
Al subclonar en el sitio SalI este oligonucleótido de doble cadena, se produjo la
inserción del mismo tanto en la orientación directa como en la reversa. Así, se generaron las
variantes 326-341/SubA y 326-341/SubB, cuyas secuencias insertadas en pauta de lectura
en 326-341 codifican para los polipéptidos, DRYPYDVPDYATLNF y DKVEGGVVRNVARV
A, respectivamente.

Construcción Cebador Secuencia del oligonucleótido

2-16 5’
3’ (5’)GGAAGCTTTCAGGATGACCATCATCCGCAAGTTTGAGGGCCAGAG(3’)
HindIII
2-135 5’
3’ (5’)GGAAGCTTTCAGGATGGACATGGTGGGGTCCCCGGCTCATGACACC(3’)
HindIII
155-209 5’
3’ (5’)CCAGCTGGCTGGCCCTGGACGAAGTG(3’)
BstXI
326-341 5’
3’ (5’)CCGTGTCGACCTCAAGGGCGACCCCTTC(3’)
SalI
3’
5’ (5’)CCTAGTCGACGAGGTCGGAGTCCGAGG(3’)
SalI
363-373 3’
5’ (5’)CCGGTGACCGGTGCTATGATCTCACGGTCAC(3’)
BstEII
V3C 5’
3’ (5’)GGAAGCTTTCAGGATGCCGTGCCGGAGGGGCCACG(3’)
HindIII
KKR-A 3’
5’ (5’)CGGGTGACCTTCTCAGTGACATTGTGGGTTGCCTCCGCTATCGCAGGTGC(3’)
BstEII
D540C 5’
3’ (5’)GGCGCGGAAGCTGTGTCGCTACTCAGAGTACGG(3’)
3’
5’ (3’)GCGCCTTCGACACAGCGATGAGTCTCATGCCGC(5’)
R541H 5’
3’ (5’)GGAAGCTGGATCACTACTCAGAG(3’)
3’
5’ (3’)CCTTCGACCTAGTGATGAGTCTC(5’)
R541A 5’
3’ (5’)GGAAGCTGGATGCCTACTCAGAGTACG(3’)
3’
5’ (3’)GCCTTCGACCTACGGATGAGTCTCATGC(5’)
Y542C 5’
3’ (5’)CGGAAGCTGGATCGCTGCTCAGAGTACGGC(3’)
3’
5’ (3’)GCCTTCGACCTAGCGACGAGTCTCATGCCG(5’)
S543C 5’
3’ (5’)GGAAGCTGGATCGCTACTGCGAGTACGGCG(3’)
3’
5’ (3’)CCTTCGACCTAGCGATGACGCTCATGCCGC(5’)
E544C 5’
3’ (5’)GGAAGCTGGATCGCTACTCATGCTACGGCGCGG(3’)
3’
5’ (3’)CCTTCGACCTAGCGATGAGTACGATGCCGCGCC(5’)
Y545C 5’
3’ (5’)CGCTACTCAGAGTGCGGCGCGGCCGTGCTGTTC(3’)
3’
5’ (3’)GATGAGTCTCACGCCGCFCCGGCACGACAAG(5’)
G546C 5’
3’ (5’)GCTACTCAGAGTACTGCGCGGCCGTGCTGTTCTTGC(3’)
3’
5’ (3’)CGATGAGTCTCATGACGCGCCGGCACGACAAGAACG(5’)
SubA/B 5’
3’ (5’)TCGACCGCTACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCCACCCTCAACTTTG(3’)
3’
5’ SalI BsiWI
(3’)GGCGATGGGCATGCTGCAAGGCCTGATGCGGTGGGAGTTGAAACAGCT(5’)
SalI BsiWI SalI

Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados para la introducción de deleciones y mutaciones puntuales en el

canal h-ERG.
Se muestran las secuencias de los oligonucleótidos conteniendo las variaciones introducidas, en negrita, y, en
algunos casos, las dianas de reconocimiento para endonulceasas de restricción, subrayadas. En las primera
columna de la izquierda aparece la construcción para la que fue utilizado el oligonucleótido y, en la segunda, su
función como cebador sentido (5’
3’) o antisentido (3’
5’).
42 - Materiales y Métodos

IV. SÍNTESIS in vitro DE cRNA

La síntesis in vitro del cRNA de las distintas construcciones del canal h-ERG se realizó
utilizando la RNA Polimerasa SP6, la cual utiliza el promotor para esta polimerasa viral,
existente en la secuencia del vector pSP64A+. Por su parte, la síntesis del cRNA del
receptor de TRH se realizó empleando RNA Polimerasa T7, que utiliza uno de los
promotores presentes en el vector pcDNA3B y bajo el cual se encuentra la secuencia del
receptor en la orientación correcta.

En una primera etapa, se generaron los DNA-moldes que, posteriormente, se utilizaron

para la transcripción in vitro. Para ello, el DNA plasmídico circular covalentemente cerrado
ha de linearizarse, por lo que los plásmidos se digirieron con el enzima EcoRI, tanto las
construcciones de h-ERG como las del receptor de TRH, purificándose seguidamente.
Tras un tratamiento de 1h a 37ºC con Proteinasa K a una concentración final de 0.5-1
mg/mL, se realizó una extracción con un volumen de fenol (“Fluka”) y un volumen de
cloroformo (“Panreac”). La fase acuosa resultante se recuperó y se precipitó el DNA-molde.
Para ello, se añadieron 3 volúmenes de etanol absoluto y 0.1 volúmenes de acetato sódico 3
M, y se dejó la mezcla un mínimo de 2 y un máximo de 12-24 h a -20ºC. Posteriormente, se
recogió el DNA-molde por centrifugación (1 h, 4ºC) y se resuspendió en un volumen
adecuado de agua milliQ tratada con DEPC a una concentración de 0.5 mg/mL.

En una segunda etapa se procedió a la transcripción in vitro de cDNA. Para ello, la

reacción contenía 2-4 μg del DNA-molde, GTP 50 μM (“Roche”), 0.5 mM de cada uno de los
ribonucleótidos (r)ATP, (r)CTP, (r)UTP (“Roche”) y del análogo del “cap” m7G(5’)ppp(5’)G
(“Amersham”, “Promega”), 50 U de inhibidor de RNasa (“Roche”), en un medio tamponado
con MgCl2 6 mM, espermidina 2 mM, Tris-HCl 40 mM a pH 7.5 y DTT 10 mM. A ésta mezcla
se le agregó 10 U de la RNA Polimerasa correspondiente (SP6 ó T7) y se dejó la reacción
de transcripción 2 h a 37ºC (de la Peña et al., 1992a).
Para tratar de obtener un mayor rendimiento en la cantidad de cRNA obtenido, en la
mayor parte de las transcripciones in vitro que se realizaron en este trabajo se emplearon
los reactivos del preparado comercial “mMESSAGE mMACHINE®” (“Ambion”). Para ello, se
siguieron las indicaciones de la casa comercial con algunas modificaciones mínimas. Así, la
cantidad de DNA-molde fue de 1.5 μg, a la que se agregaron 5 μl de una mezcla 2X que
contiene los ribonucleótidos (r)ATP, (r)CTP, y (r)UTP a una concentración de 10 mM, (r)GTP
2 mM y 8 mM del análogo del “cap” m7G(5’)ppp(5’)G, junto con 1 μl del “buffer” enzimático
10X y 1 μl de la solución del enzima, en un volumen final de 10 μl. La reacción de
transcripción se incubó a 37ºC durante 2 h, tras lo cual se detuvo añadiendo 10 μl de una
disolución 5 M de acetato amónico y 100 mM de EDTA (“Amomonium Acetate Stop
Solution®”) y, para incrementar el volumen, 80 μl de agua libre de nucleasa.

La etapa final consiste en la recuperación del cRNA sintetizado. En un principio, a

partir de las reacciones en las que no se empleaba el “kit” comercial, el cRNA se precipitaba
directamente añadiendo etanol absoluto y acetato potásico 3 M y, finalmente, se recogía por
 Materiales y Métodos - 43

centrifugación en frío (0-4ºC, 15-30 min), resuspendiéndose en 25-30 μl de agua milliQ

DEPC.
En las ocasiones en que se usó el “kit” comercial, tras detener la reacción de
transcripción in vitro, se procedió a una extracción con fenol-cloroformo, seguida de una
extracción con un volumen de cloroformo. Una vez recuperada la fase acuosa, para
precipitar el cRNA se añadió un volumen de isopropanol, y se dejó la mezcla a -20ºC un
mínimo de 12 y un máximo de 72 h. El cRNA se recogió posteriormente mediante
centrifugación en frío de larga duración (0-4ºC, 3 h) y se resuspendió finalmente en 20-30 μl
de agua milliQ libre de RNasas. Las disoluciones de cRNA se mantuvieron a -70ºC hasta su
uso.

V. EXPRESIÓN EN OOCITOS DE Xenopus laevis

Para la expresión funcional en oocitos de los canales h-ERG y el receptor de TRH, se

procedió a la microinyección citoplasmática del cRNA sintetizado según se describe en el
apartado anterior. Con este fin, se extrajeron quirúrgicamente fragmentos de ovario de
individuos hembra de Xenopus laevis (“Nasco”, Fort Atkinson, WI, USA), los cuales fueron
anestesiados previamente por inmersión en una suspensión de benzocaína (“Sigma-
Aldrich”) en agua. Para separar los oocitos del ovario, éste se raspó suavemente con la
ayuda de un asa de siembra. Posteriormente, se han de seleccionar los oocitos en el estadio
maduro del desarrollo y de apariencia sana. Tanto la obtención como la siguiente incubación
de los oocitos se realizaron en el medio OR-2 estándar descrito anteriormente.
Puesto que el núcleo de los oocitos se encuentra preferentemente en el polo
germinativo (polo animal), la microinyección citoplasmática se realizó bien en el polo
vegetativo o bien en la zona que separa ambos. Para ello se utilizó un microinyector “PLI-
100®” (“Medical Systems Co.”, Greenwale, NY, USA) y unas agujas fabricadas a partir de
capilares de vidrio de 0.2 mm de diámetro interno (“Drummond Scientific Co.”, Broomall, PA,
USA) en un estirador horizontal “PN-3®” (“Narishige Scientific Instrument Lab., Tokio,
Japón). El volumen inyectado fue de 30-50 nl/oocito, aunque, en algunas ocasiones y para
conseguir una mayor expresión de ciertas variantes del canal, éste llegó a ser de 70-80
nl/oocito. Dicho volumen se midió utilizando un telescopio invertido provisto de un ocular,
calibrado para el volumen interno de los capilares. Tras la microinyección, los oocitos se
mantuvieron a 17-19ºC en OR-2 con ampicilina.
Con el fin de facilitar el posterior registro electrofisiológico de los oocitos
microinyectados, es necesario eliminar la capa de células foliculares que los rodea. Para
ello, 24 h después de la microinyección, los oocitos se trataron con 2 mg/mL de Colagenasa
IA (“Sigma-Aldrich”) en OR-2 durante 45-50 min. Tras el lavado de los oocitos y
transcurridas 2-3 h, se procede a eliminar manualmente la capa folicular, ayudándose de
unas pinzas finas de disección y una lupa binocular. Tras este proceso, los oocitos se
mantuvieron a 17-19ºC en OR-2 convencional con ampicilina hasta su registro
electrofisiológico, unas 24 h después. Con ello, la expresión funcional de h-ERG y el
receptor de TRH se analizó 2-3 días después de la microinyección citoplasmática del cRNA
(de la Peña et al., 1992a y b; Barros et al., 1998).
44 - Materiales y Métodos

VI. REGISTRO ELECTROFISIOLÓGICOS DE LOS OOCITOS

Las corrientes iónicas de los oocitos se midieron a temperatura ambiente (20ºC) en

condiciones de “clamp de voltaje” de dos electrodos. Para ello se utilizó un amplificador
“Turbo TEC 01C®” (“N.P.I.”, Tamm, Alemania) y las pipetas de los electrodos se fabricaron a
partir de capilares de borosilicato de 1.16 mm de diámetro interno (“Clark Electromedical
Instruments”, Pangbourne Reading, UK; ”World Precision Instruments Inc.”, Sarasota, FL,
USA) en un estirador vertical “L/M 3P-A®” (“List Medical Electronic”, Alemania). La
resistencia de los electrodos de corriente y de potencial, rellenos con KCl 3 M, fue de 0.4-0.8
M
. Estos rangos fueron obtenidos tras quebrar la punta de las pipetas procedentes del
estirador, visualizándolas con un microscopio óptico convencional.
Para el registro electrofisiológico, los oocitos, libres de la capa de células foliculares, se
situaron en una pequeña cavidad de una cámara de aproximadamente 0.2 mL de volumen.
Dicha cámara fue perfundida continuamente con medio OR-2 a un ritmo de entre 0.5 y 3
mL/min. En los casos en los que se necesitó una velocidad alta de recambio del volumen de
la cámara, la velocidad de perfusión se incrementó hasta 5-6 mL/min. La perfusión de la
cámara de registro se realizó empleando una bomba peristáltica “Miniplus®” (“Gilson").
La estimulación y recogida de los datos se realizó con el programa “Pulse®” (“HEKA
Electronik”, Lambrecht, Alemania), gestionado por un ordenador Macintosh y una interfase
analógico/digital “ITC-16®” (“Instrutech Co.”, Elmont, NY, USA). Los datos fueron
muestreados y filtrados a 1 kHz. Para la substracción de los componentes óhmicos y
capacitivos se utilizó un protocolo P/n aplicado desde el potencial de membrana basal y, en
general, con un factor de multiplicación de 0.1 ó 0.2 y un nivel de repetición P/4.

La cantidad de cRNA de las variantes de h-ERG microinyectada en los oocitos, se

calibró de manera que la magnitud de las corrientes de entrada se mantuviera en un rango
entre 0.5 y 6-7 μA, tras repolarizar la membrana a -80/-100 mV en medio OR-2 50 mM K+ y
a fin de asegurar un correcto control por el “clamp” de voltaje. En ciertas ocasiones, en las
que las corrientes de entrada superaban niveles de más de 7 μA, los registros se realizaron
en medio OR-2 estándar, midiéndose entonces las corrientes de salida correspondientes a
las colas tras repolarizar la membrana entre -50 y -80 mV.
Normalmente, se utilizó un potencial de membrana basal de -80 mV. Sin embargo,
para aquellas variantes en las que la dependencia de voltaje de activación estaba
desplazada hacia valores más negativos, dicho potencial basal se fijó a -100/-110 mV. De
esta manera, se aseguró que todos los canales estuvieran basalmente en conformación
cerrada. Sólo se analizaron oocitos cuyo potencial de membrana antes de ser sometidos a
“clamp” de voltaje era más negativo de -30 mV y/o en los que las corrientes basales eran
menores de 200 nA al someterlos a “clamp” de voltaje.
 Materiales y Métodos - 45

VII. ANÁLISIS MATEMÁTICO

VII.1. Ajustes matemáticos.

El análisis de los datos de corrientes, los ajustes matemáticos para la obtención de los
parámetros cinéticos y la representación gráfica de los mismos, se realizaron mediante los
programas “PulseFit®” (“HEKA Electronik”, Lambrecht, Alemania) e “Igor Pro®” (“Wavemetric
Inc.”, Lake Oswego, OR, USA).

Para la obtención de las curvas de corriente/voltaje (curvas I/V) o de la evolución

temporal de las corrientes, las corrientes de cola fueron normalizadas respecto a la corriente
máxima según la expresión Inorm = (I – I min)/Imáx, en la que Imin indica el valor mínimo de
corriente para cada protocolo, Imáx la corriente máxima e I la cantidad de corriente en
respuesta a un pulso dado.
Cuando las curvas I/V se utilizaron solamente para el análisis de la dependencia de
voltaje de activación de las distintas construcciones, se ajustaron a una ecuación de
Boltzmann del tipo:
Inorm = 1/[1 + exp(V – V1/2)/k]
donde V es el voltaje del pulso de despolarización, V1/2 es el voltaje para el cual se alcanza
la corriente semimáxima (Inorm = 0.5) y k es la constante de Boltzmann.
En los casos en los que las curvas I/V se utilizaron para obtener también el valor de la
carga equivalente de activación (zg), éstas fueron ajustadas a una variante de la ecuación
anterior del tipo:
Inorm = 1/[1 + exp (V1/2 - V) zgF/RT]
donde F, R y T son la constante de Faraday, la constante universal de los gases y la
temperatura en Kelvin, respectivamente. Por último, cuando las curvas I/V se utilizaron para
cuantificar el valor de energía libre de activación a 0 mV (
G0), se empleó para su ajuste
una ecuación de Boltzmann alternativa:
Inorm = 1/[1 + exp(
G0 - VzgF) /RT]
en la que
G0 nos permite obtener el valor del potencial químico de activación en ausencia
de campo eléctrico (i.e. a 0 mV) y VzgF corresponde al potencial electrostático, para el
proceso de activación de cada variante.
Para generar las curvas I/V se utilizó normalmente un protocolo estándar en el que se
mide el máximo de las corrientes de cola obtenidas tras una serie de pulsos despolarizantes
de magnitud variable. En aquellas variantes de h-ERG, incluida la nativa, en las que el cierre
es particularmente lento, el máximo de la corriente de cola aporta una estimación bastante
aproximada de la fracción de canales activados (e inactivados) al final del pulso
despolarizante. Para aquellos canales cuyo cierre es muy rápido, se ajustó la fase de caída
de las corrientes de cola a una ecuación biexponencial (ver más adelante) y se extrapoló la
magnitud de la corriente al inicio del pulso despolarizante. Se obtuvo así la corriente
correspondiente a la población de canales abiertos (e inactivos) durante la despolarización,
pero sin influencia del rápido proceso de cierre durante las colas. Alternativamente y para
minimizar la posible influencia de la recuperación de la inactivación tanto en el máximo de la
corriente de cola como en la magnitud de corriente extrapolada, se estimó la integral de toda
46 - Materiales y Métodos

la corriente de cola (carga), que se utilizó para determinar la dependencia de voltaje de

activación. En ambos casos, las diferencias en los valores de V1/2 fueron mínimas, no
significativas y nunca mayores de ± 3 mV.
El impacto de la mutación de ciertos residuos, como los del lazo intracelular S4-S5 en
la activación de h-ERG, se valoró estimando el cambio en la energía libre de activación
(potencial químico) respecto al canal nativo según la expresión:


G0 =
G0(mut) -
G0(wt)
donde

G0 es el incremento en la energía libre de activación por la mutación puntual y

G0(mut) y
G0(wt) son los valores de los potenciales químicos que dirigen la activación del
mutante estudiado y del canal nativo, respectivamente.
La velocidad de activación de los distintos canales se comprobó midiendo el tiempo
necesario para alcanzar la corriente semimáxima (t0.5). Para ello, se utilizó un protocolo
indirecto de “desarrollo de corrientes” en el que se varía la duración de los pulsos
despolarizantes a un voltaje fijo, midiéndose subsiguientemente el curso temporal de la
aparición de las corrientes de cola al final de los sucesivos pulsos de despolarización.

Por su parte, las tasas de cierre se determinaron ajustando la fase de caída de las
corrientes de cola obtenidas al repolarizar a diversos voltajes, después de despolarizar a un
voltaje fijo. Dichos ajustes se efectuaron utilizando una ecuación biexponencial del tipo:
y = Af exp(1/
f · x) + As exp (1/
s · x) + C
donde
f y
s son las constantes de tiempo del componente rápido y lento, Af y As las
amplitudes relativas de estos dos componentes, y C una constante. Para hacer estos
ajustes se situó el primer cursor por detrás del máximo inicial de las colas, una vez
completada la recuperación de la inactivación.

Para determinar la evolución temporal de las corrientes durante la perfusión con los
medios oxidante y reductor, las corrientes de cola fueron normalizadas respecto a la
corriente máxima según la expresión Inorm = (I/I0)100, en la que I0 indica el valor de la
corriente de cola en el momento anterior a la entrada del medio con el agente oxidante
tbHO2 e I el valor de la corriente de cola en cada pulso.
La cinética de inhibición de las corrientes de cola tras la adición del agente oxidante,
se estimó ajustando el curso temporal de la disminución de la corriente normalizada a
ecuaciones biexponenciales del tipo de la mostrada anteriormente [y = Af exp(1/
f · x) + As
exp (1/
s · x) + C] para determinar las tasas de cierre de la corriente de cola. En algunos
casos en los que el ajuste biexponencial no rindió resultados satisfactorios, se utilizaron
ecuaciones monoexponenciales del tipo y = A exp(1/
· x) + C.

VII.2. Análisis estadístico.

Para analizar estadísticamente los datos generados, se utilizó el programa “InStat®”

(“GraphPad Software Inc.”, San Diego, CA, USA). En las gráficas, los datos numéricos se
representan como media ± s.e.m. (error estándar de la media), con “n” indicando el número
 Materiales y Métodos - 47

de oocitos y “p” el nivel de significación obtenido mediante los diferentes test comparativos
utilizados.

Los grupos de datos se analizaron primeramente mediante el test paramétrico “t de

Student” (con datos desapareados y dos colas) o bien mediante un test “ANOVA” (análisis
de la varianza). En ocasiones, debido a la dispersión de los datos, las varianzas no eran
homogéneas, de acuerdo con el test de “Barlett”, obteniéndose diferencias significativas en
las desviaciones estándar. En estos casos, se empleó para el análisis el test “Welch”, que
asume poblaciones gaussianas con desviaciones estándar no homogéneas o,
alternativamente, el test “Wilcoxon” o “Mann-Whitney”, que no hacen ninguna suposición
acerca de la dispersión de los datos.
En todos los casos, se consideraron estadísticamente significativas las diferencias
cuando el valor de “p” era menor de 0.05.

VIII. MODELOS DE HOMOLOGÍA ESTRUCTURAL

Para generar los modelos de homología de h-ERG basados en las estructuras

tridimensionales obtenidas de los cristales de Kv1.2 (Long et al., 2005) y MlotiK (Clayton et
al., 2008), se utilizó el programa “USCF Chimera®” [financiado por P41 RR-01081 del
“Instituto Nacional de Salud” estadunidense (“National Institute of Health”, NIH),
http://www.cgl.uscf.edu/chimera], con el que se generaron los modelos incluidos en las
gráficas, así como el protocolo “Deep View” del programa “Swiss-Pdb Viewer®”
(http://www.expasy.org/spdbv/), con el que se substituyeron los residuos homólogos de
h-ERG en las secuencias de Kv1.2 y MlotiK. Las estructuras tridimensionales se obtuvieron
del “Banco de Datos de Proteínas” (“Protein Data Bank”, PDB, http://www.rcsb.org),
correspondiendo los códigos identificadores de Kv1.2 y MlotiK a 2a79 y 3co2,
respectivamente.
48 - Materiales y Métodos
Resultados
 Resultados - 49

I. RELEVANCIA DEL EXTREMO AMINO Y DEL LAZO S4-S5

DE h-ERG EN LAS PROPIEDADES CINÉTICAS Y
TERMODINÁMICAS DEL CANAL

Como se ha indicado anteriormente, al igual que otros canales dependientes de

voltaje, el determinante estructural de la sensibilidad de h-ERG al potencial de membrana se
encuentra en la región limitada por los segmentos transmembranales S1 a S4 (VSD,
“voltage sensor domain”; Durell et al., 1998). Sin embargo también se ha reconocido que
existen otras estructuras intracelulares de h-ERG que pueden contribuir a la maquinaria de
apertura y cierre del canal y que son esenciales en el control de las transiciones entre sus
distintos estados conformacionales (Morais-Cabral et al., 1998; Kupershmidt et al., 1998;
Wang et al., 1998, 2000; Chen et al., 1999; Jiang et al., 1999; Sanguinetti & Xu, 1999; Viloria
et al., 2000; Aydar & Palmer, 2001; Gómez-Varela et al., 2002; Tristani-Firouzi et al., 2002;
Piper et al., 2005, Ferrer et al., 2006; Saenen et al., 2006).

En este trabajo hemos estudiado el papel que juegan ciertas estructuras

citoplasmáticas en el control de los procesos de apertura y cierre del canal h-ERG. Para ello,
se han analizado las propiedades cinéticas y termodinámicas de diferentes variantes de
h-ERG, modificadas en el extremo amino y/o mutadas en el lazo intracelular que une las
hélices transmembranales S4 y S5. Con el fin de comparar el impacto producido por las
diferentes modificaciones estructurales en determinados residuos, dominios o regiones
proteicas de h-ERG sobre la apertura y cierre del canal, los parámetros cinéticos y
termodinámicos se han obtenido en condiciones de equilibrio o verdadero estado
estacionario. En estas condiciones, del análisis de la dependencia de voltaje de activación,
se pueden obtener una serie de parámetros termodinámicos relacionados con los distintos
estados conformacionales del canal y su mecanismo de apertura y cierre. Así, a través de la
variación de energía libre (
G0) que dirige el proceso de activación, es posible conocer el
potencial químico que gobierna los cambios conformacionales de la proteína entre los
estados de abierto y de cerrado. Por otro lado, también es posible conocer el número de
cargas traslocadas a través del campo eléctrico de la membrana durante la apertura del
canal (zg), o bien el potencial electrostático (-zgEF) y el potencial electroquímico total [-(
G0-
zgEF)] que dirige la activación. Esto permitirá la comparación entre los parámetros cinéticos
de activación exhibidos por las diferentes variantes de h-ERG, no sólo en función del voltaje
aplicado a la membrana, sino también en función del potencial químico, eléctrico o
electroquímico total que dirige el proceso de apertura/cierre del canal. Además, la
cuantificación de los parámetros cinéticos bajo estas condiciones, aporta una información
sobre las características funcionales de la proteína y/o su variación tras la mutagénesis de la
misma, que es independiente de la situación experimental o de la subjetividad del
experimentador.
50 - Resultados

I.1. Efecto de la modificación estructural del extremo amino de

h-ERG sobre la dependencia de voltaje de activación del canal
en estado estacionario.

La importancia del dominio eag/PAS del extremo amino de h-ERG como determinante
de la lenta cinética de cierre del canal es conocida desde hace tiempo (Morais-Cabral et al.,
1998; Wang et al., 1998, 2000; Chen et al., 1999). Sin embargo, el posible papel que este
dominio pudiera tener en el proceso de activación de h-ERG no ha sido estudiado aún. Es
por ello que en este trabajo se ha abordado la caracterización termodinámica y cinética del
proceso de apertura en canales h-ERG modificados en la región inicial de la proteína
[residuos 1-135, en la cual se encuentra el dominio eag/PAS y cuya estructura tridimensional
ha sido caracterizada hace tiempo (Morais-Cabral et al., 1998)]. En primer lugar, se generó
un canal en el que se eliminó la totalidad de dicha región inicial (
2-135). Además, se
generó otra variante del canal carente de los primeros 16 residuos (
2-16), cuya estructura
tridimensional no es conocida, al aparecer desordenados en la estructura cristalina de la
región 1-135. Las características de ambos canales con deleciones se compararon con las
de la variante
2-370, carente de la práctica totalidad del extremo amino, así como con las
de la construcción
138-373, que carece específicamente de la región correspondiente al
dominio proximal.

Para analizar la dependencia de voltaje de activación, las células se despolarizaron a

potenciales diferentes durante un tiempo fijo y se midieron las corrientes de cola en la fase
de repolarización subsiguiente (Figura 5). Debido a que la inactivación de h-ERG es un
proceso muy rápido, las corrientes observadas durante los pulsos de despolarización que
activan al canal son muy reducidas. Además, en un amplio rango de voltajes, existe un
solapamiento entre las cinéticas de activación e inactivación (Trudeau et al., 1995;
Schönherr et al., 1999; Wang et al., 1997a; Viloria et al., 2000; Liu et al., 2003; Subbiah et
al., 2004). Por ello, y con el fin de determinar los parámetros de activación, se recurre a las
llamadas “corrientes de cola”, producidas al volver a potenciales negativos, tras haber
activado (e inactivado) los canales mediante los pulsos despolarizantes previos. Estas
corrientes, “de entrada” a los potenciales negativos y en las condiciones iónicas utilizadas en
nuestro caso, se deben a la rápida salida del estado de inactivo hacia el de abierto y antes
de que se produzca el lento cierre característico de h-ERG. Así, se puede conocer la
dependencia de voltaje de activación mediante curvas de corriente frente a voltaje (curvas
I/V), obtenidas al representar la magnitud de dichas corrientes de cola en función del
potencial de los pulsos previos de despolarización (Figs. 5 y 6).

Al estudiar la dependencia de voltaje de activación del canal nativo mediante las

curvas I/V originadas con pulsos despolarizantes de 1 s de duración desde un potencial
basal de -80 mV, se obtuvieron valores de V1/2, zg y
G0 de -21.9 ± 0.55 mV, 3.23 ± 0.06 y
-1.65 ± 0.05 kcal/mol, respectivamente. No obstante, en canales como h-ERG que se
caracterizan por sus lentas cinéticas de activación y cierre, no es esperable alcanzar el
estado estacionario con pulsos de tan corta duración. De hecho, cuando se incrementa la
duración de los pulsos de 1 a 10 s, la curva I/V se desplaza claramente hacia potenciales
más negativos a lo largo del eje de abscisas (ver Figuras 5 y 6). Esto modifica los valores de
 Resultados - 51

V1/2, zg y G0 a -42.6 ± 0.72 mV, 4.16 ± 0.09 y -4.08 ± 0.05 kcal/mol. Por otro lado, cuando a
canales h-ERG nativos se les aplican los pulsos de 10 s desde potenciales basales de -80 y
0 mV (para los cuales se espera que todos los canales estén en su conformación cerrada o
abierta, respectivamente), las curvas I/V obtenidas aún aparecen separadas unos 30 mV.
Esto demuestra que, para canales nativos, despolarizaciones de 10 s no son aún lo
suficientemente largas como para que se alcance un verdadero equilibrio, lo que significa
que, incluso con estas despolarizaciones tan largas, sólo se obtienen parámetros en un
estado “cuasiestacionario” o isocrónico, pero no los correspondientes a un auténtico estado
estacionario. Por ello, mientras para canales con cinéticas suficientemente rápidas, los
parámetros de activación se pueden obtener mediante ecuaciones de Boltzmann ajustadas
a curvas I/V coincidentes y desde los dos potenciales basales extremos (i.e. -100/-80 y
0/+40 mV) y/o con despolarizaciones largas de 10 s, para canales con cinéticas más lentas,
dichos parámetros han de obtenerse a partir de curvas promedio generadas utilizando las
curvas I/V aún no coincidentes, incluso tras despolarizaciones largas y desde los dos
potenciales basales a los que se esperan canales basalmente cerrados o abiertos,
respectivamente (ver Figs. 5 y 6). Esto garantiza que las curvas I/V sean exclusivamente
una función dependiente de los pulsos despolarizantes y no del estado previo que presenten
los canales (abierto o cerrado). Según esto, las curvas tienden a converger al aumentar la
duración del pulso independientemente de que los canales provengan del estado abierto o
cerrado y, por ello, el valor medio extrapolado marca el final de la tendencia de cada curva y
da una estimación muy razonable de los parámetros en condiciones de verdadero estado
estacionario (Schönherr et al., 1999; Viloria et al., 2000; Miranda et al., 2005). Nótese que el
promediado de las curvas ha de hacerse en horizontal y no utilizando los valores de
corriente a cada voltaje individual, para evitar que dicho promediado altere la pendiente de
las mismas. Por último, y como un claro ejemplo del impacto producido por las desviaciones
del estado estacionario, el valor de G0 de -1.65 kcal/mol obtenido mediante pulsos de 1 s
desde un potencial basal de -80 mV en canales h-ERG nativos, se convierte en -4.08
kcal/mol con pulsos de 10 s, un valor que se desvía aún claramente de las -5.70 kcal/mol
obtenidas en condiciones de auténtico equilibrio.

Es importante resaltar que las diferencias observadas en los parámetros cinéticos de

los canales en función de la duración de los pulsos condicionantes, no se deben a ningún
proceso secundario que ocurra durante las largas despolarizaciones (e.g. reclutamiento de
canales silentes o variaciones en la probabilidad de apertura a largo plazo como resultado
de un proceso celular lento e incontrolado) ya que: a) los desplazamientos en la
dependencia de voltaje obtenidos al variar el potencial de membrana basal para el mismo
tipo de despolarizaciones se dan en direcciones opuestas, y b) la cantidad de corriente en la
zona saturante de las curvas I/V al despolarizar tanto 1 como 10 s es la misma. Así, en
canales con pequeñas diferencias en la posición de las curvas I/V tras despolarizar 10 s
desde los dos potenciales basales, las variaciones en las cantidades de corriente máxima
son casi nulas (
5%) al aplicar a un oocito pulsos de 1 ó de 10 s. Análogamente, para el
canal nativo, que sí presenta grandes diferencias en la posición de las curvas, se obtienen
variaciones en la corriente máxima de tan sólo 4.0 ± 1.3% (n = 7), cuando se varía la
duración de las despolarizaciones de 1 a 10 s. Para el mutante G546C, que aún muestra
mayores desplazamientos que el canal nativo, las diferencias en la corriente máxima fueron
52 - Resultados

asimismo de tan sólo 2.3 ± 1.6% (n = 6) tras pulsos de 1 ó 10 s. Por ello, se puede afirmar
que las variaciones en los parámetros debidas a las diferentes situaciones cinéticas con
pulsos cortos y largos, afectan a la misma población de canales. Además, éste es un
comportamiento cinético inherente a h-ERG y que no está relacionado con la elección de los
oocitos de Xenopus como sistema de expresión y/o con las posibles interferencias de
corrientes de cloro endógenas de dichas células, ya que se han observado desviaciones
similares de las curvas I/V en células de mamífero HEK-293 en las que se han expresado
canales h-ERG nativos (Miranda et al., 2005).

Figura 5. Efecto de las modificaciones en el inicio del extremo amino de h-ERG sobre las corrientes
registradas mediante protocolos diseñados para obtener la dependencia de voltaje de activación en
condiciones de estado estacionario.
(A) Corrientes representativas obtenidas de un oocito que expresa canales nativos h-ERG, en respuesta a
despolarizaciones de 10 s a diferentes voltajes según se muestra en el esquema de la parte superior. Al
potencial basal de -80 mV (izqda.) la población de canales se mantiene inicialmente en estado cerrado y a 0
mV en estado abierto (dcha.). En los insertos se muestran de forma ampliada las corrientes al final de los
pulsos despolarizantes y las corrientes de cola obtenidas tras repolarizar la membrana a -100 mV.
(B) Corrientes de un oocito que expresa canales h-ERG carentes de los primeros 16 residuos (
2-16). Las
corrientes de cola se obtuvieron al repolarizar a -80 mV tras pulsos de 10 s entre -90 y +50 mV en incrementos
de 10 mV. Para abreviar, solamente se representa el final de los pulsos de despolarización y las corrientes de
cola. Los potenciales basales (“P.B.”) se indican en la gráfica. (C) Corrientes de un oocito que expresa canales
sin la región inicial del N-terminal de h-ERG, incluyendo el domino eag/PAS. Las corrientes de cola se
obtuvieron a -100 mV tras pulsos entre -90 y +60 mV.
 Resultados - 53

En el panel inferior de la Figura 6 se recogen los valores de V1/2, zg y
G0, en estado

estacionario, para las diferentes construcciones modificadas en el extremo amino de h-ERG.
Como se puede observar, al eliminar el dominio proximal se modifica el valor de V1/2 desde
los -53.5 ± 1.1 mV del canal nativo hasta los -78.3 ± 1.2 mV de la variante
138-373. Por el
contrario, en los canales carentes de los aminoácidos iniciales de la proteína, el
desplazamiento de las curvas I/V ocurre en sentido opuesto. Así, las variantes
2-16,

2-135 y
2-370 muestran valores de V1/2 de -20.0 ± 1.6, -34.1 ± 1.6, y -34.3 ± 0.5 mV,
respectivamente. Es interesante destacar que el valor de V1/2 obtenido con nuestro método
en estado estacionario para el canal nativo es muy similar al obtenido previamente tras
larguísimas despolarizaciones de 30 s (Chen et al., 1999).
Los datos de la Figura 6 también indican que los valores de zg de las construcciones

2-16 y
138-373, son significativamente menores que los correspondientes al canal tipo
silvestre. Por otro lado, mientras que para el canal carente del dominio proximal (
138-373)
se observa un potencial químico de activación muy exergónico (
G0 = -7.2 ± 0.12 kcal/mol
frente a las -5.7 ± 0.09 kcal/mol del canal nativo), para las construcciones modificadas en la
región inicial N-terminal se observan valores de
G0 menos negativos, independientemente
de la presencia o ausencia del dominio proximal (-1.7 ± 0.22, -3.5 ± 0.23, y -3.7 ± 0.13
kcal/mol para
2-16,
2-135, y
2-370). Estos resultados sugieren que la presencia del
dominio proximal tiende a estabilizar el/los estado(s) cerrado(s) de h-ERG, mientras que la
región inicial del extremo amino tiende a estabilizar el/los estados de abierto.
54 - Resultados

Figura 6. Efecto de la eliminación de regiones del extremo amino de h-ERG en su dependencia de

voltaje de activación en condiciones de estado estacionario.
Las curvas I/V correspondientes al canal nativo y al resto de las construcciones, se generaron a partir de las
corrientes de cola obtenidas según se detalla en la Fig. 5. Los círculos blancos corresponden a los datos
obtenidos al utilizar pulsos de 10 s desde valores hiperpolarizados de potencial basal (-80/-110 mV), y los
círculos negros a los obtenidos desde potenciales basales despolarizados (0/+40 mV). Los trazos continuos
representan las curvas de Boltzmann que mejor se ajustan a los datos. Las líneas punteadas representan las
curvas teóricas en condiciones de estado estacionario, las cuales se obtienen al promediar horizontalmente las
curvas correspondientes a los dos potenciales basales extremos, de manera que se conserve la sigmoidicidad
de las mismas. Las flechas indican la posición del valor de V1/2 en estado estacionario. Los datos
correspondientes a las curvas obtenidas con prepulsos de 1 s desde potenciales basales hiperpolarizantes se
representan mediante aspas para una mejor comparación. En el panel inferior izquierdo aparecen las curvas I/V
correspondientes al estado estacionario para todos los canales. Los parámetros cinéticos y termodinámicos se
muestran recopilados en la parte inferior. *p<0.05 frente al canal nativo.
 Resultados - 55

I.2. Efecto de la modificación estructural del extremo amino de

h-ERG sobre la velocidad de activación.
Análogamente a lo indicado en el apartado anterior para la dependencia de voltaje, el
solapamiento entre la rápida inactivación y la lenta activación de h-ERG, imposibilita obtener
las tasas de activación de forma directa durante los pulsos de despolarización. Como
consecuencia, para medir la velocidad de activación a diferentes voltajes se ha de utilizar un
protocolo indirecto en el que a cada potencial se varía la duración de los prepulsos
despolarizantes, midiéndose el máximo de la corriente de cola obtenida al repolarizar
posteriormente a un voltaje fijo. Además, debido a que h-ERG presenta varios estados de
cerrado antes de abrirse, el desarrollo temporal de la corriente muestra un aspecto
sigmoide, con cierto retraso inicial (Wang el al., 1997a; Gómez-Varela et al., 2002; Subbiah
et al., 2004; Saenen et al., 2006). Por ello, las tasas de activación se cuantificaron a partir
del tiempo necesario para alcanzar la corriente de cola semimáxima (t1/2) a cada voltaje de
despolarización (Viloria et al., 2000; Miranda et al., 2005).

En la Figura 7 se recogen los datos correspondientes a las diferentes construcciones

con modificaciones en el extremo amino comparados con los del canal silvestre. En todos
los canales y para todo el rango de voltajes estudiado, la variación de la tasa de activación
frente al potencial de membrana aplicado muestra una pendiente similar. Si se toman como
referencia las tasas a 0 mV, aquellos canales con modificaciones en los primeros 135
aminoácidos presentan una velocidad de activación similar a la del canal nativo. Así, los 143
± 8.6 ms necesarios para que el canal silvestre alcance la amplitud de corriente semimáxima
a 0 mV, se incrementan ligeramente hasta los 211 ± 21 y 213 ± 11 en los canales
2-16 y

2-135, o bien se reducen ligeramente hasta los 100 ± 9 ms en la construcción
2-370. Por
el contrario, y en concordancia con resultados previos (Viloria et al., 2000), el canal que
carece del dominio proximal (h-ERG
138-373) presenta una velocidad de activación unas 5
veces más rápida que la del canal nativo a dicho voltaje (t1/2 = 28 ± 1 ms).
Es importante resaltar que, debido a que todas estas modificaciones estructurales
alteran tanto la dependencia de voltaje (V1/2) como el número de cargas efectivas movidas a
través del campo eléctrico de la membrana (zg) en estado estacionario, la interpretación de
su impacto sobre la velocidad de activación es complicada, ya que en cada canal es
diferente el potencial electroquímico que dirige la activación. Por ello, se han representado
también las tasas de activación de las diferentes construcciones frente a la energía total
para dicha activación [-(
G0 – zgEF); Subbiah et al., 2004, 2005]. De nuevo, en todos los
casos, los trazos presentan la misma pendiente para todo el rango de voltajes. Sin embargo,
al compensar las tasas de activación según las diferencias en el potencial electroquímico, se
observa que la cinética de todos los canales con modificaciones en el extremo amino está
claramente acelerada en comparación con la del canal nativo. Así, tomando como referencia
un valor común de 4 kcal/mol de energía de activación, la velocidad se acelera 2 veces en
los canales
2-135, 3.5 veces en
138-373 y
2-370, y 4.3 veces en la variante
2-16.
56 - Resultados

Figura 7. Efecto de la eliminación de regiones N-terminales de h-ERG sobre la velocidad de

activación del canal.
(A) Corrientes representativas obtenidas en oocitos que expresan el canal h-ERG nativo y las variantes
modificadas en la región inicial del extremo amino (
2-16 y
2-135). El protocolo utilizado para medir la
velocidad de activación implica variar la duración de la despolarización (a 0 mV en A) según muestra el
esquema sobre los registros correspondientes al canal nativo. Las corrientes de cola mostradas se
corresponden con pulsos despolarizantes de 0, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560 y 5120 ms.
(B) Variación de las tasas de activación frente al potencial despolarizante de los prepulsos (izqda.) o frente a la
energía total de activación (dcha.) de canales modificados a lo largo del extremo amino. Para obtener el
máximo de las corrientes de cola, se utilizaron protocolos como el mostrado en el panel A para los diferentes
voltajes. Se representa el tiempo de activación semimáxima (t1/2 ) tanto frente al potencial de despolarización
(izqda.) como frente al potencial electroquímico total que empuja al ión [-(
G0 – zgEF), dcha.]. Los valores de

G0 y de zg se obtuvieron utilizando las curvas I/V en estado estacionario para cada uno de los canales. Para
una mejor comparación, se incluyen los datos correspondientes a canales
138-373 y
2-370. (C) Histogramas
que muestran la velocidad de activación a 0 mV (izqda.) y a 4 kcal/mol (dcha.) utilizando como parámetro
indicativo el inverso del tiempo de activación semimáxima. Los valores de t1/2 a 4 kcal/mol se determinaron a
partir de los puntos de cruce entre la línea discontinua, trazada a 4 kcal/mol y las gráficas de la variación de la
tasa de activación incluidas en B (panel dcho.). *p<0.05 frente al canal nativo.
 Resultados - 57

Estos resultados demuestran que, aunque las deleciones en el extremo amino

producen variaciones en la dependencia de voltaje que podrían ser la causa de cambios
aparentes en las tasas de apertura si estas se miden a potenciales de activación
submáximos, los cambios observados en dichas tasas no son un efecto secundario de los
cambios en la fuerza ión-motriz. Además, los datos sugieren que: a) además de la región
citoplasmática correspondiente al dominio proximal (Viloria et al., 2000; Gómez-Varela et al.,
2002; Saenen et al., 2006), también la zona inicial del extremo amino contribuye a modular
las características de activación, y b) las estructuras N-terminales ejercen un control sobre
las transiciones que limitan la tasa de activación durante el proceso de apertura. De hecho,
la activación es facilitada no sólo al eliminar el dominio proximal (canal
138-373), con tasas
de apertura más rápidas y un desplazamiento del equilibrio químico hacia estado(s)
abierto(s) (
G0 más negativo), sino también al eliminar la región inicial del extremo amino
(canales
2-16,
2-135, y
2-370), que desplaza el equilibrio hacia el/los estado(s) de
cerrado(s) (
G0 menos negativo). Es decir, las mutaciones del extremo amino modifican la
energía del estado de transición del proceso de apertura (
G‡), que determina la velocidad
de activación, ya que ésta es acelerada independientemente de los cambios en la diferencia
energética entre los estados de abierto y cerrado (
G0) que determina la estabilidad relativa
de ambos estados del canal.

I.3. Efecto de las modificaciones aminoterminales de h-ERG en la

cinética de cierre.
Para estimar la cinética de desactivación de h-ERG y su dependencia de voltaje, se
hicieron ajustes biexponenciales a la fase de caída de las corrientes de cola, obtenidas al
repolarizar los oocitos a diferentes voltajes tras despolarizar a un voltaje fijo (ver Métodos).
En la Figura 8, se puede observar que todos aquellos canales en los que faltan los primeros
16 aminoácidos, muestran una constante de tiempo muy reducida en el componente rápido
de cierre (que es el mayoritario en las corrientes de cola a potenciales muy negativos; ver
Morais-Cabral et al., 1998; Viloria et al., 2000; Subbiah et al., 2004), cuando se compararon
con el canal nativo. Así, a un potencial muy por debajo del umbral de activación (-100 mV),
se obtienen valores de dicha constante de 14.5 ± 1.3, 14.4 ± 2.0 y 16.0 ± 1.3 ms para los
canales
2-16,
2-135 y
2-370, respectivamente, que son mucho menores que el valor de
145 ± 14 ms correspondiente al canal nativo. Por el contrario, con la construcción en la que
se ha eliminado el dominio proximal (
138-373) se obtienen valores similares a los del canal
nativo (113 ± 4 ms).

Estos datos parecen confirmar la interpretación ya apuntada en estudios previos de

nuestro laboratorio de que la región inicial del extremo amino juega un papel crucial en las
propiedades de desactivación de h-ERG (Viloria et al., 2000). Sin embargo, al considerar las
diferencias en el potencial electroquímico de los diferentes canales y medir la constante de
tiempo (
) del componente rápido de cierre a una energía equivalente para todos (-4
kcal/mol), también se observa una velocidad de cierre 3.75 veces mayor en el canal
138-
373 que en el canal nativo. Según esto, el dominio proximal podría jugar también un papel
relevante en la cinética de cierre, una vez consideradas las diferencias en la fuerza motriz
58 - Resultados

del proceso de cierre. No obstante, la conveniencia de utilizar o no esta corrección para la

diferencia en el potencial electroquímico respecto al proceso de cierre, será discutida
posteriormente.

Figura 8. Efecto de la eliminación de regiones N-terminales sobre la cinética de cierre de h-ERG.

(A) Corrientes obtenidas para el estudio de la cinética de cierre en oocitos que expresan el canal h-ERG nativo
y las construcciones modificadas en los primeros residuos del extremo amino (h-ERG
2-16), así como el canal
carente del dominio eag/PAS (h-ERG
2-135). El protocolo utilizado para generar las familias de corrientes
comprende un prepulso a +40 mV para activar (e inactivar) los canales y una repolarización posterior a
diferentes voltajes entre -30 y -130 mV en decrementos de 10 mV, según el esquema mostrado encima de los
registros del canal nativo. Para una mayor claridad, solamente se representan los 4 primeros segundos de las
corrientes de cola durante la repolarización. (B) Variación de las tasas de cierre frente al potencial de
repolarización (izqda.) o frente a la energía total que dirige el cierre (dcha.). Las constantes de tiempo (
) se
determinaron de los ajustes biexponenciales a la fase de caída de las corrientes de cola (ver Métodos). Solo se
muestran las constantes de tiempo del componente rápido de cierre, mayoritario a los potenciales más
negativos. Para una mejor comparación, se incluyen también los datos correspondientes a las variantes

138-373 y
2-370. (C) Histogramas que resumen las tasas de cierre a -100 mV (izqda.) y a -4 kcal/mol
(dcha.). La velocidad de cierre se representa como el inverso de las constantes de tiempo del componente
rápido. Los valores de
a -4 kcal/mol se determinaron a partir de los puntos de cruce entre la línea discontinua
situada a -4 kcal/mol y los trazos que representan la variación de la tasa de cierre que aparece en panel
derecho de B. *p<0.05 frente al canal nativo.
 Resultados - 59

I.4. Influencia de las mutaciones en el lazo S4-S5 de h-ERG sobre

las propiedades de activación del canal en estado estacionario.
La existencia de interacciones entre la parte inicial del extremo amino y el lazo que
une las hélices transmembranales S4 y S5, ha sido propuesta como un determinante
esencial de la lenta cinética de cierre de h-ERG (Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al.,
1998; Chen et al., 1999; Sanguinetti & Xu, 1999; Gómez-Varela et al., 2002). En base a ello,
nos planteamos estudiar el efecto de la modificación estructural del lazo intracelular S4-S5
sobre la cinética de h-ERG. Para ello, se generaron mutantes puntuales de los residuos 540
a 546 del citado lazo, los cuales se caracterizaron utilizando los mismos procedimientos
descritos en apartados precedentes. Adicionalmente, algunas de estas mutaciones se
introdujeron en canales carentes del extremo amino completo o del dominio proximal, con el
fin de estudiar los posibles efectos aditivos de ambas modificaciones estructurales.

Figura 9. Efecto de las mutaciones puntuales en el lazo S4-S5 sobre las corrientes de h-ERG
obtenidas a diferentes voltajes de despolarización.
Los protocolos utilizados para la obtención de las familias de corrientes se muestran en la parte superior de los
registros. Se aplicaron a los oocitos pulsos despolarizantes de 1 s a voltajes entre de -80 y +60 mV en
incrementos de 10 mV desde un potencial basal de -80 mV. Nótese cómo los mutantes presentan diferentes
cinéticas de cierre en las corrientes de cola obtenidas durante las repolarizaciones a -100 mV.
60 - Resultados

Figura 10. Efecto de las mutaciones en el lazo S4-S5 sobre la dependencia de voltaje de activación
de h-ERG en estado estacionario.
Las curvas I/V mostradas se obtuvieron mediante los protocolos y familias de corrientes equivalentes a los
indicados en la Fig. 9. Los círculos negros y blancos corresponden a los datos obtenidos mediante pulsos
despolarizantes de 10 s desde potenciales basales extremos hiperpolarizados y despolarizados,
respectivamente, para los cuales los canales se mantendrían en la conformación cerrada y abierta. Debido a
que el mutante D540C exhibe una rapidísima cinética tanto de apertura como de cierre, las curvas I/V
obtenidas mediante despolarizaciones de 1 s desde ambos potenciales basales se presentan superpuestas. Las
líneas continuas se corresponden con las funciones de Boltzmann que mejor se ajustan a los datos. Las líneas
punteadas corresponden a curvas de Boltzmann cuyos parámetros son los deducidos para el estado
estacionario a partir de las curvas obtenidas para los dos potenciales basales. Las flechas indican la posición del
V1/2 en estado estacionario. Las aspas corresponden a los datos obtenidos con prepulsos de 1 s desde un
potencial basal hiperpolarizado y se muestran para una mejor comparación. En el panel inferior se comparan
las curvas de estado estacionario de todos los mutantes. En la parte inferior se resumen los datos cinéticos y
termodinámicos en condiciones de estado estacionario. *p<0.05 frente al canal nativo.
 Resultados - 61

Las Figuras 9 y 10 recogen los datos correspondientes al estudio de la dependencia de

voltaje de activación en condiciones de estado estacionario, de los canales mutantes
D540C, R541H, R541A, Y542C, S543C, E544C, Y545C y G546C. La arginina en posición
541 se mutó a alanina y también a histidina, un residuo básico conservado en numerosos
canales Kv, incluidos algunos miembros de la familia eag. Se ha descrito que al mutar esta
histidina a arginina en el canal eag de rata, parecen compensarse las modificaciones sobre
la activación de ciertas deleciones del extremo amino (Terlau et al., 1997). Como se aprecia
en la Figura 10, en oocitos que expresan los mutantes R541A, S543C y G546C la posición
de las curvas I/V en estado estacionario permanece prácticamente inalterada en
comparación con el canal nativo. Por su lado, con los canales R541H e Y545C, se observa
un leve desplazamiento hacia la derecha de unos 10 mV. Finalmente, se obtienen
desplazamientos más marcados, también hacia potenciales positivos, cuando se substituyen
por cisteínas los residuos 540, 542 y 544. En estos casos, los valores de V1/2 aumentan
desde los -53.5 ± 1.1 mV del canal nativo hasta los +21.6 ± 1.4, -19.5 ± 0.7 y -29.85 ± 0.7
mV en los mutantes D540C, Y542C y E544C, respectivamente. Estos incrementos en los
valores de V1/2, se correlacionan con reducciones en las pendientes de las curvas en las que
el valor de zg decrece desde 4.5 ± 0.08 en el canal nativo hasta 1.3 ± 0.04, 2.0 ± 0.08 y 3.3 ±
0.1 en los canales D540C, Y542C y E544C. Como resultado de estas alteraciones, el
potencial químico del proceso de activación se hace notablemente más endergónico. Así, el
valor de G0, aumenta desde -5.7 ± 0.09 kcal/mol en el canal nativo hasta 0.8 ± 0.02, -0.9 ±
0.05 y -2.3 ± 0.1 kcal/mol, en las citadas variantes. Estos datos son especialmente
indicativos para los mutantes D540C e Y542C en los que parece que la tendencia natural de
h-ERG a mantenerse abierto en ausencia de campo eléctrico (esto es, a 0 mV de potencial
de membrana), es prácticamente anulada (Y542C) o, incluso, revertida (D540C).

El lazo citoplasmático S4-S5, situado entre la última hélice
del VSD y la primera del
dominio poro (ver Introducción), se ha propuesto como el elemento que acopla las
reorganizaciones del sensor en respuesta a cambios de voltaje y la apertura de la
“compuerta” que da acceso a los iones al poro. Esta posible función se ha descrito para
diferentes canales de K+ como Shaker (Lu et al., 2002; Soler-Llavina et al., 2006) y el mismo
h-ERG (Sanguinetti & Xu,, 1999; Tristani-Firouzi et al., 2002; Piper et al., 2005; Ferrer et al.,
2006). Así, es posible que las alteraciones en la activación de h-ERG detectadas al mutar el
lazo S4-S5 se deban, al menos en parte, a la perturbación del acoplamiento entre el sensor
de voltaje y la maquinaria de apertura del canal. Según esto, y con el fin de evaluar el
impacto que la mutación de cada uno de los aminoácidos del lazo produce en la activación
de h-ERG, se calculó el incremento de energía libre respecto al control (G0, ver Métodos).
En la Figura 11, se representan los valores de incremento de energía libre de
activación respecto al canal nativo (tanto positivos como negativos) de todos los mutantes
puntuales del lazo S4-S5. Considerando arbitrariamente como relevantes cambios en la
energía libre mayores de 1 kcal/mol, se puede clasificar el impacto producido por cada
mutación según se desestabilice el estado de abierto frente al de cerrado (G0 > 1
kcal/mol), o bien el estado de cerrado frente al de abierto (G0 < -1 kcal/mol). Como se
puede observar, al sustituir la arginina 541 por una histidina, el equilibrio conformacional
permanece prácticamente inalterado. A su vez, si este residuo se reemplaza por una
62 - Resultados

alanina, el equilibrio se desplaza ligeramente hacia la(s) conformación(es) abierta(s),

aunque de forma poco marcada. También parecen poco marcados los efectos de la
introducción de cisteínas en las posiciones 543 y 546, arrojando valores de

G0 de 1.2 ±
0.32 y 1.1 ± 0.21 kcal/mol, respectivamente. Sin embargo, sí parecen tener un gran impacto
sobre la activación de h-ERG, favoreciendo el estado de cerrado frente al de abierto, las
mutaciones D540C, Y542C, E544C e Y545C. En este caso, los valores de

G0
corresponden a 6.5 ± 0.11, 4.8 ± 0.14, 3.4 ± 0.19 y 2.2 ± 0.24 kcal/mol, lo que sugiere que la
alteración de los residuos 540 y 542 de la zona N-terminal del lazo S4-S5 son los que mayor
influencia ejercen sobre el proceso de activación.

D540C

R541H

R541A

Y542C

S543C

E544C

Y545C

G546C

Figura 11. Distribución de las perturbaciones energéticas producidas en la activación de h-ERG al

mutar el lazo intracelular S4-S5.
Se representan los cambios en la energía libre de activación

G0 (ver Métodos) respecto al canal nativo que se
producen al introducir mutaciones puntuales a lo largo del lazo S4-S5. Los cambios de

G0 < -1 kcal/mol
indicarían un desplazamiento del equilibrio conformacional hacia el/los estado(s) de abierto (“O”); y, los
cambios de

G0 > 1 kcal/mol indicarían un desplazamiento hacia el/los estado de cerrado(s) (“C”). La línea
discontinua delimita el umbral de 1 o -1 kcal/mol, a partir del cual se produciría un cambio considerado
relevante.
 Resultados - 63

I.5. Influencia de las mutaciones puntuales en el lazo S4-S5 de

h-ERG sobre la velocidad de activación.
Para caracterizar la velocidad de activación de los mutantes en el lazo S4-S5 de
h-ERG, se aplicaron procedimientos análogos a los utilizados con los canales modificados
en el extremo amino (ver apartado I.2). En la Figura 12, se muestra la variación del tiempo
de activación semimáxima (t1/2) en función del voltaje de despolarización aplicado para los
diferentes mutantes. Se puede observar que para casi todos los mutantes del lazo S4-S5 la
pendiente es similar a la del canal nativo. Sin embargo, el mutante D540C es una excepción
clara, ya que en él la variación de los valores de t1/2 frente al potencial de membrana es
mínima. Por otro lado, si se comparan las tasas de activación a 0 mV, las diferencias de los
canales mutados en los residuos 541, 544 y 545 respecto al canal silvestre son
inapreciables. Sin embargo, la velocidad de apertura se reduce prácticamente a la mitad en
los canales Y542C y G546C, apareciendo también significativamente reducida en el mutante
S543C. Es interesante resaltar que el mutante D540C muestra unas tasas de activación a 0
mV muy rápidas, aunque la diferencia respecto al control tiende a desaparecer a potenciales
positivos, debido a que presenta una dependencia de voltaje de activación muy reducida
(ver apartado anterior). Nótese asimismo que la aceleración de la apertura que provoca la
mutación del residuo 540, parece aumentar al compensar las tasas por las diferencias en el
potencial electroquímico del proceso. No obstante, debido a la escasa variación energética
entre el/los estado(s) de abierto y el/los estado(s) de cerrado de este mutante, resulta
complicado compararlo de forma rigurosa a niveles muy positivos de potencial
electroquímico de activación. En lo que respecta a los otros mutantes y tomando como
referencia un nivel de energía equiparable de 4 kcal/mol, la tasa de activación del canal
S543C es prácticamente la misma que la del canal nativo. Sin embargo, se observa una
velocidad de apertura ligeramente más lenta en los mutantes R541A, R541H y G546C.
Finalmente, los mutantes Y542C, E544C e Y545C muestran unas tasas de activación
respecto al control 4.6, 3.5 y 2.6 veces más rápidas.

Estos resultados, junto con los expuestos en el apartado, anterior consolidan

claramente resultados previos que indicaban que algunas modificaciones estructurales en el
lazo intracelular S4-S5, además de alterar el proceso de cierre (Wang et al., 1998), también
pueden modificar las propiedades de activación dependiente de voltaje (Sanguinetti & Xu,
1999).
64 - Resultados

Figura 12. Efecto de la modificación del lazo S4-S5 de h-ERG sobre la velocidad de activación.
(A) Familias de corrientes obtenidas mediante el protocolo ilustrado en el inserto superior utilizando oocitos
que expresan canales con diferentes mutaciones puntuales en el lazo S4-S5. (B) Variación de las tasas de
activación frente al voltaje de los prepulsos (izqda.) o frente a la energía total de activación (dcha.) en los
diferentes mutantes. Para una mejor comparación, se incluyen los datos correspondientes al canal nativo y a la
variante
138-373, caracterizada por una fuerte aceleración de la velocidad de apertura (Viloria et al., 2000;
Saenen et al., 2006). (C) Histogramas que resumen las tasas de activación a 0 mV (izqda.) y a 4 kcal/mol
(dcha.). Las tasas de activación se representan como el inverso del tiempo de activación semimáxima. Los
valores de t1/2 a 4 kcal/mol se determinaron a partir de los puntos de cruce entre la línea discontinua situada a
4 kcal/mol y las gráficas de variación de la tasa de activación, ilustrada en el panel derecho de B. *p<0.05
frente al canal nativo.
 Resultados - 65

I.6. Influencia de las mutaciones puntuales en el lazo S4-S5 de

h-ERG sobre la cinética de cierre.
La Figura 13 recoge las constantes de tiempo (
) del componente rápido de cierre de
los mutantes del lazo intracelular S4-S5. En los mutantes S543C y G546C, la variación de la
tasa de cierre en función del voltaje de repolarización no es significativamente diferente de la
exhibida por el canal nativo. Por el contrario, en el resto de los mutantes se observan tasas
de cierre considerablemente más rápidas que las del canal nativo (7 y 3 veces mayores
velocidades en los mutantes Y542C y R541H). Es importante hacer notar que la gráfica de
la variación de
frente al voltaje, en los mutantes D540C, Y542C y E544C, presenta menor
pendiente que la del resto de los canales. Esto sugiere que al introducir cisteínas en las
posiciones 540, 542 y 544 de h-ERG, se reduce la dependencia de voltaje del proceso de
cierre, haciendo que la velocidad tienda a igualarse a los potenciales más negativos.
No obstante, al representar las tasas de cierre frente al potencial electroquímico total
impulsor de la desactivación [-(
G0 – zgEF)], las pendientes tienden a igualarse, excepto
para el canal D540C. Al comparar las tasas de desactivación para una energía equivalente
de -4 kcal/mol, la aceleración del cierre respecto al control es muy reducida en los mutantes
R541H, S543C y G546C. Sin embargo, las constantes de tiempo son significativamente
menores en los mutantes D540C, R541A, Y542C, E544C e Y545C, lo que supone una
aceleración del cierre de aproximadamente 7, 3, 9, 5 y 5 veces, respectivamente. Es
interesante notar asimismo que, mientras en todos los mutantes del lazo S4-S5 la
aceleración del cierre a un voltaje fijo de -100 mV es menor que la observada en el canal

2-370, dicha aceleración del cierre es equivalente, o incluso mayor, cuando la cinética es
comparada a una energía electromotriz análoga de -4 kcal/mol. Las posibles limitaciones de
esta comparación serán consideradas y discutidas posteriormente.
66 - Resultados

Figura 13. Efecto de la mutación del lazo intracelular S4-S5 en la cinética de cierre de h-ERG.
(A) Familias de corrientes representativas obtenidas de oocitos que expresan canales con mutaciones
puntuales en el lazo S4-S5 mediante el protocolo que se muestra en el inserto. (B) Variación de las tasas de
cierre frente al potencial de repolarización (izqda.) o frente al potencial electroquímico (dcha.).
(C) Histogramas que resumen los efectos sobre la velocidad de cierre a -100 mV (izqda.) y a -4 kcal/mol de
energía total impulsora de la desactivación (dcha.). Las tasas de cierre se representan como el inverso de las
constantes de tiempo del componente rápido. Los valores de
a -4 kcal/mol se determinaron a partir de los
puntos de cruce entre la línea discontinua y las gráficas de la variación de la tasa de cierre frente al potencial
electroquímico mostradas en el panel derecho de B. *p<0.05 frente al canal nativo.
 Resultados - 67

I.7. Alteraciones en el proceso de apertura y cierre de h-ERG

inducidas por mutaciones en el lazo S4-S5 en canales
carentes del extremo amino.
Los resultados descritos hasta ahora, no sólo extienden datos previos sobre los
efectos que sobre el cierre de h-ERG producen deleciones en la zona inicial del extremo
amino y mutaciones en el lazo S4-S5 (Morais-Cabral et al., 1998; Schönherr & Heinemann,
1996; Spector et al., 1996b; Wang et al., 1998; Viloria et al., 2000), sino que demuestran que
los cambios estructurales en dichas regiones también modifican el proceso de activación del
canal. Debido al paralelismo en los efectos observados tras la modificación de ambas
regiones y, por ello, a la posible existencia de interacciones entre ellas, resultó interesante
analizar si sus efectos pudiesen ser o no aditivos, así como discernir si, por ejemplo, las
alteraciones inducidas al mutar el lazo S4-S5 dependen de la existencia de un extremo
amino intacto. Por todo ello, se estudiaron los efectos que las mutaciones del lazo
intracelular S4-S5 producen en canales que carecen del extremo amino (
2-370). Para ello,
se combinaron con la deleción
2-370 tres mutantes del lazo S4-S5 que inducen una
aceleración del cierre casi nula (G546C), intermedia (R541A) o muy marcada (Y542).

La Figura 14 ilustra los efectos de las modificaciones en el lazo S4-S5 y en el extremo

amino sobre la dependencia de voltaje de activación bajo condiciones de estado
estacionario. Se muestran tanto las curvas generadas con pulsos de 10 s y desde dos
potenciales basales, como las curvas en estado estacionario obtenidas por convergencia de
las anteriores. Se puede observar que el impacto que produce cada mutación del lazo S4-S5
es diferente en canales con o sin el extremo amino. Así, la mutación R541A, que provoca
per se pequeños incrementos en los valores de V1/2 y zg (0.9 mV y 1.1 cargas equivalentes
traslocadas en la apertura), produce un incremento de 13 mV en el V1/2 y una reducción de
2.3 cargas en zg al combinarla con la variante
2-370. Como consecuencia, el decremento
de -1.1 kcal/mol que se obtiene en
G0 del mutante R541A respecto al control, se convierte
en un incremento de 2.6 kcal/mol en el canal R541A/
2-370 respecto al canal
2-370. Por
tanto, cuando se introduce una alanina en la posición 541 se produce una ligera reducción
en la energía libre que h-ERG necesita para abrirse [se desestabiliza(n) los estado(s) de
cerrado frente al(los) de abierto]. Sin embargo, esta mutación en un canal carente del
extremo amino, hace que la activación sea un proceso más endergónico [desestabilizando
el(los) estado(s) de abierto frente al(los) de cerrado].
Al realizar una comparación semejante con el mutante Y542C, se observa que,
mientras la mutación simple deriva en un incremento de 34 mV en el V1/2 y una reducción de
2.0 en zg respecto al canal nativo, la misma mutación en el canal
2-370, apenas cambia la
pendiente de la curva I/V y el incremento de V1/2 es de sólo 0.8 mV. Como resultado, el
incremento en
G0 de 4.8 kcal/mol producido por la mutación Y542C se reduce a 1.8
kcal/mol al eliminar el extremo amino. Finalmente, con el mutante G546C se observa un
patrón bastante diferente. En este caso, el pequeño desplazamiento de 0.6 mV hacia
valores positivos de la curva I/V observado en el mutante simple, es de 8.5 mV hacia valores
negativos en el canal G546C/
2-370 respecto al
2-370. De forma similar, el valor de zg en
el mutante sencillo (0.9 cargas) se reduce en el mutante doble (0.5 cargas). Como
consecuencia, el aumento de 1.1 kcal/mol en el valor de
G0 que se produce al introducir
68 - Resultados

una cisteína en posición 546 del canal nativo, se transforma en una reducción mínima y en
sentido contrario (-0.7 kcal/mol) al introducir la misma mutación en el canal
2-370.

Estas diferencias en el impacto que las mutaciones del lazo intracelular S4-S5
producen en canales con o sin extremo amino, también se extienden a la velocidad de
activación. Según se ilustra en la Figura 15, el t1/2 a 0 mV se reduce de forma significativa
desde los 99 ± 8.6 ms del canal
2-370 hasta los 73 ± 4 ms que muestra el canal
R541A/
2-370. Las diferencias son más pronunciadas tras compensar las tasas con sus
respectivos valores de energía total de activación. Así, la tasa de activación más lenta del
mutante R541A respecto al control a 4 kcal/mol, se acelera hasta ser prácticamente cuatro
veces más rápida en la construcción R541A/
2-370 respecto a h-ERG
2-370.
También se observan diferencias claras si se hace un análisis similar en los mutantes
Y542C y G546C. Así, las tasas de activación a 0 mV de estos mutantes, que son
significativamente más lentas que las del canal nativo, pasan a ser similares, o permanecen
lentas respecto a
2-370, al combinar estas mutaciones con la deleción del extremo amino
[t1/2 de 111 ± 9.5 ms y 216 ± 11.0 ms para Y542C/
2-370 y G546C/
2-370,
respectivamente]. Además, al comparar estos dos mutantes para un potencial
electroquímico equivalente de 4 kcal/mol, la velocidad de activación, que era 4.6 veces más
rápida en Y542C respecto al canal nativo, se reduce a 1.7 veces en Y542/
2-370 respecto a

2-370. Por último, para el mutante G546C no se observan diferencias en la tasa de
activación a 4 kcal/mol, independientemente de que dicha mutación se introduzca en el
canal nativo o en el canal carente de extremo amino.

Finalmente, también se compararon los efectos que las mutaciones en el lazo S4-S5
inducen en la cinética de cierre de canales h-ERG, con o sin extremo amino. Los resultados
de este análisis se recogen en la Figura 16. Sorprendentemente, se encontraron efectos
aditivos en la aceleración del cierre al combinar la deleción del extremo amino con las
mutaciones de los residuos 541 y 542, tanto a -100 mV como a un potencial electroquímico
equivalente de -4 kcal/mol. Por otro lado, no se observó este efecto aditivo para el caso del
mutante G546C, ya que la aceleración del cierre que se produce al eliminar el extremo
amino, se reduce al introducir una cisteína en posición 546. Así, en el canal
2-370, las
constantes de tiempo del componente rápido de cierre son 9.0 y 6.1 veces más rápidas a
-100 mV y -4 kcal/mol, respectivamente, que en el canal nativo. Sin embargo, son tan sólo
3.3 y 4.4 veces más rápidas en el canal G546C/
2-370 respecto
2-370.
Como se discutirá posteriormente, todos estos resultados sugieren que ninguna de las
mutaciones en el lazo intracelular S4-S5 es plenamente neutral respecto a la cinética de
cierre. Además, indican que, probablemente, los fenotipos similares mostrados por los
canales con mutaciones en el lazo S4-S5 y los canales modificados en la región inicial del
extremo amino, no son exclusivamente debidas al entorpecimiento de la interacción entre
ambas regiones, ya que de ser así no se esperarían efectos aditivos entre las mutaciones en
el lazo S4-S5 y la deleción del extremo amino.
 Resultados - 69

Figura 14. Dependencia de voltaje de activación en estado estacionario de canales h-ERG sin
extremo amino y con mutaciones puntuales en el lazo S4-S5.
(A) Familias de corrientes representativas en oocitos que expresan canales h-ERG con la doble modificación
tras despolarizaciones de 10 s a los potenciales indicados en la parte superior. Solamente se muestran las
corrientes registradas al final de los pulsos despolarizantes y las corrientes de cola durante la repolarización,
como se indica en los recuadros. Nótese el potencial de repolarización más negativo para el canal h-ERG
G546C/
2-370. (B) Dependencia de voltaje de activación en estado estacionario de canales con la modificación
doble. Los círculos blancos y negros corresponden a los datos obtenidos con prepulsos de 10 s desde
potenciales basales hiperpolarizados y despolarizados, respectivamente. Las líneas continuas representan
ajustes a ecuaciones de Boltzmann a los datos obtenidos. Las líneas punteadas representan las curvas teóricas
en condiciones de estado estacionario, las cuales se obtienen al promediar las curvas de los dos potenciales
basales extremos. Nótese la práctica superposición de las curvas independientemente del potencial basal. Las
flechas indican la posición de los valores de V1/2. (C) Curvas de activación en estado estacionario de diferentes
variantes. Para una mejor comparación, se incluyen las curvas tanto del canal nativo como de los canales con
cada una de las modificaciones simples. (D) Recopilación de los parámetros cinéticos y termodinámicos de
todas las variantes. * p<0.05 frente al canal nativo. # p<0.05 frente a los respectivos mutantes simples o
frente a la variante
2-370.
70 - Resultados

Figura 15. Efecto de mutaciones puntuales en el lazo intracelular S4-S5 sobre la velocidad de
activación de canales h-ERG carentes de extremo amino.
(A) Variación del tiempo de activación semimáxima de los diferentes canales frente al potencial despolarizante
aplicado al oocito (izqda.) o frente a la energía total de activación (dcha.). (B) Resumen de los efectos sobre la
velocidad de activación. Se muestran los datos del canal nativo y los canales con cada modificación simple,
para una mejor comparación. *p<0.05 frente al canal nativo. #p<0.05 frente a los respectivos mutantes
simples o frente a la variante
2-370.
 Resultados - 71

Así pues, en conjunto, el estudio de las propiedades de los mutantes del lazo S4-S5
combinados con la deleción
2-370, permite concluir que, en al menos tres de las
mutaciones estudiadas (R541A, Y542C y G546C), el cambio estructural introducido produce
una alteración en la maquinaria de apertura y cierre por sí mismo e independiente de la
presencia o no del extremo amino, ya que las mutaciones producen un efecto diferente en el
canal nativo o en la variante
2-370. Esto no contradice la posible existencia de una
interacción física entre la región inicial del extremo amino y el lazo S4-S5, y pone claramente
de manifiesto de nuevo el papel fundamental que dicho lazo desempeña en la maquinaria de
apertura y cierre (Sanguinetti & Xu, 1999; Tristani-Firouzi et al., 2002; Piper et al., 2005;
Ferrer et al., 2006).

Por otra parte, en trabajos previos de nuestro laboratorio (Viloria et al., 2000), se ha
postulado que la facilitación de la apertura de h-ERG observada al eliminar el dominio
proximal, podía ser debida a que se favorece la interacción entre la región inicial de extremo
amino y el cuerpo central del canal. Si esta interacción se diese a nivel del lazo S4-S5, sería
posible que al alterar esta región se recuperasen los efectos producidos al eliminar el
dominio proximal. Por ello, también estudiamos los efectos de la modificación del lazo S4-S5
en canales carentes del dominio proximal, combinando los mutantes R541A, Y542C y
G546C con la deleción
138-373 (datos no mostrados). Los resultados indicaron que, si
bien en algunos parámetros y algunos mutantes parecía recuperarse en parte el fenotipo
silvestre (e.g. la dependencia de voltaje de activación en Y542C/
138-373, la velocidad de
apertura G546C/
138-373 o la velocidad de cierre en R541A/
138-373), en la mayoría de
los casos, existía un efecto dominante de la deleción
138-373 sobre la mutación del lazo
S4-S5. Esto demostraría que la eliminación del dominio proximal produce una alteración de
la activación y el cierre de h-ERG que es independiente de la existencia de un lazo S4-S5
intacto.

Todos estos resultados parecen indicar que el lazo S4-S5 desempeña un papel
fundamental en la apertura y cierre de h-ERG, pero que dicho papel podría ser modulado
por las regiones del extremo amino. Para saber si la contribución de las regiones
N-terminales a la función del lazo S4-S5 es debida a una interacción física directa entre
ambos, son necesarios otros abordajes experimentales complementarios que apoyen estos
estudios cinéticos y termodinámicos. Algunos de los resultados obtenidos al intentar
confirmar de una forma directa la existencia de interacciones intramoleculares entre el
extremo amino y el cuerpo central del canal, se contemplan en los apartados siguientes de
esta Memoria.
72 - Resultados

Figura 16. Efecto de la mutación puntual del lazo intracelular S4-S5 en la velocidad de cierre de
canales h-ERG carentes de amino terminal.
(A) Variación de la constante de tiempo del componente rápido de cierre en función del potencial repolarizante
aplicado al oocito (izqda.) y del potencial electroquímico (dcha.). (B) Histogramas que recogen las tasas de
cierre a -100 mV (izqda.) y a -4 kcal/mol de potencial electroquímico (dcha.). Las tasas de cierre se
representan como el inverso de las constantes de tiempo del componente rápido. Para una mejor comparación,
se incluyen los datos tanto del canal nativo como de los canales con cada una de las modificaciones simples.
*p<0.05 frente al canal nativo. #p<0.05 frente a los respectivos mutantes simples o frente a la variante

2-370.
 Resultados - 73

II. REGULACIÓN HORMONAL DE h-ERG POR TRH:

RELEVANCIA DE LOS DOMINIOS CITOPLASMÁTICOS DEL
CANAL

II.1. Efecto de la eliminación de regiones del extremo amino sobre

la regulación hormonal de h-ERG.

Hace algunos años, se demostraron por primera vez en nuestro laboratorio los efectos
reguladores de la Hormona Liberadora de Tirotropina (TRH) sobre el canal h-ERG, tras
co-expresar funcionalmente en oocitos de Xenopus el receptor para la hormona y el canal
(Barros et al., 1998). Nuestros estudios posteriores han permitido constatar que ciertas
regiones citoplasmáticas N-terminales de la proteína de h-ERG, son esenciales para que
tengan lugar los efectos de la TRH sobre los parámetros cinéticos del canal. Así, mientras la
TRH produce una ralentización de la apertura del canal y un desplazamiento de su
dependencia de voltaje de activación hacia valores positivos (Barros et al., 1998), estos
efectos hormonales se anulan completamente cuando se elimina una gran parte del dominio
proximal del extremo amino de h-ERG (como en los canales
138-373,
223-373 y
284-
373) y, también, desaparecen cuando se elimina una secuencia de 48 residuos del citado
dominio, como en el canal
326-373. Por el contrario, la regulación hormonal por TRH
permanece inalterada cuando se eliminan los residuos 345-373. Así pues, el hecho de que
al incrementar en 19 aminoácidos el tamaño de la deleción del dominio proximal, se pierda
la regulación hormonal, llevó a concluir que la secuencia 326-345 era esencial para la
regulación hormonal por TRH del canal h-ERG (Gómez-Varela et al., 2003a; David Gómez
Varela, 2004, Tesis Doctoral).
Por otra parte, a diferencia de lo observado con la apertura, también se comprobó que
la aceleración del cierre inducida por la TRH se mantiene al eliminar aproximadamente la
mitad del dominio proximal (
284-373), mientras que dicho efecto sólo se anula totalmente
al eliminar el dominio proximal completo (
138-373). Así, la región comprendida entre los
residuos 138 y 284, es la que parece jugar un papel crucial en el control hormonal de la
desactivación de h-ERG. Por lo tanto, parecen ser diferentes las regiones implicadas en la
regulación hormonal de la activación y del cierre del canal (Gómez-Varela et al., 2003a;
David Gómez Varela, 2004, Tesis Doctoral).

En este trabajo, hemos intentado ampliar estos estudios tratando de identificar qué
secuencias concretas del dominio proximal de h-ERG son necesarias para la regulación
hormonal por TRH de los parámetros de apertura y cierre. Para este fin, inicialmente se
construyó un canal carente de los residuos 333-373 del dominio proximal y se estudiaron de
nuevo los efectos de la TRH sobre el proceso de apertura de h-ERG. Además, también se
analizó la modulación por la hormona de la activación del canal
2-135, que carece del
dominio eag/PAS.

En la Figura 17, se recogen los resultados obtenidos al estudiar la dependencia de

voltaje de activación de estas construcciones, antes y después de la adición de 1 μM TRH a
oocitos que co-expresan los citados canales y el receptor de la hormona, comparándola con
74 - Resultados

la de los canales
138-373,
326-373 y
345-373. Como se puede observar, en las

construcciones
138-373 y
326-373, la TRH no produce ningún efecto sobre la
dependencia de voltaje de apertura de estos canales. Sin embargo, en el canal
2-135 (que
carece del dominio eag/PAS) la hormona produce un desplazamiento de la curva I/V de
activación de casi 14 mV (desde un V1/2 de -20.5 ± 0.4 hasta -6.9 ± 2.3 mV, n = 11), que es
análogo al inducido sobre el canal nativo (17 mV, desde un V1/2 de -18.7 ± 1.1 mV hasta -1.4
± 1.2 mV, n = 30). Estos resultados claramente demuestran que el dominio N-terminal
eag/PAS no es necesario para la regulación hormonal por TRH del proceso de activación de
h-ERG.
Respecto al canal
333-373, es importante matizar el hecho de que su valor de V1/2
basal (en ausencia de la hormona) está ligeramente desplazado (unos 11 mV) hacia valores
más positivos, en comparación con el canal nativo (Fig. 17C). Esto contrasta con el hecho
de que todos los canales con deleciones de diferente tamaño en el dominio proximal
presentan valores de V1/2 marcadamente más negativos que el del canal nativo (e.g. -60 mV
para
326-373 y -44 mV para
345-373; Viloria et al., 2000, Gómez-Varela et al., 2003a).
En un estudio más reciente (Saenen et al., 2006), se ha sugerido que la razón del
desplazamiento en V1/2 de los canales con deleciones del dominio proximal, radica en la
eliminación en todos ellos de la carga positiva de la región 362-366 (secuencia KIKER). Esto
podría explicar porqué no se observa desplazamiento en V1/2 en el canal
333-373, ya que
en esta construcción la secuencia KIKER ausente es reemplazada por la región 326-332
correspondiente a la secuencia RYRTISK, también con carga neta positiva. De ahí que al
colocar esta secuencia positivamente cargada en una posición equivalente a la ocupada por
la secuencia KIKER, las características del canal
333-373 sean análogas a las del canal
nativo. En cualquier caso, el desplazamiento de las curvas I/V inducido por la hormona en
los oocitos que co-expresan el canal
333-373 y el receptor de TRH es de 20.1 ± 1.0 mV (n
= 6), el cual es totalmente análogo al observado tanto en el canal nativo como en canales

345-373. En este punto, es importante resaltar dos aspectos: a) las diferencias
encontradas en la dependencia de voltaje basal o en la respuesta hormonal no se deben a
las condiciones experimentales (como el medio de registro con 50 mM KCl), ya que los
desplazamientos de las curvas I/V en respuesta a la TRH son los mismos cuando las
corrientes de oocitos que expresan canales
326-373 y
333-373 se registran en un medio
con 2 mM KCl (datos no mostrados); y, b) la dependencia de voltaje basal de los canales no
es un determinante para su respuesta a la hormona, ya que en las construcciones
345-373
y
333-373 la TRH induce un desplazamiento similar, independientemente de que sus V1/2
basales sean más negativos o más positivos que el del canal nativo.
Como conclusión, puesto que los efectos hormonales están ausentes en canales

326-373, pero se recuperan totalmente en canales
333-373, podría interpretarse que la
agrupación de aminoácidos correspondientes al segmento 326-332 (secuencia RYRTISK)
parece ser determinante para la regulación hormonal por TRH de la activación de h-ERG.
 Resultados - 75

Figura 17. Efecto de la TRH sobre la dependencia de voltaje de activación de canales h-ERG que
presentan diferentes deleciones en el extremo amino.
(A) Esquema del extremo amino del canal h-ERG en las diferentes construcciones. La región correspondiente al
dominio eag/PAS (residuos 1-135) se representa como una barra gris mientras que la región correspondiente al
domino proximal (residuos 135-397) se representa como una barra blanca. Las deleciones internas se ilustran
como líneas discontinuas. (B) Familias de corrientes representativas obtenidas en oocitos que co-expresan el
receptor de TRH y el canal indicado, antes (“Control”, panel superior) o después de la adición de 1 μM TRH
(“TRH”, panel inferior), al aplicar los protocolos mostrados en el inserto. Los pulsos fueron aplicados cada 20-30
s. Los oocitos fueron perfundidos de forma continua con medio 50 mM KCl. Nótese la extremadamente rápida
cinética de desactivación característica del canal
2-135. (C) Efecto de la eliminación de regiones N-terminales
de h-ERG sobre el desplazamiento inducido por la TRH en las curvas I/V. Los datos promediados se obtuvieron
a partir del número de células que se indica en el panel D. Los círculos vacíos y los rellenos se corresponden a
los datos obtenidos en ausencia y en presencia de la hormona, respectivamente. Las líneas continuas
representan funciones de Boltzmann que mejor se ajustan a los datos obtenidos. Los valores de V1/2 antes y
después de la adición de TRH para el canal
333-373 son -11 y +10 mV, respectivamente. Para las
construcciones
2-135,
326-373 y
345-373 los valores de V1/2 con y sin hormona son -20.1/-6.9, -60/-58.5
y -44/-24 mV, respectivamente. Las funciones de Boltzmann en ausencia de TRH para el canal nativo y para el
canal carente del dominio proximal (
138-373) se incluyen como referencia. (D) Histograma en el que se
compara los desplazamientos en las curvas I/V inducidos por la TRH en los diferentes canales. También se
incluyen los datos correspondientes al canal nativo y al canal sin dominio proximal
138-373. ** p<0.001, n.s.
no significativo frente al canal nativo.
76 - Resultados

Con el fin de ahondar en la posible relevancia de la secuencia 326-332 (RYRTISK)

para la regulación de la activación de h-ERG por la TRH, además de la dependencia de
voltaje también se estudió el efecto hormonal sobre la velocidad de activación de los
canales, utilizando el protocolo indirecto descrito en apartados anteriores (ver apartado I.2
de Resultados). En la Figura 18, se muestran los resultados obtenidos al estudiar el efecto
de la TRH sobre el desarrollo temporal de las corrientes de canales h-ERG que presentan
las diferentes deleciones del extremo amino. Se puede observar que, tanto para el canal
nativo como para las variantes
2-135,
333-373 y
345-373, el tiempo de activación
semimáxima (t1/2) se incrementa a más del doble tras la adición de TRH. Por el contrario, en
el canal carente de dominio proximal (
138-373), así como en el canal al que le faltan tan
sólo los residuos 326-373, la hormona casi no ralentiza la apertura. Estos datos añadidos a
los resultados previos sobre la dependencia de voltaje de activación, demuestran de nuevo
que la eliminación adicional de tan sólo siete aminoácidos (incremento de la deleción desde

333-373 hasta
326-373), ocasiona la pérdida total de los efectos hormonales sobre la
apertura de h-ERG. Esto reduce a tan sólo 7 residuos aminoacídicos (RYRTISK) la región
que parece ser necesaria para la regulación hormonal del proceso de activación de h-ERG.

Por último, una vez estudiados los efectos de la TRH sobre la activación, se estudió la
modulación hormonal del proceso de cierre. Como una confirmación de que los efectos de la
TRH sobre la desactivación de h-ERG parecen depender, en gran medida, de la región
comprendida entre los residuos 222 y 285 del extremo amino, se comprobó que la hormona
no aceleraba el cierre de ninguno de los canales con las deleciones del extremo amino
descritas en los párrafos anteriores. Así, como se observa en la Figura 19, que ilustra el
decremento en la constante de tiempo del componente rápido de cierre a -100 mV tras el
tratamiento con la hormona, los efectos de la hormona sobre el cierre de los canales

326-373,
333-373 y
345-373 son similares a los del canal nativo, mientras que en la
variante a la que le falta el dominio proximal completo (
138-373) los efectos hormonales
son destacadamente reducidos. Dichos efectos de la hormona sobre el cierre parecen
también relativamente disminuidos en el canal carente del dominio eag/PAS (
2-135), pero
dado que esta construcción presenta una desactivación marcadamente acelerada de forma
basal (ver Figura 8), la interpretación de su regulación del cierre por la TRH resulta muy
complicada.
 Resultados - 77

Figura 18. Efecto de la TRH sobre la velocidad de activación de canales h-ERG que presentan
diferentes deleciones N-terminales.
(A) Corrientes representativas obtenidas en oocitos que co-expresan las construcciones indicadas y el receptor
de TRH, al estudiar la modulación por la hormona de la velocidad de activación. Se muestran los registros
generados a partir del protocolo indirecto mostrado en el inserto, antes (“Control”, panel superior) y después
(“TRH”, panel inferior) de la adición de 1 μM TRH. Los pulsos de despolarización se realizaron a 0 mV para
todos los canales a excepción de la construcción
326-373, en la cual se realizaron a -40 mV para compensar
el desplazamiento en su dependencia de voltaje. En todos los casos, las repolarizaciones se realizaron a -100
mV. (B) Variación de la corriente de cola en el pulso de repolarización en función de la duración del pulso
condicionante de despolarización antes (“Control”) y después (“TRH”) del tratamiento con la hormona. Los
datos promediados se muestran como normalizados al máximo de corriente obtenida. En los paneles se
incluyen los valores de t1/2 obtenidos en el punto de cruce entre la línea punteada y el gráfico. (C) Histograma
en el que se comparan los efectos de la TRH sobre la velocidad de activación de canales carentes de distintas
regiones N-terminales. Un valor del 100% indica que el tiempo de activación semimáxima se ha incrementado
el doble tras el tratamiento hormonal. ** p<0.001, n.s. no significativo frente al canal nativo.
78 - Resultados

Figura 19. Efecto de la TRH sobre el componente rápido de cierre a -100 mV de canales h-ERG con
diferentes deleciones N-terminales.
(A) Constantes de tiempo (
) del componente rápido de cierre a -100 mV del canal nativo y los distintos
canales carentes de diferentes regiones N-terminales. (B) Histograma en el que se comparan los efectos sobre
la cinética de cierre de las distintas construcciones de h-ERG tras su tratamiento con 1 μM TRH. Los
decrementos en la constante de tiempo del componente rápido de cierre se comparan con el del canal nativo,
correspondiente a un 22.6 ± 3.7 % (n=24). Una reducción del 50% en la constante de tiempo (
) se
corresponde con una velocidad de cierre el doble de rápida. ** p<0.001, n.s. no significativo frente al canal
nativo.

II.2. Efecto de la modificación de la secuencia 326-332 (RYRTISK)

sobre la regulación hormonal de h-ERG.

Los resultados mostrados en el apartado anterior apuntan a la secuencia de 7 residuos

correspondiente a la región 326-332, como un posible determinante de los efectos de la
TRH sobre la activación de h-ERG. Curiosamente, esta secuencia RYRTISK contiene varios
consensos de fosforilación para diferentes quinasas. Así, T327 sería un sitio potencial de
fosforilación para tirosín quinasas, T329 para Proteín Quinasa A (consenso RX1-2S*/T*X) y
Ca-Calmodulín Quinasa II (consenso RXXS*/T*X) y S331 para Proteín Quinasa B/Akt
(consenso RXRXXS*/T*) y Proteín Quinasa A (Kemp et al.,1990; Kennelly et al.,1991; Zhang
et al., 2003). De hecho, las Proteín Quinasas A y B y las tirosín quinasas ya han sido
consideradas como posibles moduladoras de h-ERG (Kiehn et al., 1998, 2000; Thomas et
al., 1999, 2003; Cui et al., 2000, 2001; Cayabyab & Schlichter, 2002; Kagan et al., 2002;
Zhang et al., 2003; Li et al., 2008; Zhang et al., 2008). Además, la secuencia RYRTISK
 Resultados - 79

alberga otros consensos de unión para segundos mensajeros. De este modo, la presencia
de tres residuos con cargas positivas hacen del segmento 326-332 una región hipotética de
unión para el fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2), que también ha sido propuesto como un
posible modulador de la actividad de h-ERG (Bian et al., 2001, 2004; Bian & McDonald,
2007). Por último, se ha descrito la regulación de h-ERG mediante proteínas de la familia
14-3-3 y se ha estudiado la unión de algunos miembros de esta familia al canal (Kagan et
al., 2002), para las que la secuencia RYRTISK sería también una variante de su motivo
consenso de unión [consenso RXXS(P)/T(P), donde (P) representa el residuo fosforilado].

Basándonos en estos antecedentes, generamos varios mutantes puntuales de la

secuencia RYRTISK (David Gómez Varela, 2004, Tesis Doctoral) en los que los
aminoácidos R326, Y327, R328, T329 y S331 fueron substituidos por alanina. También se
creó un mutante triple en el que los tres residuos fosforilables fueron mutados
simultáneamente a alanina (mutante triple YTS-A).
En la Figura 20, se muestran los resultados obtenidos al estudiar el impacto de todas
estas mutaciones sobre la regulación por la TRH de la activación y del cierre de h-ERG.
Sorprendentemente, todos los mutantes presentaron una regulación del proceso de
activación similar a la del canal nativo. También se puede observar cómo la aceleración del
componente rápido de cierre a -100 mV, es equiparable en todos los casos a la del canal
nativo, algo totalmente esperable dado que la secuencia RYRTISK (segmento 326-332) no
es, en principio, una región relacionada con el control del cierre de h-ERG. En cualquier
caso, estos resultados demuestran que la anulación de los efectos hormonales sobre la
activación, al aumentar el tamaño de la deleción desde el residuo 333 hasta el 326, no se
debe a la eliminación de alguno de los consensos presentes en la secuencia RYRTISK.

Como una prueba adicional para descartar a la región 326-332 y a su secuencia

RYRTISK, como un determinante para la regulación hormonal de h-ERG, se generaron
variantes del canal en las que se eliminó la secuencia RYRTISK o se substituyó por otra. Se
construyeron de este modo, además de la variante
326-341, otras dos derivadas de ésta,
en las que la secuencia eliminada fue substituida por otra no relacionada con la del canal
h-ERG (construcciones 326-341/SubA y 326-341/SubB).
Como se puede observar en la Figura 21, al eliminar la región 326-341 que contiene la
secuencia RYRTISK o al substituirla por otra ajena a h-ERG, no se alteran
significativamente las modificaciones inducidas por la TRH, ni sobre la dependencia de
voltaje de activación ni sobre la velocidad de activación de h-ERG. En ambos casos, se
obtienen modificaciones en los parámetros cinéticos análogos a los que muestran los
canales nativos. Por su parte, en la Figura 22, se ilustran los efectos de la TRH sobre el
cierre de canales h-ERG con la secuencia RYRTISK eliminada o substituida. También se
puede apreciar que, como era esperable, la aceleración del componente rápido de cierre a
-100 mV inducida por la hormona, también se mantiene inalterada en estas construcciones.
En conjunto, este grupo de resultados confirman los datos obtenidos con los mutantes
simples y el mutante triple de la secuencia RYRTISK, demostrando inequívocamente que la
región contenida entre los residuos 325 y 333 de h-ERG, no es per se la secuencia
determinante para la regulación hormonal por TRH sobre la actividad del canal h-ERG.
80 - Resultados

Figura 20. Comparación de los efectos de la TRH sobre canales h-ERG con mutaciones en la
secuencia RYRTISK (región 326-332).
(A) Histograma en el que resumen los desplazamientos en la dependencia de voltaje de activación, tras el
tratamiento con 1 μM TRH, de los oocitos que co-expresan el receptor de TRH y canales h-ERG con mutaciones
en los residuos 326, 327, 328, y 331. La construcción YTS-A corresponde al triple mutante en el que los
aminoácidos 327, 329 y 331 fueron mutados simultáneamente a alanina. La dependencia de voltaje de
activación se estudió según se indica en la Fig. 17. Los datos se presentan normalizados respecto al
desplazamiento inducido por la hormona en el canal nativo. (B) Histograma en el que se compara la
ralentización de la activación inducida por la TRH en los diferentes canales. Los valores de t1/2 se estudiaron a 0
mV según se indica en el pie de la Fig. 18. Los incrementos en el valor de t1/2 se presentan como relativos al
incremento inducido por la hormona en el canal nativo. (C) Histograma en el que se compara la aceleración del
cierre tras el tratamiento de las diferentes construcciones con TRH. La constante de tiempo (
) del componente
rápido de cierre se obtuvo según se ha descrito anteriormente. Los decrementos en
se presentan
normalizados al valor obtenido en el canal nativo. n.s. no significativo frente al canal nativo.
 Resultados - 81

Figura 21. Efecto de la TRH sobre la activación de canales h-ERG con la secuencia RYRTISK
eliminada o substituida por otras no relacionadas.
(A) Esquema del extremo amino del canal h-ERG nativo y de las diferentes construcciones. Las deleciones
internas se ilustran con líneas punteadas mientras que las substituciones de la región 326-341 se representan
como barras en dos tonalidades de azul. La secuencias aminoacídicas que substituyen a la nativa en la región
326-341 se especifican en Métodos. (B) Efecto de la TRH sobre la dependencia de voltaje (izqda.) y la
velocidad (dcha.) de activación del canal
326-341. Las curvas I/V y el desarrollo temporal de la activación,
antes y después de la adición de 1 μM TRH, se generaron según lo detallado en los pies de las Figs. 1 y 2. Se
incluyen en los gráficos los valores de V1/2 y t1/2. Para una mejor comparación se incluye la curva I/V
correspondiente a la dependencia de voltaje del canal nativo en ausencia de TRH. (C) Histograma en el que se
compara el desplazamiento inducido por la TRH en las curvas I/V de activación de los diferentes canales.
También se incluyen, para una mejor comparación, los datos correspondientes al canal nativo y a la variante

326-373. (D) Histograma de barras en el que se compara la ralentización de la activación inducida por la TRH
en los diferentes canales. Los incrementos del 100% en el valor de t1/2 indican que dicho valor es el doble que
en el control. ** p<0.001, n.s. no significativo frente al canal nativo.
82 - Resultados

Figura 22. Efecto de la TRH sobre el componente rápido de cierre a -100 mV de canales h-ERG que
presentan eliminada o substituida la secuencia RYRTISK.
(A) Constantes de tiempo (
) del componente rápido de cierre a -100 mV del canal nativo y los distintos
canales con la región 326-341 (secuencia RYRTISK y sus alrededores) eliminada o substituida por otras no
relacionadas con h-ERG. (B) Histograma en el que se comparan los efectos sobre la cinética de cierre de las
distintas construcciones de h-ERG tras su tratamiento con 1 μM TRH. Los decrementos en la constante de
tiempo del componente rápido de cierre se comparan con el del canal nativo según se describe en el pie de la
Fig. 19. n.s. no significativo frente al canal nativo.

II.3. Mantenimiento de la regulación hormonal en canales h-ERG

carentes del segmento 362-366 de aminoácidos
básicos (secuencia KIKER).

Como se mencionó anteriormente, los estudios dirigidos a correlacionar regiones,

secuencias o estructuras del dominio proximal con las características de activación basales
del canal (Viloria et al., 2000; Saenen et al., 2006), han señalado a la región correspondiente
a los residuos básicos 362-366 como particularmente importante en el control del proceso
de apertura de h-ERG. Teniendo en cuenta que esta región, que corresponde a una
agrupación de aminoácidos cargados positivamente a pH fisiológico (secuencia KIKER), se
encuentra próxima a la secuencia RYRTISK, nos planteamos analizar la posible importancia
de dicha secuencia de aminoácidos básicos en la regulación hormonal del canal. Con este
propósito, se generaron dos nuevas variantes de h-ERG en las cuales, o bien se anularon
las cargas positivas de la secuencia KIKER substituyendo todos los aminoácidos básicos
por un residuo neutro como alanina (mutante triple KKR-A), o bien se eliminó la secuencia
 Resultados - 83

completa mediante una deleción interna (canal
363-373). Por otro lado, con el fin de
estudiar la importancia relativa de las secuencias KIKER y RYRTISK, y de analizar la posible
necesidad de la presencia de ambas para la regulación hormonal del canal, las
modificaciones en la secuencia KIKER se combinaron con la mutación triple YTS-A y con la
deleción en la secuencia RYRTISK, generándose así el triple mutante doble YTS-A/KKR-A y
la variante YTS-A/
363-373. También mediante recombinación, se construyó el canal

326-342/
363-373 que presenta delecionados ambos tramos de secuencia KIKER y
RYRTISK.

Las Figuras 23 y 24, ilustran los resultados obtenidos al estudiar el impacto de estas
mutaciones combinadas en la regulación del proceso de activación de h-ERG por la TRH.
Como se puede observar, y en concordancia con los estudios previos (Saenen et al., 2006),
al anular las cargas positivas de la secuencia KIKER mediante la triple mutación KKR-A, se
produce un desplazamiento en la dependencia de voltaje de activación del canal hacia
potenciales más negativos (V1/2 = -39.3 ± 2.3 mV). Este desplazamiento hacia valores
hiperpolarizantes es aún mayor en el canal delecionado
363-373 (V1/2 = -51.5 ± 0.4 mV).
Teniendo en cuenta que la modificación en la carga local de ese segmento del dominio
proximal es equivalente para las dos construcciones (ver panel A de Fig. 23), estos
resultados indican que, en el caso de la deleción, existe otro tipo de alteración adicional a la
neutralización de las cargas positivas, que potencia el efecto sobre la activación del canal.
Es interesante destacar que estas diferencias en la dependencia de voltaje de
activación observadas en condiciones basales en ausencia de TRH, también se manifiestan
tras la adición de la hormona. Así, el desplazamiento de la curva I/V producido tras el
tratamiento hormonal en el canal KKR-A (22.3 ± 3.0 mV) es similar al que ocurre en el canal
nativo (17.3 ± 1.05 mV), mientras que este desplazamiento es ligeramente reducido,
respecto al del canal nativo, en el caso de
363-373 (11.9 ± 0.6 mV, Fig. 23D). Por último,
cuando las modificaciones en torno a la secuencia RYRTISK (YTS-A y
326-341), se
combinan con las modificaciones en la secuencia KIKER (KKR-A y
363-373) y se analizan
los efectos hormonales, se obtienen resultados similares, con un efecto ligeramente
aumentado en presencia de la modificación KKR-A y ligeramente reducido tras la deleción
de la región 363-373 (Fig. 23D).

Así pues, estos resultados indican que, aunque el grupo de residuos básicos
constituido por la secuencia KIKER tenga un papel crucial en las propiedades basales de
activación de h-ERG, esta secuencia no es demasiado relevante para los efectos
reguladores de la TRH sobre dicho proceso. Para corroborar esta idea, se estudiaron
también los efectos de la TRH sobre la velocidad de activación de estos canales. Como se
puede observar en la Figura 24, en el canal KKR-A se produce una ralentización de la
apertura tras la adición de la TRH, similar a la ocurrida en el canal nativo. Por su parte, el
efecto hormonal es reducido a un 63% en la variante
363-373. Además, cuando la triple
mutación KKR-A se combina con las modificaciones en RYRTISK (YTS-A ó
326-341), el
efecto hormonal es algo más pronunciado que en el canal nativo. Asimismo, tras la deleción
en la secuencia KIKER (
363-373) combinada con el triple mutante YTS-A o con la deleción

326-341 en la secuencia RYRTISK, la apertura del canal es ligeramente ralentizada por la
TRH, de forma similar a como ocurría en el canal
363-373 (Figs. 24 B y D).
84 - Resultados

Figura 23. Efecto de la TRH sobre la dependencia de voltaje de activación de canales h-ERG con
modificaciones en las regiones 326-332 (secuencia RYRTISK) y/o 362-366 (secuencia KIKER).
(A) Esquema del extremo amino de h-ERG en el que se muestra de forma ampliada la región 326-376 para
ilustrar las modificaciones que presentan cada uno de los diferentes mutantes. Las secuencias RYRTISK y
KIKER, así como los aminoácidos mutados, están resaltados en cursiva y en negrita. Nótese que la última lisina
puede considerarse como el residuo 362 ó 373, ya que ambas posiciones son ocupadas por este aminoácido en
la secuencia normal del canal. (B) Corrientes representativas generadas antes (“Control”, panel superior) y
después (“TRH”, panel inferior) de la adición de 1 μM TRH, obtenidas mediante el protocolo mostrado en el
inserto. (C) Efecto de la TRH en la dependencia de voltaje de activación de los diferentes canales. Los datos
promediados para generar las diferentes curvas I/V se obtuvieron del número de oocitos indicado en el panel D.
En los gráficos se indica el valor de V1/2 antes del tratamiento hormonal. (D) Histograma en el que se comparan
los desplazamientos en las curvas I/V inducidos por la TRH en canales con modificaciones en la secuencia
KIKER sola o combinada con modificaciones en la secuencia RYRTISK. * p<0.05, ** p<0.01, n.s. no
significativo frente al canal nativo.
 Resultados - 85

Figura 24. Efecto de la TRH en la velocidad de activación de canales h-ERG con modificaciones en la
secuencia RYRTISK y/o en la secuencia KIKER.
(A) Corrientes representativas obtenidas mediante el protocolo mostrado en el inserto, antes (“Control”, panel
superior) y después (“TRH”, panel inferior) de la adición de 1 μM TRH. Para compensar los desplazamientos en
la dependencia de voltaje de activación, los potenciales de membrana utilizados fueron de -20 mV para KKR-A
y
326-341, y de -40 mV para
326-341 y
326-341/
363-373. En todos los casos, las corrientes de cola se
obtuvieron repolarizando los oocitos a -100 mV. (B) Efecto de la TRH en el desarrollo temporal de la corriente
de cola de las diferentes construcciones. Los datos promediados se muestran como normalizados a la corriente
máxima y se corresponden con el número de oocitos mostrados en el panel D. Se muestran los valores de t1/2 ,
que se obtienen en el punto de cruce entre la línea punteada y los gráficos, antes (círculos blancos) y después
(círculos negros) de la adición de hormona. (C) Histograma en el que se compara la ralentización de la
activación de h-ERG inducida por la TRH en los diferentes canales con modificaciones en la secuencia KIKER
sola o combinada con modificaciones en la secuencia RYRTISK. Los datos se presentan como relativos al canal
nativo donde un incremento del 100% significa que el valor de t1/2 es el doble. * p<0.05, ** p<0.01, n.s. no
significativo frente al canal nativo.
86 - Resultados

Por último, también se estudió el efecto que las modificaciones de las secuencias
KIKER y RYRTISK ejercen sobre las características y la regulación hormonal del cierre de
h-ERG. Así, en la Figura 25, se puede observar que la TRH induce, en todas las
construcciones con modificaciones en la región KIKER, una aceleración del componente
rápido de cierre a -100 mV, análoga a la producida en el canal nativo. Nótese asimismo que
los efectos de la TRH sobre la desactivación, son similares a los inducidos en el canal
nativo, independientemente de que las modificaciones en la secuencia KIKER se presenten
solas o combinadas con las modificaciones en la secuencia RYRTISK.
De nuevo, estos resultados indican que las secuencias KIKER y RYRTISK no están
relacionadas con el control hormonal del proceso de cierre de h-ERG y son coherentes con
los datos previos que indican que, en los efectos hormonales sobre el cierre, parecen ser
determinantes otras regiones como la comprendida entre los residuos 223 y 284 del dominio
proximal del canal (Gómez-Varela et al., 2003a).

Figura 25. Efecto de la TRH sobre el componente rápido de cierre a -100 mV de canales h-ERG con
modificaciones en la secuencia RYRTISK y/o en la secuencia KIKER.
(A) Se muestran las constantes de tiempo (
) del componente rápido de cierre a -100 mV del canal nativo y de
las distintas variantes con modificaciones en la secuencia RYRTISK y en su entorno, y/o en la secuencia KIKER.
(B) Histograma en el que se comparan los efectos sobre la cinética de cierre de las construcciones de h-ERG
tras su tratamiento con 1 μM TRH. Los decrementos en la constante de tiempo del componente rápido de cierre
se comparan con el del canal nativo según lo descrito en el pie de la Fig. 19. n.s. no significativo frente al canal
nativo.
 Resultados - 87

II.4. Reducción de los efectos hormonales inducidos por la TRH en

canales h-ERG carentes del segmento 155-209.

Contrariamente a la presunción inicial, los resultados expuestos hasta ahora indican

que la pérdida de los efectos de la TRH sobre la activación de h-ERG causados por la
deleción
326-373 y por deleciones mayores hasta englobar la totalidad del dominio
proximal, no parecen deberse a la ausencia de una secuencia específica, como las regiones
RYRTISK ó KIKER. Por ello, una hipótesis alternativa podría ser que no es la secuencia,
sino el tamaño del fragmento proteico eliminado el que, al alcanzar un umbral o punto
crítico, provoca la alteración de algún determinante estructural importante para la regulación
hormonal del proceso de activación de h-ERG. Este razonamiento sería coherente con el
hecho de que los canales
326-341,
333-373 y
345-373, carentes de 16, 41 y 19
residuos aminoacídicos, respectivamente, muestran una regulación hormonal normal;
mientras que aquellos canales en los que se eliminan más de 48 aminoácidos del dominio
proximal (construcciones
326-373 hasta
138-373), no presentan ninguna regulación por
TRH del proceso de activación (ver también Gómez-Varela et al., 2003a).
Con el fin de constatar esta hipótesis, se generó una nueva variante del canal en la
que se eliminó un fragmento proteico de un tamaño análogo al eliminado en el canal

326-373, pero en una zona diferente del dominio proximal. Así, se construyó el canal

155-209, carente de 55 residuos en la zona N-terminal del dominio proximal, en lugar de
en la zona C-terminal como en el resto de las deleciones analizadas hasta el momento.

En la Figura 26, se muestran los resultados obtenidos al estudiar la regulación

hormonal por TRH del canal
155-209. Como se puede observar, los efectos hormonales
que la TRH ejerce sobre los dos parámetros de activación, la dependencia de voltaje y la
velocidad de apertura, aparecen significativamente reducidos tras eliminar la región
155-209, siendo incluso mucho más evidente la disminución en el efecto de la ralentización
de la apertura a 0 mV que la modificación de la dependencia de voltaje de activación. Es
importante indicar también que la reducción de los efectos hormonales en la deleción

155-209, tiene lugar aún cuando sus propiedades basales de activación son muy similares
a las del canal nativo, indicando que la ausencia de regulación hormonal en los canales en
los que el tamaño del fragmento proteico eliminado se incrementa desde el segmento
326-373 hasta la totalidad del dominio proximal, no se debe a la alteración de los
parámetros basales de activación, provocado por la deleción en sí. Nótese asimismo que en
la variante
155-209, también aparecen reducidos los efectos hormonales sobre el cierre
(Figura 26, panel D izquierdo), en concordancia con el hecho de que la deleción
155-209
engloba residuos de la región 138-223, cuya eliminación hace que la regulación hormonal
por la TRH de la desactivación se reduzca al 20% (Gómez-Varela et al., 2003a).
Todos estos resultados afianzan la idea de que es el cambio estructural que ocasiona
la deleción de grandes regiones citoplasmáticas, lo que causa la pérdida de la regulación
hormonal sobre la maquinaria de apertura-cierre situada en el cuerpo central del canal.
88 - Resultados

Figura 26. Efecto de la TRH sobre canales
155-209 carentes de 55 residuos en la región N-terminal
del domino proximal.
(A) Esquema del extremo amino de los canales h-ERG nativo,
326-373 y
155-209. (B) Corrientes
representativas de oocitos que co-expresan el receptor de TRH y la construcción
155-209, antes (“Control”,
panel superior) y después (“TRH”, panel inferior) de la adicción de 1 μM TRH. Los registros se obtuvieron para
el estudio de la dependencia de voltaje (izqda.) y la velocidad (dcha.) de activación en respuesta a los
protocolos mostrados en los insertos. (C) Efecto de la TRH sobre la dependencia de voltaje (izqda.) y la
velocidad de activación a 0 mV (dcha.) de canales
155-209. Para una mejor comparación, también se
muestra la dependencia de voltaje de activación en ausencia de TRH con el canal nativo (línea discontinua).
(D) Histograma en el que se comparan los efectos de la TRH en la dependencia de voltaje y la velocidad de
activación, así como en el componente rápido de cierre de los canales nativo,
326-373 y
155-209. * p<0.05,
** p<0.001, n.s. no significativo frente al canal nativo.
 Resultados - 89

II.5. Supresión de los efectos hormonales inducidos por la TRH en

canales h-ERG con mutaciones puntuales en el lazo S4-S5.

Los resultados expuestos hasta ahora, indican que es necesaria una estructura global
relativamente inalterada en el dominio proximal de h-ERG para que tengan lugar los efectos
reguladores de la TRH sobre la actividad del canal. Sería posible pues, que al eliminar
regiones del dominio proximal se alterase, además de su estructura, su posicionamiento, o
el de otros dominios N-terminales como el dominio eag/PAS, respecto al cuerpo central del
canal, donde se encuentra la maquinaria de apertura y cierre.
Como ya se ha indicado anteriormente, el lazo intracelular que une las hélices
transmembranales S4 y S5 de h-ERG, ha sido propuesto como el posible sitio de interacción
entre la región inicial N-terminal y el cuerpo central del canal y, además, como el elemento
transmisor de las reorganizaciones estructurales en respuesta al voltaje para la apertura de
la “compuerta” del mismo (Wang et al., 1998; Chen et al., 1999; Sanguinetti & Xu, 1999;
Viloria et al., 2000; Tristani-Firouzi et al., 2002; Piper et al., 2005; Ferrer et al., 2006; Saenen
et al., 2006). Por otro lado, de existir interacciones entre las estructuras N-terminales y el
lazo S4-S5 (residuos 540 a 546), es muy probable que dichas interacciones proteína-
proteína se vean alteradas al eliminar el dominio proximal de h-ERG (Viloria et al., 2000;
Gómez-Varela et al., 2002). Así pues, partiendo de esta idea, y en base a nuestros
resultados (ver apartado I), nos planteamos la posibilidad de que la regulación hormonal de
h-ERG, que es significativamente alterada por cambios en las estructuras N-terminales del
canal, se vea también severamente afectada al modificar el lazo intracelular S4-S5.

La Figura 27, recoge los resultados obtenidos al estudiar el impacto que las
mutaciones puntuales en el lazo intracelular S4-S5 ejercen sobre la regulación por la TRH
de la dependencia de voltaje de apertura de h-ERG. Como se puede observar, los
desplazamientos en la curva I/V son marcadamente reducidos, o completamente anulados,
en los canales con las mutaciones puntuales D540C, R541H e Y542C. A su vez, cuando la
arginina 541 se substituye por una alanina en vez de por una histidina (R541A), también se
observa una reducción significativa en el desplazamiento de la dependencia de voltaje
inducido por la hormona. Sin embargo, esta supresión de la acción hormonal al mutar la
región N-terminal del lazo S4-S5, no se observa cuando las mutaciones se introducen en la
sección C-terminal del lazo, ya que como se ilustra en la Figura, los canales S543C, E544C,
Y545C y G546C muestran una regulación hormonal de la dependencia de voltaje normal e
incluso ,en algunos casos, algo mayor que la del canal nativo.
En la Figura 28, se puede observar que también se obtienen resultados similares
cuando se analiza el efecto hormonal sobre el desarrollo temporal de la corriente. Así, la
ralentización de la apertura del canal inducida por la TRH, es mínima en los canales D540C,
R541H, R541A e Y542C, mientras que el efecto hormonal es normal, o incluso algo más
acentuado, en los canales S543C, E544C, Y545C y G546C. Es importante resaltar aquí que,
como se señaló en el caso del canal con la deleción
155-209, también en esta ocasión, la
presencia o ausencia de efecto hormonal no se correlaciona con la modificación que sobre
el proceso de activación del canal pueda causar la mutación en sí. Así, se puede comprobar
que el efecto de la TRH es reducido tanto en los mutantes D540C e Y542C (los cuales
muestran un marcado desplazamiento de su dependencia de voltaje hacia valores más
90 - Resultados

positivos y un decremento en la pendiente de la curva I/V; ver Fig. 10), como en los
mutantes R541H e R541A, con unas propiedades de activación no muy diferentes a las del
canal nativo. Esto de nuevo indica que la reducción o supresión de los efectos hormonales
sobre la apertura, son debidos a la alteración de un mecanismo de regulación, y no a la
alteración previa del proceso de apertura causada por las mutaciones. Por otro lado, estos
resultados señalan, además, a la sección N-terminal del lazo intracelular S4-S5 como un
determinante esencial en la transmisión del efecto regulador de la TRH desde las regiones
citoplasmáticas hasta la maquinaria de apertura-cierre, situada en el cuerpo central del
canal, embebido en la membrana plasmática.

Por último, también se estudió el efecto de las mutaciones del lazo S4-S5 sobre la
aceleración del componente rápido de cierre a -100 mV inducida por la TRH. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 29. Se puede comprobar que la hormona no produce
ningún efecto sobre el cierre de los canales D540C, R541H, R541A e Y542C, mutados en el
sección N-terminal del lazo. Sin embargo, el proceso de cierre sí parece acelerarse tras la
adición de la TRH a los canales S543C, E544C, Y545C y G546C, mutados en la sección
C-terminal del lazo, aunque la aceleración del cierre es algo menor en los mutantes E544C e
Y545C. No obstante, es importante señalar en este punto que el análisis de los efectos
hormonales sobre el cierre de h-ERG, se complica enormemente en aquellos canales que
(como la variante
2-135) presentan ya una tasa de cierre marcadamente más rápida que la
del canal nativo, en condiciones basales en ausencia de hormona. Este es precisamente el
caso de los canales D540C, R541H, R541A, Y542C, E544C e Y545C (ver Fig. 13), por lo
que puede ser posible que la falta de efecto hormonal sobre el cierre de alguno de estos
canales, sea debido, en parte, a la aceleración basal del cierre causada por la propia
mutación.

Así pues y a modo de resumen global de este apartado de Resultados, podemos decir
que el trabajo previo de nuestro laboratorio, utilizando canales con deleciones seriadas,
sugirió que los residuos 326-345 del dominio proximal eran necesarios para la regulación
hormonal de la activación de h-ERG por la TRH (Gómez-Varela et al., 2003a) y que, aún
cuando al estudiar nuevas construcciones pareció delimitarse todavía más esta región a los
residuos 326-332, el hecho de que los mutantes puntuales en la misma sean regulados
normalmente por la hormona (David Gómez Varela, 2004, Tesis Doctoral) indica que el
mantenimiento de la secuencia no es importante para la regulación hormonal del canal. De
hecho, esta interpretación es definitivamente confirmada al comprobar que los efectos
inducidos por la TRH, se mantienen también en canales en los que la agrupación de
aminoácidos básicos 362-366 es eliminada. Por último, hemos podido constatar que al
mutar la región N-terminal del lazo S4-S5 de h-ERG, el canal pierde su regulación por la
hormona. Estos resultados sugieren que es necesaria una correcta organización estructural
de las regiones N-terminales para la regulación de h-ERG por la TRH y que una
modificación de las mismas podría alterar una posible interacción entre el dominio eag/PAS
y el lazo S4-S5, la cual sería fundamental para la transmisión del mecanismo regulador
desde los dominios citoplasmáticos al cuerpo central del canal.
 Resultados - 91

Figura 27. Efecto de la TRH en la dependencia de voltaje de activación de canales h-ERG con
mutaciones puntuales en el lazo intracelular S4-S5.
(A) Corrientes representativas de oocitos que co-expresan el receptor de TRH y los diferentes canales
mutados, antes (“Control”, panel superior) y después (“TRH”, panel inferior) de la adición de 1 μM TRH. Los
registros se obtuvieron tras aplicar el protocolo mostrado en el inserto. Nótese que la escala temporal se
presenta ampliada en los mutantes D540C, Y542C y E544C para resaltar la rápida desactivación de las
corrientes de cola mostrada por estos canales (ver apartado I.6 de Resultados). (B) Curvas I/V promedio
obtenidas a partir del número de oocitos mostrado en C. La dependencia de voltaje del canal nativo en ausencia
de hormona también se representa en los gráficos (línea discontinua). (C) Histograma en el que se compara el
desplazamiento inducido por la TRH en los distintos mutantes con el del canal nativo. * p<0.05, ** p<0.001,
n.s. no significativo frente al canal nativo.
92 - Resultados

Figura 28. Efecto de la TRH en la velocidad de activación de canales h-ERG con mutaciones
puntuales en el lazo intracelular S4-S5.
(A) Corrientes representativas de oocitos que co-expresan el receptor de TRH y los diferentes canales
mutados, antes (“Control”, panel superior) y después (“TRH”, panel inferior) de la adición de 1 μM TRH. En
todos los casos, el voltaje del pulso despolarizante fue de 0 mV a excepción del mutante G546C, en el cual fue
de +20 mV, debido a su velocidad de activación ligeramente más lenta en comparación con la del canal nativo.
Para todas las construcciones las corrientes de cola se obtuvieron repolarizando las membranas de los oocitos a
-100 mV. (B) Desarrollo temporal de las corrientes de los diferentes canales. Se muestran los valores de t1/2,
que se obtienen en el punto de cruce entre la línea punteada y los gráficos, antes (círculos blancos) y después
(círculos negros) de la adición de hormona. La escala temporal representada en el eje de abscisas se reduce a 3
s para una mejor visualización del retraso inducido por la TRH. (C) Histograma en el que se compara el efecto
de la TRH sobre la velocidad de activación de los canales mutados en el lazo intracelular S4-S5 con el del canal
nativo. Un incremento del 100% indica que t1/2 alcanza un valor doble en respuesta a la TRH. * p<0.05,
** p<0.001, n.s. no significativo frente al canal nativo.
 Resultados - 93

Figura 29. Efecto de la TRH sobre el componente rápido de cierre a -100 mV de canales h-ERG con
mutaciones puntuales en el lazo intracelular S4-S5.
(A) Constantes de tiempo (
) del componente rápido de cierre a -100 mV del canal nativo y de los distintos
mutantes en el lazo S4-S5. (B) Histograma en el que se comparan los efectos hormonales sobre la cinética de
cierre de los distintos mutantes de h-ERG, tras su tratamiento con 1 μM TRH. Los decrementos en la constante
de tiempo del componente rápido de cierre se comparan con el del canal nativo según se describe en la Fig. 19.
* p<0.05, ** p<0.001, n.s. no significativo frente al canal nativo.
94 - Resultados

III. ESTUDIO DE INTERACCIONES INTRAMOLECULARES

EN EL CANAL h-ERG

III.1. Análisis de posibles interacciones intramoleculares mediante

el estudio de la modulación del cierre de h-ERG por el pH
extracelular.

En estudios anteriores de distintos laboratorios, se ha observado que la acidificación

del medio de perfusión de oocitos de Xenopus y de células L929 que expresan
heterólogamente h-ERG, es capaz de modificar el comportamiento cinético del canal,
concretamente sus propiedades de desactivación (Anumonwo et al., 1999; Jiang et al.,1999;
Liu et al., 2003). Para tratar de explicar esta modulación por el pH, se ha sugerido que la
acidificación extracelular ocasionaría la protonación de varios aspartatos repartidos entre las
hélices S1 a S3, los cuales estarían implicados en la formación de interacciones
electrostáticas con residuos de arginina de la hélice S4. El mantenimiento de los citados
puentes salinos, se vería favorecido por una hipotética interacción proteína-proteína
intramolecular entre el dominio eag/PAS del extremo amino y el lazo intracelular S4-S5, lo
que podría constituir un “interruptor molecular”, que controla la cinética de desactivación del
canal (Liu et al., 2003). De hecho, incluso en uno de estos estudios, ya se había
comprobado que la aceleración del cierre de h-ERG ocasionado por la acidificación
extracelular, se reducía al eliminar la práctica totalidad del extremo amino del canal (Jiang et
al., 1999).

Puesto que en el primer apartado de este capítulo de Resultados, hemos demostrado

cómo la región inicial N-terminal de h-ERG contribuye a fijar sus propiedades de cierre, pero
que también el dominio proximal (región 138-373) desempeña un papel relevante en este
proceso cuando se comparan las distintas mutaciones a un potencial electroquímico
equivalente, nos planteamos estudiar el impacto que la disminución del pH externo desde
7.5 a 6.5 ejerce sobre la cinética de cierre de las distintas construcciones con deleciones
N-terminales y con mutaciones puntuales en el lazo S4-S5. Aunque se trata de un abordaje
indirecto, pensamos asimismo que estos estudios podrían aportar una información valiosa
acerca de la posible existencia de interacciones entre la región inicial N-terminal de h-ERG y
el cuerpo central del canal.

III.1.1. Efecto de la eliminación de regiones N-terminales en la modulación del

cierre de h-ERG por la acidificación extracelular.

En las Figuras 30 y 31, se muestran los resultados obtenidos al analizar los efectos de
la acidificación extracelular sobre la cinética de desactivación del canal nativo. De acuerdo
con trabajos anteriores (Anumonwo et al., 1999; Jiang et al., 1999; Liu et al., 2003), al
disminuir el pH externo desde 7.5 a 6.5, se produce una ligera reducción de la magnitud de
las corrientes de cola obtenidas a diferentes potenciales negativos, así como una clara
aceleración del proceso de cierre. Se puede observar que la acidificación reduce las
 Resultados - 95

constantes de tiempo tanto del componente lento (
lenta) como, predominantemente, del
componente rápido (
rápida) de cierre, el cual es el mayoritario en las corrientes de cola
registradas a potenciales muy negativos. Esta aceleración del cierre es similar tanto en 50
mM como en 2 mM KCl, sin bien, para potenciales negativos próximos o por debajo del
potencial de reversión del catión, el efecto de la acidificación fue algo más reducido al utilizar
el medio con baja concentración de potasio (datos no mostrados). Por todo ello y para
maximizar la magnitud de las corrientes de cola, las comparaciones cinéticas fueron
realizadas en un medio extracelular conteniendo 50 mM KCl.

En los paneles B-E de la Figura 30, se muestran corrientes registradas a diferentes

voltajes de repolarización en oocitos que expresan canales h-ERG carentes de distintos
segmentos N-terminales. Se puede observar cómo todas estas modificaciones estructurales
del extremo amino, anulan la aceleración del cierre inducida por la acidificación del medio.
En la Figura 31A, se muestra la variación de las cinéticas de cierre en función del voltaje, o
en función del potencial electroquímico, a pH 7.5 y 6.5. Se muestran las constantes de los
componentes rápido y lento de cierre, obtenidas a ambos pHs, tanto para el canal h-ERG
nativo, como para los canales
2-16,
2-135 (carente del dominio eag/PAS),
138-373
(carente del dominio proximal) y
2-375 (carente del extremo amino completo). Por su parte,
en los paneles B y C de la Figura 31, se cuantifica la aceleración del componente rápido de
cierre medido a -100 mV o a -4 kcal/mol de potencial electroquímico total. En ambos casos,
se puede observar que, para el canal nativo, la velocidad de cierre prácticamente se triplica
al disminuir el pH extracelular. Sin embargo, esta aceleración es inapreciable en todos los
canales con deleciones en el extremo amino, demostrando que la eliminación de los
primeros residuos N-terminales es suficiente para anular el efecto de la acidificación
extracelular.

Estos resultados podrían indicar que los efectos de acidificación sobre el cierre del
canal h-ERG, precisarían de la presencia de los primeros 16 residuos aminoacídicos de la
proteína. Sin embargo, la ausencia de aceleración del cierre inducida por la acidificación,
también se observa cuando se elimina el dominio proximal (
138-373). Es interesante
destacar también que en otra variante de h-ERG, carente de un segmento del carboxilo
terminal (
864-1010), se observa una aceleración del cierre por la acidificación extracelular
que es análoga a la del canal nativo (datos no mostrados), indicando que la anulación o
reducción de los efectos de la acidificación extracelular sobre el cierre, es dependiente
específicamente del extremo amino del canal. Nótese asimismo que, si bien los canales con
diferentes deleciones en el comienzo del extremo amino (
2-16,
2-135 y
2-370) ya
presentan una cinética basal de cierre más rápida que la del canal nativo, la ausencia de
aceleración del cierre también ocurre en la construcción
138-373, cuya cinética basal de
cierre es similar a la del canal nativo. Parece claro pues que la ausencia de modulación por
el pH extracelular, no se debe exclusivamente a la aceleración basal del cierre causada por
algunas de las modificaciones N-terminales.
96 - Resultados

Figura 30. Efecto de la acidificación extracelular en la desactivación de las corrientes de cola de

canales h-ERG que presentan diferentes deleciones N-terminales.
Familias de corrientes representativas obtenidas de oocitos que expresan las variantes de h-ERG indicadas en la
parte superior de los registros a pH extracelular de 7.5 y a pH 6.5. Para generar las corrientes de cola a los
distintos voltajes de repolarización, se utilizó el protocolo mostrado en el inserto. Únicamente se representan
los trazos de corriente obtenidos cada 20 mV y los primeros 3 s de las corrientes de cola, para una mayor
claridad y mejor comparación de la fase de caída de las mismas.

Por último, la insensibilidad del cierre del canal
138-373, carente de dominio proximal
a la acidificación extracelular, sugiere que los efectos producidos al eliminar el citado
dominio, podrían ser colaterales a la modificación del posicionamiento de la región inicial
N-terminal respecto al cuerpo central del canal. Así, es posible que al eliminar el dominio
proximal se propicie o estabilice una interacción constante entre la región inicial N-terminal y
la maquinaria de apertura y cierre, que funcionaría como el “interruptor molecular” del cierre
de h-ERG, y que, por ello, se minimice el efecto de la acidificación. Alternativamente, la
ausencia de aceleración del cierre inducida por la acidificación en el canal
138-373, podría
deberse a una interrupción permanente de esa interacción intramolecular, haciendo al canal
incapaz de “sentir” los cambios en el pH extracelular.
 Resultados - 97

Figura 31. Efecto de la eliminación de regiones N-terminales sobre la aceleración del cierre de
h-ERG inducida por la acidificación extracelular.
(A) Efecto de la acidificación extracelular en la variación de las constantes de cierre frente al voltaje aplicado a
la membrana (panel superior) o frente al potencial electroquímico [panel inferior; -(
G0 -EzgF)], en las distintas
variantes de h-ERG. Para estimar la cinética de desactivación se ajustaron las fases de caída de las corrientes
de cola durante los distintos pulsos repolarizantes a ecuaciones biexponenciales, según lo descrito en los
Métodos. Se muestra, en coordenadas semilogarítimicas, la variación de la constante de tiempo tanto del
componente lento (
lenta, triángulos) como del componente rápido (
rápida, círculos), obtenidas a pH extracelular
de 7.5 (símbolos blancos) y 6.5 (símbolos negros). (B) Histograma en el que se compara la aceleración del
componente rápido de cierre a -100 mV, inducida por la acidificación extracelular. Solamente se muestran los
datos correspondientes al componente rápido, mayoritario a potenciales muy negativos. Un incremento del
100% significa que la
rápida se ha reducido a la mitad. (C) Histograma en el que se compara la aceleración
inducida por la acidificación extracelular para el mismo valor de potencial electroquímico de -4 kcal/mol. Los
parámetros termodinámicos de activación en estado estacionario a pH 7.5 se obtuvieron en la forma indicada
en el apartado I de Resultados. * p<0.05 frente al canal nativo.
98 - Resultados

III.1.2. Efecto de las mutaciones del lazo S4-S5 en la modulación del cierre de
h-ERG por la acidificación extracelular.

Como ya se ha comentado, se ha sugerido que para que la región inicial N-terminal de

h-ERG module el proceso de cierre, podría interaccionar con el cuerpo central del canal a
nivel del lazo intracelular S4-S5 (Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al., 1998; Chen et al.,
1999; Sanguinetti & Xu, 1999; Gómez-Varela et al., 2002). Teniendo en cuenta esta
sugerencia y los resultados anteriormente descritos, que muestran la ausencia de
aceleración del cierre por la acidificación extracelular en canales que carecen de diferentes
regiones N-terminales, nos planteamos la posibilidad de que esto pudiese pasar, a su vez,
en canales con mutaciones en el lazo S4-S5. Para examinar esta posibilidad, se estudió el
efecto de la disminución del pH sobre la cinética de cierre de los canales mutados en el
citado lazo y ya descritos previamente en apartados anteriores de esta memoria (D540C,
R541H/A, Y542C, S543C, E544C, Y545C y G546C).

En la Figura 32, se muestran las familias de corrientes originadas a pH 7.5 y pH 6.5

cuando se repolariza a diferentes voltajes la membrana de oocitos que expresan los
diferentes mutantes del lazo S4-S5 (paneles B-I). Al igual que ocurría en los canales con
deleciones N-terminales, se puede apreciar que en los mutantes D540C, R541H, R541A,
Y542C, y E544C, la fase de caída de las corrientes de cola prácticamente no es acelerada
por la acidificación extracelular. Por el contrario, las corrientes de cola de los canales S543C
y G546C, son afectadas por la disminución del pH de 7.5 a 6.5 de forma similar a como
ocurre en el canal nativo.
La Figura 33, por su parte, ilustra la variación de las constantes de los componentes
lento y rápido de cierre a los dos pHs en función del voltaje de repolarización (paneles
superiores) o del potencial electroquímico total (paneles inferiores). Se puede observar la
escasa o nula aceleración del cierre a pH 6.5 en los mutantes D540C, R541H, R541A,
Y542C y E544C, y la aceleración similar a la del canal nativo en los canales S543C, Y545C
y G546C.
Por último, en la Figura 34, se cuantifica la aceleración del componente rápido de
cierre (
rápida) por la acidificación tanto a -100 mV como a -4 kcal/mol de potencial
electroquímico total. Se puede observar de nuevo que los efectos son casi nulos en los
mutantes D540C e Y542C, y claramente reducidos en los canales R541A, R541H y E544C.
Sin embargo, la aceleración del componente rápido de cierre, es semejante a la del canal
nativo en los mutantes S543C, Y545C y G546C. Es importante señalar que las diferencias
en la aceleración del cierre, ocasionadas por la acidificación, se producen en mutantes con
tasas de cierre equiparables (e.g. R541A y Y545C). Esto indica que la reducción de la
aceleración no se debe a la previa aceleración basal del cierre, causada por la mutación en
sí, sino que está relacionada con la alteración estructural en la maquinaria de apertura y
cierre.
Así pues, los mutantes de la región N-terminal del lazo S4-S5 (residuos 540-542),
presentan un comportamiento distinto a los del segmento 543-546, señalando a esta región
N-terminal del lazo S4-S5 como el punto clave en la transmisión de los efectos en el cierre,
inducidos por la acidificación extracelular. Además, el hecho de que tanto las modificaciones
en el extremo amino del canal como algunas mutaciones en el lazo S4-S5, presenten la
 Resultados - 99

característica común de que su cinética de cierre no sea modulada por el pH externo,

afianza la idea de que existe una relación funcional entre ambos y, aunque indirectamente,
apoya la hipótesis de la existencia de una interacción entre ambas regiones intracelulares.

Figura 32. Efecto de la acidificación extracelular sobre el cierre de canales h-ERG mutados en el lazo
intracelular S4-S5.
Se muestran familias de corrientes representativas obtenidas de oocitos que expresan los mutantes de h-ERG
indicados en la parte superior de los registros, a un pH extracelular de 7.5 y de 6.5. Para generar las corrientes
de cola a los distintos voltajes de repolarización, se utilizó el protocolo mostrado en la parte superior. Solo se
representan los trazos de corriente obtenidos cada 20 mV y los primeros 3 s de las corrientes de cola, para una
mayor claridad y mejor comparación de la fase de caída de las mismas.
100- Resultados

Figura 33. Efecto de la mutaciones en el lazo S4-S5 sobre la aceleración del cierre de h-ERG inducida
por la acidificación extracelular.
Efecto del acidificación extracelular en la variación de las constantes de tiempo de cierre en función del voltaje
aplicado a la membrana o del potencial electroquímico [-(
G0-zgEF)]. Para estimar la cinética de desactivación,
se utilizó el método ya descrito y comentado previamente en la Figura 31. Se muestra, en escala
semilogarítmica, la variación de las constante de cierre tanto del componente lento (lenta, triángulos) como del
componente rápido (rápida, círculos), obtenidas a pH extracelular de 7.5 (símbolos blancos) y 6.5 (símbolos
negros).
 Resultados -101

Figura 34. Efecto de la mutaciones en el lazo S4-S5 de h-ERG sobre la aceleración de la constante de
tiempo del componente rápido de cierre (
rápida) inducida por la acidificación extracelular.
(A) Histograma en el que se compara la aceleración del componente rápido de cierre a -100 mV inducida por la
acidificación extracelular. (B) Histograma en el que se compara la aceleración inducida por la acidificación para
el mismo valor de potencial electroquímico de -4 kcal/mol. El número de células utilizado en los promedios se
muestra en el panel A. Los parámetros termodinámicos de activación en estado estacionario a pH 7.5 se
obtuvieron en los estudios ya expuestos en el apartado I de los Resultados. *p<0.05 frente al canal nativo.

Es interesante destacar que algunos trabajos preliminares de nuestro laboratorio,

estudiando la acidificación extracelular, demostraron que el efecto del pH extracelular se
ejercía de forma específica sobre el cierre de h-ERG (Diego García Manso, 2006, Tesis
Doctoral). Para confirmar esta interpretación, analizamos también el efecto de la
acidificación en este caso sobre la cinética de apertura de los distintos canales.
Comprobamos así que la dependencia de voltaje de activación era desplazada unos 10 mV
hacia valores más positivos en el canal nativo, y un valor similar en todo el resto de los
canales mutados, ya que en todos los casos se obtuvieron valores entre +8 y +16 mV para
el desplazamiento de las curva I/V de activación, tanto en los canales con deleciones en el
extremo amino como en los distintos mutantes del lazo S4-S5 (datos no mostrados). Es
importante destacar que este desplazamiento, no significativamente distinto del observado
en el canal nativo, se observó no sólo en canales que muestran una dependencia de voltaje
de activación equivalente a la del canal nativo, sino también con canales que muestran una
pendiente muy reducida de las curva I/V de activación (D540C e Y542C) y con canales con
considerables desplazamientos basales de la dependencia de voltaje, tanto en la dirección
despolarizante (D540C e Y542C) como hiperpolarizante (
138-373). Ello demuestra, en
conjunto, que los efectos de la acidificación extracelular son ejercidos de modo selectivo
sobre el proceso de cierre de h-ERG.
102- Resultados

III.2. Análisis de las interacciones intramoleculares en h-ERG

mediante la óxido-reducción de cisteínas.

Trabajos previos de varios laboratorios, incluido el nuestro, han constatado que las
alteraciones estructurales en la región inicial N-terminal de h-ERG y las mutaciones del lazo
S4-S5, modifican de modo equivalente las características cinéticas del canal (Morais-Cabral
et al., 1998; Wang et al., 1998; Chen et al., 1999; Sanguinetti & Xu, 1999; Gómez-Varela et
al., 2002). Esta correspondencia entre las características de los canales modificados en
ambas regiones intracelulares, ha llevado a proponer la existencia de una interacción física
entre las mismas, la cual explicaría porqué diferentes alteraciones estructurales en estos
dominios alejados en la secuencia proteica, ocasionan el mismo impacto sobre la
funcionalidad.
Una indicación adicional que apoya la existencia de dichas interacciones
intramoleculares, es aportada por los datos recogidos en el apartado I de Resultados, en el
que tras el análisis de las características cinéticas y termodinámicas de variantes de h-ERG
modificadas en ambas regiones, de nuevo se ha demostrado el paralelismo existente entre
los efectos producidos sobre los parámetros cinéticos. De igual forma, hemos observado
una reducción equivalente de la aceleración del cierre inducida por la acidificación
extracelular, tanto en canales carentes de regiones N-terminales como en los mutados en el
lazo S4-S5, sugiriendo de nuevo la posible existencia de un contacto físico entre ambos
dominios proteicos.
Asimismo, y aunque también de modo indirecto, esta hipótesis es apoyada por un
estudio reciente de nuestro laboratorio (Miranda & Manso et al., 2008) en el que, tras un
análisis mediante FRET (“Fluorescence Resonance Energy Transfer”) de canales h-ERG
etiquetados con proteínas fluorescentes derivadas de GFP (“Green Fluorescence Protein”),
se comprobó que la región inicial N-terminal se sitúa más próxima a la membrana que la
región final del extremo carboxilo, proponiéndose que tanto el dominio eag/PAS como el
dominio proximal se localizan cercanos al cuerpo central del canal. Por último, en un estudio
previo de nuestro laboratorio (Viloria et al., 2000), también se ha postulado que la facilitación
de la apertura del canal que provoca la eliminación del dominio proximal de h-ERG, es
debida a una mejor interacción entre el dominio eag/PAS y la maquinaria de apertura-cierre,
situada en el parte central del canal embebida en la membrana plasmática.

No obstante, aunque muy sugerentes, ninguno de estos datos ha permitido demostrar

de una forma directa la existencia de un contacto físico entre el extremo amino y el lazo
S4-S5 de h-ERG. También es importante recordar que algunas mutaciones en el lazo S4-S5
en canales carentes de extremo amino (ver apartado I.7 de Resultados), inducen por sí
mismas alteraciones en la maquinaria de apertura-cierre, independientemente de la
presencia del citado extremo amino, complicando la interpretación de los datos cinéticos y
las posibles implicaciones del comportamiento equivalente de los canales modificados en
dicho lazo y/o en el extremo amino.
A la vista de todos estos antecedentes y con el fin de comprobar de un modo directo si
realmente existe una proximidad física entre el segmento inicial N-terminal y el lazo S4-S5,
nos planteamos estudiar la posibilidad de que entre ambas regiones, si se encuentran
 Resultados -103

especialmente próximas, se pudiesen establecer puentes disulfuro, debido a la colisión entre

los grupos sulfhidrilos (-SH) de un par de cisteínas introducidas y su posterior oxidación con
un agente oxidante como el tert-butilhidroperóxido (tbHO2). En el caso de que estos enlaces
covalentes se formen entre dos puntos, cuya interacción dinámica sea esencial para la
actividad del canal, es previsible que se ocasione alguna alteración funcional medible, como,
por ejemplo, la reducción de las corrientes mediadas por el canal. Este tipo de estrategia
experimental ya ha sido utilizada con éxito en un trabajo reciente (Ferrer et al., 2006), para
comprobar, en este caso, si el lazo S4-S5 participa directamente en el acoplamiento entre
los cambios conformacionales inducidos por las variaciones del potencial de membrana y la
apertura de h-ERG, y para constatar la existencia de una interacción directa entre el residuo
D540 del lazo S4-S5 y los residuos R665/L666 de la región C-terminal de la hélice
transmembranal S6, que se ha postulado es parte integrante de la “compuerta” del canal.

III.2.1. Introducción de cisteínas al inicio del extremo amino y en el lazo S4-S5

de h-ERG para el análisis de la proximidad entre ambas regiones.

Dado que se disponía de una batería de mutantes puntuales a cisteína en el lazo

S4-S5, y con el fin de estudiar la posible formación de puentes disulfuro entre dicho lazo y
algún punto del extremo amino del canal, particularmente de la parte inicial del mismo,
generamos dos nuevos mutantes puntuales, uno en el que se substituyó por cisteína la
valina 3 del canal (mutante V3C) y un segundo mutante doble combinando cisteínas en la
valina 3 y en la tirosina 542 del lazo S4-S5 (doble mutante V3C/Y542C).

h-ERG V1/2 (mV) t1/2 (ms)
rápida (ms)

Nativo -21.9 ± 0.55 (n = 25) 143.0 ± 8.6 (n = 6) 145 ± 14 (n = 9)

V3C -17.9 ± 1.05 (n = 12)* 272.3 ± 15.9 (n = 15)* 46.1 ± 0.01 (n = 9)*

Y542C -5.9 ± 0.55 (n = 20)* 274.5 ± 11.2 (n = 8)* 21.3 ± 2.5 (n = 9)*

V3C/Y542C -5.3 ± 4.2 (n = 2)* 187.1 ± 1.8 (n = 2) 18.6 ± 1.9 (n = 2)*

Tabla 4. Características cinéticas de los canales h-ERG mutantes V3C e Y542C, y del mutante doble
V3C/Y542C.
Se muestran los parámetros cinéticos de dependencia de voltaje (V1/2) y tiempo (t1/2) de activación
semimáxima, así como la constante de tiempo del componente rápido de cierre (
rápida), de los canales h-ERG
con las mutaciones V3C e Y542, y V3C/Y542C, así como del canal nativo. La dependencia de voltaje de
activación se obtuvo despolarizando los oocitos a diferentes voltajes mediante pulsos de 1 s desde un potencial
basal de -80 mV (ver apartado I de Resultados) y después de ajustar los datos a ecuaciones de Boltzmann
según lo descrito en Métodos. Para obtener los valores de t1/2 se utilizó el protocolo indirecto, descrito en el
apartado I de Resultados, con despolarizaciones a 0 mV. Los valores de
rápida se obtuvieron ajustando la fase
de caída de las corrientes de cola a -100 mV a ecuaciones biexponenciales (ver Métodos), mediante el protocolo
descrito en el apartado I de Resultados. *p<0.001 respecto al canal nativo.

Los resultados de la caracterización funcional de dichos mutantes se exponen en la

Tabla 4, donde se comparan las propiedades cinéticas de estos canales mutantes con las
del canal h-ERG nativo.
104- Resultados

Se puede observar que, tanto en los mutantes simples como en el mutante doble, se
produce un cierto desplazamiento de las curvas I/V de activación hacia potenciales más
positivos, si bien dicho desplazamiento de la dependencia de voltaje de activación es
mínimo en el canal V3C, y algo mayor en los mutantes Y542C y V3C/Y542C, que muestran
una dependencia de voltaje totalmente análoga. También observamos una cinética de
apertura a 0 mV significativamente más lenta en los mutantes V3C e Y542C, pero similar a
la del canal nativo en el mutante combinado V3C/Y542C.
Por último, y de modo totalmente esperable, dada la conocida influencia del extremo
amino y el lazo S4-S5 en las propiedades de desactivacón de h-ERG, se puede observar
que la cinética de cierre a -100 mV está acelerada en todos los canales mutados. Estos
resultados indican que los canales mutantes y, particularmente, el mutante doble, no
presentan graves distorsiones funcionales que los diferencie ni del canal nativo ni de los
mutantes simples correspondientes.

III.2.2. Efecto de la oxidación de cisteínas introducidas en el inicio del extremo

amino y el lazo S4-S5 sobre las corrientes de h-ERG.

En la Figura 35, se muestra el efecto de la adición del agente oxidante tbHO2 sobre las
corrientes de cola de h-ERG, en oocitos que expresan tanto los mutantes simples V3C e
Y542C, como el doble mutante V3C/Y542C o el canal nativo. En todos los casos, los
canales se mantuvieron en estado basal cerrado a -80 mV, abriéndolos periódicamente para
su análisis mediante despolarizaciones de 1 s a +40 mV, seguidas de una repolarización
posterior a -100 mV y con una frecuencia de 15 s. La perfusión del medio con el oxidante
tbHO2 2 mM, se hizo de forma continua mediante un flujo lo suficientemente rápido como
para asegurar un recambio total de la solución en la cámara de registro en sólo unos pocos
segundos. Se puede observar en los oocitos que expresan el canal V3C/Y542C, que la
corriente de cola es rápidamente reducida en tan sólo 1 min tras la adición del oxidante. Sin
embargo, a ese tiempo, la corriente fue muy poco reducida en el resto de canales,
manteniéndose en un 94.7% en el canal nativo, y en un 88.2 y 81% en los mutantes Y542C
y V3C, respectivamente. Tras 5 min de perfusión con el oxidante, la corriente se redujo
hasta el 23.5% en oocitos que expresan el doble mutante V3C/Y542C, pero sólo disminuyó
hasta el 80.3, 57.5 y 51.3% en los que expresan los canales nativo, Y542C y V3C,
respectivamente. Estos datos demuestran que, aunque en los mutantes V3C e Y542C se
produce una inhibición de la corriente por el tbHO2 que es algo mayor que la que sufre el
canal nativo, dicha inhibición es mucho mayor e, inicialmente, presenta una cinética mucho
más rápida en el mutante doble V3C/Y542C.
 Resultados -105

Figura 35. Efecto de la oxidación de cisteínas introducidas en las posiciones 3 del extremo amino y
542 del lazo S4-S5 de h-ERG.
(A) Corrientes representativas de oocitos que expresan los mutantes simples h-ERG V3C e Y542C, así como el
doble mutante V3C/Y542C y el canal nativo. Los registros corresponden al momento anterior a la adición del
agente oxidante tbHO2 2 mM y a los obtenidos durante los cinco primeros minutos de tratamiento con el
oxidante, a intervalos de 1min. En el inserto de la parte superior de la figura, se muestra el protocolo utilizado
para generar las corrientes. Las corrientes de cola aparecen de forma ampliada en los recuadros. (B) Curso
temporal del efecto del tbHO2 sobre la magnitud de las corrientes de cola. La magnitud de la corriente fue
cuantificada como la diferencia entre el pico inicial y la registrada al final de la repolarización a -100 mV. Los
datos se presentan normalizados respecto al valor de la corriente justo antes de la adición de tbHO2 (ver
Métodos). Nótese la escala semilogarítmica del panel central y los mismos datos representados en escala lineal
en el inserto.
106- Resultados

En conjunto, estos resultados sugieren que las cisteínas en posición 3 del extremo
amino y 542 del lazo S4-S5, se encuentran lo suficientemente próximas como para que sea
posible la formación de un puente disulfuro entre ambas. De hecho, la rapidez y la magnitud
del efecto oxidante inicial del tbHO2 sobre el mutante doble V3C/Y542C parecen superiores
a las esperables si se suman los efectos observados en los dos mutantes simples, V3C e
Y542C. No obstante, la presencia de un cierto efecto del agente oxidante en cada uno de los
mutantes simples por separado, tiende a complicar la interpretación de los resultados. Por
ello, resultó conveniente llevar a cabo una serie de controles adicionales para analizar la
posibilidad de que los resultados con el doble mutante V3C/Y542C no fueran debidos a la
formación de un puente disulfuro entre las últimas, sino a la mera oxidación individual de
ambas, o bien a que dicho puente disulfuro no se estableciera directamente entre ellas, sino
con otras cisteínas ya presentes en el canal y distintas del par considerado.

III.2.3. Reversión del efecto de la oxidación de cisteínas introducidas en el

inicio del extremo amino y el lazo S4-S5 de h-ERG.

Como una primera confirmación de que los efectos del tbHO2 son debidos a la
formación de puentes disulfuro entre cisteínas, se comprobó la posible reversión de los
mismos con el agente reductor ditiotreitol (DTT). Este compuesto, tiene un poder reductor lo
suficientemente alto como para poder revertir la formación de puentes disulfuro,
caracterizados por su elevado grado de oxidación (Zahler & Cleland, 1968), aportando una
demostración directa e inequívoca de la formación de dichos enlaces covalentes.

En la Figura 36, se muestran los efectos del DTT sobre la corriente de los canales
V3C, Y542C y V3C/Y542C, así como sobre la del canal nativo, tras su tratamiento con el
oxidante tbHO2. Como se puede observar, el agente reductor causa un rápida reversión del
efecto del oxidante sobre el canal mutante V3C, situando a la corriente de cola a un nivel
similar al observado con el canal nativo tras los mismos tratamientos. Sin embargo, el
agente reductor revierte de forma mínima el nivel de inhibición causado por el oxidante en el
mutante Y542C, que del 39.6% de la corriente presente al final del tratamiento con tbHO2,
se incrementa en un 8% (hasta un 47.6%) en presencia del DTT. Por su parte, el agente
reductor revierte parcialmente la inhibición de la corriente causada por la oxidación en el
doble mutante V3C/Y542C, precisamente hasta el nivel exhibido por el mutante sencillo
Y542C, cuya corriente no es prácticamente revertida en presencia del DTT como acabamos
de indicar.
Estos datos son totalmente coherentes con la posibilidad de que entre la cisteína 3 y la
cisteína 542, ambas introducidas en h-ERG, se establezca un puente disulfuro, ya que el
efecto inhibitorio rápido del oxidante, es revertido totalmente en el doble mutante
V3C/Y542C, hasta el nivel irreversible alcanzado en el mutante sencillo Y542C. Por su
parte, la irreversibilidad observada en el canal Y542C sugiere que, salvo que dicha cisteína
forme un puente disulfuro con otra cisteína nativa de h-ERG situada en un estado no
accesible al DTT, el efecto del oxidante probablemente se deba a la mera modificación de la
cisteína 542 hacia derivados oxidados sulfónicos (-SO3-) y sulfénicos (-SO-). Estos posibles
derivados de la cisteína 542, serían totalmente incapaces per se de formar puentes
 Resultados -107

disulfuro, pero su formación probablemente compita con la reacción que da lugar a los
puentes disulfuro entre las cisteínas 3 y 542 del doble mutante. Este hecho sería asimismo
completamente coherente con la lenta tasa de modificación exhibida por el mutante sencillo
Y542C, ya que la velocidad de reacción de formación de derivados no disulfidos es mucho
menor que la de formación de puentes disulfuro (revisado por Bass et al., 2007). Este es
también el caso del otro mutante sencillo V3C, que también muestra una manifiesta lentitud
en el efecto del oxidante sobre la corriente. Sin embargo, la clara reversibilidad del efecto,
en este caso, complica la interpretación de los datos. Por ello, se planteó el estudio de
algunas construcciones adicionales en las que una parte de las cisteínas nativas de h-ERG
hubieran sido eliminadas de determinadas regiones.

Figura 36. Reversión del efecto del tbHO2 en canales con cisteínas introducidas en la posición 3 del
extremo amino y 542 del lazo S4-S5 de h-ERG.
Se muestra, en escala semilogarítmica, la evolución temporal de la magnitud de la corriente de cola
normalizada durante la perfusión con medio oxidante (“tbHO2 2 mM”) y tras la adición de medio reductor con
20 mM DTT. Las corrientes de cola fueron obtenidas aplicando a los oocitos el protocolo de estimulación
indicado en la Figura 35.

III.2.4. Efecto de la óxido-reducción de cisteínas introducidas en el extremo

amino y el lazo S4-S5 de canales h-ERG carentes de dominios
citoplasmáticos.

La situación ideal para el análisis por mutagénesis dirigida a cisteínas y la

subsiguiente utilización de la química de puentes disulfuro, es aquella en la que la proteína
estudiada carece de residuos de cisteína intrínsecos, bien naturalmente o por haber sido
eliminados mediante mutagénesis dirigida (revisado por Bass et al., 2007).
Desafortunadamente, h-ERG contiene 23 residuos de cisteína, de los cuales sólo 2 se
encuentran en el lazo extracelular S1-S2 y otras 3 dentro de las hélices transmembranales
108- Resultados

S5 y S6. El resto de las cisteínas nativas de h-ERG, se localizan en dominios

citoplasmáticos, concretamente 8 de ellas en el dominio eag/PAS y 2 en el dominio proximal
del extremo amino, 4 en la región que va desde la última hélice transmembranal (S6) hasta
el final del dominio cNBD (“C-linker”) y las 4 restantes en la región final del extremo
carboxilo. Por lo tanto, en la proteína de h-ERG, existen un total de 18 residuos de cisteína
intracelulares, que podrían actuar como parejas de las cisteínas introducidas por
mutagénesis para la formación de puentes disulfuro.
Con el fin de minimizar esta posibilidad sin una costosa y exhaustiva mutagénesis, que
eliminara totalmente tan elevado número de cisteínas nativas, se comenzó introduciendo las
mutaciones V3C e Y542C, en canales previamente obtenidos en nuestro laboratorio, bien
carentes de una parte del extremo carboxilo (
864-1010), para generar las construcción
V3C/
864-1010 e Y542C/
864-1010, carente de 2 cisteínas del extremo carboxilo, o bien
en canales carentes de la práctica totalidad del extremo amino (
2-370), para generar la
construcción Y542C/
2-370, carente de 10 cisteínas del extremo amino. Estas
construcciones fueron utilizadas para el estudio del efecto del oxidante y el reductor sobre
las corrientes y para su comparación con los mutantes sencillos.
Como se puede apreciar en la Figura 37A, el efecto de la óxido-reducción sobre las
construcciones V3C y V3C/
864-1010, es totalmente análogo, indicando que el posible
emparejamiento de la cisteína 3 que pudiera explicar la inhibición causada por el oxidante
en dicho mutante, no es con ninguna de las dos cisteínas del extremo carboxilo eliminadas
con la deleción
864-1010. La posible eliminación de las 5 cisteínas presentes en el inicio
de la región carboxilo y el cNBD mediante un método similar no resultó viable, debido a la
pérdida de función que causan las deleciones en esta región. Tampoco se intentó extender
este abordaje al resto de las cisteínas del carboxilo, dada la presumible implicación de éste
en el mecanismo de tetramerización de los canales de la familia eag, incluido h-ERG
(Kupershmidt et al. 1998, 2002; Jenke et al., 2003).

En lo que respecta al posible emparejamiento de la cisteína 542, los resultados de la

Figura 37B, de nuevo indican que ni la combinación Y542C/
864-1010 ni la Y542C/
2-370
aportan notables diferencias respecto a los resultados obtenidos con el mutante sencillo
Y542C. Dado que la deleción
2-370 elimina las 10 cisteínas nativas de h-ERG en su
extremo amino y la deleción
864-1010 las 2 localizadas en el extremo carboxilo, los efectos
del tbHO2 sobre el mutante Y542C pueden tener dos explicaciones. En primer lugar, que la
cisteína en posición 542 forme un puente disulfuro con otra nativa de h-ERG distinta de las
12 eliminadas con las deleciones
864-1010 y
2-370. En segundo lugar, que el efecto de
la oxidación en el mutante Y542C no conlleva la formación de un puente disulfuro, sino que
está relacionado, efectivamente, con la modificación oxidativa de la cisteína introducida en la
posición 542. De hecho, la lenta cinética y la poca reversibilidad de los efectos oxidantes
sobre el canal Y542C apoyan claramente esta última posibilidad.
 Resultados -109

Figura 36. Efecto de la óxido-reducción sobre canales h-ERG con cisteínas en el extremo amino y el
lazo S4-S5, y con deleciones en dominios citoplasmáticos para la eliminación de cisteínas nativas.
(A) Evolución temporal de la corriente de cola normalizada durante la perfusión con el medio oxidante (“tbHO2
2 mM”) y reductor (“DTT 20 mM”) de los canales V3C y V3C/
864-1010. Para una mejor comparación, también
se incluye la evolución temporal correspondiente a los canales nativo y doble mutante V3C/Y542C.
(B) Evolución temporal de la corriente de cola durante la perfusión con medio oxidante y reductor de los
canales Y542C, Y542C/
864-1010 e Y542C/
2-370.
110- Resultados

III.2.5. Cinética y dependencia de estado de la oxidación de cisteínas

introducidas en el extremo amino y el lazo S4-S5 de h-ERG.

Los resultados expuestos hasta ahora, sugieren la formación de un puente disulfuro

entre las cisteínas 3 y 542 del mutante V3C/Y542C tras su tratamiento con el agente
oxidante y, por tanto, indican que existe una proximidad física entre ambos residuos. No
obstante, una prueba adicional de dicha proximidad, sería comprobar si existe una
especificidad del efecto oxidante, según la conformación funcional que presenten los
canales h-ERG.
Teniendo en cuenta que, en el protocolo utilizado en los experimentos anteriores para
generar la corriente de cola, los canales permanecen basalmente y durante mucho más
tiempo en el estado cerrado, se planteó la posibilidad de que la posición relativa de las
cisteínas 3 y 542 pudiese variar, dependiendo del estado abierto o cerrado en el que
estuviesen los canales. Para estudiar esta posibilidad, se comprobó si el efecto de la
oxidación sobre los canales era dependiente de estado, analizando el efecto del oxidante
sobre las corrientes de cola del canal V3C/Y542C, pero generadas, en este caso, mediante
un protocolo en el que los canales permanecen más tiempo en conformación abierta.
Además, las cinéticas de reducción de las corrientes de cola por la oxidación se
cuantificaron mediante ajustes exponenciales al curso temporal de dicha disminución, tras la
adición del oxidante tbHO2.

Como se puede apreciar en la Figura 38, la rápida cinética que muestra la inhibición
de la corriente debida a la oxidación en h-ERG V3C/Y542C, cuando los canales
permanecen basalmente cerrados, se ajusta a una ecuación biexponencial con un
componente rápido muy prominente y mayoritario. Sin embargo, la cinética de inhibición de
las corrientes de cola es notablemente más lenta, cuando el tratamiento con el oxidante se
realiza manteniendo los canales abiertos (e inactivos) a un potencial basal de +40 mV
(desde el que las corrientes de cola son obtenidas mediante repolarizaciones sucesivas a
-100 mV a intervalos de 15 s). Esto supone que las constantes de tiempo de los
componentes rápido y lento durante la reducción biexponencial de la magnitud de las
corrientes de cola, son incrementadas desde los 34 ± 0.2 y 327 ± 36 s (n = 13),
correspondientes a las medidas desde un potencial basal de -80 mV (canales cerrados),
hasta los 94.5 ± 24 y 406 ± 62 s, correspondientes a un potencial basal de +40 mV (canales
abiertos/inactivos). Además, al situar los canales abiertos/inactivos a +40 mV, el porcentaje
del componente con desaparición rápida a -80 mV de potencial basal, correspondiente a un
93.7 ± 1% del total, es drásticamente disminuido hasta un 61.2 ± 6%. Por último, dado que,
en estos experimentos, la obtención de las corrientes de cola se llevó a cabo cada 15 s y
que su cuantificación conlleva la repolarización de la membrana a -100 mV con el
consiguiente cierre periódico de los canales, se repitió el análisis de los efectos del oxidante
a +40 mV de potencial basal, pero con menos incursiones a potenciales negativos (una vez
cada dos minutos) para la generación de las corrientes de cola. Esta estrategia provocó una
ralentización aún mayor de la cinética de reducción de las corrientes por el oxidante, hasta
valores muy similares a los obtenidos con cualquiera de los mutantes simples V3C o Y542C.
De hecho, debido al reducido número de valores experimentales generados en estas
condiciones y a la ralentización de la cinética de reducción de las corrientes, en este caso,
 Resultados -111

sólo fue posible realizar un ajuste monoexponencial a la cinética, que supuso una caída de
la magnitud de las corrientes mucho más lenta y con una única constante de tiempo de
250 s.
Estos datos claramente demuestran que la reducción de las corrientes del doble
mutante V3C/Y542C, provocada por la oxidación, es mucho más rápida cuando se
mantienen los canales en estado cerrado durante el máximo tiempo posible. Como se
discutirá posteriormente, estos resultados sugieren que las cisteínas introducidas en las
posiciones 3 y 542, se encuentran mucho más próximas o en una configuración mucho más
favorable para la formación de un puente disulfuro, cuando el canal se encuentra en el
estado cerrado que cuando h-ERG se sitúa en estado abierto.

III.2.6. Especificidad de los efectos de la oxidación para el par de cisteínas 3 y 542

introducidas en h-ERG.

Como hemos indicado en los apartados anteriores, los resultados obtenidos hasta el
momento no permiten excluir completamente la posibilidad de que los efectos del agente
oxidante tbHO2 sobre el doble mutante V3C/Y542C no sean debidos, en parte, a la simple
oxidación de las cisteínas en ambas posiciones, o a la formación de puentes disulfuro entre
cada una de ellas y alguna otra cisteína nativa presente en la secuencia de h-ERG. Para
aportar una prueba adicional de la especificidad de los efectos de la oxidación para el par
V3C/Y542C, se planteó la posibilidad de buscar una pareja alternativa para la cisteína 3 en
el lazo S4-S5, introduciendo la mutación V3C en el mutante G546C, el cual tiene una
cisteína reemplazando a una glicina en la zona C-terminal del lazo S4-S5, generándose así
el doble mutante V3C/G546C.

En la Figura 39, se muestra el efecto de la adición del agente oxidante tbHO2, sobre la
magnitud de las corrientes de cola del mutante doble V3C/G546C. Se puede observar que la
caída de la corriente de este doble mutante es prácticamente idéntica que la del mutante
sencillo V3C. Además, por otro lado, la reducción de la corriente del mutante simple G546C
por efecto del oxidante es mínima e igual a la que muestra el canal nativo. Por tanto, parece
que la cinética de oxidación exhibida por el mutante V3C/G546C es debida sólo y
exclusivamente a la presencia de la mutación sencilla V3C. Estos resultados claramente
demuestran que, cuando se introducen dos cisteínas en posiciones 3 y 542 de h-ERG, se
obtiene una inhibición por el oxidante tbHO2 amplia y particularmente rápida, que no se
obtiene cuando las cisteínas se introducen en posiciones 3 y 546. Así pues, existe una
especificidad de oxidación cuando la cisteína 3 se combina con la 542, lo cual afianza la
idea de la proximidad entre la región inicial del extremo amino y la zona N-terminal del lazo
intracelular S4-S5.

En resumen, este grupo de resultados indican que existe una proximidad física entre el
inicio del extremo amino y el lazo intracelular S4-S5, situado en el cuerpo central del canal.
Suponen, además, un inicio muy prometedor para explorar con más profundidad las
interacciones intramoleculares en el canal h-ERG, que son cruciales tanto para su
funcionalidad como para su regulación hormonal.
112- Resultados

Figura 38. Cinética y dependencia de estado de los efectos de la oxidación sobre h-ERG con cisteínas
introducidas en el extremo amino y en el lazo S4-S5.
(A) Evolución temporal de la magnitud de las corrientes de cola, tras la adición del agente oxidante tbHO2 a
canales V3C/Y542C. La evolución temporal, a un potencial basal de -80 mV, de las corrientes de cola de los
mutantes V3C e Y542C, y del canal nativo, se muestran mediante líneas punteadas, para una mejor
comparación. En el inserto, se muestran los mismos datos, en representación semilogarítmica. Las curvas de
inhibición de la corriente se ajustaron a ecuaciones exponenciales. (B) Resumen de los parámetros cinéticos de
las curvas de inhibición de la corriente. Se muestra el potencial basal (“P.B.”) al que se mantuvieron los
oocitos, la frecuencia (“f”) de las repolarizaciones a -100 mV que generan las corrientes de cola, las constantes
de tiempo de los componentes rápido y lento de caída de las ecuaciones biexponenciales y de cada una de las
monoexponenciales (
rápida,
lenta), y el porcentaje de componente rápido de la cinética inhibición biexponencial
(“% de comp. rápido”).
 Resultados -113

Figura 39. Efecto de la oxidación de cisteínas introducidas en las posiciones 3 del extremo amino y
546 del lazo S4-S5 de h-ERG.
Se muestra el curso temporal de la magnitud de las corrientes de cola durante la perfusión con medio oxidante
(“tbHO2 2 mM”) del doble mutante de V3C/G546, así como de cada uno de los mutantes simples V3C y G546C.
También se incluyen las curvas correspondientes al canal nativo y el doble mutante V3C/Y542C, para una mejor
comparación. Los datos se muestran normalizados a la corriente registrada justo antes de la adición del
oxidante y en escala semilogarítmica.
114- Resultados
Discusión
 Discusión -115

I. RELEVANCIA DEL EXTREMO AMINO Y DEL LAZO S4-S5

DE h-ERG EN LAS PROPIEDADES CINÉTICAS Y
TERMODINÁMICAS DEL CANAL

En este trabajo hemos realizado una caracterización cinética y termodinámica de

canales h-ERG con alteraciones estructurales en el extremo amino y el lazo intracelular
S4-S5. El extremo amino de h-ERG, es una región particularmente extensa en comparación
con la de otros canales, que contiene un dominio inicial muy conservado en la familia eag
(dominio eag/PAS), que precede a una región única y exclusiva (dominio proximal) de esta
proteína. Por su parte, el lazo S4-S5 sirve como conexión entre el VSD (segmentos S1-S4) y
el dominio poro (segmentos S5-S6) tanto en h-ERG como en otros canales (e.g. Kv, CNG y
HCN), siendo por ello considerado como el elemento de acoplamiento funcional entre el
VSD y el poro (Sanguinetti & Xu,, 1999; Tristani-Firouzi et al., 2002; Piper et al., 2005; Ferrer
et al., 2006). Desde hace algunos años, se ha considerado y propuesto que la lenta cinética
de cierre de h-ERG, se debe a la interacción intramolecular entre el extremo amino y el lazo
S4-S5, situado en el cuerpo central del canal (Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al., 1998;
Chen et al., 1999; Sanguinetti & Xu, 1999; Gómez-Varela et al., 2002).
El impacto que producen las alteraciones estructurales en h-ERG sobre su mecanismo
de apertura/cierre, se ha analizado mediante protocolos que permiten determinar los
parámetros cinéticos bajo condiciones de auténtico estado estacionario. A pesar de que en
algunos trabajos previos, incluidos los de nuestro propio grupo, se ha enfatizado la
necesidad de obtener dichos parámetros en condiciones de equilibrio (Schönherr et al.,
1999; Viloria et al., 2000; Miranda et al., 2005), esta circunstancia ha sido sistemáticamente
ignorada (Trudeau et al., 1995; Wang et al., 1997a; Kupershmidt et al., 1998; Chen et al.,
1999; Aydar & Palmer, 2001; Paulussen et al., 2002, 2005; Liu et al., 2003; Subbiah et al.,
2004, 2005; Zhang et al., 2005; Saenen et al., 2006). Nuestros resultados demuestran que
pulsos despolarizantes de uno o varios segundos, son claramente insuficientes para
alcanzar el equilibrio con la mayoría de las variantes de h-ERG y que incluso largos
prepulsos de 10 s, son suficientes sólo para alcanzar un estado cercano al estacionario, con
canales con cinéticas rápidas de apertura y cierre, siendo aún inadecuados para determinar
los parámetros cinéticos y termodinámicos de canales con cinéticas de apertura y cierre
lentas, a voltajes cercanos al V1/2 de las curvas de activación. Esta circunstancia, además de
aportar incertidumbres sobre los parámetros cinéticos cuantificados, imposibilita una
estimación rigurosa del impacto de las mutaciones y, dado que las medidas no son
realizadas bajo condiciones equivalentes, no permite establecer una comparación de los
efectos que éstas ejercen sobre el canal. Se ha indicado como explicación que la lenta
activación de h-ERG es el factor determinante de las desviaciones respecto al estado de
equilibrio, aún cuando se usen pulsos de despolarización relativamente largos (Schönherr et
al., 1999). Sin embargo, nuestros resultados demuestran que es la combinación de unas
lentas tasas de activación y de cierre, lo que determina los desplazamientos de las curvas
I/V respecto al estado estacionario, ya que se observan desplazamientos realmente
pequeños, tanto en canales con cinéticas de activación muy rápidas (e.g.
138-373), como
116- Discusión

también en otros que muestran una marcada aceleración del cierre (e.g.
2-16,
2-135,

2-370, R541H, R541A y Y542C).
En estudios previos sobre variantes de h-ERG con alteraciones en el dominio eag/PAS
del extremo amino, se ha demostrado el papel fundamental de esta región en la cinética de
cierre (Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al., 1998, 2000; Chen et al., 1999). Por otro lado,
en otros trabajos, incluidos los de nuestro grupo, se ha demostrado el papel que en la
cinética de activación de h-ERG juega el dominio proximal, situado entre el eag/PAS y la
hélice S1 (Viloria et al., 2000; Gómez-Varela et al., 2002; Saenen et al., 2006). Sin embargo,
hasta este trabajo, no se había reconocido que la porción inicial aminoterminal de h-ERG
jugara ningún papel en la activación del canal. Nuestros resultados demuestran la
importancia de este segmento inicial de la proteína en la apertura de h-ERG. Así, al
modificar esta región, se produce un desplazamiento de la dependencia de voltaje de
activación hacia valores más positivos y una reducción del valor de z g en la curva I/V de
estado estacionario, haciendo que el valor de
G0 sea menos negativo, es decir,
desplazando el equilibrio conformacional hacia los estados cerrados. Hemos obtenido las
características termodinámicas del estado estacionario para comparar las velocidades de
apertura de los canales en las mismas condiciones energéticas, observando que todos los
canales modificados en la región inicial del extremo amino presentan tasas de activación al
menos dos veces más rápidas que las del canal nativo, si se comparan a potenciales
electroquímicos equivalentes. Teniendo en cuenta esta apertura más rápida y que, además,
todos estos canales presentan acelerado el cierre, podemos concluir que las modificaciones
del extremo amino estabilizan el estado de transición entre los estados de abierto y de
cerrado, disminuyendo la barrera energética entre ambos (
G‡), acelerando así la apertura y
el cierre del canal. Es importante destacar que nuestro análisis no permite diferenciar cuales
de las transiciones individuales durante la activación de h-ERG son afectadas por las
modificaciones estructurales, tan sólo permite identificar regiones proteicas implicadas en el
proceso global de apertura y cierre. Es importante asimismo considerar que se está
estudiando un proceso dependiente de voltaje y, por ello, la velocidad del mismo estará
directamente relacionada con la cantidad de energía (potencial electroquímico) que lo dirige.
Por tanto, hay que asegurarse que las diferencias en las tasas de apertura y cierre no son
sólo una consecuencia de los desplazamientos en la dependencia de voltaje,
comparándolas a una energía equivalente.
En lo referente al dominio proximal del extremo amino de h-ERG, nuestro grupo había
demostrado su papel modulador sobre el proceso de apertura, no considerando relevante en
ese momento su participación en el cierre del canal (Viloria et al., 2000). Sin embargo, en
este trabajo de Tesis, hemos observado una clara aceleración del cierre en canales carentes
de dominio proximal, cuando se compensan las tasas de cierre por la diferencia en el
potencial electroquímico. Es importante hacer el tratamiento de los datos con precaución, ya
que al compensar la cinética de cierre por la energía que dirige la activación, se asume que
el proceso de cierre es una reversión del de apertura con idénticas transiciones en ambos
sentidos, suponiendo entonces que el cierre está acoplado al movimiento del sensor de
voltaje, lo que es una cuestión aún controvertida. Así pues, las constantes de tiempo de
cierre se deberían de corregir por los valores de z g y V1/2 de activación, solamente si el cierre
está acoplado a los cambios conformaciones del VSD. Teniendo en cuenta que las
alteraciones detectadas en la activación y en el cierre se producen al modificar el dominio
 Discusión -117

proximal y la región inicial N-terminal, respectivamente, esto parece indicar que ambos
procesos no son una simple reversión uno del otro, ya que están determinados por dominios
proteicos diferentes. De cualquier forma, y dado que se producen alteraciones comunes
sobre la apertura y sobre el cierre al modificar ambos dominios del extremo amino, se podría
especular que tanto la apertura como el cierre son procesos relacionados, acoplados a
reorganizaciones estructurales en el sensor de voltaje, a pesar de que pueden estar
ampliamente influenciados por otras regiones de la proteína.
Nuestro análisis cinético y termodinámico bajo condiciones de equilibrio, aporta una
información muy importante para identificar las regiones del canal que participan en la
maquinaria de apertura/cierre, permitiendo conocer la estabilidad relativa de los estados
conformacionales del canal bajo diferentes condiciones. Se observa, por ejemplo, que las
variantes de h-ERG con modificaciones en la región inicial del extremo amino, presentan un
desplazamiento de las curvas I/V de estado estacionario hacia potenciales positivos. Como
consecuencia, estos canales se caracterizan por un valor de
G0 menos negativo, indicando
un desplazamiento del equilibrio conformacional hacia los estados de cerrado. Por el
contrario, la variante carente de dominio proximal presenta valores de V1/2 y de
G0 mucho
más negativos, indicando que el equilibrio está desplazado en sentido contrario, esto es,
hacia los estados de abierto. De cualquier forma, cuando se tienen en cuenta en ambos
tipos de canales, las diferencias en el potencial electroquímico [i.e. -(
G0-z gEF) o las
diferencias energéticas entre los estados abierto y cerrado], se observa en ambos casos una
clara aceleración de la velocidad de apertura. Esto sugiere que ambas regiones del extremo
amino contribuyen a una serie de interacciones químicas específicas implicadas en la
elevación de la barrera energética de activación (
G‡), es decir, de la energía necesaria
para alcanzar el estado de transición entre las conformaciones de abierto y cerrado.

Se ha descrito que los efectos moduladores del dominio proximal sobre la apertura de
h-ERG, se deben a la secuencia de aminoácidos básicos 362-366 (Saenen et al., 2006), y a
su influencia electrostática sobre la maquinaria de apertura/cierre del canal. A pesar de ello,
permanece por esclarecer si estas interacciones electrostáticas se dan de forma directa con
las estructuras que dirigen la apertura y el cierre (e.g. el VSD, el lazo S4-S5 o la “compuerta”
de la hélice S6), o de una forma indirecta mediante alguna estructura intermediaria (e.g. el
dominio eag/PAS). De acuerdo con nuestros resultados, tanto en los canales sin dominio
proximal como en los carentes de todo el extremo amino, se produce una facilitación similar
de la apertura para valores equivalentes de potencial electroquímico. Teniendo en cuenta
que los efectos que dichas alteraciones ejercen sobre las tasas de activación y cierre son
similares y no aditivos (ver características de
2-370; Figuras 7C y 8C), se podría especular
con la necesidad de una correcta ubicación del dominio eag/PAS (especialmente de los
primeros 16 residuos) respecto al cuerpo central del canal, no sólo para un cierre normal,
sino también para la activación. Como consecuencia, la organización estructural del extremo
amino propiciaría la adecuada orientación del dominio eag/PAS hacia el cuerpo central del
canal. De esta forma, si se altera dicha organización, se afectaría la correcta colocación de
la región inicial y, con ello, se modificarían las características de activación del canal. Esto
podría explicar el efecto dominante de la deleción de los 16 primeros residuos del extremo
amino frente a la eliminación del dominio proximal. Así, el desplazamiento de la
dependencia de voltaje hacia valores negativos del canal
138-373, es revertido cuando se
118- Discusión

eliminan ambas regiones, el dominio proximal y la porción inicial del extremo amino. De ahí
que se observe una dependencia de voltaje de activación similar en las variantes
2-16,

2-135 y
2-370. Es decir, al eliminar el dominio proximal se produce un desplazamiento
negativo de la dependencia de voltaje sólo si se conservan los 16 primeros aminoácidos de
la proteína. De esta forma, al eliminar el extremo amino al completo (i.e. variante
2-370) y,
por ello, el dominio proximal y los 16 primeros aminoácidos, se produce un desplazamiento
de la dependencia de voltaje hacia potenciales positivos, que es similar al producido cuando
se eliminan tan sólo estos primeros 16 residuos o todo el dominio eag/PAS.
Como ya se ha indicado, hace tiempo que se propone que la lenta cinética de cierre de
h-ERG se debe a una interacción de la región inicial del extremo amino con el lazo S4-S5
(Morais-Cabral et al., 1998; Wang et al., 1998; Chen et al., 1999; Sanguinetti & Xu, 1999;
Gómez-Varela et al., 2002). Dicho lazo también se ha propuesto como el elemento de
acoplamiento mecánico entre el movimiento del VSD en respuesta a cambios en el voltaje y
la maquinaria de apertura/cierre en el dominio poro (Sanguinetti & Xu,, 1999; Tristani-Firouzi
et al., 2002; Piper et al., 2005; Ferrer et al., 2006). Asumiendo que exista una interacción
física entre el inicio del extremo amino y el lazo S4-S5, que pueda ser importante para
modular el proceso de activación y cierre, se podría esperar que la alteración de cualquiera
de ambas regiones produjese efectos análogos sobre las propiedades del canal. Además,
también se esperaría que dichos efectos no fuesen aditivos. Aunque algunas de las
propiedades en estado estacionario de los mutantes del lazo S4-S5 dependen de la posición
que ocupe el residuo mutado, se observan claros desplazamientos positivos en la
dependencia de voltaje del estado estacionario en los mutantes D540C, Y542C, E544C e
Y545C. Como consecuencia, se obtiene un valor de
G0 menos negativo respecto al canal
nativo, indicando que el equilibrio conformacional está desplazado hacia los estados de
cerrado. También es común a estos cuatro mutantes la notable aceleración que muestran
tanto en la cinética de activación como en la de cierre. Dado que estas características
también aparecen en las variantes con modificaciones en la región inicial del extremo amino,
parece que realmente existe una correspondencia entre el efecto de las modificaciones
aminoterminales y el de las mutaciones en el lazo S4-S5.
Adicionalmente, también se estudió el efecto de combinar mutaciones en el lazo S4-S5
con deleciones del extremo amino completo. Sorprendentemente, en todos los casos
estudiados (R541A/
2-370, Y542C/
2-370 y G546C/
2-370), el comportamiento de estos
canales doblemente modificados, no se corresponde con el de sus relativos mutantes
puntuales. En principio, si se asume que los efectos de las mutaciones en el lazo S4-S5 se
deben a un entorpecimiento del contacto físico entre éste y la región inicial aminoterminal,
no se esperaría que el efecto de las mutaciones puntuales fuese distinto con o sin extremo
amino. Estos datos no contribuyen a afianzar la idea de la existencia de interacciones entre
ambos dominios, sin embargo no contradicen necesariamente que dicha interacción pueda
existir, ya que es posible que las mutaciones del lazo S4-S5 no sean neutras, sino que
afecten por sí solas a la maquinaria de apertura/cierre, dado el supuesto papel del citado
lazo como elemento de acoplamiento entre el VSD y el dominio poro. Es necesario pues, ser
muy cauto en la interpretación de las características de estos canales respecto a la
existencia de interacciones entre ambos dominios citoplasmáticos.
En base a lo anteriormente mencionado, sería razonable pensar que, para mantener
las propiedades de activación de h-ERG, es importante preservar una organización
 Discusión -119

adecuada de todo el extremo amino, que permita una correcta orientación de su porción
inicial respecto al cuerpo central del canal. Así, podríamos pensar que al eliminar el dominio
proximal se produce una reorganización del todo el extremo amino, que reposiciona su
región inicial hacia el cuerpo central del canal, facilitando su apertura; una hipótesis que ya
se ha propuesto en anteriores trabajos (Viloria et al., 2000; Gómez-Varela et al., 2002).
Asumiendo pues que la región inicial N-terminal ha de tener un posicionamiento adecuado
para su interacción con el lazo S4-S5, es posible que la alteración del lazo entorpezca la
interacción entre ambos dominios. Esto podría explicar de nuevo porqué el desplazamiento
de la dependencia de voltaje de activación del canal
138-373, carente de dominio proximal,
va en sentido contrario al que muestran los canales
2-16,
2-135 y
3-370. Para validar
esta posibilidad, se estudiaron también las características de las mutaciones del lazo S4-S5
pero, en este caso, en canales carentes del dominio proximal (datos no mostrados). De
nuevo, y a pesar de que en ciertos mutantes y en determinados parámetros, parece haber
un efecto dominante de la deleción frente a la mutación, en otros casos, se da el fenómeno
contrario o el efecto es nulo. Por tanto, al igual que en el caso de los mutantes carentes del
extremo amino completo, las características de los canales doblemente modificados en el
dominio proximal y el lazo S4-S5 son distintas a las de los canales modificados, bien por
mutación o por deleción. Esto confirma la idea de que las mutaciones en el lazo S4-S5
alteran la maquinaria de apertura/cierre de h-ERG por sí mismas, si bien la facilitación de la
apertura producida al eliminar el dominio proximal domina, en algunos casos, sobre las
mutaciones en el lazo S4-S5.
Un caso particularmente interesante es el comportamiento de los mutantes D540C e
Y542C. En ambos, aparte de los cambios en su cinética de apertura, también se observa
una notable reducción del valor de zg, obteniéndose un perfil energético casi plano en la
activación de estos canales mutantes. Este perfil se caracteriza no sólo por una escasa
tendencia termodinámica a producirse la transición de cerrado a abierto, en ausencia de un
campo eléctrico aplicado (i.e.,
G0 ~ 0), sino también por una baja energía de activación
(i.e. un reducido valor de
G‡ del estado de transición entre los estados cerrado y abierto).
Además, el canal mutante D540C presenta una dependencia de voltaje muy reducida en sus
tasas de activación. Esto concuerda con un trabajo anterior en el que se mostraba cómo al
neutralizar la carga negativa en la posición 540 de h-ERG, aparece un gran componente de
“corrientes de compuerta” a potenciales negativos a los cuales el canal aún no conduce
corriente (Piper et al., 2005), es decir, se produce un desplazamiento de las curvas de
activación hacia potenciales negativos en lo que respecta a la relación Q/V (carga movida
frente a voltaje del pulso despolarizante) y hacia potenciales positivos en la relación G/V
(conductancia frente a voltaje, equivalente a las curvas I/V). Junto con nuestros resultados
respecto a las variaciones en los parámetros de activación y cierre, todo ello sugiere que la
mutación D540C hace que el movimiento del VSD se desacople de la apertura del canal
iónico en el dominio poro. Este fenómeno de desacoplamiento también se ha descrito en
varios trabajos con el canal Shaker, mutado en diferentes regiones de la proteína: la hélice
S4 (Ledwell & Aldrich, 1999; Pathak et al., 2005), el lazo S4-S5 (Schoppa & Sigworth, 1998)
y el extremo de la hélice S6 (Ding & Horn, 2003). En este último caso, parece que el
movimiento del sensor de voltaje es incapaz de acoplarse a la apertura de la “compuerta”.
La explicación de ello supone que al mutar el final de la hélice S6 que constituye la
“compuerta”, ésta se aleja del lazo S4-S5, permitiendo un movimiento más fácil de la hélice
120- Discusión

S4 (o de todo el VSD), favoreciendo la fácil traslocación de sus “cargas de compuerta”

asociadas y sin que se abra la vía de permeación (Ding & Horn, 2003). Notablemente, en
algunos trabajos con h-ERG, se ha reforzado la idea de una interacción directa entre el final
de la hélice S6 y el inicio del lazo S4-S5, especialmente en el residuo 540 (Tristani-Firouzi et
al., 2002; Ferrer et al., 2006). Nótese asimismo que el desacoplamiento entre el sensor y la
compuerta, se refleja de forma diferente en Shaker y en h-ERG. Así, mientras en el primero
dicho desacoplamiento se traduce en una ralentización de la apertura, en caso del mutante
D540C de h-ERG, se induce una aceleración de la apertura del canal. Es posible que en
Shaker tal desacoplamiento estabilice un estado de cerrado, independiente del movimiento
del VSD (Yifrach & MacKinnon, 2002), mientras que, por el contrario, en h-ERG, el
desacoplamiento sensor/compuerta desestabilizaría el estado de cerrado frente a los de
abierto. Esto concuerda con un trabajo reciente en el que se ha descrito que la estabilización
de una posible interacción entre los residuos 540 y R665 ó L666 del final de la hélice S6,
mantiene la “compuerta” de h-ERG en una conformación cerrada (Ferrer et al., 2006).

En resumen, los resultados correspondientes a esta primera sección indican que en la

maquinaria de apertura y cierre de h-ERG participan no sólo dominios proteicos situados en
el cuerpo central del canal, como el sensor de voltaje o la compuerta, sino otras estructuras
citoplasmáticas como la porción inicial aminoterminal o el dominio proximal. Mientras los
efectos de la región inicial del extremo amino sobre el cierre de h-ERG ya habían sido
considerados previamente, no se había descrito ningún papel de esta porción inicial en el
proceso de activación. Tras un análisis cuidadoso de las propiedades biofísicas del canal en
estado estacionario, hemos obtenido un valor de V1/2 en condiciones de equilibrio, a partir
del cual hemos podido corregir las tasas de activación (y cierre) de las diferentes
construcciones según la diferencia en el potencial electroquímico que dirige el proceso. Este
aspecto ha sido obviado sistemáticamente en trabajos anteriores y, por ello, se ha
subestimado el efecto modulador de las regiones aminoterminales y el lazo S4-S5 de h-ERG
sobre el equilibrio conformacional entre los estados de abierto y de cerrado, así como de la
barrera energética entre ambos.
Si bien se ha propuesto que la particularmente lenta cinética de apertura y cierre de
h-ERG, se debe a un lento movimiento del segmento S4 del VSD a través del campo
eléctrico transmembranal (Smith & Yellen, 2002; Piper et al., 2003; Subbiah et al., 2004), la
razón de ello es aún desconocida. Nuestros datos indican que, bien por ralentizar el
movimiento del sensor, o bien al retrasar o enlentecer el acoplamiento de dicho movimiento
a la apertura de la compuerta, los dominios citoplasmáticos de h-ERG pueden modular las
propiedades de activación y cierre. Aunque serían necesarios más experimentos para
dilucidar las relaciones entras las distintas regiones de la proteína, es probable que una
interacción física entre el extremo amino y la parte citoplasmática de la hélice S4 o el lazo
S4-S5, pueda desempeñar un papel crucial en estos procesos. De hecho, un mecanismo de
este tipo, podría ser un factor determinante del lento movimiento del segmento S4 y de la
lenta transducción del mismo hasta la “compuerta” de acceso al poro iónico en el final de la
hélice S6, un proceso en el que el lazo S4-S5 estaría directamente implicado. Otros
resultados que aportan más pistas sobre la existencia de una contacto físico entre la región
inicial del extremo amino y el lazo S4-S5, y su posible contribución al control del mecanismo
de apertura/cierre de h-ERG, son comentados a continuación.
 Discusión -121

II. REGULACIÓN HORMONAL DE h-ERG POR TRH:

RELEVANCIA DE LOS DOMINIOS CITOPLASMÁTICOS DEL
CANAL

Como hemos indicado anteriormente, una de las características distintivas de h-ERG

frente al resto de canales Kv, CNG y HCN, es poseer un extremo amino considerablemente
largo, debido a la presencia de una región exclusiva de unos 400 aminoácidos, que separa
el dominio eag/PAS (común a todos los miembros de la familia eag) de la primera hélice
transmembranal S1 (Warmke & Ganetzky, 1994; Viloria et al., 2000). La eliminación seriada
de diferentes segmentos de este dominio proximal exclusivo, ocasiona una clara facilitación
de la apertura (Viloria et al., 2000; Gómez-Varela et al., 2002). Un trabajo posterior permitió
determinar que el dominio proximal y, en particular, la región 326-345, constituye además un
determinante esencial de la regulación hormonal de la activación de h-ERG por la TRH
(Gómez-Varela et al., 2003a).

Con el fin de delimitar aún más la región del dominio proximal esencial para que tenga
lugar la regulación por TRH de la activación de h-ERG, hemos generado una nueva
construcción con una deleción intermedia entre las de los canales
326-373 y
345-373, en
la que se ha eliminado la región 333-373. Al estudiar el comportamiento de esta variante
frente al tratamiento hormonal, se comprobó que presentaba el mismo comportamiento que
el canal nativo. Teniendo en cuenta que al aumentar el tamaño de la deleción en otros 7
residuos en la variante
326-373 (respecto al canal
333-373) se pierden los efectos
reguladores de la TRH, se consideró que la secuencia 326-332 era imprescindible para la
regulación hormonal de la apertura del canal. La secuencia 326-332 (RYRTISK) contiene
varios consensos para modificación covalente y/o unión de segundos mensajeros,
albergando varios sitios de fosforilación para diferentes proteín quinasas y para la unión de
proteínas de familia 14-3-3 o de fosfatidil inositol-4,5-bisfosfato (PIP2), todos los cuales ya
habían sido propuesto como agentes moduladores de las corrientes ERG (Kiehn et al.,
1998; Heath & Terrar, 2000; Kiehn 2000; Thomas et al., 1999, 2003; Cui et al., 2000, 2001;
Bian et al., 2001, 2004; Cayabyab et al., 2002; Cayabyab & Schlichter, 2002; Kagan et al.,
2002; Zhang et al., 2003; Bian & McDonald, 2007; Cockerill et al., 2007; Li et al., 2008;
Zhang et al., 2008). Sin embargo, sorprendentemente, al eliminar en el segmento 326-332
mediante mutagénesis dirigida (de forma individual o combinada) los sitios susceptibles de
ser fosforilados, no se produjo ninguna modificación de los efectos hormonales de la TRH
sobre la actividad del canal. Además, al substituir las argininas 326 y 328, cuyas cargas
positivas podrían ser determinantes para la unión de PIP2, además de fundamentales para
la unión de proteínas de la familia 14-3-3, tampoco se observaron diferencias en la
regulación hormonal respecto al canal nativo. Estos resultados demuestran que la pérdida
de los efectos hormonales observada al incrementar el tamaño de la deleción (retirando
desde el residuo 333 hasta el 326), no se debe a la eliminación de la secuencia diana para
algún agente regulador.
122- Discusión

No obstante, los datos parecen indicar que la supresión de los efectos hormonales se
relaciona con el tamaño de la deleción del dominio proximal, que ocasiona alguna
modificación estructural en el extremo amino de h-ERG. Esta indicación está claramente
respaldada por el hecho de que las variantes de h-ERG en las que se elimina la secuencia
RYRTISK y sus alrededores (canal
326-341), o en las que se substituye por otra secuencia
no relacionada con la nativa (canales 326-341/SubA y 326-341/SubB), presentan una
regulación hormonal totalmente normal.
Una vez demostrada la irrelevancia de la secuencia 326-332 (RYRTISK) de h-ERG
para su regulación hormonal por TRH, nos planteamos la posibilidad de que los canales no
regulados fuesen aquellos en los que las alteraciones estructurales modifican per se los
parámetros cinéticos del canal. Este podría ser el caso de las variantes en las que se ha
eliminado desde el segmento 326-373 hasta la totalidad del dominio proximal, las cuales
presentan una alteración de las propiedades de apertura que podría explicar su incapacidad
para ser reguladas por la hormona. Así, se podría explicar la ausencia de regulación
hormonal de la apertura en las variantes
326-373,
284-373,
223-373 y
138-373, las
cuales presentan una activación marcadamente acelerada y una dependencia de voltaje
claramente desplazada hacia potenciales negativos (Viloria et al., 2000; Gómez-Varela et
al., 2003a). Esta hipótesis también sería coherente con el hecho de que el control hormonal
de la activación en el canal
333-373 sea normal, teniendo en cuenta que en este canal la
apertura está sólo ligeramente ralentizada y con un pequeño desplazamiento de la curva I/V
hacia potenciales positivos. También se podría explicar así la ausencia de regulación sobre
el componente rápido de cierre en el canal
2-135, en el cual el cierre ya está basal
acelerado.
Sin embargo, este razonamiento no es en absoluto válido para los canales
345-373 y

355-373, que también muestran una marcada facilitación de la apertura, acelerada y con
un prominente desplazamiento de la dependencia de voltaje hacia potenciales negativos,
pero que son regulados normalmente por la TRH (Gómez-Varela et al., 2003a). Tampoco
resulta válido en el caso del canal
155-209, que presentando unos parámetros de
activación similares a los del canal nativo, muestra unos efectos hormonales de la TRH muy
reducidos. No parece existir pues una relación entre la modificación cinética inducida por
una alteración estructural, y el hecho de que del canal no pueda ser regulado. Para
demostrar que la citada relación no existe, está el caso de los mutantes en el lazo
intracelular S4-S5. En primer lugar, ninguno de estos canales mutantes presenta una
modificación de los parámetros de activación semejante a la encontrada en las deleciones
del dominio proximal (i.e. facilitación de la apertura) y, sin embargo, los canales con
mutaciones en la porción inicial del lazo S4-S5 presentan una regulación hormonal de la
activación nula o muy reducida. En segundo lugar, a pesar de que el mutante Y542C y,
sobre todo, el D540C, presentan una notable alteración de la activación (desplazamiento de
la curva I/V hacia potenciales positivos así como un decremento en su pendiente), apenas
son modulados por la TRH. Tampoco lo son los mutantes R541H y R541A, los cuales
presentan una apertura muy similar a la del canal nativo. Una aparente excepción a la
independencia entre la alteración basal y ausencia de regulación hormonal se observa en la
modulación del componente rápido de cierre, ya que todos los mutantes que lo presentan
basalmente acelerado, se caracterizan por una regulación hormonal nula, o marcadamente
 Discusión -123

reducida (D540C, Y542C, R541A/H, E544C é Y545C). Nótese sin embargo que, al contrario
de lo que ocurre con la aceleración basal de la apertura, que puede compensarse midiendo
las tasas a potenciales para los cuales la velocidad es comparable a la del canal nativo, para
analizar la velocidad de cierre tras la adición de TRH, es necesario estimarla a potenciales
negativos para los cuales la contaminación residual de las corrientes de cloro activadas por
la hormona es nula. Como consecuencia, las velocidades de cierre se comparan para el
mismo voltaje sin compensar las diferencias en la aceleración basal que presenten los
canales mutantes respecto al canal nativo. Esto complica el poder distinguir claramente si la
ausencia de regulación sobre el cierre de estos canales se debe a la aceleración basal de
este proceso, o a la alteración del control hormonal.
Una interpretación alternativa a las expuestas hasta ahora para nuestros resultados,
sería que la ausencia de control hormonal fuese debida a que los canales presentan
alteraciones estructurales que provocan la desestabilización de algún dominio citoplasmático
y/o su orientación respecto a la maquinaria de apertura y cierre del canal. Los resultados
obtenidos con el canal
155-209 respaldarían esta hipótesis, ya que dicho canal, con una
deleción de un tamaño semejante a la del canal
326-373 (55 aminoácidos para la primera y
48 para la segunda) y situada en el extremo opuesto del dominio proximal, muestra unos
efectos de la TRH sobre la activación también muy reducidos.
Por su parte, los efectos hormonales sobre la apertura del canal
2-135, que carece
del dominio eag/PAS, son normales respecto a los observados en el canal nativo. Estos
resultados apuntan a que sólo las modificaciones en el dominio proximal, y no en el dominio
eag/PAS, perturban la regulación hormonal de la apertura de h-ERG. Como se expuso
anteriormente, debido a la aceleración del cierre que presenta esta variante carente de
extremo amino, es difícil comprobar si este proceso sigue siendo regulado por la TRH.
Por otro lado, algunos estudios recientes (Saenen et al., 2006) han enfatizado el papel
de la secuencia positivamente cargada 362-366 (KIKER) del dominio proximal en la cinética
de apertura de h-ERG. Al analizar si la secuencia KIKER era relevante para el control
hormonal de la apertura de h-ERG, comprobamos que, tras anular las cargas positivas de
esta secuencia mediante mutagénesis (KKR-A) o mediante la deleción
363-373, los
efectos hormonales de la TRH son similares a los del canal nativo.
Por último, al estudiar la regulación hormonal de la activación en canales con
mutaciones en el lazo S4-S5, se pudo comprobar que los efectos hormonales eran nulos o
marcadamente reducidos en aquellos mutantes en los que el residuo modificado se
localizaba en la porción N-terminal del citado lazo. Esta reducción de los efectos hormonales
se produce no sólo en mutantes que presentan alterado el proceso de apertura (D540C é
Y542C), sino también en los canales en los que los parámetros de activación son similares a
los del canal nativo (R541H y R541A).

En resumen, el conjunto de nuestros resultados sugiere que, para que tenga lugar la
regulación hormonal de la activación de h-ERG, es necesario tanto una correcta
organización de la estructura de los dominios del extremo amino, como un posicionamiento
adecuado de éstos respecto al cuerpo central del canal. Además, nuestros datos han
permitido identificar la región N-terminal del lazo S4-S5 como un determinante esencial para
la transmisión de los efectos reguladores de los receptores acoplados a la Fosfolipasa C,
desde los dominios citoplasmáticos hasta el cuerpo central del canal h-ERG.
124- Discusión

III. ESTUDIO DE INTERACCIONES INTRAMOLECULARES

EN EL CANAL h-ERG

Como se ha venido indicando a lo largo de esta sección, los resultados de este trabajo
nos llevan a proponer la existencia en h-ERG de interacciones entre la región inicial del
extremo amino y el lazo intracelular S4-S5, que son fundamentales para el normal
funcionamiento del mecanismo de apertura y cierre. Además, el mantenimiento de la
organización de los dominios aminoterminales parece conllevar una orientación y/o
posicionamiento del extremo amino hacia el cuerpo central del canal, a nivel del lazo S4-S5,
que es necesaria también para la regulación hormonal por la TRH. A pesar de ello, no se
han aportado pruebas directas de la existencia de tales interacciones entre el inicio del
extremo amino y el lazo S4-S5.
Como se ha indicado anteriormente, se ha postulado que la aceleración del cierre de
h-ERG al disminuir el pH extracelular, se debe a la protonación de residuos cargados
negativamente de la región S1-S3, los cuales establecerían interacciones electrostáticas con
residuos de arginina de la hélice S4. El mantenimiento de dichos puentes salinos se vería
favorecido por una interacción proteína-proteína entre el dominio eag/PAS del extremo
amino y el lazo intracelular S4-S5, presumiblemente constituyendo un “interruptor molecular”
que controla la cinética de cierre del canal (Jiang et al., 1999; Liu et al., 2003). En base a
este postulado, en este trabajo, para estudiar de una forma indirecta dichas interacciones,
nos planteamos analizar las contribuciones relativas del extremo amino (particularmente del
dominio eag/PAS y del dominio proximal) y del lazo S4-S5 de h-ERG, a la aceleración del
proceso de cierre que induce la acidificación extracelular.

Cuando estudiamos la aceleración del cierre inducida por la acidificación extracelular

en canales con deleciones en diferentes dominios del extremo amino, observamos que ésta
no se produce en canales carentes tanto de los primeros 16 aminoácidos del extremo
amino, como del dominio proximal o del extremo amino completo. Estos datos extienden
resultados previos que mostraron la total ausencia de aceleración del cierre al disminuir el
pH, en canales h-ERG a los que se les había eliminado el extremo amino completo (Jiang et
al., 1999). Nuestros resultados también demuestran que, tanto al eliminar los primeros 16
residuos aminoterminales como al mutar la región 540-542 del lazo intracelular S4-S5, se
produce una notable reducción en la aceleración del cierre, inducida por la acidificación
extracelular. Esta analogía entre ambas alteraciones estructurales en su comportamiento
frente a la acidificación extracelular, sugiere de nuevo la existencia de una interacción entre
ambas regiones intracelulares del canal. De este modo, los resultados obtenidos, no sólo
afianzan la idea del papel esencial del extremo amino en la modulación del cierre por
cambios en el pH externo, sino que también refuerza la hipótesis de la existencia de
interacciones entre el región inicial del extremo amino y el VSD o el dominio poro.
Aparte de los prominentes efectos que ejerce sobre el cierre de h-ERG, la acidificación
extracelular también se ha observado que ocasiona un ligero desplazamiento de la
dependencia voltaje de activación. Se ha propuesto que dicho desplazamiento es debido a
una influencia dual sobre el canal a dos niveles: a) a través de un cambio en la carga local
superficial de la membrana, y b) por una interrupción de la repulsión electrostática entre el
 Discusión -125

aspartato 411 y una carga negativa cercana, que desestabiliza la(s) conformación(es) de
cerrado. Como resultado, al disminuir el pH, se favorecería la activación del canal, al
producirse un desplazamiento de la dependencia de voltaje hacia potenciales negativos y,
quizá, también al acelerarse la apertura (Liu et al., 2003). A este respecto, nuestros
resultados sugieren que el efecto de la acidificación sobre la apertura es únicamente
resultado de la modificación de la carga superficial. Así, se obtienen desplazamientos de las
curvas I/V similares en todos los canales, tanto en el nativo como en aquellos con
modificaciones aminoterminales o en el lazo S4-S5. Además, el desplazamiento en el V1/2 al
disminuir el pH externo, es equivalente en el canal nativo y en la variante sin dominio
proximal, la cual muestra una fuerte desestabilización de los estados de cerrado, con un
marcado desplazamiento de su dependencia de voltaje de activación hacia potenciales
negativos, y una notable aceleración basal de la velocidad de apertura (ver apartado I de
Resultados; Viloria et al., 2000; Gómez-Varela et al., 2002).

Estos estudios acerca de la modulación por el pH extracelular, pueden tener cierta

relevancia fisiopatológica, ya que existen muchas circunstancias que pueden derivar en una
acidificación del miocardio. Así, se ha descrito una acidosis local equivalente a la reducción
del pH extracelular de 7.5 a 6.5, que nosotros hemos utilizado, en patologías como la
isquemia cardiaca (Yan & Kléber, 1992; Marzouk et al., 2002) o en las arritmias, así como
por la acción de fármacos antiarrítmicos (Orchard & Cingolani, 1994; Lin et al., 2005).
Además, aparte de la reconocida relevancia de h-ERG en el ventrículo, la modulación del
cierre por la acidificación extracelular puede determinar la tasa de la repolarización diastólica
en el nódulo sinoatrial, ya que el cierre de canales K+ es un factor crucial de la actividad
eléctrica de las células marcapasos (Anumonwo et al., 1999) y en ellas se ha descrito una
abundante expresión del h-ERG (Wymore et al., 1997; Scharm et al., 2002).

Como resumen de los resultados obtenidos al estudiar el comportamiento de las

diferentes variantes de h-ERG frente a la acidificación extracelular, se puede concluir que
existe una analogía en los efectos causados por las deleciones del extremo amino y por la
mutación del lazo S4-S5, apoyando de nuevo la hipótesis de una interacción entre ambas
regiones intracelulares. Además, nuestros datos sugieren que los determinantes
moleculares de dicha interacción se encuentran localizados, fundamentalmente, en los
primeros 16 residuos del extremo amino y la porción N-terminal del lazo S4-S5 (residuos
540-542).

La hipótesis de la existencia de interacciones entre el extremo amino de h-ERG

(básicamente el dominio eag/PAS) y el lazo S4-S5, se ha apoyado en una serie de datos
cinéticos previos, incluidos los procedentes de nuestro laboratorio, pero siempre de una
forma indirecta. Más recientemente y de nuevo de forma indirecta, hemos obtenido una serie
de datos, coherentes con dicha hipótesis, utilizando la técnica de FRET para calcular
distancias entre parejas de fluoróforos insertados en distintas posiciones de h-ERG. Con
estas medidas, se ha elaborado un modelo de la arquitectura molecular global de los
dominios intracelulares de h-ERG, en el que se propone que el dominio eag/PAS podría
situarse alrededor del denominado “C-linker” del extremo carboxilo, justo debajo del cuerpo
126- Discusión

central del canal y muy cercano tanto al lazo S4-S5 como a la “compuerta” limitada por la
parte final de la hélice S6 (Miranda & Manso et al., 2008).
Desafortunadamente, aunque muy sugerentes, todos estos datos no han aportado una
prueba directa de la existencia de una interacción física entre el extremo amino y el lazo
S4-S5. En un trabajo relativamente reciente (Ferrer et al., 2006), se ha indicado que entre el
residuo 540 del lazo S4-S5 y los residuos 665/666 del extremo de la hélice S6, existe una
proximidad suficiente como para que entre ellos se formen puentes disulfuro, tras introducir
en estas posiciones cisteínas y añadir un agente oxidante. Basándonos en este tipo de
abordaje experimental, nos planteamos el estudio de la proximidad espacial entre los
primeros residuos del extremo amino y en la región N-terminal del lazo S4-S5 de h-ERG,
mediante la introducción en esas regiones de cisteínas y la formación de puentes disulfuro
por oxidación con tert-butilhidroperóxido (tbHO2). Es previsible que, en el caso de que estos
enlaces covalentes se formen entre dos puntos cuya interacción dinámica sea esencial para
la actividad del canal, se produzca alguna alteración funcional medible, como, por ejemplo,
la eliminación de las corrientes mediadas por el canal (Ferrer et al., 2006).
Nuestros resultados demuestran que al introducir por mutagénesis dos cisteínas en la
posición 3 (V3) del extremo amino y en el residuo 542 (Y542) del S4-S5, la adición del
agente oxidante tbHO2 a oocitos que expresan el doble mutante V3C/Y542C, provoca una
rápida disminución de las corrientes h-ERG. Esta eliminación de la corriente es
prácticamente nula en el canal h-ERG nativo. Además, el curso temporal de la disminución
de la corriente sigue una cinética biexponencial con un marcado y predominante
componente rápido inicial. Esta rápida cinética es totalmente coherente con una reacción de
formación de puentes disulfuro, la cual se produce a una tasa extremadamente rápida
cuando dos cisteínas se encuentran a la distancia y orientación adecuadas, y son sometidas
a condiciones oxidantes, debido al aumento de la probabilidad de colisión entre los grupos
sulfhidrilo y a la reactividad de los mismos (revisado por Bass et al., 2007). Así pues, dadas
las restrictivas condiciones necesarias para favorecer la formación de puentes disulfuro, los
resultados obtenidos con el doble mutante V3C/Y542C indican que entre estas dos cisteínas
existe una gran proximidad, y que sus cadenas laterales están orientadas en un ángulo
correcto como para que se formen dichos enlaces covalentes.
Es importante indicar que cuando se introducen cisteínas aisladamente en las
posiciones 3 ó 542 de h-ERG, también se produce una reducción de las corrientes por
efecto del oxidante tbHO2. Sin embargo, dicha inhibición es mucho menos marcada y no
ocurre de forma tan rápida como en el doble mutante, ajustándose básicamente a una
ecuación monoexponencial con una lenta constante de tiempo. Mientras la rápida cinética
del doble mutante es una buena indicación de la formación de un puente disulfuro, la lenta
tasa exhibida por los mutantes sencillos resulta más difícil de interpretar. Así, cuando el
grupo sulfhidrilo (-SH) de la cadena lateral de una cisteína se somete a condiciones
oxidantes, da lugar a un derivado reactivo del tipo tiolato (-S-). Si dos de estos grupos se
encuentran a una distancia de menos de 4.6 Å entre sus respectivos carbonos
,
presentando además la orientación angular adecuada, podrían formar puentes disulfuro
entre ambos (revisado por Bass et al., 2007). No obstante, si se mantienen las condiciones
oxidantes en el tiempo, y debido a las fluctuaciones térmicas que puede experimentar el
esqueleto hidrocarbonato de la proteína, dos cisteínas separadas una mayor distancia (de
incluso 15 Å) pueden llegar a colisionar en su forma reactiva y establecer puentes disulfuro,
 Discusión -127

aunque de forma mucho más lenta (revisado por Bass et al., 2007). Así, el efecto del agente
oxidante sobre los mutantes individuales V3C e Y542C, se podrían explicar por la formación
de derivados reactivos tipo tiolato en sus cadenas laterales que no son capaces de formar
puentes disulfuro rápidamente con otros próximos, pero que, con el tiempo y debido a las
fluctuaciones de la proteína, podrían acabar formándolos, produciendo la inhibición de la
corriente de cola. Esto explicaría la lenta cinética monoexponencial de caída de las
corrientes de los canales V3C e Y542C, así como la presencia del componente lento,
minoritario, en la caída biexponencial del mutante doble V3C/Y542C. De hecho, es posible
que en este mutante doble V3C/Y542C, la adición del tbHO2 podría ocasionar que en la gran
mayoría de canales se formasen puentes disulfuro entre las posiciones 3 y 542, mientras
que en una pequeña población, se podrían formar puentes disulfuro alternativos de cada
cisteína con otras próximas. Así, podría existir cierto grado de competencia entre la rápida
formación de puentes disulfuro entre el par 3 y 542, favorecida por su proximidad, y la lenta
reacción de formación de puentes disulfuro alternativos, dando lugar al componente rápido y
lento de caída de la corriente, respectivamente.

Una indicación muy sólida de la formación de puentes disulfuro, es su reversión al

añadir un medio reductor con ditiotreitol (DTT), el cual tiene un bajo potencial de óxido-
reducción (i.e. alto potencial de reducción-oxidación), que le hace capaz de reducir
completamente ese tipo de enlaces (Zahler & Cleland, 1968). Este es el caso del doble
mutante V3C/Y542C tras el tratamiento con el tbHO2, cuyo componente rápido de inhibición
es revertido muy eficientemente por el DTT. No obstante, el DTT también es capaz de
revertir el lento efecto del agente oxidante sobre el mutante sencillo V3C. Es posible que, al
mantener las condiciones oxidantes, la cisteína en posición 3 pueda establecer puentes
disulfuro con otras cisteínas reactivas, al aproximarse ambas debido a las fluctuaciones
térmicas del esqueleto hidrocarbonado de la proteína. Esto explicaría la lenta cinética de
oxidación del mutante V3C y la reversión del efecto por el agente reductor. También
explicaría un cierto nivel de competición en el doble mutante con la rápida formación del
puente entre las cisteínas 3 y 542.
Por último, el hecho de que el efecto, también lento, del oxidante sobre el mutante
sencillo Y542C no sea revertido por el DTT, aporta una interpretación adicional a los
resultados del doble mutante V3C/Y542C. Esta ausencia de reversión en el caso del canal
Y542C se puede explicar por la formación de derivados sulfónicos (-SO3-) o sulfénicos (-SO-)
en las cadenas laterales de las cisteínas (revisado por Bass et al., 2007), que debido a su
elevado grado de oxidación, no son reducidos por el DTT. Así, la formación del derivado
oxidado de la cisteína 542 ocasionaría la lenta inhibición de la corriente de cola en el
mutante sencillo, lo que también podría competir con la rápida inhibición debida formación
de puentes disulfuro entre los residuos 3 y 542 en el doble mutante. Es probable que la
estratégica posición del residuo Y542C en el lazo S4-S5, encargado de acoplar los cambios
conformacionales de la proteína a la apertura del poro, haga que su oxidación a estos
derivados sulfónicos o sulfénicos sea capaz de eliminar las corrientes del canal. Aunque
muy poco probable, tampoco se puede descartar completamente la posibilidad de una lenta
formación de un puente disulfuro entre la cisteína 542 y otra cisteína endógena de canal. En
este caso, es difícil encontrar una explicación a la falta de reversión por el agente reductor,
128- Discusión

ya que una escasa accesibilidad de este puente disulfuro secundario al DTT es complicada
de conciliar con la clara accesibilidad mostrada al agente oxidante.
De las 23 cisteínas endógenos presentes en el canal h-ERG nativo, 5 se encuentran
repartidas entre el lazo extracelular S1-S2 y las hélices S5 y S6, insertadas en la membrana
plasmática, mientras que existen 18 cisteínas situadas en dominios intracelulares y que son
posibles candidatas para formar puentes disulfuro con las introducidas en las posiciones 3 y
542. Tras combinar la mutación V3C con la deleción
864-1010 y comprobar que los efectos
del agente oxidante y reductor eran análogos a los observados en el mutante sencillo V3C,
parece claro que la pareja de la cisteína 3 para formar un posible puente disulfuro
secundario no es ninguna de las 2 presentes en la región del extremo carboxilo eliminada.
Teniendo en cuenta que la inhibición de la corriente conlleva, en último término, un bloqueo
de la maquinaria de permeación en el cuerpo central del canal, podríamos pensar que el
efecto del oxidante sobre el canal V3C se debe a la lenta formación de un puente disulfuro
entre la cisteína 3 y alguna otra situada en la proximidad de la maquinaria de permeación,
para influir sobre ella. De esta forma, de las 16 restantes posibles cisteínas que se podrían
emparejar con la 3, las máximas candidatas podrían ser alguna de las 4 presentes en la
región que une el final de la hélice S6 con el dominio cNBD (“C-linker”). Aunque
indirectamente, esta idea estaría apoyada por el modelo, propuesto por nuestro laboratorio,
para la arquitectura de los dominios citoplasmáticos de h-ERG, que sitúa al dominio
eag/PAS rodeando al conjunto de hélices perpendiculares a la membrana que constituye el
“C-linker” del canal, de modo análogo a lo propuesto para otros canales (Miranda & Manso
et al., 2008).
También hemos comprobado que el efecto del oxidante y el reductor sobre la corriente
de los canales en los que la mutación Y542C se combina con la deleción del extremo
carboxilo
864-1010 o con la deleción del amino
2-370, es similar al producido sobre el
mutante sencillo Y542C. De esta manera, hemos podido descartar 12 cisteínas endógenas
de h-ERG como posibles parejas para la lenta formación de puentes disulfuro con la 542: las
2 eliminadas con la deleción
864-1010 y otras 10 eliminadas con la
2-370. Por tanto, de
las 18 posibles cisteínas endógenas del canal que pudieran ser candidatas para formar
puentes disulfuro, sólo quedarían 6 después de éste análisis. Dichas cisteínas se
encontrarían en el “C-linker” (4) y la región final del extremo carboxilo (2). Es interesante que
la irreversibilidad del efecto del oxidante por el DTT observada con el mutante sencillo
Y542C, también se observa en los mutantes combinados con las deleciones, indicando que
la falta de accesibilidad del agente reductor, o el alto grado de oxidación alcanzado por la
cisteína 542, es insensible a la eliminación de las citadas regiones amino y
caboxiloterminales. La escasa reversibilidad de la oxidación, junto con la lenta cinética de
caída de la corriente, apoyan la hipótesis de que en la cisteína 542, el grupo sulfhidrilo de la
cadena lateral, es oxidado a radicales sulfónicos o sulfénicos, con un estado de oxidación
que no puede ser revertido por el DTT.

Los resultados discutidos hasta el momento, sugieren que, en el mutante V3C, el

tratamiento con el oxidante ocasiona la formación de un puente disulfuro secundario con una
cisteína endógena del canal, probablemente localizada en el “C-linker”, debido a su
proximidad, a fluctuaciones térmicas de la proteína y al mantenimiento de las condiciones
oxidantes. En el mutante Y542C, por su parte, la presencia constante del tbHO2, haría que
 Discusión -129

se formen derivados sulfónicos y/o sulfénicos de la cisteína 542, que, por su alto grado de
oxidación, no son reducidos por el DTT. En ambos casos, los procesos siguen una cinética
que se ajusta a ecuaciones monoexponenciales con una lenta constante de tiempo. Por el
contrario, en el mutante doble V3C/Y542C, debido a la proximidad y orientación correcta de
las cisteínas 3 y 542, se establecen puentes disulfuro entre ambos residuos en un proceso
muy rápido que originaría la rápida caída de las corrientes de cola. Muy probablemente, las
reacciones lentas de formación de puentes disulfuro secundarios entre la cisteína 3 y otra(s)
endógena(s) del canal, así como de formación de derivados altamente oxidados de la
cisteína 542, competirían en alguna medida con la rápida reacción de formación de puentes
disulfuro entre las cisteínas 3 y 542, dando lugar al componente lento de caída de la
corriente del mutante doble V3C/Y542C.

Una prueba adicional que confirma el establecimiento de puentes disulfuro entre las
cisteínas 3 y 542, es la dependencia de estado de la inhibición de la corriente en el mutante
doble V3C/Y542C. Así, la cinética de caída de la corriente, cuando los canales se mantienen
basalmente abiertos, se ajusta a una ecuación biexponencial, con unas constantes de
tiempo mucho mayores que las obtenidas cuando los canales se mantienen basalmente
cerrados. Estos datos indican que la cisteína 3 y la 542 se encuentran mucho más próximas
y/o mejor orientadas para la formación de puentes disulfuro, cuando el canal se presenta
preferentemente en su conformación cerrada.
En un principio, la mayor eficiencia en la formación de los puentes disulfuro en el
estado cerrado, parece contradecir la hipótesis mantenida hasta el momento, que propone
que la interacción entre el extremo amino y el lazo S4-S5 contribuye a ralentizar el cierre de
h-ERG, o que la facilitación de la apertura al eliminar el dominio proximal, se debe a que se
favorece la interacción entre el dominio eag/PAS y el cuerpo central del canal (Viloria et al.,
2000). Sin embargo, la disposición exacta de los residuos implicados en la formación de los
puentes disulfuro, puede variar en los canales mutantes y/o con modificaciones estructurales
o cinéticas. Además, el hecho de que la máxima proximidad entre el inicio del extremo
amino y el lazo S4-S5 se produzca predominantemente en la conformación cerrada del
mutante V3C/Y542C, no excluye la posibilidad de que en el canal nativo dicha proximidad se
alcance en la conformación abierta. Teniendo en cuenta que la cinética de cierre del
mutante V3C/Y542C es muchísimo más rápida que la del canal nativo, parece que, en esta
variante, la conformación cerrada está estabilizada frente a la de abierta. Por tanto, el
mutante V3C/Y542C tiene una mayor tendencia a mantenerse cerrado que el canal nativo y,
quizá por ello, la región aminoterminal pueda mantenerse más próxima al lazo S4-S5 en
esta conformación.
En cualquier caso, la existencia de diferencias detectables en la eficiencia de
formación de puentes disulfuro entre las cisteínas 3 y 542, entre los canales en estado
predominantemente abierto o en estado cerrado, reflejan las diferencias en la conformación
del canal en ambos estados, por lo que pueden constituir, además, una forma de analizar
los cambios conformacionales que sufre el canal durante el proceso de apertura y cierre.

Según se ha indicado anteriormente, los datos obtenidos al estudiar la modulación del

cierre por la acidificación en canales h-ERG con deleciones en el extremo amino y con
mutaciones en el lazo S4-S5, sugieren que de darse una interacción entre el dominio
130- Discusión

eag/PAS y el cuerpo central, ésta se produce preferentemente entre los primeros 16

residuos del extremo amino y la porción N-terminal del citado lazo. Por otro lado, los
estudios sobre la regulación de h-ERG por la TRH, también sugieren un papel determinante
de la porción N-terminal del lazo S4-S5 para el control hormonal del proceso de apertura y
cierre. Estos resultados son coherentes con el hecho de que la cisteína en posición 3
establezca puentes disulfuro con la cisteína 542, situada en la región N-terminal del lazo S4-
S5, y no con la introducida en la posición 546, localizada en la porción C-terminal del citado
lazo.

Un apoyo definitivo a la idea de la existencia de una interacción física entre la región

inicial del extremo amino y la región N-terminal del lazo S4-S5, podría ser aportado por la
resolución de la estructura tridimensional del canal h-ERG. Sin embargo, dicha estructura no
ha podido ser determinada aún. Con el fin de tener alguna idea adicional de la posible
distribución espacial de los residuos del lazo S4-S5, hemos generado como hipótesis de
trabajo un modelo de homología (Figura 40), basado en la estructura tridimensional de
Kv1.2, el único canal Kv eucariótico que se ha podido cristalizar (Long et al., 2005). Para
obtener este hipotético modelo, se substituyeron los residuos desde el extremo del
segmento S4 hasta la región final del segmento S6 de Kv1.2 por sus homólogos de h-ERG.
De forma alternativa, también generamos un segundo modelo de homología, basado en la
estructura tridimensional del canal procariótico MlotiK, cuya estructura tridimensional ha sido
recientemente resuelta (Clayton et al., 2008). En ambos canales, Kv1.2 y MlotiK, la
estructura tridimensional alrededor del lazo S4-S5 es totalmente superponible. Sin embargo,
debido a que los cristales de las proteínas se han conseguido en dos conformaciones
diferentes (estados abierto y cerrado, respectivamente) la posición espacial del lazo
respecto al poro central es diferente (Long et al., 2005; Clayton et al., 2008). Además, el
canal Kv1.2 posee en su hélice S6 un motivo PVP, que posiciona la región final de dicha
hélice debajo del lazo S4-S5. Por contra, en MlotiK, y como en el caso de h-ERG, en la
hélice S6 no existe un motivo PVP y, por tanto, dicho segmento se proyecta
perpendicularmente a la membrana hacia el citosol. A su vez, el canal MlotiK presenta, al
igual que h-ERG, un domino cNBD en su región citoplasmática carboxiloterminal (Taraska &
Zagotta, 2007), el cual está ausente en Kv1.2.
Es interesante que en ambos modelos de homología, la porción N-terminal del lazo
S4-S5 de h-ERG (residuos 540-542; secuencia DRY), que es crucial para los efectos de la
acidificación extracelular sobre el cierre y para la regulación hormonal del canal, se
encuentra junto la lisina 538, en la unión angular entre la hélice S4 y el lazo S4-S5,
accesible al medio citosólico en el fondo del cuerpo central del canal. Esta posición de la
secuencia DRY, sería coherente con la posibilidad de que la región inicial del extremo amino
pudiese interaccionar con él. A su vez, esto concordaría con los resultados, publicados
recientemente por nuestro laboratorio, indicando que las proteínas fluorescentes (CFP o
YFP) introducidas en la región inicial aminoterminal se sitúan próximas al cuerpo central de
h-ERG, localizado en la membrana (Miranda & Manso et al., 2008).
A pesar de que estos modelos de homología pueden aportar información valiosa
acerca de las organizaciones intramoleculares del canal, es probable que h-ERG sea muy
diferente a los canales usados aquí como templado. Así, en Kv1.2, el lazo S4-S5 forma una
hélice anfipática formada por tres leucinas en las posiciones 314, 317 y 321, dirigidas hacia
 Discusión -131

el cuerpo del canal, y una línea de residuos polares en la cara opuesta. Sin embargo, en
h-ERG, el lazo S4-S5 no tiene tal naturaleza anfipática, ya que, en él, los residuos polares
se sitúan en la primera mitad del lazo, mientras que los no polares lo hacen en la segunda
mitad de su secuencia (Figura 40A, B). Por otro lado, la introducción de la arginina 541 de
h-ERG en la posición correspondiente a una glicina en Kv1.2, hace que en el modelo de
homología se produzca una colisión entre las hélices, ya que la cadena lateral voluminosa
de la arginina no encaja en el hueco correspondiente a la glicina de Kv1.2. Asimismo, se ha
descrito una interacción directa entre el aminoácido D540 y los aminoácidos R665/L666,
localizados en el extremo C-terminal de la hélice S6, en la conformación cerrada de h-ERG
(Ferrer et al., 2006). Sin embargo, en el modelo de homología de h-ERG, tal interacción es
imposible, dada la enorme distancia entre estos residuos, debida a la ausencia del motivo
PVP en la hélice S6 y, por tanto, a la curvatura que en Kv1.2 tiende a aproximar el extremo
carboxilo de la hélice S6 a la superficie interior de la membrana.
Por último, los efectos relativamente similares en la funcionalidad de h-ERG,
observados al mutar la secuencia DRY de la región N-terminal del lazo S4-S5, son difíciles
de correlacionar con el dispar posicionamiento espacial de estos residuos en los modelos.
Sería pues necesario clarificar si esto es debido a una orientación de las cadenas laterales
de estos aminoácidos hacia la misma superficie de la proteína (a diferencia de lo esperado
en base a los modelos), o bien si la modificación de cualquiera de estos residuos produce
una alteración funcional análoga, aún cuando se encuentren dirigidos hacia diferentes partes
de la proteína, como predicen los modelos de homología. Finalmente, es importante hacer
notar que ambos modelos aportan escasa información acerca de la localización espacial y la
organización estructural de los extremos amino y carboxilo de h-ERG, algo que es
sumamente relevante dada la importancia funcional de estas regiones y de sus posibles
interacciones con las estructuras del cuerpo central transmembranal, puestas de manifiesto
a lo largo de este trabajo.

Como resumen final, podríamos concluir que los extremos citoplasmáticos del canal
h-ERG, particularmente el extremo amino, participan de modo crucial en el control de las
propiedades de activación y desactivación del canal, y constituyen un factor determinante
para la transmisión de los efectos reguladores sobre la apertura y el cierre en respuesta a la
activación hormonal de la Fosfolipasa C. En ambos casos, nuestros resultados indican que
una interacción física entre la región inicial de extremo amino de la proteína y la porción final
de la hélice S4 o la inicial del lazo S4-S5, parece constituir la base molecular de la
regulación funcional de la maquinaria de apertura/cierre, localizada en el cuerpo central
transmembranal del canal.
 132- Discusión

A
S4 S5 S6
Kv1.2 KLSRHSKGLQILGQTLKASMRELGLLIFFLFIG....GYGDMVPTTIGGKIVGSLCAIAGVLYIALPVPVIVSNFNYFYHR
306 419
MlotiK KPLRDSTFFPVLGRVLANEARNLIGVTTLFGVV....GYGDTIPQSFAGRVLAGAVMMSGIGIFGLWAGILATGFYQEVRR
107 220
h-ERG RVARKLDRYSEYGAAVLFLLMCTFALIAHWLAC....GFGNVSPNTNSEKIFSICVMLIGSLMYASIFGNVSAIIQRLYSG
534 669
 Discusión -133

Figura 40. Modelos de homología de h-ERG basados en las estructuras cristalinas de Kv1.2 y MlotiK.
(A) Alineamiento de las secuencias, en código aminoacídico de una letra, de la región correspondiente al lazo
intracelular S4-S5 y al segmento transmembranal S6 de los canales Kv1.2, MlotiK y h-ERG. Se resaltan en
negrita los residuos con carga negativa situados en la región C-terminal del segmento transmembranal S4, el
motivo GYGD, o el equivalente en h-ERG, del poro de permeación, las glicinas de la hélice S6, que le confieren
cierta flexibilidad, y el motivo PVP, que produce la curvatura característica de la S6 en Kv1.2. Los aminoácidos
del lazo S4-S5 se muestran en color rojo. Para una mejor visión se omiten los residuos que abarcan desde la
segunda mitad de la hélice S5 hasta el GYGD del poro de permeación (motivo H5). Los residuos del lazo S4-S5
que interaccionan con sus “parejas” de las hélices S5 y S6 de la misma subunidad o de la adyacente en la
estructura de Kv1.2, se representan en color azul y verde, respectivamente, en la secuencia de Kv 1.2. El
aminoácido D540 del lazo S4-S5 y los residuos R665 y/o L666 del segmento S6 de h-ERG, entre los cuales se
ha sugerido que pueda existir una interacción directa (Ferrer et al., 2006), se muestran como subrayados.
(B) Estructura tridimensional de la región correspondiente al lazo S4-S5 de una de las subunidades de K v1.2
(izquierda, ID en el PDB: 2a79) y modelo de homología obtenido al intercambiar los residuos del citado lazo de
Kv1.2 por sus homólogos de h-ERG (derecha). Las cadenas laterales de los aminoácidos de las hélices S4 y S5
de Kv1.2 se representan con bastones y aquellas cadenas de estos residuos que tienen carga positiva se
representan, además, en rojo. Los aminoácidos del lazo S4-S5 de ambas estructuras se representan con
esferas. (C) Representación con cintas del tetrámero del modelo de homología, en el que se ha substituido la
región comprendida desde el final del segmento S4 hasta el inicio S6 (i.e. el lazo S4-S5 y sus alrededores) de
h-ERG en la estructura de Kv1.2 (izquierda) o de MlotiK (derecha; ID en el PDB: 3co2). El lazo S4-S5 con las
cintas de la hélice
correspondiente al mismo, se remarca en color rojo, a excepción de una de las subunidades
en la que se representa la superficie total de la estructura proteica correspondiente a dicho lazo. Nótese que el
motivo PVP, presente en el segmento S6 de Kv 1.2, produce una curvatura que sitúa dicho segmento justo por
debajo del lazo S4-S5. Ese motivo está ausente en MlotiK (y en h-ERG) haciendo que dicho segmento se
proyecte hacia el citosol, de forma casi perpendicular a la membrana. (D) Visión ortogonal ampliada de la
región correspondiente al lazo S4-S5 (cintas rojas) de una de las subunidades mostradas en C, en la cual se
representan los contactos con el segmento S6 de la misma subunidad (rosa) y el S5 de la subunidad adyacente
(verde). Las cadenas laterales de los residuos del lazo S4-S5 y de los segmentos S5 y S6 que interaccionan con
dicho lazo, se representan como bolas y bastones. Se muestra superpuesta y transparente la superficie global
del lazo S4-S5. Nótese que en el modelo basado en Kv1.2 (izquierda) se produce una colisión entre la arginina
541 de h-ERG y la hélice S5 de la subunidad adyacente (no mostrado), que no existe en Kv1.2, en el que el
residuo correspondiente a la arginina 541 de h-ERG es una glicina. Nótese también que ni en el modelo basado
en Kv1.2, con el motivo PVP presente, ni en el basado en MlotiK (derecha), sin PVP, se predice la interacción
propuesta entre el residuo D540 del lazo S4-S5 y los residuos R665/L666 del final del segmento S6 (Ferrer et
al., 2006). Las figuras se obtuvieron utilizando el programa “USF Cimera ” y los residuos de K v1.2 y MlotiK se
substituyeron por sus homólogos de h-ERG utilizando el programa “Swiss-Pdb Viewer”.
134- Discusión
Conclusiones
 Conclusiones -135

1. La determinación de los parámetros cinéticos y termodinámicos de h-ERG,

bajo condiciones de auténtico estado estacionario, es esencial para conocer el papel
de una determinada región y/o secuencia en la funcionalidad del canal, y para
comparar el impacto real que determinadas mutaciones producen sobre sus
características funcionales.

2. La región inicial de extremo amino de h-ERG y, en concreto, los primeros 16

residuos de la proteína, es fundamental no sólo para determinar la lenta cinética de
cierre del canal, sino que, además, determina su lenta cinética de apertura.

3. Los residuos aspartato 540 y tirosina 542, situados en la región N-terminal del
lazo intracelular S4-S5 de h-ERG, están involucrados en el acoplamiento funcional
entre el movimiento del sensor de voltaje y la maquinaria de apertura y cierre del
canal.

4. La introducción de mutaciones en el lazo S4-S5 de h-ERG, modifica las

propiedades de activación/desactivación del canal. Además, estas mutaciones
influencian la acción moduladora del extremo amino sobre la maquinaria de apertura y
cierre.

5. El mantenimiento de una estructura global correcta en el dominio proximal del

extremo amino de h-ERG que permita un adecuado posicionamiento de dicho extremo
respecto al cuerpo central transmembranal, es esencial para la regulación hormonal
del canal por la TRH.

6. La ausencia de regulación hormonal en canales h-ERG con deleciones

seriadas en el dominio proximal, no es debida a la eliminación de una secuencia
aminoacídica específica, sino a las alteraciones estructurales causadas al incrementar
el tamaño de la deleción.
136- Conclusiones

7. La alteración estructural de la región N-terminal del lazo S4-S5 de h-ERG,

entre los residuos 540 a 542, reduce significativamente los efectos reguladores de la
TRH sobre la actividad del canal h-ERG.

8. Las regiones citoplasmáticas y, en particular, el extremo amino de h-ERG,

ejercen una influencia moduladora sobre la maquinaria de apertura y cierre localizada
en el cuerpo central transmembranal del canal, determinando las lentas cinéticas de
activación y desactivación y la capacidad de regulación hormonal del canal.

9. La aceleración del cierre de h-ERG inducida por la acidificación extracelular,

se reduce significativamente al eliminar ciertas regiones del extremo amino del canal y
al modificar por mutagénesis los residuos de la región N-terminal del lazo intracelular
S4-S5.

10. El residuo 3 del extremo amino y el 542 de la región N-terminal del lazo
S4-S5 de h-ERG, se encuentran lo suficientemente próximos como para que se
formen entre ellos puentes disulfuro, de forma dependiente de estado, cuando ambos
aminoácidos son substituidos por cisteínas y la proteína es sometida a condiciones
oxidantes.

11. La existencia de interacciones entre los primeros residuos del extremo amino
y la región N-terminal del lazo S4-S5, parece esencial para el mantenimiento de la
particulares propiedades de apertura y cierre del canal h-ERG y para su regulación
hormonal por receptores acoplados a proteínas G.
 Referencias
bibliográficas
 Referencias bibliográficas -137

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Publicaciones
Biophysical Journal Volume 94 May 2008 3893–3911 3893

Thermodynamic and Kinetic Properties of Amino-Terminal and S4-S5

Loop HERG Channel Mutants under Steady-State Conditions

Carlos Alonso-Ron, Pilar de la Peña, Pablo Miranda, Pedro Domı́nguez, and Francisco Barros
Departamento de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular, Edificio Santiago Gascón, Campus del Cristo, Universidad de Oviedo,
E-33006 Oviedo, Asturias, Spain

ABSTRACT Gating kinetics and underlying thermodynamic properties of human ether-a-go-go-related gene (HERG) K1
channels expressed in Xenopus oocytes were studied using protocols able to yield true steady-state kinetic parameters. Channel
mutants lacking the initial 16 residues of the amino terminus before the conserved eag/PAS region showed significant positive
shifts in activation voltage dependence associated with a reduction of zg values and a less negative DGo, indicating a deletion-
induced displacement of the equilibrium toward the closed state. Conversely, a negative shift and an increased DGo, indicative of
closed-state destabilization, were observed in channels lacking the amino-terminal proximal domain. Furthermore, accelerated
activation and deactivation kinetics were observed in these constructs when differences in driving force were considered,
suggesting that the presence of distal and proximal amino-terminal segments contributes in wild-type channels to specific
chemical interactions that raise the energy barrier for activation. Steady-state characteristics of some single point mutants in the
intracellular loop linking S4 and S5 helices revealed a striking parallelism between the effects of these mutations and those of the
amino-terminal modifications. Our data indicate that in addition to the recognized influence of the initial amino-terminus region on
HERG deactivation, this cytoplasmic region also affects activation behavior. The data also suggest that not only a slow movement
of the voltage sensor itself but also delaying its functional coupling to the activation gate by some cytoplasmic structures possibly
acting on the S4-S5 loop may contribute to the atypically slow gating of HERG.

INTRODUCTION
The human ether-a-go-go-related gene (HERG) encodes a
potassium channel that mediates the cardiac repolarizing cur-
rent IKr (1,2). ERG potassium channels play a key role setting
the electrical behavior of a variety of cell types (3–10). Mal-
function of HERG currents is responsible for the type 2 long
QT syndrome (1,11–16), a clinical disorder characterized by
prolongation of the QT interval on the electrocardiogram as-
sociated with an increased risk of life-threatening arrhythmia
(11,17,18). The critical determinant of HERG physiological
roles is its atypical kinetic behavior, characterized by slow
activation kinetics and a very fast voltage-dependent inacti-
vation process on depolarization. In addition, a fast recovery
from inactivation followed by a much slower deactivation
process take place on repolarization, helping to maintain the
channels open before closing at negative potentials. This
makes HERG operate as an inward rectifier because little
outward current passes through it during depolarization, al-
though an increased current is induced during repolarization,
even though the driving force for potassium decreases at
negative voltages under physiological conditions (19–23).
It is important to understand the activation and deactiva-
tion gating kinetics to properly interpret the contribution of
HERG channels to cell function. In this case, use of equi-
Submitted July 5, 2007, and accepted for publication December 28, 2007.
Address reprint requests to Dr. Francisco Barros, Departamento de
Bioquı́mica y Biologı́a Molecular, Edificio Santiago Gascón, Campus del
Cristo, Universidad de Oviedo, E-33006 Oviedo, Asturias, Spain. Tel.:
34-985103565; Fax: 34-985103157; E-mail: fbarros@uniovi.es.
Editor: Francisco Bezanilla.
Ó 2008 by the Biophysical Society
0006-3495/08/05/3893/19 $2.00
librium and/or steady-state conditions to obtain voltage de-
pendencies and for derivation of thermodynamic parameters
is of primary interest for at least two reasons: 1), it provides a
model- and researcher-independent way to quantify the ki-
netic characteristics, and 2), it allows for an accurate com-
parison of these characteristics among different channel
constructs that could help to understand the impact of a given
residue and/or protein domain on channel functionality. How-
ever, disparate V½ values for activation of different HERG
mutants, sometimes differing by several tens of millivolts,
have been reported using so-called fully activated or steady-
state activation curves (2,23–33). As previously emphasized
(22,34,35), the slow rates of HERG activation and deacti-
vation at voltages around the V½ values of the activation
curves make the use of very long pulses necessary to reach a
complete steady state. On the other hand, such slowness will
shift the voltage dependence of activation, making impossi-
ble an accurate comparison of two channel mutants showing
different activation time courses, unless the steady-state
condition is fulfilled.
As for other voltage-dependent potassium channels, the
main determinant of HERG voltage sensitivity is the occur-
rence of conformational changes in the voltage-sensing do-
main contributed by the S1-S4 transmembrane segments
(29–33,36–38). However, it has been also recognized that
other protein regions can contribute to the gating machinery
and influence the activation and deactivation transitions.
Thus, an interaction of the N-terminus with the S4-S5 linker
has been proposed as a determinant of HERG slow deacti-
vation (19,23,39), although direct proof of such a physical
doi: 10.1529/biophysj.107.116731
3894
coupling between these structures is still lacking. It has also
been proposed that an interaction of the initial eag domain
with the channel core could be involved in facilitation of
opening after elimination of the proximal domain in the
amino terminus of HERG (34). Electrostatic interactions
between a small section of the proximal domain (close to the
S1 helix) and the gating machinery (possibly at the level of
the S4-S5 loop), have been proposed as a determinant of the
modulatory effects of this domain on gating (33). Finally, a
role of the S4-S5 linker coupling the voltage sensor move-
ment to the activation gate of HERG has also been recently
recognized (40).
In this study we characterized the thermodinamic and ki-
netic gating properties of HERG channel mutants either
lacking specific domains of the amino terminus or carrying
several point mutations in the S4-S5 loop, using protocols
designed to yield kinetic parameters under true steady-state
conditions. The results were also compared with those ob-
tained with channels combining structural alterations in both
regions. Our findings emphasize the key role of these cyto-
plasmic structures modulating HERG gating properties and
indicate that not only the movement of the voltage sensor
itself but also the S4-S5 linker and the N-terminal regions act
as important determinants of activation and deactivation
voltage-dependent properties.
METHODS
Plasmids and preparation of cRNA
The original plasmid containing the cDNA for the HERG channel
(psP64A1-HERG) was a generous gift of Dr. E. Wanke (University of
Milan, Italy). For in vitro cRNA synthesis, the HERG constructs cloned in
the psP64A1 vector were linearized, and capped cRNA was synthesized
from the linear cDNA templates by standard methods using SP6 RNA poly-
merase as described previously (41,42).
Generation of HERG channel mutants
Procedures for generation of the D138-373 and D2-370 mutants have been
detailed elsewhere (34,43). To construct the mutant D2-16, a forward poly-
merase chain reaction (PCR) primer was synthesized to introduce a HindIII
restriction site and an ATG codon, plus 27 bp of HERG coding sequence
corresponding to amino acids 17–26 (59-GGAAGCTTTCAGGATGACC-
ATCATCCGCAAGTTTGAGGGCCAGAG). The reverse primer was de-
signed to cover the coding sequence of HERG corresponding to amino acids
400–407 (59-CCTTGAAGGGGCTGTAATGCAGGAT). The resulting PCR
product was digested with HindIII and BstEII, gel purified, and ligated into
HindIII/BstEII-digested wild-type HERG in the psP64A1 expression vector.
For the D2-135 mutant, a forward primer containing the HindIII site, an ATG,
and the coding sequence corresponding to amino acids 136–145 (59-GGAAG-
CTTTCAGGATGGACATGGTGGGGTCCCCGGCTCATGACACC) was
used in PCR with the same reverse primer as above covering amino acids 400–
407 of the HERG sequence. The PCR product generated was digested with
HindIII/BstEII, and the purified fragment was used to replace the corre-
sponding HindIII/BstEII wild-type fragment in the psP64A1-HERG construct.
The point mutants D540C, R541H, R541A, Y542C, Y545C, and G546C
were created by site-directed mutagenesis using the PCR-based overlap
extension method as previously described (34,43,44). The final PCR frag-
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
ments were digested with BstEII/BglII and ligated into BstEII/BglII-digested
wild-type HERG in the psP64A1 vector. To combine S4-S5 loop mutations
and the D2-370 amino-terminal deletion, BstEII/BglII restriction fragments
from each of the S4-S5 channel mutants were used to replace the corre-
sponding segments in HERG deleted construct D2-370. All constructs were
sequenced to confirm the mutations and to ensure the absence of introduced
errors.
Expression of HERG channel variants and
current recording conditions in Xenopus
laevis oocytes
Procedures for frog anesthesia and surgery, obtaining oocytes, and micro-
injection have been detailed elsewhere (34,41–43,45). Oocytes were main-
tained in OR-2 medium (in mM: NaCl 82.5, KCl 2, CaCl2 2, MgCl2 2,
Na2HPO4 1, HEPES 10, at pH 7.5). Cytoplasmic microinjections were
performed with 30–50 nl of in vitro synthesized cRNA per oocyte. HERG
currents were studied in manually defolliculated oocytes. Recordings were
systematically obtained in high-K1 OR-2 medium in which 50 mM KCl
replaced an equivalent amount of NaCl to maximize tail current magnitude at
negative repolarizing potentials. A continuous perfusion of the cells at 1–5
ml/min was used to minimize the possible influence of K1 variations during
long test pulses. The amount of injected cRNA was calibrated to maintain
inward current levels in the 1–6 mA range at repolarizing voltages around
100 mV to ensure proper voltage control. Functional expression was
typically assessed 2–3 days after microinjection. Recordings were made at
room temperature using the two-electrode voltage-clamp method as de-
scribed previously (34,42,43,45). Membrane potential was typically clamped
at 80 mV except for constructs showing a left shift in voltage dependence
of activation, in which a 100/110 mV basal voltage was used to com-
pensate for this shift. When indicated, a holding potential of 0/120 mV was
also used to maintain the channels open to obtain true steady-state activation
data. Ionic currents sampled at 1 KHz were elicited using the voltage pro-
tocols indicated in the graphs.
Kinetic parameters of activation and deactivation were obtained as pre-
viously described (34,42). The voltage dependence of activation was as-
sessed by standard tail current analysis using depolarization pulses of
variable amplitude. For slowly deactivating channels, the size of the peak
inward tail currents gives a reasonable estimate for the fraction of channels
activated (and inactivated) at the end of the depolarization. Alternatively, and
for very rapidly deactivating constructs, fitting the relaxation of the tail
currents and extrapolating the magnitude of the decaying current to the
moment the depolarizing pulse ended were used to determine the amount of
current passing through channels opened on depolarization without influence
of rapid inactivation (2,42). To take into account the possible influence of the
inactivation recovery process on peak tail current or extrapolated current
magnitudes, the integral of the completely deactivated tail currents was also
used to estimate the voltage dependence of these channels. In all cases, very
small variations of the half-maximum activation voltage (V½) were observed
by any of the three alternative procedures, never reaching differences above
63 mV. Tail current magnitudes normalized to maximum were fitted with a
Boltzmann function to estimate the V½ and equivalent gating charge (zg):
Itail =Imax ¼ 1=½ð1 1 expððV½  VÞzg F=RTÞ;
where V is the test potential, and F, R, and T are Faraday constant, gas con-
stant, and absolute temperature, respectively. The activation data were also
fitted with a second Boltzmann function of the form:
Itail =Imax ¼ 1=½ð1 1 expððDGo  Vzg FÞ=RTÞ;
where DGo is the work done at 0 mV. Although both equations are equiv-
alent, from the last expression, the effect of every mutation on changes in the
chemical potential (DGo) and electrostatic potential (VzgF) that drives
activation can be obtained. The time course of voltage-dependent activation
Steady-State Properties of HERG Mutants
was studied using an indirect envelope-of-tail-currents protocols, varying the
duration of depolarizing prepulses, and following the magnitude of the tail
currents on repolarization. The time necessary to reach a half-maximal tail
current magnitude was used to compare the speed of activation of the
different channels.
The rates of deactivation were determined from negative-amplitude
biexponential fits to the decaying phase of tail currents using a function of the
form:
y ¼ Af expðinvt f  xÞ 1 As expðinvt s  xÞ 1 C;
where tf and ts are the time constants of fast and slow components, Af and As
are the relative amplitudes of these components, and C is a constant. In this
case, the first cursor of the fitting window was advanced to the end of the
initial hook because of the recovery of inactivation.
Statistics
Data values given in the text and in figures with error bars represent the
mean 6 SE for the number of indicated cells. Comparisons between data
groups were at first performed by parametric Student’s unpaired t-test (two-
tailed) or ANOVA. Where nonhomogeneous variances (as evidenced after
Bartlett’s test) were obtained, alternate Welch’s test assuming Gaussian
populations with unequal SD and nonparametric Wilcoxon or Mann-Whit-
ney tests, which do not make any assumption about the scatter of the data,
were also used to evaluate significance of mean differences between cell
populations. In all cases, p-values ,0.05 were considered indicative of
statistical significance.
RESULTS
Influence of specific amino-terminal deletions on
steady-state activation voltage dependence of
HERG channels
Exhaustive mutagenesis and kinetic studies using HERG
channels modified in the initial protein segment located be-
tween residues 1 and 135, which includes the conserved eag/
PAS domain, have been used to emphasize the crucial role of
this region in setting the slow closing kinetics of the channel
(19–21). However, the possible impact of these structural
alterations on activation gating has not been similarly as-
sessed.
To investigate the possible influence of the initial amino-
terminal domains on HERG activation properties, we gen-
erated two channel constructs lacking either the first 135
amino acids including the previously characterized PAS
structure located between residues 16 and 135 (mutant D2-
135) or only the initial 16 amino acids (mutant D2-16) that
remained disordered in the crystalline structure (21). The
characteristics of these channels were compared with those of
mutant D2-370 in which not only the initial portion but most
of the amino terminus has been deleted, and with D138-373
channels lacking only the protein segment corresponding to
the proximal domain. In all cases, these constructs were ex-
pressed in Xenopus oocytes, and currents were measured
using a two-electrode voltage clamp. To elucidate the voltage
dependence of activation, depolarization pulses to different
potentials were applied, and tail currents were recorded on
repolarization (Fig. 1). Because of the rapid inactivation
3895
exhibited by HERG, the ionic currents during depolarizing
pulses used to activate the channels are rather small, and their
kinetics are obscured by superposition of activation and in-
activation transitions over a wide range (2,22,24,29,30,34).
Big deactivating tail currents can be measured after the return
to negative voltages following the depolarizing steps that
trigger the activation (and inactivation) of the channels. Such
currents, inward at the negative potentials and ionic condi-
tions used here, result from fast inactivation removal, fol-
lowed by a decay caused by a relatively slow channel closing.
Analysis of the magnitude of these tail currents as a function
of previous depolarization voltage can be used to generate
I versus V curves from which the voltage dependence of
channel activation can be obtained (Fig. 2). For wild-type
channels, Boltzmann fits (see Methods) to the normalized tail
current data obtained in response to depolarization pulses of
1 s duration from a holding potential of 80 mV yielded V½,
zg, and DGo values of 21.9 6 0.55 mV, 3.23 6 0.06, and
1.65 6 0.05 kcal/mol, respectively (n ¼ 25). However,
for such channels as wild-type HERG characterized by very
slow activation/deactivation kinetics, no steady state will be
achieved unless much longer pulses are applied. Thus, at a
holding potential of 80 mV the position of the Boltzmann
curve along the voltage axis was strongly shifted toward
more negative values by increasing the duration of the de-
polarizing step from 1 to 10 s. This modified the aforemen-
tioned kinetic parameters to 42.6 6 0.72 mV, 4.16 6 0.09,
and 4.08 6 0.05 kcal/mol (n ¼ 5). On the other hand, and
perhaps more important, when 10 s preconditioning test
pulses were applied to wild-type channels from two holding
voltages (80 and 0 mV), at which closed and open channels
are expected, respectively, the activation curves were still
separated by nearly 30 mV. This demonstrates that for wild-
type channels test depolarizations of up to 10 s are not long
enough to reach a true equilibrium because if a steady-state
condition is attained during the depolarizing test pulse, the
current magnitudes and the position of the derived I/V curves
must be independent of the previous channel state (holding
voltage) or the test pulse duration. Therefore, only fractional
or isochronal but not real steady-state parameters can be
derived from these data. Subsequently, V½ values under
steady-state conditions and the charge and free-energy
parameters for all channel constructs were obtained from
Boltzmann fits to activation curves either coming from
coincident curves at two extreme holding voltages and long
10-s depolarizations or from the extrapolated mean of such
still noncoincident curves (Fig. 2). This guaranteed that I/V
curves were exclusively a function of test pulse character-
istics, regardless of the previous (open or closed) state of
the channels. As previously shown, this extrapolated value
marks the end of the I/V curve trend to converge as a result
of increased test pulse duration from any holding voltage,
yielding a reasonable estimation of the true steady-state V½
(22,34,35). As an example of the impact caused by steady-
state deviations on the derived kinetic parameters, the 1.65
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
3896
kcal/mol DGo value obtained for wild-type HERG using 1-s
depolarization pulses from a holding potential of 80 mV is
increased to 4.08 kcal/mol with 10-s conditioning pulses, a
value still deviated from the 5.70 kcal/mol under steady-
state conditions.
It is important to note that the observed variations in ki-
netic behavior after short (1-s) and long (10-s) conditioning
pulses are not a consequence of a secondary process (e.g.,
recruitment of silent channels or long-term open probability
variations as a result of a slow and uncontrolled cellular
process) taking place during long depolarizations because 1),
for the same conditioning pulse, opposite I/V curve shifts are
obtained as a function of the holding potential, and 2), the
same amount of current was obtained at saturating positive
voltages for the 1- and 10-s-derived I/V curves. Thus, with
those constructs showing relatively small displacements of
the 10-s I/V curve and almost coincident 10-s-derived curves
at two holding potentials (i.e., D2-16, D2-135, D2-370, R541A
and Y545C channels), only nonsignificant variations (,5%)
in the maximal amount of current were observed when I/V
curves obtained using 10-s conditioning pulses were com-
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
FIGURE 1 Effect of deleting the initial region of the
amino terminus on HERG currents recorded with protocols
designed to yield steady-state activation voltage depen-
dence. (A) Membrane currents obtained from an oocyte
expressing wild-type HERG channels after 10-s depolari-
zations to different voltages as indicated at the top. Holding
potentials of 100 mV to keep the channels fully closed
(left) and 0 mV to hold them fully open (right) were used.
Currents at the end of the depolarizing steps and the tail
currents at 100 mV corresponding to the boxed area are
shown expanded in the insets. (B and C) Membrane
currents in oocytes expressing HERG constructs lacking
the initial 16 amino acids (D2-16) or the initial region of the
amino terminus including the eag/PAS domain (D2-135).
Tail currents at 80 (B) or 100 mV (C) were obtained
after 10-s prepulses between 90 and 150/160 mV in 10-
mV increments. Only the end of the depolarizing steps and
the tail currents are shown for simplicity. Holding potentials
(H.P.) of 80 (left traces) and 0 mV (right traces) were
used as indicated on the graphs.
pared with those obtained in the same oocytes using 1-s
depolarizing steps. Analogously, maximal current levels
amounting to 4.0 6 1.3% (n ¼ 7) and 2.3 6 1.6% (n ¼ 6) of
those recorded in response to 1-s depolarizing steps were
obtained when 10-s depolarizations were applied to wild-type
and G546C channels, respectively. Therefore, the short- and
long-term derived parameters originate from the different ki-
netic situations affecting the same channel population. On the
other hand, this kinetic behavior is inherent to HERG itself and
not related to the oocyte expression system or to contamina-
tion of recordings with endogenous chloride currents during
long voltage steps because analogous deviations are observed
in HEK293 cells expressing wild-type HERG channels (35).
The steady-state values of V½, zg, and DGo of the different
constructs are summarized at the bottom of Fig. 2. It can be
observed that a negative shift in V½ from 53.5 6 1.1 mV for
wild-type (n ¼ 5) to 78.3 6 1.2 mV for D138-373 (n ¼ 5) is
induced by deletion of the proximal domain, but the voltage
dependence of activation is shifted in the opposite direction
in channels lacking the initial amino acids of the protein.
Thus, mutants D2-16, D2-135, and D2-370 showed V½
Steady-State Properties of HERG Mutants
values of 20.0 6 1.6 (n ¼ 6), 34.1 6 1.6 (n ¼ 6), and
34.3 6 0.5 mV (n ¼ 7), respectively. Interestingly, a V½
value equivalent to that obtained here under steady-state
conditions has been previously reported for wild-type HERG
using 30-s depolarization steps (23). The data in Fig. 2 also
indicate a significant reduction of zg for D2-16 and D138-373
compared with wild-type channels. On the other hand, whereas
a larger chemical potential drives the opening of the proximal-
domain-deleted D138-373 channels (DGo ¼ 7.2 6 0.12
kcal/mol as compared with 5.7 6 0.09 kcal/mol for wild-
type), a less negative DGo is observed for those constructs
deleted in the initial region of the amino terminus, regardless
of the presence or absence of the proximal domain (1.7 6
0.22, 3.5 6 0.23, and 3.7 6 0.13 kcal/mol for D2-16,
D2-135, and D2-370 mutants). These data suggest that the
3897
FIGURE 2 Effect of amino-terminal deletions on HERG
activation voltage dependence under steady-state condi-
tions. Fractional activation curves for wild-type (WT) and
the indicated channel variants were obtained from tail
current data obtained as detailed in Fig. 1. Open and filled
symbols correspond to data obtained in response to 10-s
prepulses from hyperpolarized (80 to 110 mV) and
depolarized (0 to 140 mV) holding voltages, respectively.
The continuous lines correspond to Boltzmann curves that
best fitted the data. The dotted lines represent the deduced
position of the activation curves under steady-state condi-
tions, obtained by horizontally averaging the values of the
two lines coming from both holding voltages to prevent
alterations in the sigmoidal shape of the traces. The V½
values for the steady-state curves are indicated by arrows in
the graphs. Activation curves obtained with prepulses of 1-s
duration (crosses) from hyperpolarized holding potentials
are also shown for comparison. Steady-state curves for the
different constructs are shown superimposed (lower right
panel). Kinetic and thermodynamic parameters obtained
under steady-state conditions for the different channel
variants are summarized at the bottom. *p , 0.05 versus
wild-type.
presence of the proximal domain tends to stabilize the closed
state(s) of HERG, whereas the initial segment of the protein
tends to stabilize the group of open states relative to the group
of closed ones.
Effect of amino-terminal deletions on HERG
activation rates
As indicated above for the activation voltage dependencies,
direct measurement of HERG activation rates during depo-
larization steps is not possible because of overlapping of
rapid inactivation and channel opening. Therefore, we stud-
ied the time course of voltage-dependent activation using an
envelope-of-tails protocol in which the duration of a depo-
larizing prepulse is varied at each potential, and the magni-
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
3898
tude of the tail current peak at a constant repolarizing voltage
is measured at the end of every conditioning prepulse. Be-
cause of the presence of several preopen closed states, the
HERG activation time course shows a sigmoidal shape
(24,30,33,45). Therefore, we estimated the rate of activation
at a given voltage from the time necessary to attain half-
maximum tail current magnitude at every depolarization
potential (34,35). The data obtained with the different con-
structs carrying deletions in the amino terminus are compared
with those from wild-type channels in Fig. 3. Plots of acti-
vation rates as a function of depolarization membrane po-
tential showed a similar slope for all channel types through
the tested range. With a value of 0 mV taken as a reference,
relatively similar activation kinetics was observed for chan-
nels carrying deletions in the first 135 amino acids, as com-
pared with those of the wild-type channels. Thus, the 143 6
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
8.6 ms (n ¼ 6) necessary to reach the half-maximal tail am-
plitude of the wild-type channels at this voltage were either
slightly increased to 211 6 21 ms (n ¼ 6) and 213 6 11 ms
(n ¼ 7), or slightly decreased to 100 6 9 ms (n ¼ 6) for D2-
16, D2-135, and D2-370 channels, respectively. However,
consistent with previous results (34), a marked acceleration
in activation kinetics of around fivefold (t½ ¼ 28 6 1 ms (n ¼
6)) was obtained with D138-373 channels selectively deleted
in the proximal domain.
The analysis of the mutation effects on activation rates is
complicated by the shifts in voltage dependence of steady-state
activation (V½) and by the alterations in the effective number
of gating charges moving across the membrane electric field
(zg). Because this would change the total activation driving
force (chemical plus electrostatic potential) for every channel
mutant at a given voltage, we also plotted the activation rates
FIGURE 3 Effect of amino-terminal deletions on HERG
activation rates. (A) Comparison of channel activation rates
at 0 mV in oocytes expressing wild-type HERG and D2-16
or D2-135 constructs. The time course of voltage-dependent
activation was studied by varying the duration of a
depolarizing pulse to 0 mV following the voltage protocol
shown on top of the wild-type current traces. Current traces
corresponding to depolarization steps of 0, 20, 40, 80, 160,
320, 640, 1280, 2560, and 5120 ms are shown super-
imposed. (B) Dependence of activation rates on depolari-
zation membrane potential (left) or total potential driving
force (right) for channels carrying different deletions in the
amino terminus. The magnitude of the peak tail current on
repolarization was determined from recordings as shown in
panel A after varying the duration of depolarization pre-
pulses to different potentials. The time necessary to attain
half-maximum tail current magnitude is plotted versus
either depolarization potential (left) or total energy driving
activation (i.e., (DGo  zgEF), right). DGo and zg values
were derived as detailed in Methods from steady-state
activation voltage-dependence curves of the different chan-
nels. Data from D138-373 and D2-370 deleted channels are
also shown for comparison. (C) Summary of activation
rates at 0 mV (left) and 4 kcal/mol of electrochemical
driving force (right). The speed of activation of the different
constructs is compared as measured by the inverse value of
the half activation time. The t½ values at 0 mV or those
graphically determined at 4 kcal/mol from the crossing of
the activation graphs and the 4 kcal/mol line in B (right
panel) were used. *p , 0.05 versus wild-type.
Steady-State Properties of HERG Mutants 3899

for the different constructs versus the total energy driving Influence of S4-S5 loop mutations on
activation (i.e., (DGo  zgEF)) (30,31). These plots showed steady-state activation voltage dependence of
similar slopes along the tested range. Interestingly, when HERG channels
compensated for the differences in driving force, the activation
The interaction of the initial HERG region with the S4-S5
kinetics of all mutants appeared clearly accelerated as com-
linker has been proposed as a determinant of slow deactiva-
pared with the wild-type channel. If a level of 4 kcal/mol is
tion (19,23,39). The aforementioned modifications of HERG
taken as a reference, this acceleration corresponded to almost
activation properties, observed when the initial segment of
2-fold for the D2-135 mutant, 3.5-fold for D138-373 and
the amino terminus is eliminated, prompted us to check if
D2-370 channels, and 4.3-fold for the D2-16 construct.
mutations in the S4-S5 loop could similarly affect activation
These results indicate that although the mutations cause
parameters. For this purpose, we generated several single-
shifts in the steady-state voltage dependence of activation
point mutations between residues 540 and 546 of this linker
that could affect opening rates at submaximal activation
that were characterized using procedures analogous to those
potentials, the changes observed in the rates are not sec-
described above for the amino-terminal constructs. Addition-
ondary to those shifts. They also suggest that 1), not only the
ally, some of these mutations were combined with amino-
N-terminal region corresponding to the proximal domain
terminal deletions to check for possible additive effects on
(33,34,45) but also the initial part of the amino terminus may
gating (see below).
contribute to set the activation characteristics of HERG, and
Data regarding the activation voltage dependence of
2), the amino-terminal structures exert rate-limiting control
D540C, R541A, Y542C, Y545C, and G546C mutants are
of gating transitions during the activation process. Interest-
summarized in Figs. 5 and 6. Results of channels in which
ingly, our corrected data show that a facilitation of activation
arginine 541 was replaced by histidine (R541H) are also
(faster activation rate) is induced not only by deletion of
shown. This change introduced a histidine that is highly
the proximal domain (D138-373) that causes a shift of the
conserved in the same position of several Kv channels, in-
equilibrium toward the open state (more negative DGo) but
cluding some members of the eag family, and whose muta-
also in the mutants lacking the initial amino-terminal region
tion to arginine has been reported to compensate for the
(D2-16, D2-135, and D2-370) in which DGo is shifted by the
alterations in activation gating caused by N-terminal dele-
deletions to less negative values. This demonstrates the utility
tions of the rat eag channel (46). The position of the steady-
of this approach to separate alterations in the transition en-
state Boltzmann curves along the x-axis remained the same in
ergy of the gating process from changes in energy difference
cells expressing R541A and G546C channels as compared
between, or relative stability of, the closed and open states.
with wild-type, whereas a small rightward shift of around 10
mV was observed with R541H and Y545C mutants (Fig. 6).
Effect of amino-terminal deletions on HERG However, strong displacements to more depolarized poten-
deactivation kinetics tials were obtained after introducing cysteines in residues
540 and 542. In this case the V½ values were modified from
Fitting the decaying phase of tail currents to a biexponential
the 53.5 mV of the wild-type to 21.6 6 1.4 (n ¼ 6) and
function at different potentials after a fixed depolarization
19.5 6 0.7 mV (n ¼ 10) in D540C and Y542C channels,
pulse allows the estimation of the voltage dependence of
respectively. These huge modifications in steady-state volt-
deactivation kinetics. As illustrated in Fig. 4, the time con-
age dependencies were also accompanied by a substantial
stant of the fast deactivation component that accounts for
reduction in the slope of the I/V curves that lowered the zg
most of the current amplitude at negative voltages (21,30,34)
value from 4.5 in the wild-type to 1.3 6 0.04 and 2.0 6 0.08
became strongly reduced in all channel mutants lacking the
in D540C and Y542C channels. As a result of these altera-
initial 16-amino-acid segment. Thus, values of 14.5 6 1.3,
tions, the chemical potential for activation DGo was raised
14.4 6 2.0, and 16.0 6 1.3 ms (n ¼ 8–14) were obtained for
from the control 5.7 kcal/mol to 0.8 6 0.02 and 0.9 6
D2-16, D2-135, and D2-370 compared with 145 6 14 (n ¼ 9)
0.05 kcal/mol, respectively. These data indicate that without
for wild-type channels at 100 mV, a potential well below
an applied membrane field (e.g., at 0 mV) the tendency of the
the threshold for activation of all constructs. However, a
channels to open is nearly abolished (Y542C) or slightly
value closer to that of wild-type was observed with the
reversed (D540C) by the mutations.
proximal domain-deleted D138-373 mutant (113 6 4 ms, n ¼
6). These results emphasized the key role of the amino-ter-
minus initial segments on regulation of HERG deactivation
Effect of S4-S5 loop mutations on HERG
properties (34). Interestingly, although this reduction in de-
activation rates
activation time constants remained almost unaltered for all
the initial segment-deleted constructs, once differences in To characterize the time dependence of the activation pro-
total potential energy are considered, a 3.75-fold acceleration cess, an envelope-of-tails protocol (see above) was applied
of closing was also observed for D138-373 channels at to mutants in the S4-S5 linker. As shown in Fig. 7, plots of
equivalent driving forces. half-activation-time variation as a function of depolariza-

Biophysical Journal 94(10) 3893–3911

3900
tion potential showed similar slopes for the S4-S5 mutants
as compared with wild-type and proximal-domain-deleted
channels. However, there was a notable exception to this
trend in the case of the D540C mutant, which showed only a
small variation of t½ values at different depolarizing volt-
ages. Comparison of activation rates at 0 mV indicated very
little change in the kinetics of opening after modification
of residues 541 and 545, but almost twofold slower rates
were observed with Y542C and G546C mutants. Interest-
ingly, considerably faster rates were obtained with D540C
channels at 0 mV, although this difference tended to dis-
appear at positive voltages because of the reduced voltage
dependence of the activation rates exhibited by this mutant.
Indeed, the acceleration of channel opening induced by
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
FIGURE 4 Effect of amino-terminal deletions on HERG
deactivation rates. (A) Comparison of channel deactivation
in wild-type channels and D2-16 or D2-135 constructs
carrying deletions in the eag/PAS region. Families of
currents were obtained during steps to potentials ranging
from 120 to 30 mV after depolarization pulses to open
(and inactivate) the channels, as indicated at the top of the
wild-type current traces. Only the first part of the 4-s
repolarization steps used to follow the complete decay of
the tail currents is shown for clarity. (B) Dependence of
deactivation rates on repolarization membrane potential
(left) or total potential driving force (right) for channels
carrying different deletions in the amino terminus. Deacti-
vation time constants were quantified by fitting a double
exponential to the decaying portion of the tails as described
in Methods. Only the magnitude of the deactivation time
constant corresponding to the fast decaying current major
component at negative voltages is shown. Data from D138-
373 and D2-370 deleted channels are also shown for
comparison. (C) Summary of deactivation rates at 100
mV (left) and 4 kcal/mol of electrochemical driving force
(right). The speed of deactivation of the different constructs
are compared as reflected by the inverse value of the
deactivation time constant. Values obtained at 100 mV
or those graphically determined at 4 kcal/mol from the
deactivation graphs and the 4 kcal/mol line crossing in B
(right panel) were used. *p , 0.05 versus wild-type.
mutation of residue 540 became more pronounced when
activation rates were compensated for differences in driv-
ing force. Nevertheless, the flat energetic profile of the
D540C mutant complicated the performance of a rigorous
comparison at the more positive levels of energy driving
activation. With the 4 kcal/mol level taken as a reference,
we also observed a slightly slowed activation rate with
R541A, R541H, and G546C channels. Finally, the Y542C
and Y545C mutants exhibited 4.6- and 2.6-fold faster ac-
tivation rates than wild-type at equivalent driving force.
Altogether, these results indicate that not only deactiva-
tion gating (19) but also voltage-dependent activation prop-
erties can be affected by structural alterations in the S4-S5
linker (39).
Steady-State Properties of HERG Mutants 3901

FIGURE 5 Effect of S4-S5 loop single point mutations

on HERG currents obtained at different depolarization
voltages. Families of currents were obtained with the
protocols indicated on top of the traces, using 1-s depolar-
izations to test potentials between 80 and 160 mV in 10-
mV steps from a holding potential of 80 mV. Note the
differences in the tail-current kinetics of the different
mutants on repolarization to 100 mV.

Effects of S4-S5 loop mutations on HERG force of 4 kcal/mol also showed that although very small
deactivation kinetics accelerations of deactivation are obtained with R541H and
G546C mutants, the time constant of deactivation is notably
The effects of S4-S5 loop mutations on the time constant
smaller in mutants D540C, R541A, Y542C, and Y545C than
of the fast deactivation component are summarized in Fig. 8.
in wild-type, meaning deactivation accelerations of about
No significant differences in the rate of deactivation as a
seven-, three-, nine-, and fivefold, respectively. Interestingly,
function of voltage were observed for G546C as compared
whereas the accelerations of deactivation at 100 mV in
with wild-type. However, considerably faster rates were ob-
the S4-S5 loop mutants were always smaller than that of the
tained for the rest of the S4-S5 mutants. This acceleration of
D2-370 construct lacking most of the amino terminus, equiv-
deactivation ranged from about sevenfold faster for Y542C
alent or greater accelerations than that of the D2-370 mutant
than wild-type at 100 mV to almost threefold as observed
were observed at the same driving force with D540C, Y542C,
with R541H. It is important to note the smaller inclination of
and Y545C channels.
the D540C and Y542C t-versus-voltage plots as compared
with those of the rest of mutants. This tended to equalize the
tail-current kinetics at very negative voltages, suggesting a
Gating modifications induced by S4-S5 loop
reduction of the voltage dependence of closing from intro-
alterations in channels lacking the
duction of a cysteine in these positions. When the deactiva-
amino terminus
tion rates were plotted as a function of total potential energy
((DGo  zgEF)), a clear tendency of the slopes obtained The aforementioned results demonstrate that in addition to
with the different mutants to be equal was observed, except the previously reported effects of amino-terminal deletions
for D540C channels, for which a steeper trace was apparent. and S4-S5 loop mutations on HERG deactivation properties
Comparison of deactivation rates at an equivalent driving (19,21,34,47,48), clear modifications on activation gating

Biophysical Journal 94(10) 3893–3911

3902
can also be induced by structural alteration of these domains.
Therefore, the effects of S4-S5 loop mutations were also
assessed in the background of the D2-370 variant, which is
lacking almost the whole amino terminus. As an initial ap-
proach, three S4-S5 mutants were used, corresponding to
those showing no effect (G546C) or intermediate (R541A)
and strong (Y542C) accelerations of closing kinetics.
Fig. 9 summarizes the effects of the double mutations on
activation voltage dependence. Fig. 9 A shows current traces
in response to the voltage-clamp protocols depicted on top,
and Fig. 9 B illustrates steady-state activation curves con-
structed from the relation between depolarization membrane
voltage and the amplitude of tail currents, using 10-s depo-
larizing steps and two holding potentials. Comparison of
Boltzmann curves for the double mutants and those of wild-
type and single mutants in Fig. 9 C indicates that the impact
of the mutation is clearly different in channels with or without
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
FIGURE 6 Effect of S4-S5 loop mutations on
HERG activation voltage dependence under steady-
state conditions. Fractional activation curves for
wild-type (WT) and the indicated mutants were
obtained from tail-current data obtained as detailed
in Fig. 2. Open and filled symbols correspond to
data obtained after 10-s depolarization prepulses
from hyperpolarized and depolarized holding volt-
ages at which channels are maintained closed and
open, respectively. Fully superimposable graphs
after short 1-s depolarizations from both holding
potentials are illustrated in the case of the very fast
activating and deactivating D540C channels. The
continuous lines correspond to Boltzmann curves
that best fit the data, and the dotted lines represent
the deduced position of the activation curves under
steady-state conditions obtained as a mean of those
corresponding to both holding voltages. The V½
values for the steady-state curves are indicated by
arrows in the graphs. Activation curves obtained
with prepulses of 1-s duration (crosses) from hyper-
polarized holding potentials are also shown for
comparison. Steady-state curves for the different
constructs are shown superimposed (lower panel).
Kinetic and thermodynamic parameters obtained
under steady-state conditions for the different chan-
nels are summarized at the bottom. *p , 0.05
versus wild-type.
the amino terminus. Thus, the small changes in V½ and zg
values (0.9 mV and 1.1 equivalent gating charges) obtained
with the R541A single mutant, largely differ from the 13 mV
depolarizing shift and the 2.3 reduction in zg induced by the
mutation in the D2-370 channel background. Subsequently,
the 1.1 kcal/mol of DGo increase between R541A and
wild-type channels is changed to 2.6 kcal/mol between the
R541A 1 D2-370 and D2-370 variants. Therefore, the slight
reduction of free energy needed for channel activation (de-
stabilization of closed states relative to activated states)
caused by mutating residue 541 is changed to a clear net in-
crease in free energy (destabilization of activated states rel-
ative to closed ones) by introducing the R541A mutation in
the D2-370 background. Performance of similar comparisons
with the Y542C mutation reveals that, whereas the single
Y542C mutant exhibits a positive shift of 34 mV and a zg
reduction of 2.0, a similar reduction in the slope of the I/V
Steady-State Properties of HERG Mutants
curve but a shift of only 0.8 mV is induced by mutating the
same residue in the D2-370 construct. Concomitantly, the
4.8 kcal/mol increase in DGo obtained with the Y542C mu-
tation is reduced to 1.8 kcal/mol when the mutation is com-
bined with the deletion of the amino terminus. However, a
quite different pattern is observed with the G546C mutation.
In this case, the limited 0.6 mV rightward shift obtained with
the single mutant is changed to an 8.5 mV leftward shift
between the G546C 1 D2-370 and the D2-370 constructs,
and the 0.9 reduction in zg is diminished to 0.5. This means a
small change in DGo increase from 1.1 kcal/mol after intro-
ducing the G546C mutation in wild-type channels, to –0.7
kcal/mol after introduction of the same mutation in D2-370.
The differences in the impact of the S4-S5 loop mutations
in channels with or without the amino terminus can be ex-
tended to the activation time course. As shown in Fig. 10, the
3903
FIGURE 7 Effect of S4-S5 loop mutations on HERG
activation rates. (A) Comparison of channel activation rates
at 0 mV in oocytes expressing different S4-S5 loop single-
point mutants. Representative families of currents recorded
using an envelope-of-tails protocol as detailed in Fig. 3 are
shown. (B) Dependence of activation rates on depolariza-
tion membrane potential (left) or total potential driving
force (right) for the different mutants. The time necessary
to attain half-maximum tail-current magnitude is plotted
against depolarization potential (left) or total energy driving
activation (i.e., –(DGo  zgEF); right). Data from either
wild-type channels or those deleted in the proximal domain
(D138-373), with strong accelerations in activation kinetics
(33,34), are also shown for comparison. (C) Summary of
activation rates at 0 mV (left) and 4 kcal/mol of electro-
chemical driving force (right). The speed of activation of
the different channel variants is compared according to the
inverse value of the half-activation time. The t½ values at 0
mV or those graphically determined at 4 kcal/mol from the
crossing of the activation graphs and the 4 kcal/mol line
in B (right panel) were used. *p , 0.05 versus wild-type.
time necessary to reach half-maximal activation at 0 mV was
significantly reduced from 99 6 8.6 ms (n ¼ 6) in the D2-370
mutant to 73 6 4 ms (n ¼ 6) in the R541A 1 D2-370 con-
struct. This contrasts with the almost identical activation rate
observed at that voltage when wild-type and R541A channels
are compared. These differences were still more pronounced
after compensation of activation rates for differences in
driving force because the slightly slower rate of activation
exhibited by the R541A mutant at 4 kcal/mol (see also above)
was changed to an almost fourfold faster rate in the R541A 1
D2-370 construct as compared with the D2-370 channel.
Clear differences were also observed after performance of a
similar analysis with the Y542C and G546C mutations. Thus,
compared with wild-type activation rates, the significantly
slower rates exhibited by the Y542C and G546C mutants at
0 mV were either abolished by introducing a cysteine in
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
3904
position 542 of the D2-370 channel (Y542C 1 D2-370 ac-
tivation t½ 111 6 9.5 ms, n ¼ 7) or remained slow in the
G546C 1 D2-370 mutant (216 6 11.0 ms, n ¼ 8). Further-
more, the 4.6-fold faster than wild-type activation shown by
the Y542C mutant at 4 kcal/mol was reduced to a 1.7-fold
faster rate of the Y542C 1 D2-370 construct as compared
with the D2-370 channel at the same driving force. Finally,
no changes in activation rates were observed at 4 kcal/mol
regardless of the background in which the G546C mutation
was introduced.
As a final verification, we also compared the effects of
mutating S4-S5 loop residues on closing kinetics with and
without the amino terminus. The results of this analysis are
summarized in Fig. 11. Surprisingly, clearly additive accel-
erations of closing were obtained after combining the elim-
ination of the amino terminus with mutations of residues 541
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
FIGURE 8 Effect of S4-S5 loop mutations on HERG
deactivation rates. (A) Representative currents obtained
with the voltage protocol indicated in the inset. (B) Plots
of fast deactivation time constants as a function of voltage
(left) or total electrochemical driving force (right). (C)
Summary of deactivation rates at 100 mV (left) and 4
kcal/mol of electrochemical driving force (right). The speed
of deactivation of the different mutants is compared
according to the inverse value of the deactivation time
constant. Time constant values obtained at 100 mV or
those graphically determined at 4 kcal/mol were used.
*p , 0.05 versus wild-type.
or 542, both at 100 mV and at an equivalent driving force of
–4 kcal/mol. On the other hand, the acceleration of closing
induced by removal of the amino terminus was significantly
reduced by the G546C mutation. Thus, the 9.0- and 6.1-fold
faster than wild-type deactivation rates of D2-370 channels at
100 mV and 4 kcal/mol, respectively, became 3.3- and
4.4-fold faster in the G546C 1 D2-370 construct than in D2-
370. As discussed below, this suggests that neither of the
structural alterations in the S4-S5 linker is entirely neutral in
respect to deactivation characteristics. In addition, the similar
phenotypes exhibited by the S4-S5 linker mutants and the
channel variants lacking amino-terminal segments are prob-
ably not exclusively caused by disruption of an interaction
between the amino terminus and the S4-S5 loop because in
this case no further effect of the mutations should be expected
in channels lacking the whole amino terminus.
Steady-State Properties of HERG Mutants
DISCUSSION
In this article we show the characterization of gating and
thermodynamic properties of HERG channels carrying either
single or combined structural alterations in the amino ter-
minus and S4-S5 linker domains. The impact of such struc-
tural modifications on gating is also assessed using protocols
capable of yielding kinetic parameters under true steady-state
conditions. Whereas previous work emphasized the need to
perform adequately designed experiments to obtain real
steady-state properties and to derive kinetic parameters in a
way independent of the researcher or the underlying gating
model (22,34,35), such circumstances are frequently ne-
glected (2,23–33). Our results demonstrate that, in most ca-
ses, the use of conditioning pulses of one or a few seconds is
clearly insufficient to reach equilibrium. These results also
3905
FIGURE 9 Steady-state activation voltage dependence
of HERG channels without amino terminus and carrying
single-point mutations in the S4-S5 loop. (A) Comparison
of membrane currents obtained from oocytes expressing
double mutant HERG channels after 10-s depolarizations to
different voltages as indicated at the top. Only currents
recorded at the end of the depolarizing steps and the tail
currents corresponding to the boxed area are shown. Note
the more negative repolarization voltage (100 mV) used
with G546C 1 D2-370 channels as compared with that
(80 mV) used with R541A 1 D2-370 and Y542C 1 D2-
370 constructs. (B) Activation voltage dependence under
steady-state conditions of the double mutant channels.
Fractional activation curves were obtained from tail cur-
rents, with open and filled symbols corresponding to data
recorded in response to 10-s prepulses from hyperpolarized
and depolarized holding voltages, respectively. The con-
tinuous lines correspond to Boltzmann curves that best
fitted the data. The dotted lines represent the deduced
position of the activation curves under steady-state condi-
tions obtained as a mean of those corresponding to both
holding voltages. Note the good correspondence of all plots
regardless of the holding-potential level. The V½ values for
the steady-state curves are indicated by arrows in the
graphs. (C) Superimposed steady-state activation curves
for different constructs. Activation curves for wild-type
channels and those corresponding to the single mutants are
also shown for comparison. (D) Summary of kinetic and
thermodynamic parameters obtained under steady-state
conditions for the different channels. *p , 0.05 versus
wild-type. #p , 0.05 versus single mutants in the S4-S5
loop or amino-terminus-deleted D2-370 channel.
indicate that 10-s-long prepulses could yield quasi-steady-
state characteristics for channels showing relatively fast
activation/deactivation rates, but they might be inadequate to
determine the kinetic and thermodynamic behavior of chan-
nels with slow activation and deactivation rates around the
V½ values of the activation curves (e.g., wild-type or G546C
isoforms). Apart from introducing uncertainties in the cal-
culated parameters, this would also preclude appropriate es-
timations of the impact caused by a structural modification
until measurements are performed under equivalent condi-
tions. Interestingly, the key role of slow activation gating in
deviations from steady state has been previously recognized,
even after long depolarization prepulses (22). Our results
indicate that the combination of slow activation and deacti-
vation rates determines the shifts from the steady-state acti-
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
3906
vation (nN) curves. Thus, very small shifts in nN curves are
obtained, not only with D138-373 channels showing a se-
lective acceleration of activation kinetics but also with sev-
eral constructs (e.g., D2-16, D2-135, D2-370, R541H,
R541A, or Y542C) exhibiting activation kinetics equivalent
to those of wild-type but a marked acceleration of closing.
Previous work with channel constructs modified in the
initial region of HERG amino terminus including the eag/
PAS domain indicated the crucial role of this segment in
setting deactivation characteristics and suggested that it can
interact with the gating machinery, likely at the S4-S5 loop
level (19–21,23). A specific role on HERG activation gating
has also been proposed for the proximal domain located in
the amino terminus between the eag/PAS and the first
transmembrane helix, because deleting this region or modi-
fying a short cluster of basic residues near S1 helix caused
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
FIGURE 10 Effect of combining S4-S5 single-point mu-
tations with the deletion of the amino terminus on HERG
activation rates. (A) Plots of the dependence of activation
rates on depolarization membrane potential (left) or total
potential driving force (right) for the different mutants. (B)
Comparisons of the activation speed expressed as the in-
verse of the half-activation time at 0 mV (left) or 4 kcal/mol
of electrochemical driving force (right). Data from wild-
type channels and single mutants also illustrated in Figs. 3
and 7 are shown for comparison. *p , 0.05 versus wild-
type. #p , 0.05 versus single mutants in the S4-S5 or
amino-terminus-deleted D2-370 channel.
strong alterations of activation properties (33,34,45). How-
ever, a possible role of the initial amino-terminal segment on
activation properties has not been previously recognized. Our
current results indicate that the relevance of this protein
segment in normal activation gating is greater that previously
depicted. Thus, significant positive shifts in steady-state ac-
tivation voltage dependence associated with a reduction of zg
values and a less negative DGo are caused by selective de-
letion of this domain. These effects map to the initial region
of the protein because they are also observed in channel var-
iants lacking only the first 16 residues of the amino terminus.
The differences in activation kinetics also extend to opening
rates once differences in driving force are taken into account
because the activation of the deleted constructs is at least
twofold faster at equivalent electrochemical potentials. Be-
cause these deleted channels also show a marked acceleration
Steady-State Properties of HERG Mutants
of deactivation, it is conceivable that the alterations in the
amino terminus cause stabilization of a transition state
leading to a smaller energetic barrier between the group of
closed and open states and hence faster activation and de-
activation kinetics.
It is important to emphasize that our analysis does not al-
low us to identify the individual steps in the gating pathway
that are influenced by the mutations but only to recognize
positions or structures altering the whole gating process. It is
also evident that for a voltage-dependent event, the speed of
the process will be related to the amount of force (chemical
plus electrostatic potential) driving it. Therefore, the distinct
deviations from electrochemical equilibrium must be taken
into account in comparing mutants to ensure that differences
in gating rates are not simply secondary to shifts in voltage
dependence. It could be argued that, because activation and
3907
FIGURE 11 Effect of combining S4-S5 single-point mu-
tations with the deletion of the amino terminus on HERG
deactivation rates. (A) Plots of fast deactivation time con-
stants as a function of voltage (left) or total electrochemical
driving force (right). (B) Summary of deactivation rates at
100 mV (left) and 4 kcal/mol of electrochemical driving
force (right). The speed of deactivation of the different
mutants is compared according to the inverse value of the
deactivation time constant. Data from wild-type channels
and single mutants also illustrated in Figs. 4 and 8 are
shown for better comparison. *p , 0.05 versus wild-type.
#
p , 0.05 versus single mutants in the S4-S5 loop or amino-
terminus-deleted D2-370 channel.
deactivation rates are measured at potential ranges at which
subsecond time constants are present but very long voltage
steps are necessary to derive the equilibrium parameters,
different gating transitions are being isolated in both cases.
Note, however, that although activation and deactivation
rates cannot be individually measured at potentials around
the activation V½ (e.g., 53 mV for wild-type channels) be-
cause of superpositioning of the two processes, extrapolation
of their values up to these voltages indicates that, for exam-
ple, for wild-type channels, activation half-time and fast
deactivation rate are longer than 1 s. This suggests that the
measured rates and the equilibrium parameters both qualify
the global gating process. It also validates the use of the
steady-state V½ and zg values to correct and compare the
gating rates of the different mutants. Interestingly, except for
the D540C mutant, which shows a reduced voltage depen-
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
3908
dence of activation rates, the similar slope of the plots relating
the gating parameters of the different constructs either with
voltage or with driving force over a wide range indicates that
similar conclusions about the effect of the mutations and the
role of different regions in gating would be reached if acti-
vation (and deactivation) rates extrapolated to potential
values near V½ are used.
Deletion of the proximal domain located after the eag/PAS
segment in the amino terminus causes a strong alteration in
activation parameters, but an irrelevant participation of this
domain on deactivation has been proposed (34). However,
a significant acceleration of closing is observed in these
proximal-domain-deleted channels once differences in total
potential energy driving deactivation are considered. As pre-
viously pointed out (33), care should be taken when com-
pensating deactivation rates for driving force because the
extent to which the gate remains coupled to the voltage sen-
sor movement during closing is still an open question. Thus,
the time constants of deactivation have to be corrected for the
corresponding variations in zg and voltage dependence of
activation only if channel closure remains directly coupled
to voltage sensor movements. Until now, the selective al-
terations of activation and deactivation gating by specific
modification of the proximal and the initial amino-terminus
domains, respectively, have been taken as an indication that
both processes were not simple reversions of each other.
However, it is tempting to speculate that the common alter-
ations in response to both structural alterations demonstrated
here are produced because activation and deactivation gating
are related and similarly coupled to sensor reorganizations,
although they can also be strongly influenced by other do-
mains or structures within the protein.
Although the molecular mechanism by which some struc-
tural alterations modify the distribution of HERG closed and
open states is still unclear, a combination of steady-state and
kinetic data can provide important information to identify
gating-sensitive regions in the channel and to show the rel-
ative stability of those states under different conditions. We
observed that all mutants lacking the initial portions of the
amino terminus showed a positively shifted V½ of steady-
state activation and a less negative DGo compared with wild-
type, which indicates that such deletions shift the equilibrium
toward the closed state. Conversely, a negative shift and an
increased DGo indicating a destabilization of the closed state
were observed for proximal domain-deleted channels. Inter-
estingly, in both cases an accelerated activation is obtained
once differences in electrochemical potential energy driving
activation (i.e., (DGo  zgEF) or the differences in total
energy between the open and closed states) are taken into
account. This suggests that the presence of any amino-terminal
segment contributes in wild-type channels to specific chemical
interactions that raise the energy barrier for activation.
Recent work has localized the modulatory effects of the
proximal domain on gating activation to a short positively
charged sequence between residues 362 and 366 that seems
Biophysical Journal 94(10) 3893–3911
Alonso-Ron et al.
to act through an electrostatic influence on the gating ma-
chinery (33). Whether this influence is exerted by a direct
interaction of this sequence with the gating structures them-
selves (e.g., voltage sensor, S4-S5 linker, or channel gate at
the bottom of S6) or indirectly through some intermediate
structure (e.g., distal amino or eag/PAS domains) remains an
open question. Our results indicate that a similar facilitation
of activation is apparent at the same driving force in channels
lacking the initial portion of the amino terminus, the proximal
domain, or both. Because the effects of such deletions on
activation (and deactivation) rates are similar and nonaddi-
tive (as illustrated by D2-370 channels; Figs. 3 C and 4 C),
it is possible to speculate that an adequate positioning of
the eag/PAS-containing region (most probably the first 16
N-terminal residues) toward the channel core is important not
only for normal deactivation as previously proposed but also
for activation gating. Consequently, it is possible that main-
tenance of a normal organization in the amino terminus is
essential for proper orientation of this region and that dis-
rupting it could contribute to modifications of activation
properties. This would also be consistent with the dominant
effect of its deletion on activation voltage dependence. Thus,
the negative shifts caused by removal of the proximal domain
in the D138-373 variant are readily reversed when both
proximal and the initial amino-terminus domains are elimi-
nated, as demonstrated by the similar voltage dependencies
exhibited by the D2-16, D2-135, and D2-370 constructs.
It has been proposed that an interaction of the initial part of
the amino terminus with the S4-S5 linker acts as a determi-
nant of HERG slow deactivation (19,23,39). It has also been
shown that some mutations in this linker alter HERG acti-
vation properties and that it constitutes a crucial component
of the activation process by acting as a coupler between
voltage sensor movements and the gate (39,40). We reasoned
that if physical interaction(s) between the amino terminus and
the S4-S5 loop also participate in modulation of activation
gating, mutations introduced in the contact point(s) at the
level of the S4-S5 loop could phenocopy the effect of the
amino-terminal deletions. Furthermore, it could also be ex-
pected that the effects of both structural alterations would not
be additive. Steady-state properties of mutants in residues
540 to 546 show some differences as a function of the mu-
tated residue. Clear displacements of the V½ to more positive
voltages and a notably less negative value of DGo were ob-
tained after introducing a cysteine at residues D540, Y542,
and Y545. On the other hand, a remarkable acceleration of
activation (and deactivation) kinetics was observed in these
three mutants, indicating an agreement between the behavior
of the channels lacking the initial segment of the amino ter-
minus and that of the S4-S5 loop-altered constructs. As an
additional control to strengthen the possibility of an amino
terminus/S4-S5 loop interaction, we characterized the effect
of mutations in the S4-S5 linker using an amino-terminal-
deleted channel as background. Surprisingly, in all cases the
behavior of the double mutants did not correspond to any of
Steady-State Properties of HERG Mutants
the single mutants. It is difficult to conceive a mechanism by
which the S4-S5 single-point mutations could cause addi-
tional effects on channels lacking virtually the whole amino
terminus if such an effect strictly relies on a physical inter-
action between the two structures. Although these data are
not contrary to the possibility that such an interaction exists,
they demonstrate that in no case are the structural and/or
functional alterations induced in the gating machinery by the
S4-S5 mutations neutral by themselves. Therefore, caution
must be exercised when using them as an argument in favor
of or against the existence of the interaction.
The changes in activation kinetics of the D540C and
Y542C channels were accompanied by a strong zg reduction.
Thus, our data indicate the existence of an almost flat ener-
getic profile for these mutants, characterized not only by a
small thermodynamic tendency of the closed-to-open tran-
sition to take place at 0 mV (i.e., near zero DGo) but also by a
low activation energy (i.e., small DGz of the transition state
between the closed and open states). Remarkably, we de-
tected a very small voltage dependence of the D540C channel
activation rates. It has been shown that neutralization of the
negative charge in position 540 makes a prominent compo-
nent of gating charge movement appear at negative voltages,
where channels do not open (49). Altogether, the negative
and positive shifts in the Q-V and the G-V relations, respec-
tively, and the effects on activation and deactivation kinetics
suggest that the mutation uncouples the movements of the
voltage sensor and the activation gate. Albeit with slight
variations, similar alterations have been thoroughly charac-
terized in Shaker channels in which several mutations in the
S4 helix (50,51), the S4-S5 linker (52), and the bottom of S6
(53) have been shown to disrupt the normally tight coupling
between voltage sensor and gate. In that case, movement of
the voltage sensor appeared to be hindered by coupling to the
activation gate, thus helping to explain the effects of carboxy-
terminal S6 mutations in which unloading this region from
the S4-S5 linker allows the S4 segment to more easily carry
its gating charge without effectively opening the permeation
pathway (53). Previous work on HERG strengthened the
evidence of an interaction between the bottom of S6 and the
first part of the S4-S5 linker, specifically at residue 540
(40,54). Interestingly, sensor and pore opening uncoupling in
Shaker leads to slowed activation kinetics (e.g., ILT and V2
mutants; 52,55), but the opposite happens in the HERG
D540C mutant. It is possible that whereas in Shaker such
uncoupling favors a more stable voltage sensor-independent
closed state (56), an unstable HERG closed channel is gen-
erated after mutation of residue 540. This would also be
consistent with the recently observed stabilization of the
activation gate closed conformation by interactions between
the initial portion of the S4-S5 linker (around D540) and the
C-terminal S6 residues around R665 or L666 (43).
In summary, our results indicate that besides the gate and
the voltage sensor located in the central channel core, other
cytoplasmic regions such as the initial part of the amino
3909
terminus can influence normal function of the HERG gating
machinery. Some of these effects cannot be exerted only on
the deactivation process as previously recognized (19,23,39)
but also affect the activation behavior, probably by modu-
lating the transduction of charge movement into channel
opening and closing. Previous studies measuring time con-
stants without correcting for driving force or for the shift in
V½ determined at true steady state may have misinterpreted
observations about how amino-terminal regions or the S4-S5
linker modulate relative stability of closed and open states
and the energy of gating transitions between them. Our data
also suggest that in addition to the slow movement of the
voltage sensor itself (30,36,37), delaying voltage sensor and
activation gate functional coupling by other channel struc-
tures can contribute to the atypically slow activation of
HERG. Although further work is needed to elucidate the
exact interactions involved, it is possible that physical cou-
pling of the initial amino-terminal segment to the bottom of
helix S4 or the S4-S5 linker could contribute to these mod-
ulatory effects.
This work was supported by grants SAF2003-00329 from Ministerio de
Ciencia y Tecnologı́a, BFU2006-10936 from Ministerio de Educación y
Ciencia of Spain (both partially cofinanced by FEDER European Funds)
and IB05-002 from Principado de Asturias (Spain). C.A.R. is a predoctoral
fellow from the Spanish Ministerio de Ciencia y Tecnologı́a (refs. BES-
2004-3872). P.M. holds a predoctoral fellowship from FICYT of Asturias
(ref. BP03-108).
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 Pflugers Archiv-European Journal of Physiology

Participation of HERG channel cytoplasmic structures

on regulation by the G-protein-coupled TRH receptor
Fo

Journal: Pflugers Archiv-European Journal of Physiology

Manuscript ID: EJP-00269-2008.R1

r

Manuscript Type: Original Articles

Pe

Date Submitted by
n/a
the Author:
er

Complete List of Alonso-Ron, Carlos; University of Oviedo,

Authors: Biochemistry and Molecular Biology
Barros, Francisco; University of Oviedo, Dept.
Biochem. & Mol. Biol.
Re

Manso, Diego; University of Oviedo, Biochemistry

and Molecular Biology
Gomez-Varela, David; University of Oviedo,
vi

Biochemistry and Molecular Biology

Miranda, Pablo; University of Oviedo, Biochemistry
ew

and Molecular Biology

Carretero, Luis; University of Oviedo, Biochemistry
and Molecular Biology
Dominguez, Pedro; University of Oviedo,
Biochemistry and Molecular Biology
de la Peña, Pilar; University of Oviedo, Biochemistry
and Molecular Biology

Potassium channel, Regulation, Gating, Thyrotrophin

Keywords: releasing hormone, Ether- -go-go, Cardiac
potassium current, Site-directed mutagenesis
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10
Participation of HERG channel cytoplasmic structures on regulation by the G-
11 protein-coupled TRH receptor
12
13
14
15
16
17 Carlos Alonso-Ron, Francisco Barros, Diego G. Manso, David Gómez-Varela, Pablo
18
19 Miranda, Luis Carretero, Pedro Domínguez and Pilar de la Peña
20
Fo

21
22
23
24
rP

25 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Edificio Santiago Gascón, Campus

26
27
del Cristo, Universidad de Oviedo, E-33006, Oviedo, Asturias, Spain.
28
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ee

30
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rR

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ev

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41
iew

42
43
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45 Running title: Cytoplasmic domains and hormonal modulation of HERG
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57 Send correspondence to Dr. Francisco Barros at the above address. Phone: +34-985-
58
59 103565; FAX: +34-985-103157; email: fbarros@uniovi.es
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2
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4
5 ABSTRACT
6
7
8 Human ether-a-go-go-related gene (HERG) channels heterologously expressed
9
10
in Xenopus oocytes are regulated by the activation of G-protein-coupled hormone
11 receptors that, like the thyrotropin-releasing hormone (TRH) receptor, activate
12
13 phospholipase C. Previous work with serially deleted HERG mutants suggested that
14 residues 326-345 located in the proximal domain of the channels amino terminus might
15
16 be required for the hormonal modulation of HERG activation. Generation of new
17 channel mutants deleted in this region further point to the amino acid sequence between
18
19 residues 326-332 as a possible determinant of the TRH effects, but individual or
20 combined single point mutations in this sequence demonstrate that maintenance of its
Fo

21
22 consensus sites for phosphorylation and/or interaction with regulatory components is
23 not important for the modulatory response(s). The TRH-induced effects also remained
24
rP

25 unaltered when a basic amino acid cluster located between residues 362 and 366 is
26
27
eliminated. Additionally, no effect of TRH was observed in channels carrying single
28 point mutations at the beginning of the intracellular loop linking transmembrane
29
ee

30 domains S4 and S5. Our results indicate that a correct structural arrangement of the
31 amino terminal domains is essential for the hormone-induced modifications of HERG
32
activation. They also suggest that the hormonal regulatory action is transmitted to the
rR

33
34 transmembrane channel core through interactions between the cytoplasmic domains and
35
36 the initial portion of the S4-S5 linker.
37
ev

38
39
40 Keywords: HERG, potassium channel, gating, hormonal regulation, cytoplasmic
41
iew

42 domains, amino terminus, S4-S5 linker

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6
INTRODUCTION
7
8
9
10
Ether-a-go-go-related gene (ERG) potassium channels play a key role setting the
11 electrical behaviour of a variety of cell types [2,3,5,8,13,27,30,34]. The human-ERG
12
13 (HERG) channel mediates the cardiac repolarizing current IKr [32,40]. Reduction of
14 this current due to mutations in HERG or to channel blockade by cardiac and non-
15
16 cardiac drugs causes congenital type 2 long QT and most of the acquired long QT
17 syndromes, respectively [9,14,20,28,32,37,42]. Long QT syndrome is a clinical disorder
18
19 characterized by prolongation of the QT interval on the electrocardiogram, associated
20 with an increased risk of life-threatening arrhythmias [29,36,42]. It is known that many
Fo

21
22 cardiac events in patients with long QT syndrome including the HERG-asssociated
23 LQT2 occur during physical or emotional stress (reviewed in [27,30,37]) suggesting a
24
rP

25 link between β- and/or α-adrenergic stimulation and the pathological manifestation of

26
27
the disease. The regulation of HERG currents by cAMP through direct and protein
28 kinase A-mediated mechanisms triggered by β-adrenergic activation has been reported
29
ee

30 (reviewed in [23,39]). It has also been demonstrated, both in heterologous expression

31 systems and cardiomyocytes, that the activation of phospholipase C (PLC)-coupled
32
receptors [such as cardiac α1A-adrenergic, α1C-adrenergic and thyrotropin-releasing
rR

33
34 hormone (TRH) receptors] and the activation of protein kinase C, cause HERG current
35
36 reductions and a positive shift in the HERG activation curve [4,6,18,38]. Interestingly,
37 β-blockers remain the mainstay of long-term therapy for long-QT patients [30,37,43].
ev

38
39 However, the response of type 2 HERG-associated long-QT patients to these agents is
40 less complete than that of type 1 long-QT patients [37] and in these cases a combination
41
iew

42 of β-blockade and left cardiac sympathetic denervation, that would also block α-
43
adrenergic pathways, appears to provide significant additional protection [26,37,43].
44
45 Therefore, it is of great interest to better understand the molecular reasons for the effects
46
47
of PLC-coupled receptor activation on HERG properties.
48 We have previously demonstrated that activation of PLC-coupled receptors,
49
50 such as TRH and serotonin-1c receptors co-expressed in Xenopus oocytes with HERG
51 channels, modifies HERG channel gating; slowing activation, accelerating deactivation
52
53 and shifting the activation voltage dependence in the depolarizing direction [4,16].
54 Similar effects on activation have been reported in response to α-adrenergic receptor
55
56 stimulation and to protein kinase C activation with phorbol esters [18,38]. ERG
57 channels endogenously expressed in adenohypophysial cells are also similarly
58
59 modulated by TRH [16,25,36]. In an attempt to characterize the structural requirements
60
for hormonal regulation of channel activation, we used channel variants carrying serial
deletions in the proximal domain of the HERG amino terminus extending from several
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2
3 positions in the channel sequence up to residue 373 near the first transmembrane helix
4
5 [16]. Based on the fact that normal hormonal responses are observed with channels
6
lacking the protein segment corresponding to residues 345-373, but that the TRH-
7
8 induced modifications in activation properties are virtually abolished when an
9
10
additional segment (residues 326-373) is deleted, we concluded that the sequence
11 extending from residues 326 to 345 is essential for the hormonal modulation of HERG
12
13 activation [16]. To further identify the minimal amino acid sequence required for the
14 hormonal effects we used here a new HERG variant lacking residues 333 to 373. Since
15
16 the TRH-induced effects in activation were totally normal in the ∆333-373 mutant but
17 were lacking in the ∆326-373 construct, this initially suggested a requirement of the
18
19 326-332 sequence for the hormonal effects to take place. Surprisingly, introduction into
20 this sequence of single or combined point mutations leading to disruption of consensus
Fo

21
22 sites for phosphorylation by different protein kinases or for interaction with regulatory
23 components such as 14-3-3 proteins and inositol phospholipids, did not modify the
24
rP

25 TRH-induced responses. Also, the identification of a positively charged amino acid

26
27
cluster (residues 362-366 near the S1 segment) as an important determinant of HERG
28 activation characteristics [32], prompted us to evaluate its significance for hormonal
29
ee

30 modulation of activation gating, either alone or in combination with the 326-332

31 sequence. Finally, introduction of single point mutations in the initial portion of the
32
intracellular loop that links HERG transmembrane domains S4 and S5 abolished the
rR

33
34 hormonal effects. Our results suggest that the effect of the amino terminal deletions
35
36 antagonizing the TRH-induced regulation of HERG is not mainly due to elimination of
37 specific amino acid sequences, but instead results from structural modifications in the
ev

38
39 cytoplasmic domains and/or disruption of their normal positioning towards the
40 transmembrane channel core. Furthermore, we identify the initial portion of the S4-S5
41
iew

42 HERG linker as a key point for transmission of the regulatory actions triggered by
43
activation of the PLC-coupled receptors from the cytoplasmic domains to the channel
44
45 core.
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4
5 METHODS
6
7
8 Plasmids and preparation of cRNA
9
10
The original plasmid containing the cDNA for the HERG channel was a
11 generous gift of Dr. E. Wanke (University of Milan, Italy). Isolation of the TRH-R
12
13 cDNA has been described previously [10]. For in vitro cRNA synthesis HERG
14 constructs cloned in the psP64A+ vector were linearized and capped cRNA was
15
16 synthesized from the linear cDNA templates by standard methods using SP6 RNA
17 polymerase as described previously [4,10,11].
18
19
20 Generation of HERG channel mutants
Fo

21
22 Procedures for the generation of the ∆2-135, ∆138-373 and ∆326-373 variants
23 have been detailed elsewhere [1,15,42]. Variant ∆333-373 was constructed in a similar
24
rP

25 way using a forward polymerase chain reaction (PCR) primer containing a Hind-III site
26
27
and including the coding sequence for the first six residues of HERG (5'-TTG AAG
28 CTT CTC AGG ATG CCG GTG CGG AGG GGC-3') and a reverse primer containing
29
ee

30 the coding sequence corresponding to amino acids 325-332 followed by a 9-bp

31 sequence corresponding to amino acids 374-376 and with a unique BstEII site (5'-CTG
32
GGT GAC CTT GTC AAT GGT GCG GTA GCG CAC G-3'). Variant ∆345-373 was
rR

33
34 generated in a similar way using a PCR reverse primer containing HERG coding
35
36 sequence corresponding to residues 338-344 followed by the 9-bp sequence containing
37 the unique BstEII site (5'-CTG GGT GAC CTT GAG GTC CAC AAA GTT GAG G-
ev

38
39 3'). Construction of variant ∆326-341 was performed by combining two independent
40 constructs. The first one containing the 342-698 HERG sequence was obtained by PCR
41
iew

42 using a forward primer containing the SalI site followed by the coding sequence 343-
43
348 (5'-CCG TGT CGA CCT CAA GGG CGA CCC CTT C-3'). The reverse primer
44
45 contained the sequence corresponding to residues 694-701 and the unique XhoI site in
46
47
the HERG sequence. The amplification product was digested with SalI and XhoI,
48 purified and subcloned into pBluescript KS+, yielding the construct pBKS+ HERG 342-
49
50 698. The second construct containing the HERG coding sequence from amino acids 1 to
51 325 and a SalI site was obtained by PCR using a forward primer containing the Hind-III
52
53 site and covering the 5' end of the HERG cDNA including the initial ATG triplet (5'-
54 TGG AAG CTT CTC AGG ATG CCG GTG CGG AGG GGC CAC-3') and a reverse
55
56 primer that contained the HERG coding sequence corresponding to residues 319-325
57 and 342-343 and also a SalI site (5'-CCT AGT CGA CGA GGT CGC AGT CCG AGG-
58
59 3'). The amplification product was digested with HindIII and SalI, purified and
60
subcloned into the pBKS+ HERG 342-698 construct yielding the pBKS+ HERG 1-698
construct with the 326-341 deletion. Finally, the HindIII/XhoI fragment of this construct
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1 6
2
was introduced into the corresponding site of the psP64A+ plasmid containing the
3
4
5 cDNA for the wild-type HERG.
6
7 For construction of the InsA/326-341 and InsB/326-341 variants in which the
8 326-341 sequence is substituted by other sequences unrelated to HERG, a double chain
9
10 oligonucleotide 5'-TGC ACC GCT ACC CGT ACG ACG TTC CGG ACT ACG CCA
11 CCC TCA ACT TTG-3' was subcloned into the SalI site of the ∆326-341 variant. This
12
13 oligonucleotide contained a BsiWI site and two SalI sites at both ends. The sense and
14 antisense oligonucleotides used to generate the double chain segment were hybridized
15
16 after phosphorylation with ATP and polynucleotide kinase. Insertion of this double
17
18
chain oligonucleotide into the SalI site of ∆326-341 was done in both sense and
19 antisense orientation yielding the InsA/326-341 and InsB/326-341 variants in which the
20
original HERG 326-341 segment is substituted by DRYPYDVPDYATLNFV and
Fo

21
22 DKVEGGVVRNVARVAV sequences, respectively.
23
24 Construction of the ∆155-209 variant was also performed by PCR using a
rP

25 forward primer containing the sequence coding for HERG residues 152-154 and 209-
26
27 215 as well as a BstXI site that corresponds to the sequence of residues 152-154 and
28 209 (5'-CCA GCT GGG TGG ACG TGG ACC TGA CG-3'). The reverse primer
29
ee

30 contained the coding sequence corresponding to residues 365-372 and a BstEII site (5'-
31 GGA CAG GAC CTG GGT GAC CTT CTC-3'). The PCR product digested with BstXI
32
and BstEII was gel-purified and substituted into the wild-type psP64A+ HERG.
rR

33
34
The point mutants D540C, R541H and Y542C were created by site-directed
35
36 mutagenesis using the PCR-based overlap extension method as previously described
37
[1,15,42]. The resulting PCR products were digested with BstEII/XhoI and ligated into
ev

38
39 BstEII/XhoI-digested wild-type psP64A+ HERG.
40
41 All constructs were sequenced to confirm the mutations and to ensure the
iew

42 absence of frame errors.

43
44
45 Expression of receptors and HERG channel variants and current recording conditions
46
47 in Xenopus oocytes
48 Procedures for frog anesthesia and surgery, obtaining oocytes and microinjection
49
50 have been detailed elsewhere [1,4,11,12,15,16,42]. Oocytes were maintained in OR-2
51 medium (in mM: NaCl 82.5, KCl 2, CaCl2 2, MgCl2 2, Na2HPO4 1, HEPES 10, at pH
52
53 7.5). Cytoplasmic microinjections were performed with 30-50 nl of in vitro synthesized
54
55
cRNA per oocyte. HERG currents were studied in manually defolliculated oocytes [4].
56 Unless otherwise specified, recordings were obtained in high-K+ medium in which 50
57
58 mM KCl substituted an equivalent amount of NaCl to maximize tail current magnitude
59 at negative repolarizing potentials and/or to obtain an adequate current magnitude with
60
those mutants showing lower expression levels. The amount of cRNA was calibrated to
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1 7
2
3
maintain inward current levels in the 1-6 µA range at repolarizing voltages around -100
4
5 mV to ensure proper voltage control. Functional expression was typically assessed 2-3
6
7
days after microinjection. Recordings were made at room temperature using the two-
8 electrode voltage-clamp method with a Turbo TEC01C amplifier (NPI, Tamm,
9
10 Germany) as described previously [1,4,15,16,42]. Membrane potential was typically
11 clamped at -80 mV except for constructs ∆138-373, ∆326-373, ∆333-373 and ∆345-373
12
13 in which a -100/-110 mV basal voltage was used to compensate for the left-shift in
14 voltage dependence of activation caused by the deletions. This ensures that in all cases
15
16 the whole channel population remains closed at the holding potential used. TRH data
17 collection started 2 min after adding the hormone. Stimulation and data acquisition were
18
19 controlled with Pulse+PulseFit software (HEKA Elektronic, Lambrecht, Germany)
20 running on Macintosh computers. Ionic currents sampled at 1 KHz were elicited using
Fo

21
22 the voltage protocols indicated in the graphs. Data analysis and exponential fits to ionic
23
24
currents were performed with the programs PulseFit (HEKA Elektronic) and Igor-Pro
rP

25 (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR, USA). A P/n method was used for leak and
26
27 capacitive current subtraction. Kinetic parameters of activation and deactivation were
28 obtained as previously described [1,16,42]. The voltage dependence of current
29
ee

30 activation was assessed using standard tail current analysis. Tail current magnitudes
31 normalized to maximums were fitted with a Boltzmann function:
32
h(V) = Imax [1/(1 + exp((V - V1/2)/k))]
rR

33
34 where V is the test potential, V1/2 is the half-activation voltage, and k is the slope factor.
35
36 The time course of voltage-dependent activation was studied using indirect envelope of
37 tail current protocols, varying the duration of depolarising prepulses and following the
ev

38
39 magnitude of the tail currents upon repolarization. The time necessary to reach a half-
40
maximal tail current magnitude was used to compare the speed of activation for the
41
iew

42 different channel variants.

43
44
45 Statistics
46
47 Data are presented as means ± S.E.M. with the number of oocytes indicated in
48 the graphs. Significance level is indicated by P. Comparisons were performed with the
49
50 InStat program (GraphPad Software) by the parametric Student's unpaired t test (2-
51 tailed) except in cases in which significant differences in standard deviations were
52
53 present. In these cases an alternate Welch's test for Gaussian populations with unequal
54 S.D. was used. P-values <0.05 were considered as indicative of statistical significance.
55
56
57
58
59
60
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1 8
2
3
4
5 RESULTS
6
7
8 Effect of amino terminus ∆2-135 and ∆333-373 deletions on the TRH-induced
9
10
modifications of HERG activation
11 Our previous studies to test the relevance of different segments of the HERG
12
13 amino terminal regions on TRH-induced regulation of activation kinetics, indicated that
14 the hormone induces a clear slowing of activation and a marked shift in activation
15
16 voltage both in wild-type channels and in those lacking residues 345-373 of the
17 proximal domain in the amino terminus, but that the hormonal effect is virtually
18
19 abolished in those channel variants from which either the 326-373 sequence or a longer
20 amino acid stretch extending up to the whole proximal domain sequence (e.g. ∆284-
Fo

21
22 373, ∆223-373 and ∆138-373 mutants) is deleted. Since the 345-373 segment is not
23 necessary for the hormonal effects to take place, but the deletion of 19 additional
24
rP

25 residues (∆326-373 construct) eliminates such effects, we interpreted that the relatively
26
27
short sequence extending from residues 326 to 345 is essential for the hormonal
28 modulation of HERG activation [16]. In an attempt to further delimit the specific region
29
ee

30 involved in the hormonal regulation, here we generated two new constructs: a variant
31 lacking residues 333-373 in the proximal domain and a ∆2-135 channel lacking the
32
eag/PAS domain (see Methods). The activation voltage dependence of these mutants
rR

33
34 and their modification upon treatment with TRH in oocytes co-expressing the channel
35
36 and the TRH receptor are compared with those corresponding to the ∆326-373 and
37 ∆345-373 constructs in Fig. 1. It can be observed that, unlike the results obtained with
ev

38
39 ∆326-373 and ∆138-373 (see also [16]), a shift in activation voltage dependence
40 analogous to that observed in wild-type HERG (from –18.7 ± 1.1 mV of V1/2 without
41
iew

42 hormone to –1.4 ± 1.2 mV after TRH, n=30) is induced by the hormone in the eag/PAS-
43
deleted ∆2-135 construct (from –20.5 ± 0.4 to –6.9 ± 2.3 mV, n=11). This indicates that
44
45 the eag/PAS region is not necessary for the hormonal effect.
46
47
Performance of an activation voltage dependence analysis with the ∆333-373
48 construct in the absence of hormone demonstrates that the activation V1/2 of this variant
49
50 is slightly shifted (≈11 mV) to more depolarized voltages as compared to wild-type.
51 This strongly contrasts with all other mutants with different size proximal domain
52
53 deletions in which the activation voltage dependence is markedly shifted to more
54 hyperpolarized voltages (e.g. from –18.7 mV in the wild-type to -60 and -44 mV in
55
56 ∆326-373 and ∆345-373 channels, respectively. See also [16,42]). Consistent with
57 previous results [32], it is likely that the hyperpolarizing modifications of basal
58
59 activation voltage dependence in channels lacking the positively charged KIKER
60
sequence (between residues 363 and 367), are compensated by substitution of this
sequence by an equivalently positive stretch (RIRTYSK using the one letter amino acid
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1 9
2
3
code) in the ∆333-373 construct, leading to a wild-type behaviour. Regardless of the
4
5 modifications in the I/V curves caused by the deletion itself, a prominent shift of 20.1 ±
6
7
1.0 mV can be observed (analogous to those obtained with ∆345-373 and wild-type
8 channels) triggered by the hormone in oocytes expressing ∆333-373 channels. It is
9
10 important to note that: i) the differences in the basal or hormonally-induced behaviour
11 of the constructs were not related to the different conditions used for recording
12
13 membrane currents (i.e., 50 mM KCl) in these experiments, since the position of the I/V
14 curves and their displacement in response to TRH addition were the same when ∆326-
15
16 373 and ∆333-373 currents were recorded in medium containing 2 mM KCl (not
17 shown), and ii) the position of the I/V curves along the voltage axis did not act as an
18
19 important determinant of the hormonal effect, since an analogous shift was observed in
20 ∆345-373 and ∆333-373 channels, in spite of the fact that in the absence of hormone
Fo

21
22 their voltage dependencies appeared displaced to hyperpolarizing and depolarizing
23
24
voltages, respectively, as compared with the wild-type channel. In principle, these
rP

25 results would be compatible with the interpretation that the seven amino acid RYRTISK
26
27 segment corresponding to residues 326-332 could be acting as a determinant of the TRH
28 effects since the hormone-induced response is absent from channels lacking residues
29
ee

30 326-373 but is recovered in the ∆333-373 construct.

31 As a further confirmation of the results obtained by looking at the voltage
32
dependence of activation, we also used the deleted variants to analyze the TRH-induced
rR

33
34 effects on activation rates. Due to the overlap of relatively slow activation transitions
35
36 and fast inactivation rates in HERG upon depolarization, we monitored the time course
37 of transitions from closed to open states using an indirect envelope of tail currents
ev

38
39 protocol, following the increase of tail current magnitude as a result of duration
40
increases in a previous depolarization pulse at a fixed voltage. As shown in Fig. 2, the
41
iew

42 time necessary to attain a half-maximal tail current was more than two-fold longer after
43
44
addition of TRH to ∆2-135 and ∆333-373 channels, a result similar to that obtained
45 with wild-type and ∆345-373 channels. However, the activation rate remained almost
46
47 unaltered following hormone addition to channels lacking either the 326-373 segment
48 or most of the proximal domain (∆138-373). This confirmed and extended our previous
49
50 results and indicated that increasing the length of the deletion by seven additional
51 residues (from ∆333-373 to ∆326-373) causes an almost complete loss of the TRH-
52
53 induced effects on activation parameters.
54
55
56 Effect of mutations in the 326-332 (RYRTISK) HERG sequence on TRH-induced
57
modifications of activation parameters
58
59 The identification of the short RYRTISK sequence corresponding to residues
60
326-332 as a possible determinant of the hormonal effects, opened some a priori
exciting and additional possibilities. As a matter of fact, several consensus sequences
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1 10
2
3 are localized in this short region including phosphorylation sites for tyrosine kinases at
4
5 Y327, for protein kinase A (RX1-2S/TX) and Ca-Calmodulin kinase II (RXXS/TX) at
6
T329, and for protein kinase B/Akt (RXRXXS/T) at S331 [21,22,47]. Interestingly,
7
8 protein kinases A, B and tyrosine kinase(s) have been proposed as regulators of HERG
9
10
currents [7,23,47]. Furthermore, the presence of three positively charged residues in the
11 seven residue segment 326-332 constitutes a hypothetical determinant of PIP2 binding,
12
13 a putative modulator of HERG channel activity [6]. Finally, the RYRTISK sequence is
14 a variant of the RXXpS/pT motif that constitutes a consensus for interaction with 14-3-
15
16 3 proteins, also proposed as modulators of HERG [19]. Based on this information,
17 several point mutants were generated in which residues R326, Y327, R328, T329 and
18
19 S331 were changed to alanine, and a triple mutant (YTS/AAA) in which the three
20 putatively phosphorylated residues were simultaneously changed to alanine was
Fo

21
22 constructed. Surprisingly, the modulatory effects of TRH on activation parameters
23 including the slowed activation rate and the shift in activation voltage dependence were
24
rP

25 not modified by any of the mutations (Fig. 3). This suggests that the impairment of the
26
27
hormonal effects caused by extending the size of the deletions from residue 333 up to
28 amino acid 326 was not due to elimination of any of the aforementioned consensus
29
ee

30 sites, but was possibly related instead to the deletion itself and/or to a general disruption
31 of a structural motif linked to this region in the channel molecule.
32
As a last test of the real contribution of the 326-332 sequence to the hormonal
rR

33
34 modulation, the TRH effects were tested in other constructs carrying only a short
35
36 deletion that includes the 326-332 sequence and its surroundings (construct ∆326-341),
37 and in variants in which the 326-341 sequence was replaced by sequences unrelated to
ev

38
39 HERG (constructs InsA/326-341 and InsB/326-341, see Methods). As shown in Fig. 4,
40 deleting the 326-341 segment or exchanging it with other unrelated sequences did not
41
iew

42 significantly alter the TRH-induced modifications of HERG activation voltage

43
dependence and activation rates. This supports the results obtained with the single point
44
45 mutations and unequivocally demonstrates that the amino acid sequence located
46
47
between positions 325 and 333 does not determine by itself the hormonal regulatory
48 effects.
49
50
51 Maintenance of the TRH-induced effects in channels lacking the positively charged
52
53 amino acid cluster (KIKER sequence) corresponding to residues 362-366
54 As indicated above, it has been shown that the positively charged KIKER
55
56 sequence corresponding to residues 362-366 constitutes an important determinant of
57 HERG activation characteristics [32]. Due to their positioning near the sequence(s) that
58
59 appear to influence the TRH effects, we evaluated the possible significance of those
60
residues for hormonal regulation of activation gating. For this purpose we first
generated two new constructs (Fig. 5A) either by substituting the three basic residues of
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1 11
2
3 the KIKER with alanines (KKR/AAA construct) or by introducing a short deletion that
4
5 included the KIKER sequence (∆363-373 construct). Additionally, these mutations were
6
combined with the YTS/AAA triple mutant (YTS/AAA+KKR/AAA and
7
8 YTS/AAA+∆363-373 constructs) or with the ∆326-341 deletion (∆326-341+KKR/AAA
9
10
and ∆326-341+∆363-373 constructs), both affecting the RIRTYSK sequence. The
11 results obtained with all these constructs are summarized in Figures 5 and 6. It can be
12
13 observed that the triple mutant KKR/AAA shows a negatively shifted voltage
14 dependence of activation (V1/2 = -39.3 ± 2.3 mV, n=6; p<0.0001 vs wild-type). This
15
16 leftward shift was significantly bigger for the ∆363-373 construct (V1/2 = -51.5 ± 0.4
17 mV, n=9; p<0.005 vs KKR/AAA). Since an equivalent local charge is expected in the
18
19 region around the 363-373 residues in both channels (Fig. 5A), this indicates that some
20 additional disruption of the normal gating behaviour is induced by the deletion.
Fo

21
22 Remarkably, the TRH-induced displacement of the I/V curve to positive potentials
23 remained the same in the KKR/AAA mutant (22.3 ± 3.0 mV shift) and was only slightly
24
rP

25 reduced (11.9 ± 0.6 mV) in the ∆363-373 construct (Fig. 5C,D). Similar results for the
26
27
hormonal effect were obtained when the YTS/AAA or the ∆326-341 mutations around
28 the RYRTISK region were combined with the KKR/AAA or the ∆363-373
29
ee

30 modifications, respectively (Fig. 5D). Altogether, these results suggest that, in spite of
31 its crucial role in setting the basal activation parameters of HERG, the positively
32
charged KIKER sequence does not act as an important determinant of the hormonal
rR

33
34 regulatory effects on HERG activation behaviour.
35
36 As an additional indication that the KIKER sequence is not essential for the
37 TRH-induced effects on channel activation, we also compared the influence of the
ev

38
39 hormonal treatment on the time course of activation using the same constructs (Fig. 6).
40 Again, the slowing of activation gating caused by TRH in the wild-type channel
41
iew

42 remained the same in the triple mutant KKR/AAA, and was slightly reduced to 63% of
43
the control in the ∆363-373 construct. However, such slowing was more pronounced
44
45 when the KKR/AAA mutant was combined with the YTS/AAA or ∆326-341
46
47
modifications in the RYRTISK region. Finally, a slowing of gating equivalent to that
48 observed in the ∆363-373 construct was obtained when this deletion was combined with
49
50 the YTS/AAA or the ∆326-341constructs (Fig. 6B-D).
51
52
53 Impairment of the TRH-induced effects in ∆155-209 channels
54 The aforementioned results indicate that, different to our initial supposition (see
55
56 above), the impairment of the hormonal effects caused by the ∆326-373 and longer
57 amino terminal deletions is not due to the absence of a specific combination of residues,
58
59 but instead to the size of the deleted region beyond a critical point. This would be
60
coherent with the normal response observed in channels lacking the 16, 41 and 19
residues corresponding to sequences 326-341, 333-373 and 345-373, respectively, and
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1 12
2
3 with the absence of hormonal regulation in the constructs from which more than 48
4
5 residues are lacking (variants ∆326-373 to ∆138-373; see also [16]). To verify this
6
possibility we deleted a 55 amino acid region (variant ∆155-209) similar in size to that
7
8 of the ∆326-373 variant, but located near the amino terminal region of the proximal
9
10
domain. Analysis of the TRH effects on activation parameters of this new construct
11 demonstrated a significant reduction of the TRH-induced shifts in activation voltage
12
13 dependence (Fig. 7). Such a reduction of the hormonal effect was even more prominent
14 regarding the slowing down of the activation at 0 mV. Interestingly, the impairment of
15
16 the hormonal regulatory effects was observed in spite of the fact that the activation
17 properties of the ∆155-209 mutant remained the same as those of the wild-type
18
19 channels. This suggests that the lack of hormonal effects in channels lacking segments
20 326-373 (or with bigger deletions) is not due to alterations in the activation properties
Fo

21
22 induced by the deletions. It therefore supports the interpretation that the effect of the
23 longer deletions is due to structural alteration(s) in the cytoplasmic domain(s) leading to
24
rP

25 a diminished ability to modulate the gating machinery located in the transmembrane

26
27
channel core.
28
29
ee

30 Elimination of the TRH-induced modifications in activation by mutations in the S4-S5

31 linker
32
As indicated above, our data suggest that maintenance of a global structure
rR

33
34 relatively unaltered in the amino terminal domains is important for the regulatory effects
35
36 triggered by TRH. This would explain the lack of hormonal effects once the structure
37 and/or the correct positioning of one or more of these domains towards the channel
ev

38
39 and/or its gating machinery is altered. The intracellular region that links HERG
40 transmembrane domains S4 and S5 has been proposed as a docking site for the N-
41
iew

42 terminal region and also as a possible linker between S4 movement and channel
43
opening or as a part of the activation gate itself [32,42]. Also, data from our laboratory
44
45 suggested that the interaction between amino terminal structures and the S4-S5 linker
46
47
(amino acids 540 to 546) may act as a determinant of changes in activation parameters
48 caused by deletion of proximal domain segments [1]. This prompted us to check
49
50 whether the modulatory effects of TRH on activation parameters can also be altered by
51 structural modifications in the S4-S5 linker. As shown in Fig. 8, the TRH-induced shifts
52
53 in activation voltage dependence are strongly reduced in channels with the single point
54 mutations D540C, R541H and Y542C. A sizeable but significantly smaller shift was
55
56 also observed in the R541A mutant. However, the TRH-induced alteration of activation
57 voltage dependence remained the same (or was even increased) when the amino acids
58
59 located in the carboxy terminal portion of the S4-S5 linker (residues 543, 544, 545 and
60
546) were substituted with cysteines. Analogous results were obtained when the TRH
effect on activation was tested during a time course. Thus, the slowing of activation
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1 13
2
3 triggered by the hormone was also minimized by the mutations D540C, R541H, R541A
4
5 and Y542C, but not by the S543C, E544C, Y545C and G546C mutants (Fig. 9). It is
6
important to emphasize that the reduction of the hormonal effects was similarly
7
8 observed both in the D540C mutant (showing an activation voltage dependence
9
10
relatively shifted to positive values and less steep I/V curves; see [1]) and in the R541H
11 and Y542C mutants showing similar activation properties to those of wild-type
12
13 channels. This indicates that impairment of the TRH-induced effects is specifically due
14 to the disabling of the regulatory mechanism and not to a previous alteration of the
15
16 activation gating process as a consequence of the mutation itself. On the other hand, it
17 also identifies the initial amino-terminal portion of the S4-S5 linker as a crucial point
18
19 for transmission of the regulatory message to the gating machinery.
20 It is important to note that the bulk of constructs used in this study to map the
Fo

21
22 influence of amino terminal structural alterations on activation parameters, have been
23 designed to cover the second half of the proximal domain, previously proposed to be
24
rP

25 involved in hormonal modulation of HERG activation [16]. However, consistent with

26
27
our previous data showing a maintained effect of the hormone on deactivation of
28 channels lacking almost half of the proximal domain (residues 284 to 373, ref [16]), a
29
ee

30 normal acceleration of closing rates equivalent to that obtained with wild-type HERG
31 was observed with most of the constructs used here (supplemental Fig 1). Note also that
32
although a clear impairment of the TRH effect on closing was observed with channel
rR

33
34 variants either deleted in the initial eag/PAS domain (∆2-135) or carrying single point
35
36 mutations in the amino half of the S4-S5 loop (e.g. D540 and R541 residues), a clear
37 interpretation of these data is complicated by the strong modification of closing rates
ev

38
39 induced by the mutations themselves (supplemental Fig 1 and ref [1]).
40
41
iew

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2
3
4
5 DISCUSSION
6
7
8 A distinctive structural signature of HERG channels, that differentiates them
9
10
from the rest of voltage-dependent potassium channels, is the presence of a long stretch
11 of amino acids in the amino terminus (the proximal domain) that separates the initial
12
13 eag domain (conserved in members of the eag channel subfamily) from the first
14 transmembrane helix S1 [42,46]. Our previous studies using HERG deleted variants
15
16 indicated that elimination of the proximal domain induces kinetic alterations that favour
17 channel activation [15,42]. More recent work using the aforementioned channel variants
18
19 suggested that the proximal domain, particularly the sequence corresponding to residues
20 326-345, constituted a crucial component for TRH-induced modulation of HERG
Fo

21
22 activation in oocytes co-expressing TRH receptors and HERG channels [16]. In an
23 attempt to further delimit the molecular determinants of the hormonal effects, we
24
rP

25 generated a HERG variant from which residues 333-373 were deleted. Due to the fact
26
27
that normal TRH-induced responses are obtained with this variant but that a complete
28 elimination of the hormonal effects is achieved by increasing the size of the deletion by
29
ee

30 few additional residues (variant ∆326-373), we initially interpreted that the short
31 sequence extending from residues 326 to 332 was required for the hormonal regulation
32
of HERG activation to take place. The amino acid composition of this sequence was
rR

33
34 especially appealing since it included several consensus sites for phosphorylation by
35
36 different protein kinases and for interaction with regulatory components such as 14-3-3
37 proteins and inositol phospholipids, all of them recently proposed as putative regulators
ev

38
39 of ERG currents [6,7,19,23,47]. Surprisingly, introduction of single point mutations
40 (either individually or combined) in the phosphorylation sites of the 326-332 sequence
41
iew

42 and changing the two arginine residues included in this sequence to alanines, did not
43
alter the TRH-induced effects on activation voltage dependence and activation rates.
44
45 This suggests that the impairment of the hormonal effects caused by extending the size
46
47
of the deletions from residue 333 to amino acid 326 was not due to the elimination of
48 the consensus sites, but it is probably related to the deletion itself and/or to a structural
49
50 disruption of the cytoplasmic domains. An additional demonstration that this is the case
51 is provided by channel variants carrying: i) a short deletion that includes the 326-332
52
53 sequence and its surroundings, or ii) a short stretch of amino acids replacing the
54 sequence contained between residues 326-341 by a different sequence unrelated to
55
56 HERG. In all cases, these structural modifications do not significantly modify the TRH-
57 induced modifications of HERG activation voltage dependence and activation rates.
58
59 The demonstration that the amino acid sequence corresponding to positions 326-
60
332 does not determine by itself the hormonal regulatory effects opens up the possibility
that the lack of hormonal effects in channels without the segment 326-373 (or having
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1 15
2
3 longer deletions) is due to the alteration(s) in activation behaviour caused by the
4
5 deletions themselves. This would be coherent with the absence of TRH effects in
6
variants ∆284-373, ∆223-373 and ∆138-373 showing a very accelerated activation and a
7
8 strong shift in the I/V curves to the left [16] and also with the fact that a normal TRH-
9
10
induced regulation is obtained with ∆333-373 channels with a slightly slower activation
11 and a certain displacement of the I/V curve to more depolarized values. However, a
12
13 normal TRH-induced regulation is observed in ∆345-373 and ∆355-373 channels in
14 which clear accelerations of activation rates and hyperpolarizing shifts are induced by
15
16 the deletions. Additionally, ∆155-209 channels display activation properties analogous
17 to those of wild-type HERG, but show a significant impairment of the hormonal effects.
18
19 Finally, the hormonal regulation is virtually abolished in single-point mutants of the S4-
20 S5 linker that do not show the altered activation kinetics encountered in the proximal
Fo

21
22 domain-deleted mutants. All these data together mean that no correlation exists between
23 the alterations in activation induced by a given mutation and its ability to impair the
24
rP

25 TRH-induced regulation.
26
27
Alternatively, it could be possible that the structural modifications introduced in
28 the channel variants showing a reduced hormonal response could cause a destabilization
29
ee

30 of some cytoplasmic domain(s) and/or their miss alignment towards the channel gating
31 machinery. This possibility is supported by the results obtained with variant ∆155-209
32
which has a deletion equivalent in size to that of the ∆326-373 construct but located in
rR

33
34 the amino-terminal portion of the proximal domain. Even though the hormonal
35
36 regulation was not impaired to the same extent as in the ∆326-373 channels, a
37 significant reduction of the TRH-induced effects was induced by the ∆155-209 deletion.
ev

38
39 Remarkably, the hormonal effect remained unaltered in channels from which the initial
40 135 amino acids (including the eag/PAS, ref. [25]) had been eliminated. This indicates
41
iew

42 that it is the amino terminal proximal domain but not the eag/PAS region which is
43
important for the TRH effects on HERG activation. It is also worth noting that the
44
45 modulatory effects triggered by the hormone were not impaired in channels carrying an
46
47
altered (or absent) KIKER sequence between residues 362 and 367. This demonstrates
48 that in spite of the crucial role of this charged amino acid cluster in setting the basal
49
50 HERG activation phenotype [32], it does not seem to be involved in the hormonal
51 modulation of activation parameters by TRH. Further work will be necessary to identify
52
53 the cytoplasmic structure(s) involved in transmission of the TRH effects to the HERG
54 gating machinery.
55
56 Previous work with HERG and other channels indicated that the S4-S5 linker
57 could play a crucial role in the coupling of the voltage sensing machinery to channel
58
59 activation [40]. This concept has been recently strengthened by structural evidence in a
60
Shaker family K+ channel [24]. It is also known that the S4-S5 linker acts as docking
site for regulation of HERG deactivation gating by amino terminal domains
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1 16
2
3 [15,26,34,44]. Our recent results also suggest that an interaction between the amino
4
5 terminus and the S4-S5 linker may contribute to HERG gating alterations induced by
6
amino terminal deletions [1] or extracellular acidification (Alonso-Ron et al.
7
8 Manuscript in preparation). The results reported here demonstrate that the hormonal
9
10
effects are strongly impaired by single point mutations in the amino terminal portion of
11 the S4-S5 linker. Interestingly, this is observed not only with mutants showing a
12
13 relatively strong alteration of their activation parameters (e.g. D540C channels), but also
14 with channels carrying much more conservative mutations (e.g. R541H) in which
15
16 activation properties similar to those of wild-type channels were obtained. Altogether,
17 this suggests that not only is a correct structural organization of the amino terminal
18
19 domains required, but also an appropriate arrangement of these domains towards the
20 central channel body is critical for hormonal modulation of HERG activation properties.
Fo

21
22 Furthermore, it identifies the initial portion of the S4-S5 linker as a key point for
23 transmission of the regulatory actions triggered by activation of PLC-coupled receptors
24
rP

25 from the cytoplasmic domains to the HERG channel core.

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4
5 ACKNOWLEDGEMENTS
6
7
8 This work was supported by grants SAF2003-00329 from the Ministerio de Ciencia y
9
10
Tecnología, BFU2006-10936 from the Ministerio de Educación y Ciencia of Spain
11 (both partially co-financed by FEDER European Funds) and IB05-002 from the
12
13 Principado de Asturias (Spain). C.A.R. and D.G.M. are predoctoral fellows from the
14 Spanish Ministerio de Ciencia y Tecnología (refs. BES-2004-3872 and AP2000-4363).
15
16 P.M. holds a predoctoral fellowship from FICYT of Asturias (ref. BP03-108).
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5 FIGURE LEGENDS
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8 Fig. 1. Effect of TRH on activation voltage dependence of HERG channels carrying
9
10
deletions in the amino terminal domains. (A) Schematic diagram of HERG amino
11 terminus in wild-type and deletion mutants. The regions corresponding to the eag/PAS
12
13 (residues 16-135) and the proximal domains up to the first transmembrane helix are
14 shown as striped and white bars, respectively. The portion corresponding to amino acids
15
16 1-16 that remained disordered in the eag/PAS crystalline structure [26] is not
17 represented in the scheme. Internal deletions are marked by dashed lines. The size of
18
19 every domain and the lengths of the deletions are represented on a horizontal scale
20 proportional to the total length of the amino terminus. (B) Families of currents obtained
Fo

21
22 in the absence (Control, upper part) or the presence of 1 µM TRH (TRH, lower part)
23 using the voltage protocol shown in the inset. Test pulses were applied once every 20-
24
30 s. Oocytes bathed in high-K+ medium were used for recordings. Note the fast
rP

25
26
27
deactivation kinetics exhibited by the ∆2-135 construct. (C) Effect of proximal domain
28 deletions on TRH-induced shifts in HERG activation voltage dependence. Averaged
29
ee

30 data for the number of oocytes indicated in panel D were used to generate the I/V curves
31 in the absence (open symbols) or the presence (solid symbols) of TRH. The continuous
32
lines correspond to Boltzmann curves h(V) = Imax [1/(1 + exp((V - V1/2)/k))], which
rR

33
34 best fitted the data with V1/2 of -11 and +10 mV for control and TRH-treated ∆333-373
35
36 channels. V1/2 values of ∆2-135, ∆326-373 and ∆345-373 channels corresponded to –
37 20.5 and –6.9, -60.0 and -58.5, and –44.0 and –24.0 mV in the absence or the presence
ev

38
39 of TRH, respectively. Boltzmann curves obtained in the absence of TRH from oocytes
40 expressing wild-type and proximal domain-deleted ∆138-373 channels are also included
41
iew

42 as reference. (D) Comparison of TRH-induced I/V shifts on channels with different

43 deletions in the proximal domain. Shifts in V1/2 value for wild-type and ∆138-373
44
45 channels [16] are also shown for comparison.
46
47
48 Fig. 2. Effect of proximal domain modifications on TRH-induced slowing of HERG
49
50 activation. (A) Time course of voltage-dependent activation obtained in oocytes co-
51 expressing the TRH receptor and the HERG variants indicated at the top, in the absence
52
53 (Control) or the presence of 1 µM TRH studied by varying the duration of a
54 depolarization prepulse according to the voltage protocol shown in the inset. The
55
56 oocytes were bathed in high-K+ medium for recording currents and the activation time
57 course was followed at 0 mV except with ∆326-373 channels in which -40 mV was
58
59 used to compensate for the shift in voltage dependence of activation exhibited by this
60
mutant. In all cases a repolarizing potential of –100 mV was used. (B) Variation in the
tail current magnitude upon repolarization. Averaged data normalized to maximum are
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2
3 shown. The time necessary to reach a half-maximal tail current magnitude (dashed
4
5 lines) is indicated in the graphs. (C) Comparison of TRH effects on activation time
6
course of channels carrying different deletions in the amino terminus. One-hundred %
7
8 increase corresponds to a doubled t0.5 value. Data for wild-type and ∆138-373 channels
9
10
[16] are also included for comparison. The deletion mutants in this figure correspond to
11 those schematized in Fig 1A.
12
13
14 Fig. 3. Comparison of TRH-induced effects on activation parameters of HERG channels
15
16 carrying single point mutations in the 326-332 RYRTISK sequence. (A) Maintenance of
17 TRH-induced shifts in activation voltage dependence after mutation of residues 326,
18
19 327, 328, 329 and 331 to alanine. YTS/AAA corresponds to a triple mutant in which
20 residues 327, 329 and 331 were simultaneously changed to alanine. Activation voltage
Fo

21
22 dependence was studied as indicated in Fig. 1. Data normalized to the shift value
23 measured in wild-type channels are presented. n.s.: not significant vs. wild-type. (B)
24
rP

25 TRH-induced slowing-down of HERG activation in the different mutants. Times for

26 half-maximal activation at 0 mV were studied as detailed in Fig. 2. Increases in t0.5
27
28 values normalized to that obtained with wild-type channels are shown.
29
ee

30
31 Fig. 4. Effect of TRH on activation properties of channels with structural modifications
32
around the 326-332 RYRTISK sequence. (A) Schematic diagram of HERG amino
rR

33
34 terminus in wild-type and modified HERG channels. Deletions are marked by dashed
35
36 lines. Insertions of a HERG-unrelated sequence covering the region deleted in the ∆326-
37 341 construct are represented by a dotted and a vertically striped bar in the InsA/326-
ev

38
39 341 and the InsB/326-341 variants, respectively. See Methods for more details about the
40 specific sequences introduced in these constructs. (B) Effect of TRH on activation
41
iew

42 voltage dependence (left) and the activation time course at 0 mV (right) of ∆326-341
43
channels. I/V curves in the absence or the presence of 1 µM TRH were generated as
44
45 detailed in the legend of Fig. 1. V1/2 and t0.5 values with and without TRH are indicated
46
47
in the graphs. A Boltzmann curve obtained without TRH from oocytes expressing wild-
48 type channels (dashed line) is also shown for comparison. Activation time courses were
49
50 followed as detailed in the legend of Fig. 2. (C) Comparison of TRH-induced shifts in
51 activation voltage dependence. Data for wild-type and ∆326-373 channels are also
52
53 included for clarity. (D) Comparison of TRH-induced slowing of HERG activation at 0
54 mV. Increases in t0.5 values are shown with a 100% increment representing a doubled
55
56 half-maximal activation time.
57
58
59 Fig. 5. Effect of TRH on activation voltage dependence of HERG channels with
60
modifications around the RYRTISK and KIKER sequences. (A) Schematic diagram of
HERG amino terminus and sequence alignment of residues 325-376 in the different
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3 constructs. (B) Families of currents obtained in the absence (Control, top) or the
4
5 presence of 1 µM TRH (TRH, bottom) using the voltage protocol shown in the inset.
6
(C) Comparison of the TRH-induced shifts in HERG activation voltage dependence for
7
8 different constructs. Averaged data for the number of oocytes indicated in panel D were
9 used to generate the I/V curves. V1/2 values before adding TRH are indicated in the
10
11 graphs. (D) Comparison of TRH-induced I/V shifts on channels with different
12
13 modifications in the region corresponding to the KIKER cluster either alone or
14 combined with mutations in the RYRTISK sequence.
15
16
17 Fig. 6. Effect of TRH on the activation time course of HERG channels carrying
18
19 modifications around the RYRTISK and KIKER sequences. (A) Families of currents
20 obtained in the absence (Control, top) or the presence of 1 µM TRH (TRH, bottom)
Fo

21
22 using the voltage protocol shown on top. Depolarizing voltages of –20 mV for
23 KKR/AAA and ∆326-341+KKR/AAA, and –40 mV for ∆363-373 and ∆326-
24
rP

25 341+∆363-373 constructs were used to compensate for the shifts in activation voltage
26
27
dependence. In all cases a repolarizing potential of –100 mV was used. (B) Comparison
28 of the activation time courses of different constructs. Averaged data normalized to
29
ee

30 maximum are shown. The time necessary to reach a half-maximal tail current
31 magnitude (dashed lines) with (solid symbols) and without TRH (open symbols) is
32
indicated in the graphs. (C) Comparison of TRH effects on activation time course of
rR

33
34 channels carrying different modifications in the region corresponding to the KIKER
35
36 cluster either alone or combined with mutations in the RYRTISK sequence. One-
37 hundred % increase corresponds to a doubled t0.5 value. The constructs in this figure
ev

38
39 correspond to those schematized in Fig 5A.
40
41
iew

42 Fig. 7. Effect of TRH on activation properties of the HERG channel construct ∆155-209
43
with a 55 amino acid deletion in the proximal domain. (A) Schematic diagram of HERG
44
45 amino terminus in wild-type, ∆326-373 and ∆155-209 HERG channels. (B) Effect of
46
47
TRH on ∆155-209 channel currents in response to the indicated voltage protocols for
48 studying the activation voltage dependence (left) and the activation time course at 0 mV
49
50 (right). (C) Effect of TRH on activation voltage dependence (left) and the time course of
51 activation at 0 mV (right) of ∆155-209 channels. A Boltzmann curve obtained without
52
53 TRH from oocytes expressing wild-type channels (dashed line) is also shown for
54 comparison. (D) Comparison of TRH-induced effects on activation voltage dependence
55
56 shifts and increases in t0.5 values of ∆155-209 channels. Data for wild-type and ∆326-
57 373 channels are also included for comparison.
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Fig. 8. Effect of TRH on activation voltage dependence of HERG channels carrying
single point mutations in the S4-S5 linker. (A) Membrane currents from oocytes
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3 expressing the indicated channel mutants are shown. Families of currents correspond to
4
5 individual representative oocytes in the absence (top panels) or the presence of 1 µM
6
TRH (bottom panels) using the voltage protocol shown in the inset. Oocytes bathed in
7
8 high-K+ medium were used for recordings. Note the enhanced time scale in the D540C,
9
10
Y542C and E544C mutant panels for a better view of the fast deactivating tails
11 exhibited by these channels. (B) Averaged I/V curves for the number of oocytes
12
13 indicated in panel C. Boltzmann curves obtained without TRH from oocytes expressing
14 wild-type channels (dashed lines) are also shown. (C) Comparison of TRH-induced I/V
15
16 shifts on channels with different single point mutations in the S4-S5 linker
17
18
19 Fig. 9. Effect of TRH on activation time course of HERG channels with single point
20 mutations in the S4-S5 linker. (A) Membrane currents from oocytes expressing the
Fo

21
22 indicated channel mutants. Families of currents correspond to individual representative
23 oocytes in the absence (top) or the presence of 1 µM TRH (bottom) using a voltage
24
rP

25 protocol identical to that depicted in Figures 2 and 6. A depolarizing voltage of 0 mV

26
27
was used except for the G546C mutant for which data were obtained at +20 mV due to
28 its slightly slowed activation kinetics. In all cases a repolarizing potential of –100 mV
29
ee

30 was used. (B) Activation time courses of the different mutants. Averaged data
31 normalized to maximum are shown. The time necessary to reach a half-maximal tail
32
current magnitude (dashed lines) with (solid symbols) and without TRH (open symbols)
rR

33
34 is indicated in the graphs. The scale of the x axes has been limited to 3 s for a better
35
36 view of the differences in the activation time course after adding TRH. (C) Comparison
37 of TRH effects on activation time courses of channels mutated in the S4-S5 linker. One-
ev

38
39 hundred % increase corresponds to a doubled t0.5 value.
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Supplemental Fig. 1. Deactivation properties of different constructs and effect of
structural modifications in the amino terminus and the S4-S5 loop on TRH-induced
acceleration of HERG deactivation. (A) Summary of fast deactivation rates at –100 mV.
We considered for analysis only the time constants of the fast deactivation current that
corresponds to the major component of current at negative voltages and that shows
minimal contamination with residual oocyte chloride currents triggered by the hormone
treatment. The rates of deactivation were determined from negative-amplitude
biexponential fits to the decaying phase of tail currents at –100 mV as detailed in ref [1]
of the paper. (B) Comparison of TRH effects on deactivation kinetics in channels
carrying different structural alterations in the amino-terminus. Bars in the histogram
represent TRH-induced reductions in the magnitude of fast deactivation time constant at
–100 mV as compared to that observed in wild-type channels, that amounted 22.6±3.7%
(n=24) in this set of experiments. In this case, a 50% reduction corresponds to a doubled
speed of closing. (C) Comparison of TRH effects on deactivation kinetics in channels
carrying single-point mutations in the S4-S5 loop (residues 540-546) and the 326-331
sequence of the proximal domain.
J Physiol 566.3 (2005) pp 717–736 717

Specificity of TRH receptor coupling to G-proteins

for regulation of ERG K+ channels in GH3 rat anterior
pituitary cells
Pablo Miranda, Teresa Giráldez, Pilar de la Peña, Diego G. Manso, Carlos Alonso-Ron,
David Gómez-Varela, Pedro Domı́nguez and Francisco Barros
Departamento de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular, Edificio Santiago Gascón, Campus del Cristo, Universidad de Oviedo, E-33006, Oviedo,
Asturias, Spain

The identity of the G-protein coupling thyrotropin-releasing hormone (TRH) receptors

to rat ether-à-go-go related gene (r-ERG) K+ channel modulation was studied in situ
using perforated-patch clamped adenohypophysial GH3 cells and dominant-negative variants
(Gα-QL/DN) of G-protein α subunits. Expression of dominant-negative Gαq/11 that minimizes
the TRH-induced Ca2+ signal had no effect on r-ERG current inhibition elicited by the hormone.
In contrast, the introduction of dominant-negative variants of Gα13 and the small G-protein
Rho caused a significant loss of the inhibitory effect of TRH on r-ERG. A strong reduction of this
TRH effect was also obtained in cells expressing either dominant-negative Gαs or transducin
α subunits, an agent known to sequester free G-protein βγ dimers. As a further indication
of specificity of the dominant-negative effects, only the dominant-negative variants of Gα13
and Rho (but not Gαs -QL/DN or Gαt ) were able to reduce the TRH-induced shifts of human
ERG (HERG) activation voltage dependence in HEK293 cells permanently expressing HERG
channels and TRH receptors. Our results demonstrate that whereas the TRH receptor uses a
Gq/11 protein for transducing the Ca2+ signal during the initial response to TRH, this G-protein
is not involved in the TRH-induced inhibition of endogenous r-ERG currents in pituitary cells.
They also identify Gs (or a Gs -like protein) and G13 as important contributors to the hormonal
effect in these cells and suggest that βγ dimers released from these proteins may participate in
modulation of ERG currents triggered by TRH.
(Received 28 February 2005; accepted after revision 12 May 2005; first published online 19 May 2005)
Corresponding author F. Barros: Departamento de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular, Edificio Santiago Gascón, Campus
del Cristo, Universidad de Oviedo, E-33006, Oviedo, Asturias, Spain. Email: fbarros@correo.uniovi.es

Regulation of ether-à-go-go related gene (ERG) K+
channel activity by the hypothalamic neuropeptide
thyrotropin-releasing hormone (TRH) constitutes an
essential point of hormonal control of electrical activity,
and hence of intracellular Ca2+ levels ([Ca2+ ]i ) and the
secretory response in anterior pituitary cells (Barros et al.
1994, 1997; Weinsberg et al. 1997; Bauer, 1998; Bauer
et al. 1998, 1999). The human ERG (HERG) channel
has been also recognized as an important determinant
of action potential characteristics in heart muscle and
its inhibition by inherited mutations or a panoply of
cardiac- and noncardiac-related prescribed drugs has been
associated with an increased risk of cardiac arrhythmia
and sudden death (Chiang & Roden, 2000; Keating &
Sanguinetti, 2001; Redfern et al. 2003; Finlayson et al.
2004). Interestingly, the observation that arrhythmogenic
syncopes are usually associated with physical, emotional
or auditory stress suggests a link between hormonal
(e.g. adrenergic) stimulation and cardiac ion channel
function including HERG (Thomas et al. 2004).
Furthermore, ERG channels also seem to play a key role
setting the electrical behaviour of other cell types including
neurones and glial, chromaffin, pancreatic β and tumour
cells (Zhou et al. 1998a; Emmi et al. 2000; Rosati et al. 2000;
Gullo et al. 2003; Sacco et al. 2003; Lastraioli et al. 2004).
Nevertheless, unlike the relatively well known molecular
and kinetic characteristics of ERG channels and in spite
of their physiological and pathological relevance, many
of their molecular mechanisms of regulation by different
physiological agents remain unclear.
In native lactotrophs and clonal GH adenohypophysial
cells, endogenous ERG currents are inhibited by activation
of the G protein-coupled TRH receptor (TRH-R; Bauer
et al. 1990, 1994; Barros et al. 1992, 1993; Schäfer et al.

C The Physiological Society 2005 DOI: 10.1113/jphysiol.2005.085803

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718 P. Miranda and others
1999; Schledermann et al. 2001). The TRH-R is coupled to
a G-protein of the Gq/11 family (reviewed in Gershengorn
& Osman, 1996) resulting in phospholipase C
(PLC) activation and generation of myo-inositol
1,4,5-trisphosphate (IP3 ) and diacylglycerol (DAG)
from phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2 ). It
is also known that TRH is able to activate several PKC
isozymes in GH3 cells (Kiley et al. 1991; Akita et al. 1994).
However, TRH-induced inhibition of ERG current in these
cells does not depend on PKC or PKA activation (Bauer
et al. 1990, 1994; Barros et al. 1992, 1993; Schäfer et al.
1999; Schledermann et al. 2001). Whether Gq/11 protein
transduction, typically linked in many cells (including
adenohypophysial cells) to Ca2+ signalling, plays a role
in ERG channel regulation remains controversial. Thus,
a pathway for ERG regulation by TRH involving a G13 -
and Rho-mediating signalling cascade has been described
in whole-cell voltage-clamped GH4 C1 cells (Storey et al.
2002), but the relative importance of this transduction
pathway as compared with the ‘classical’ Gq/11 -mediated
TRH-induced signalling was not assessed. Furthermore,
Gq/11 but not Gi/o or G13 has been recently shown to
mediate muscarinic inhibition of ERG currents in tsA-201
cells coexpressing rat ERG1 channels and M1 muscarinic
receptors (Hirdes et al. 2004). In adenohypophysial cells,
the Gq/11 -mediated coupling of TRH-R to PIP2 hydrolysis
leads to an initial elevation of [Ca2+ ]i via IP3 that
mediates a peak of secretion associated with a transient
hyperpolarization of the cell membrane due to activation
of Ca2+ -dependent K+ channels (Gómez-Varela et al.
2003b). However, normal inhibition of ERG channel
activity in response to TRH has been observed in
individual cells in which the initial Ca2+ response is totally
absent (Barros et al. 1991, 1992, 1994). Although the
PKC branch of the PLC signalling cascade is necessary for
reversal of the TRH-induced ERG inhibition in GH3 cells
(Gómez-Varela et al. 2003b) and PIP2 depletion could
lead to HERG current reduction in HEK293 cells (Bian
et al. 2001), the TRH-induced inhibition of the GH3 cell
r-ERG current also takes place after blockade of PIP2
consumption with a PLC inhibitor (Gómez-Varela et al.
2003b). These results and the reported modification of the
TRH effects on r-ERG in cholera toxin-treated GH3 cells
(Barros et al. 1994; Bauer et al. 1994) open the possibility
that, at least in adenohypophysial cells, a transduction
cascade(s) involving either a Gs -like protein or a G13 - and
Rho-based pathway, couples the TRH-R to endogenous
ERG channel inhibition.
In this report we use double mutants (Gα-QL/DN) of
G-protein α subunits able to act as dominant-negative
inhibitors against specific G-proteins (Yu et al. 2000) to
explore the specificity of TRH-R coupling to G-proteins for
ERG K+ channel inhibition in GH3 rat anterior pituitary
cells. Our results demonstrate that whereas the TRH-R
certainly uses a Gq/11 protein for transducing the Ca2+
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J Physiol 566.3
signal during the initial response to the hormone, this
G-protein is not involved in the TRH-induced inhibition
of ERG currents. Dominant-negative variants of Gα 13 and
Rho, but not of Gα q/11 , are able to significantly reduce
the inhibitory effect of TRH on ERG. Furthermore, a
prominent reduction is observed upon introduction of
dominant-negative Gα s . Interestingly, a strong reduction
of the TRH-induced inhibition is also observed in cells
overexpressing transducin α subunits (Gα t ), an agent
known to sequester free G-protein βγ dimers (Crespo
et al. 1994; Faure et al. 1994; Palomero et al. 1998). The
specificity of the dominant-negative and Gα t effects is
demonstrated by their failure to modify the Ca2+ response
in the same cells. Furthermore, dominant-negative Gα q/11
(but not Gα t or dominant-negative Gα s , Gα 13 and
Rho) was able to reduce TRH-induced release of Ca2+
from intracellular stores in HEK293 cells permanently
expressing HERG channels and TRH-Rs. In these cells,
however, only the dominant-negative forms of Gα 13 and
Rho (but not Gα t or dominant-negative Gα s ) were able
to antagonize the modifications in activation voltage
dependence induced by TRH on HERG currents. On
the other hand, only Gα t and dominant-negative Gα q/11
expression reduced the TRH-induced HERG current
inibition at positive voltages. Apart from emphasizing the
specificity of the different dominant-negative constructs,
this also suggests that the cellular background and/or
the channel isoform may influence the transduction
mechanism(s) involved in hormonal regulation of ERG.
Methods
Plasmids and chemicals
The original plasmid containing the cDNA for the
HERG channel was a generous gift of Dr E. Wanke
(University of Milan, Italy). pEGFP-N3 plasmid was
obtained from Clontech. pcDNA3.1 plasmids containing
dominant-negative forms of Gα q (Gα q -Q209L/D277N),
Gα 13 (Gα 13 -Q266L/D294N), Gα s (Gα s -Q227L/D295N)
and RhoA (RhoA-T19N 3xHA-tagged-NH2) were
obtained from Guthrie (Guthrie cDNA Resource Center;
currently transferred to University Missouri-Rolla cDNA
Resource Center, Rolla, MO, USA). Gα t was cloned in
pcDNA3 as an EcoRI/XhoI fragment transferred from
pcDNAI (provided by Dr J. S. Gutkind, N. I. of Dental
Research, N.I.H., Bethesda, MD, USA). TRH and nystatin
were purchased from Sigma. E-4031 and anti-HERG poly-
clonal antibodies were from Alomone Laboratories; Fura-2
and Fura-2/AM were from Molecular Probes.
GH3 cell culture and transfection
GH3 rat anterior pituitary cells (ATCC-CCL 82.1) were
plated in 35-mm diameter tissue culture plastic dishes
containing sterile glass coverslips coated with poly l-lysine


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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation
and grown at 37◦ C in a humidified atmosphere of 95%
air and 5% CO2 . The culture medium consisted of a
1 : 1 mixture of Dulbecco’s modified Eagle’s medium
and Ham’s F-12 nutrient mixture (Sigma) supplemented
with 100 U ml−1 penicillin, 1.1 mg ml−1 streptomycin and
a serum mixture of 15% horse serum and 2.5% fetal
bovine serum. The coverslips constituted the bottom
of a small recording chamber (0.2–0.3 ml) that was
continuously perfused with saline at a rate of about
1 ml min−1 . Cells trypsinized 24 h prior to transfection
lying in poly-l-lysine-coated coverslips were transiently
transfected using Lipofectamine 2000 according to the
manufacturer’s instructions (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA). Unless otherwise indicated, 5.0 µg of plasmids
containing the different constructs and pEGFP-N3
codifying green fluorescent protein (eGFP) as a marker
for transfection in a 10 : 1 ratio were used. The mixture
of 5.5 µg of total DNA and Lipofectamine was incubated
in serum-free medium for 20 min and added to the
plates containing the cells in serum-containing medium
without antibiotics. Recordings were performed 24–48 h
after transfection.
Generation and isolation of permanently transfected
HEK 293 cell clones
HERG channel cDNA was subcloned into HindIII/BamHI
sites of the pcDNA3 vector (Invitrogen). Monolayer
cultures (∼50% confluent) of human embryonic kidney
cells (HEK293; ATCC CRL-1573) were transfected with
this construct using Lipofectamine (Gibco). Three days
after transfection, the cells were trypsinized and diluted in
a medium containing 1 mg ml−1 geneticin. Subsequently
they were cultured until cell colonies were visible.
Individual colonies were picked with cloning cylinders
and tested for HERG currents. A clone named H36 was
selected for further transfection. Cells of clone H36
were cotransfected with plasmid pcDNA3.1/Hygro(+)
(Invitrogen) containing the cDNA for the TRH-R (de
la Peña et al. 1992) inserted between the HindIII/XbaI
sites of the vector. Hygromycin B (150 µg ml−1 ) was
used to select H36 clones coexpressing HERG channels
and TRH-Rs. We chose for further work a clone named
HEK-H36/T1 showing: (a) robust HERG currents under
voltage-clamp, (b) reproducible calcium responses
when perfused with TRH after loading the cells with
the fluorescent Ca2+ indicator Fura-2, and (c) a pre-
dominant level of a 155 kDa band of HERG protein,
corresponding to the mature and more glycosylated
HERG likely to be located in the plasma membrane
(Zhou et al. 1998b; Petrecca et al. 1999), immunodetected
in cell extracts with HERG-specific antibodies. Cells
were grown at 37◦ C in a humidified atmosphere of
95% air and 5% CO2 . HEK 293 cells were cultured
in the same medium as GH3 cells supplemented with


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719
100 U ml−1 penicillin, 0.1 mg ml−1 streptomycin and 10%
fetal bovine serum. HEK-H36/T1 cells were maintained
in the presence of 1 mg ml−1 geneticin sulphate and
150 µg ml−1 hygromycin B (Gibco) and plated on
the poly-l-lysine-coated coverslips for recording.
Transient transfection of HEK-H36/T1 cells was
performed following the procedures indicated above for
the GH3 cells.
Electrophysiological recordings, solutions
and data analysis
Current recordings were performed at room temperature
with the perforated-patch variant of the patch-clamp
technique as previously described (Barros et al. 1991,
1992, 1994, 1997; Gómez-Varela et al. 2003b). Electro-
des were fabricated from borosilicate or kimax disposable
micropipettes (Boralex, Rochester Scientific, Rochester,
NY; Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburg, PA or Kimble
glass Inc., Vineland, NJ, USA). Electrode resistance
amounted 2–5 M when filled with the pipette solution
containing (mm): 65 KCl, 30 K2 SO4 , 10 NaCl, 1 MgCl2 ,
50 sucrose and 10 Hepes (pH 7.4 with KOH). The
tip of the pipette was initially filled with nystatin-free
solution and the remainder of the pipette was back-filled
with the same solution also containing 250 µg ml−1
nystatin, added from a stock of 50 mg ml−1 nystatin
freshly dissolved in dimethylsulphoxide. These solutions
were sonicated just before use. The course of perforation
was followed by monitoring the progress of capacitive
transients under voltage-clamp mode, setting the pipette
voltage at a value of −70 mV. Access resistance, as
estimated from the capacitive compensation circuitry on
the amplifier, reached 10–30 M within 5–20 min after
the seal was made. Solution junction potentials were
nulled before seal formation. Once patch permeabilization
reached the indicated levels, the extracellular solution was
changed as indicated and the cell was voltage-clamped
at the desired holding potential. An EPC-7 patch-clamp
amplifier (HEKA Elektronic, Lambrecht, Germany) was
used to record membrane currents. Stimulation, data
acquisition and analysis were carried out using Pulse
and PulseFit software (HEKA Elektronic) running on
Macintosh computers. Current records were sampled
every 1 ms and digitally filtered at 500 Hz. r-ERG current
data are shown without correction for leakage and
capacitative transients. A P/n method was used for leak and
capacitive current subtraction of the HERG recordings in
HEK-H36/T1 cells. Further data processing was performed
with PulseFit and Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego,
OR, USA).
The standard extracellular saline used for perforation
and monitoring [Ca2+ ]i contained (mm): 137 NaCl, 4 KCl,
1.8 CaCl2 , 1 MgCl2 , 10 glucose, and 10 Hepes (pH 7.4
720 P. Miranda and others
with NaOH). Recordings of r-ERG currents in GH3 cells
were performed after changing the extracellular medium
to high-K+ , Ca2+ -free solution once permeabilization of
the patches had been completed. This solution contained
(mm): 140 KCl, 4 MgCl2 , 10 EGTA and 10 Hepes titrated
to pH 7.4 with KOH. Inward currents were studied during
hyperpolarization pulses to −100 mV from a holding
potential of −10 mV. The hyperpolarization pulses were
preceded by a 100 ms ramp from 0 to −50 mV that
can yield an estimation of the membrane conductance
within this voltage range and would tend to potentiate the
otherwise voltage-dependent effect of TRH (Bauer et al.
1990; Barros et al. 1992, 1994, 1997). To prevent variations
due to differences in deactivation rates from cell to cell,
the magnitude of the inward currents was estimated with
the PulseFit software as the total inward charge computed
between cursors located at 0.5 and 100% duration of the
hyperpolarization pulses. HERG currents were recorded
in HEK-H36/T1 cells in standard extracellular saline
following the pulse protocols indicated on the figures.
Kinetic parameters of activation and deactivation were
obtained as previously described (Barros et al. 1998; Viloria
et al. 2000). The voltage dependence of current activation
was assessed using standard tail current analysis. Tail
current magnitudes normalized to maximum were fitted
with a Boltzmann function:
h(V ) = Imax [1/(1 + exp((V − V1/2 )/k))]
where V is the test potential, V1/2 is the half-activation
voltage, and k is the slope factor. Steady-state voltage
dependencies of activation were obtained as previously
described (Viloria et al. 2000) applying depolarization
pulses of variable magnitude and up to 10 s duration from
two holding potentials: +40 mV to hold the channels fully
open and −80/−100 mV to hold them fully closed. The
position of the Boltzmann curves under true steady-state
conditions was estimated as an extrapolated mean from
the curves obtained at both holding potentials to ensure
that they were a function exclusively of depolarization
pulse characteristics, regardless of the previous (open or
closed) state of the channels. The time course of activation
was monitored using an indirect envelope of tail current
protocol (Viloria et al. 2000), varying the duration of the
depolarization pulse and following the variation in the
magnitude of the tail currents recorded after going back to a
negative voltage. The rates of deactivation were determined
from negative-amplitude biexponential fits to the decaying
phase of tail currents. The first cursor of the fitting window
was advanced to the end of the initial hook due to the
recovery of inactivation.
Intracellular calcium measurements
Measurements of intracellular Ca2+ concentrations
([Ca2+ ]i ) were performed in cells platted in
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J Physiol 566.3
poly-l-lysine-coated coverslips as indicated above.
In this case the coverslips were transferred to wells
containing standard extracellular saline plus 5 µm
Fura-2/AM (Molecular Probes) and loaded with the
dye for about 60 min at room temperature. After
loading with Fura-2, cells were washed with saline to
remove non-hydrolysed Fura-2/AM and left for another
30 min before recording to facilitate AM hydrolysis
by cellular esterases. Fluorescence measurements were
performed in a Axiovert 100 microscope equipped with
a Plan-NeoFluar 40×/0.75 objective and epifluorescence
accessories (Carl Zeiss), attached to a fluorescence imaging
system (TILL-Photonics GmbH, Martinsried, Germany).
Control of the monochromator (Polychrome IV) and
the 12-bit cooled CCD camera (IMAGO) was performed
using TILLvisION imaging software. Cells were excited
through a dichroic mirror reflecting less than 395 nm
light. Fluorescence signals were filtered through a 410 nm
long-pass filter. Cycles of sample excitation were repeated
every 500 ms consisting in 10/20 ms periods of irradiation
with 340, 360 and 380 nm light. The ratio of the emission
intensities (340 nm/380 nm) was used as a measure for
changes in intracellular Ca2+ . When eGFP-transfected
cells were used, a correction for eGFP fluorescence due to
residual eGFP excitation at 340–380 nm was performed.
Using eGFP-containing cells without Fura-2 we estimated
previously that 13% of the fluorescence recovered above
510 nm (using a GFP filter set with a 500 nm dichroic
and a 510 nm long-pass filter) following eGFP excitation
at 488 nm is also present upon eGFP excitation at
380 nm using the conventional Fura-2 set-up. Less than
1% was recovered when eGFP was excited at 340 nm.
Subsequently, the eGFP-derived fluorescence at 380 nm
was estimated in every individual cell loaded with Fura-2
from the (13%) fluorescence intensity at 488 nm (a
wavelength at which Fura-2 is not excited). This amount
was subtracted from the total fluorescence at 380 nm to
isolate the Fura-2-specific signal. Ca2+ concentrations
were estimated from the 340 nm/380 nm fluorescence
ratio by comparison with Fura-2 standards (Barros et al.
1994).
Statistics
Data values given in the text and in figures with error
bars represent the mean ± s.e.m. for the number of
indicated cells. Comparison between data groups was at
first performed by parametric Student’s unpaired t test
(2-tailed) or ANOVA. Due to dispersion of the data in
individual cells after some treatments (e.g. Gα 13 -QL/DN
and RhoA T/N transfections in Fig. 4), non-homogeneous
variances (as evidenced after a Bartlett’s test) were
sometimes obtained. Therefore, alternate Welch’s test
assuming Gaussian populations with unequal s.d.s and
a non-parametric Wilcoxon or Mann-Whitney test that


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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation
does not make any assumption about the scatter of the data
were also used to evaluate significance of mean differences
between cell populations. For a posteriori comparison of
two specific samples a Bonferroni or a Dunn test for
multiple comparisons was also used following one-way
ANOVA or Kruskal-Wallis non-parametric ANOVA tests,
respectively. In all cases, P-values < 0.05 were considered
as indicative of statistical significance.
Results
Validation of the dominant-negative strategy
using Gαq -QL/DN and the TRH-induced Ca2 +
response of the GH3 cells
To examine the transduction pathway leading to ERG
inhibition upon TRH stimulation, we expressed xanthine
nucleotide binding mutants of different G-protein α
subunits. These mutants carrying a double mutation
(leucine and asparagine substituting for a glutamine
and an aspartate, respectively) possess a lowered affinity
by guanine nucleotides and an enhanced affinity by
xanthine nucleotides that make them form stable and
specific complexes with cognate receptors and compete
with endogenous wild-type G-proteins (Yu et al. 2000).
We first probed the effectivity of this approach using
dominant-negative Gα q (Gα q -Q209L/D277N) and
exploring the initial (Phase 1) TRH-dependent response
of the GH3 cells. This phase corresponds to a transient
release of stored Ca2+ into the cytosol due to production
of IP3 by PLC-catalysed PIP2 hydrolysis, leading to
an initial and transient hyperpolarization of the cell
membrane by activation of Ca2+ -dependent K+ channels
(Gómez-Varela et al. 2003b). We reasoned that blockade of
this transduction pathway with Gα q -QL/DN should mini-
mize all the cellular responses that characterize this phase
such as (i) the transient membrane hyperpolarization,
(ii) the transient increase in potassium currents
that determine this hyperpolarization, and (iii) the
transient [Ca2+ ]i increase that activates the
Ca2+ -dependent K+ currents. As shown in Fig. 1A the
transient hyperpolarization of the cell membrane induced
by TRH in perforated-patch current-clamped GH3 cells
is nearly abolished in cells expressing Gα q -QL/DN (see
averaged voltage traces in the insets). Interestingly, as
shown in the individual cell recordings illustrated in
Fig. 1A, the increase in the rate of production of action
potentials (Phase 2 of hormone action) that follows the
initial hyperpolarization was maintained in the presence
of the dominant-negative. As a second validation of the
dominant-negative effect, we studied the appearance of
membrane currents immediately after TRH addition in
patch-perforated voltage-clamped GH3 cells bathed in
high-K+ Ca2+ -free solution. Figure 1B shows that the
current increases induced by TRH were absent in cells
expressing Gα q -QL/DN. Thus, these increases represent


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721
Gα q -mediated PLC activation and activation of K+
currents by Ca2+ released from intracellular stores via
IP3 , because they were determined without extracellular
Ca2+ . Furthermore, the effect of Gα q -QL/DN was specific
since the TRH-induced currents remained unaltered in
cells expressing the dominant-negative α subunit of G13 ,
a G-protein predictably unrelated to the PLC–IP3 Ca2+
signalling pathway.
For an additional demonstration of the effectiveness and
specificity of the dominant-negative approach we studied
the effect of the Gα-QL/DN proteins on hormone-induced
[Ca2+ ]i increases. For this purpose, the fluorescence of
Fura-2 was monitored in the transfected cells as indicated
in Methods. As an internal control, TRH-induced
variations in fluorescence of the cells present in the
same microscope field but not expressing the transfection
marker (eGFP) were monitored. We determined first that
transfection or expression of the eGFP biosensor itself does
not modify the [Ca2+ ]i increases induced by the hormone,
using GH3 cells transfected with eGFP and pcDNA3B
plasmid lacking any G-protein codifying insert. Data
from a representative experiment indicate that whereas
addition of 1 µm TRH raised [Ca2+ ]i from a basal averaged
value of 105 ± 32 nm (n = 35) to an initial maximum of
236 ± 32 nm in the 35 cells of a microscope field lacking
eGFP fluorescence, the [Ca2+ ]i level was increased from
80 ± 31 to 240 ± 29 nm in the 13 cells from the same field
showing a clear eGFP expression. On the other hand, in
both cases most of the cells showed a significant increase
in peak [Ca2+ ]i regardless of the presence or the absence
of eGFP expression.
The aforementioned results strongly differ from
those obtained with cells transfected with eGFP and
a plasmid coding for Gα q -QL/DN (Fig. 2A). In this
case, TRH raised the basal [Ca2+ ]i level of 73 ± 9 nm to
141 ± 14 nm in the 26 cells showing no detectable eGFP
expression. In contrast, only a peak value of 61 ± 5 nm
[Ca2+ ]i from a basal level of 49 ± 6 nm was obtained
upon TRH addition in the 11 cells of the same field
showing a clear eGFP fluorescence. It is also important
to note that in this case only 3 of the 11 cells expressing
eGFP showed any significant increase in [Ca2+ ]i as
compared with the 18 in which [Ca2+ ]i was clearly
increased from 26 cells not expressing the transfection
marker. Furthermore, whereas only a modest [Ca2+ ]i
increase from 61 ± 6 to 94 ± 4 nm was observed in those
three cells expressing eGFP, a prominent initial peak
of Ca2+ that raised [Ca2+ ]i from 73 ± 9 to 172 ± 7 nm
was obtained in the 18 cells in which eGFP (and hence
Gα q -QL/DN) expression was not detectable. Analogous
results were obtained in two additional experiments.
This demonstrates that (i) a much lower percentage
of cells expressing the dominant-negative variant of
Gα q respond to TRH, and (ii) even in the few cells
expressing Gα q -QL/DN that show a detectable response
722 P. Miranda and others J Physiol 566.3

Figure 1. Blockade by dominant-negative Gαq -QL/DN of the initial phase 1 of response induced by TRH
in GH3 cells
A, effect of dominant-negative Gα q on TRH-induced Phase 1 of hyperpolarization. Representative recordings of
membrane potential are shown in two cells either expressing the dominant-negative form of Gα q (lower trace)
or not (upper trace). Application of 1 µM TRH is marked with a horizontal line on top of the traces. Note the
maintenance of Phase 2 of increased electrical activity in the Gα q -QL/DN-transfected cell. Traces averaged point
by point from several cells are shown in the insets. Continuous current traces averaged point by point and their
corresponding S.E.M. are shown. In this cases, traces were synchronized to the time of TRH addition as indicated
with an arrow. B, effect of dominant-negative Gα q and Gα 13 on Ca2+ -dependent K+ currents elicited in GH3
cells by TRH during the initial Phase 1 of response. Continuous current traces averaged point by point and their
corresponding S.E.M. are shown for cells transfected with vector pcDNA3B (Control 3B), or with plasmids codifying
the dominant-negative mutants of Gα q (Gα q -QL/DN) and Gα 13 (Gα 13 -QL/DN). Traces were synchronized to the
time of 1 µM TRH addition as indicated with an arrow. High-K+ , low-Ca2+ extracellular solution and a potential of
−30 mV were used for better detection of inward K+ currents activated by Ca2+ released from intracellular stores
via IP3 .

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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation 723

Figure 2. Effect of dominant-negative Gα subunits or Gαt expression on Ca2+ liberation from GH3 cell
intracellular stores in response to TRH
The time course of variations in [Ca2+ ]i levels is shown for Fura-2 loaded cells from a microscope field transfected
with Gα q -QL/DN (A), Gα s -QL/DN (B), Gα 13 -QL/DN (C), or Gα t (D). Addition of 1 µM TRH is indicated by horizontal
lines on top of the traces. Continuous traces averaged point by point and their corresponding S.E.M. are shown.
Averaged basal levels are signalled by dashed lines. Data correspond to cells showing fluorescence of the trans-
fection marker (eGFP+ , left) or not (eGFP− , right). Variations of [Ca2+ ]i levels in the cell subpopulations showing a
detectable peak Ca2+ increase after visual inspection are illustrated. In all cases the number of averaged cells with
respect to the total number of cells present in the field is boxed. Data from the whole cell population present in
the microscope field are shown in the insets of panel A. Averaged values from all data points before TRH addition
and that of the initial maximum are indicated. Analogous results were obtained in two additional experiments.

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724 P. Miranda and others J Physiol 566.3

Figure 3. Effect of dominant-negative Gα subunits and Gαt on TRH-induced inhibition of endogenous

r-ERG currents in GH3 cells
The time course of relative r-ERG current reduction by TRH and E-4031 is shown for six different cells transfected
with vector pcDNA3B (A), or with plasmids encoding the dominant-negative mutants of Gα q (B), Gα 13 (C), RhoA
(D) and Gα s (E), or the α subunit of transducin (F). Currents were recorded during 1 s hyperpolarizing pulses to
−100 mV from a holding potential of −10 mV. The hyperpolarization step was preceded by a 100 ms ramp from
0 to −50 mV (Gómez-Varela et al. 2003b). Current estimations were performed from total inward charge during
the hyperpolarization steps at −100 mV as described in Methods. Averaged charge values before any addition

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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation 725

to the hormone, the magnitude of the [Ca2+ ]i increase is
clearly smaller than that of cells in which the transfection
marker (and hence the dominant-negative Gα q ) has not
been expressed.
Specificity of dominant-negative Gα subunits on
TRH-induced Ca2+ response
The results presented above indicate that expression of the
dominant-negative form of Gα q constitutes an efficient
way to suppress the Gq-dependent initial Ca2+ response
to TRH of the GH3 cells. Whereas coupling of end-
ogenous and heterologously expressed TRH-Rs to Gq
for activation of PLC-mediated PIP2 hydrolysis has been
widely documented, it has been also reported that in GH
cells the TRH-R can interact with a number of different
G-proteins that may include G13 , Gi and Gs or a Gs -like
protein (Storey et al. 2002; reviewed by Gershengorn &
Osman, 1996). To check the possible specificity of the
dominant-negatives we also studied the Ca2+ response in
cells expressing the QL/DN variants of Gα s and Gα 13 . The
elevations of [Ca2+ ]i in response to TRH remained the
same in cells expressing either Gα s -QL/DN (Fig. 2B) or
Gα 13 -QL/DN (Fig. 2C) as compared with cells from the
same microscope field lacking eGFP expression. Similar
results were obtained in cells expressing transducin α
subunits (Fig. 2D; see also below). Furthermore, as in
control cells transfected with pcDNA3B (see above) or
in untransfected cells (not shown), most of the cells
expressing dominant-negatives of Gα s or Gα 13 showed
significant increases in peak [Ca2+ ]i . This indicates that
whereas coupling of TRH-R to Gq/11 is indispensable for
the TRH-evoked Ca2+ response, coupling to a G-protein
of the Gs or G13 type is not required for this effect.
Effect of different dominant-negative Gα subunits on
TRH-induced inhibition of endogenous r-ERG currents
in GH3 cells
To investigate the transduction cascade linking the
TRH-R to r-ERG channel inhibition we always used
perforated-patch conditions to minimize cell dialysis and
to preserve intact the intracellular components necessary
for the hormonal response. To isolate the r-ERG current
present in GH3 cells and to quantify its inhibition
by TRH, high-K+ low-Ca2+ extracellular solutions and
established voltage protocols were used. Thus, due to
the fast inactivation of ERG channels at depolarized
potentials and the presence of several outwardly rectifying
voltage- and calcium-dependent K+ currents in GH3 cells,
currents were studied during hyperpolarization pulses
to −100 mV from a holding potential of −10 mV (see
Methods). High-K+ low-Ca2+ extracellular solutions were
also used to increase the amplitude of the inwardly
rectifying r-ERG currents and to reduce Ca2+ currents
and activation of Ca2+ -dependent K+ currents (Bauer
et al. 1990, 1999; Barros et al. 1992, 1997; Weinsberg
et al. 1997). Furthermore, since under these conditions
the TRH-induced current inhibition is almost exclusively
exerted on ERG currents, 5 µm of the ERG-specific blocker
E-4031 (a concentration that totally blocks the r-ERG
current) was added at the end of the experiments to
subtract the E-4031-insensitive currents from the initial
ones and compare the difference between the TRH- and
E-4031-blocked currents in every individual cell (see
Gómez-Varela et al. 2003b). Representative examples of
TRH effects on r-ERG currents in cells transfected with
different G-protein α subunit variants are shown in Fig. 3.
Only successfully expressing cells identified by their eGFP
fluorescence were used for recording. As shown in Figs 3A
and 4, the inhibitory effect of TRH on the E-4031-sensitive
current was not modified by the transfection procedure.
Thus, a value of 76.8 ± 2.7% (n = 20) was obtained in cells
transfected with eGFP and pcDNA3B plasmid lacking any
G-protein coding insert, as compared with the 78.6 ± 5.4%
(n = 8) inhibition obtained in cells showing no detectable
eGFP expression. Similar inhibitions have been previously
reported under identical conditions using untransfected
cells (Gómez-Varela et al. 2003b). Most importantly, the
TRH-induced inhibition was the same in cells expressing
dominant-negative Gα q -QL/DN (74.8 ± 6.3%, n = 6). It
is important to note that failure to significantly modify
the TRH-induced inhibition of r-ERG was not due to
lack of efficient expression of Gα q -QL/DN, since the early
increases in Ca2+ -dependent K+ currents induced by TRH
(a Gq-dependent and PLC/IP3 /Ca2+ -related effect, see
above) were absent in the same cells (Fig. 3B). Apart from
adding further support to specificity of the Gα q -QL/DN
for the Ca2+ response, this indicates that whereas the

and those corresponding to the minimum following addition of 5 µM E-4031 were considered as 0 and 100%,
respectively. Filled circles correspond to the current traces shown above. The first one or two data points following
addition of TRH, when total inward currents become transiently enhanced by activation of Ca2+ -dependent
K+ channels due to massive liberation of Ca2+ from intracellular stores, have been deleted for clarity. Perfusion
of 1 µM TRH and addition of E-4031 to the recording chamber are indicated. Values for the data in the absence
and presence of TRH are indicated by horizontal dashed lines in the time courses. A continuous membrane current
recording at a holding potential of −30 mV around the time of hormone addition is shown in B and marked with a
thick arrow. Note the total absence of transient Ca2+ -dependent K+ currents following TRH addition in the same
cell showing a clear reduction of r-ERG currents. Similar results were obtained in the five additional cells expressing
Gα q -QL/DN.

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726 P. Miranda and others
TRH receptor certainly uses a Gq/11 protein for trans-
duction of the Ca2+ signal during the initial response
to the hormone, this G-protein is not involved in the
TRH-induced inhibition of endogenous r-ERG currents
in GH3 cells.
Recent experiments in GH4 C1 cells using a constitutively
active mutant of Gα 13 and whole-cell recording showed
a partial inhibition of r-ERG currents equivalent to
that induced by TRH under similar conditions (Storey
et al. 2002). Using our perforated-patch conditions, the
inhibition of r-ERG by TRH was attenuated when the
G13 pathway was antagonized with dominant-negative
Gα 13 . Thus, an inhibition of 56.4 ± 6.9% (n = 12, P < 0.01
versus control pcDNA3B-transfected cells, Welch and
Mann-Whitney tests) in the E-4031-sensitive r-ERG
currents was induced by TRH in cells transfected with
1.6 µg of plasmid encoding Gα 13 -QL/DN (4 : 1 ratio
versus EGFP plasmid; not shown). This value was
slightly decreased to 43.8 ± 6.4 (n = 15) when 5.0 µg
of the same plasmid were used (Figs 3C and 4).
This effect was specific, as demonstrated by the total
absence of Gα 13 -QL/DN influence on TRH-induced Ca2+
responses (see above). Interestingly, the magnitude of
the TRH-induced inhibition in individual cells showed
a huge dispersion at both DNA concentrations, which
made it appear that the 27 cell sample was composed
Figure 4. Percentage inhibition of r-ERG currents induced by
TRH in GH3 cells expressing dominant-negative Gα subunits
and Gαt
Current inhibitions were estimated from total inward charge as
described in Fig. 3. Data from individual cells averaged on the bars are
shown as open circles. Values from cells transfected with dominant
negative variants of Gα q , Gα 13 , RhoA and Gα s , or transducin α
subunits (Gα t ) are shown. Data from cells transfected with vector
pcDNA3B (Control 3B) and from untransfected cells (NO transf.) are
also shown for comparison. Significant variations among population
medians as evidenced by Mann-Whitney test or ANOVA and post hoc
multiple comparison test are indicated.
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J Physiol 566.3
of two subpopulations. Whereas nearly half of the cells
showed TRH-induced r-ERG inhibitions above 50%
(equivalent to those of controls and untransfected cells),
a clear reduction of the hormonal effects leaving the
TRH-induced inhibition below 50% took place in the other
half of the cell population (see Fig. 4).
It has been shown that the activation of G13 - (and Gq -)
dependent pathways is able to signal to different effectors
through the small G-protein RhoA (Seasholtz et al. 1999;
Sah et al. 2000; Dutt et al. 2002; Vogt et al. 2003). Expression
of the dominant-negative RhoA-T19N also significantly
attenuated r-ERG modulation by TRH, leaving a mean
inhibition of 53.4 ± 6.3% (n = 11, P < 0.01 versus control,
Welch and Mann-Whitney tests; Figs 3D and 4). Again, a
considerable dispersion of the data was obtained in this
case. Nevertheless, these data confirm previous results
in GH4 C1 cells and suggest that a transduction cascade
involving G13 (but not Gq ) and Rho may participate in the
inhibition of ERG channels by TRH.
Previous results in GH3 cells showed a modification of
the TRH-induced effects on r-ERG in cells treated with the
Gs -modifying agent cholera toxin (Barros et al. 1994; Bauer
et al. 1994). Although a coupling of TRH-R to Gs with sub-
sequent activation of adenylyl cyclase has been reported in
GH3 cells, evidence against (i) stimulation of the enzyme
by TRH and (ii) specific down-regulation of Gα s following
long-term expositions of GH3 cells to TRH has been
obtained also (reviewed in Gershengorn & Osman, 1996).
Furthermore, a cholera toxin-dependent degradation of
Gα s has been demonstrated in GH3 cells (Chang & Bourne,
1989), but it is also known that cholera toxin treatment can
cause a significant reduction in the number of TRH-Rs
(Yajima et al. 1988). This prompted us to check whether
antagonization of the Gs pathway with dominant-negative
Gα s could cause any effect on the TRH-induced r-ERG
current reductions. As shown in Figs 3E and 4, a prominent
reduction of the inhibitory effect of TRH on r-ERG
was observed in the presence of dominant-negative
Gα s -QL/DN. In this case, mean inhibition amounted only
to 33 ± 3.9% (n = 10, P < 0.0001 versus control, Student’s
t and Mann-Whitney tests). This value is also significantly
smaller than that obtained in the presence of RhoA-T19N
(P < 0.02, Mann-Whitney test). It is important to note
that in the presence of dominant-negative Gα s not only is
the reduction of the TRH-induced inhibition the biggest
observed, but also the dispersion of the data is notably
reduced (Fig. 4). This supports the conclusion that Gs plays
a crucial role on the inhibitory effects of TRH in GH3 cells.
Effect of transducin α subunit expression on the
TRH-induced inhibition of r-ERG in GH3 cells
It has been recognized that receptors that activate G13 also
couple to Gq and G11 . It is also well known that Gα 13
and Gα q/11 signals induce Rho activation and subsequent


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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation
cellular responses by inducing GDP–GTP exchange in
Rho guanine nucleotide exchange factors in response to
extracellular stimuli (Seasholtz et al. 1999; Sah et al. 2000;
Dutt et al. 2002; Vogt et al. 2003). Thus it seemed surprising
that dominant-negative Gs (but not Gq ), G13 and Rho
share antagonism on the TRH-induced effects on r-ERG.
To check the possibility that reduction of TRH-induced
inhibition involves a component common to Gs and G13
but not available in heterotrimeric Gq , we studied the
consequences of expressing transducin α subunits (Gα t ),
a scavenger of βγ dimers after they are released from
G-proteins by receptor stimulation (Crespo et al. 1994;
Faure et al. 1994; Palomero et al. 1998). The inhibition
of r-ERG by TRH was strongly attenuated by Gα t
(33.5 ± 4.4%; n = 14, P < 0.0001 versus control, Student’s
t and Mann-Whitney tests; Figs 3F and 4) up to levels
equivalent to those observed with dominant-negative Gα s .
This effect of Gα t was totally specific, since both the
percentage of cells showing a detectable increase in peak
[Ca2+ ]i and the magnitude of the TRH-induced Ca2+
response remained the same regardless of the presence
or the absence of Gα t (Fig. 2D). As discussed below, this
suggests that free βγ subunits released from Gs (and
perhaps shared by G13 ) heterotrimers may be responsible
for the TRH-induced inhibition of endogenous r-ERG
currents in GH3 cells.
Generation of a HEK293 cell clone permanently
expressing HERG channels and TRH receptors and
characterization of the TRH response
Unlike the strong and quite reproducible current
inhibitions induced by TRH on the endogenous ERG
current, only modest effects of the hormone have been
reported on other kinetic characteristics of ERG either end-
ogenous or heterologously expressed in GH3 cells (Barros
et al. 1992; Bauer et al. 1998; Schledermann et al. 2001).
This fact and the sometimes variable effect of dominant
negatives in the individual cells prevented us from reaching
any consistent conclusion about the way in which different
G proteins could be affecting other current parameters in
these cells.
HEK293 cells permanently expressing HERG constitute
an interesting and widely used model system to study easily
the biochemical and electrophysiological properties of the
channel (Zhou et al. 1998b). For this reason, we initially
isolated several cell clones expressing HERG. Subsequently,
they were cotransfected with a plasmid containing the
TRH-R cDNA (de la Peña et al. 1992). Single colonies
were selected and tested for both HERG current under
voltage-clamp and TRH-induced Ca2+ responses with
the fluorescent Ca2+ indicator Fura-2 (see Methods).
A cell line named HEK-H36/T1 showing high HERG
current density and also systematic Ca2+ increases when
exposed to TRH was used for the experiments reported


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727
here. As shown in Fig. 7, the HEK-H36/T1 cells showed
voltage-activated K+ currents typical of HERG under the
perforated-patch conditions chosen to maintain as intact
as possible the hormonal responses. Apart from HERG
currents, we frequently detected also other outward K+
currents during the depolarization steps. The magnitude
and the degree of inactivation of these currents during the
depolarization pulses were highly variable. Nevertheless,
their contribution was negligible along the tail current
time course, as evidenced by their absence after treating
the cells with the specific HERG inhibitor E-4031 (Fig. 5A).
Thus only HERG current characteristics would be referred
to by limiting the analysis to tail currents. Addition of
TRH to HEK-H36/T1 cells loaded with Fura-2 triggered
a transient increase in cytoplasmic Ca2+ that slowly
declined to basal values upon hormone washout. On
the average, the amplitude of this Ca2+ response was
equivalent to that elicited in the same cells by carbachol
(data not shown) probably acting through the endogenous
muscarinic receptors of HEK293 cells. The TRH-induced
Ca2+ responses were absent in the cell clones containing
HERG channels but not coexpressing TRH-Rs.
The simultaneous presence of TRH-R and HERG
channels in HEK-H36/T1 cells prompted us to check the
effect of the hormone on HERG currents in this putatively
simple and defined cellular background. TRH reduced
tail HERG currents within 1–3 min after introducing
the hormone in the recording chamber (Fig. 5A). The
current level was lowered by 36 ± 2% (n = 38) when
measured at the peak of the tails that followed pulses of
1 s duration at +40 mV. Furthermore, a strong shift in
current availability voltage dependence to more positive
voltages was also caused by TRH. Thus the V1/2 value of
the Boltzmann functions describing the I–V curves was
shifted from −1.5 ± 1 to +25.5 ± 2 mV (n = 14) under
these conditions (Fig. 5A). It is important to note that the
diminished tail currents remaining after treatment with
TRH were entirely due to the operation of HERG channels,
since they were abolished by E-4031.
Due to the slow activation and deactivation kinetics
of HERG channels, no steady-state conditions would
be expected within 1 s depolarizations. A possible cause
of the shift in activation voltage dependence could be
a displacement of the V 1/2 values to more depolarized
potentials due to a slower activation rate leading to a less
steady-state condition (Schönherr et al. 1999; Viloria et al.
2000). In fact, it is known that the activation rate of HERG
channels in Xenopus oocytes is slowed by activation of
coexpressed TRH-Rs (Barros et al. 1998). For this reason,
we also tested the effects of TRH on HERG activation
rates in HEK-H36/T1 cells using an indirect envelope of
tail currents protocol (Barros et al. 1998; Viloria et al.
2000). As shown in Fig. 5B, the time required to attain a
half-maximum current magnitude was increased by TRH
near an order of magnitude between +40 and +60 mV.
728 P. Miranda and others J Physiol 566.3

Thus the difference in the inflection potentials of the was also detected in response to TRH when the I–V
I–V curves could be due, at least in part, to the different curves were generated from tail currents following long
activation rates around the V1/2 values. Nevertheless, an depolarization steps of 10 s duration (Fig. 6A). Finally,
18 mV shift from −22.5 ± 2.2 to −4.1 ± 2.8 mV (n = 6) the position of the curves under real steady-state was

Figure 5. Effect of TRH on HERG current activation in HEK-H36/T1 cells

A, effect of TRH on voltage dependence of HERG current availability. The voltage dependence of activation was
studied in the absence (Control) or the presence of 100 nM TRH (TRH) by varying the amplitude of a 1 s prepulse from
a holding potential of −80 mV, and measuring the magnitude of the peak tail current at a constant repolarizing
voltage of −50 mV. Membrane currents recorded in the presence of TRH plus 1 µM E-4031 (E-4031) are also
shown for comparison. Superimposed current traces for depolarizing steps between −50 and +40 mV (Control)
or −40 and +60 mV (TRH and E-4031) are shown on the left. Control and TRH traces obtained after subtracting
the E-4031-resistant currents are also shown on the right. Pulses were applied once every 20 s. Current traces
have been subtracted for leak. Recording of currents in the presence of TRH started 2 min after introducing the
neuropeptide in the recording chamber. Averaged fractional activation curves obtained before and after addition
of TRH are shown at the bottom. Normalized outward tail current magnitudes at the peak are plotted versus
test pulse potential (Em ). Data normalized to maximum of tail current magnitude without TRH are presented. The
continuous lines correspond to Boltzmann curves h(V ) = I max (1/(1 + exp(V − V1/2 )/k)), that best fitted the data.
The relative position of the V1/2 values and their numeric magnitude are indicated in the graph. B, effect of TRH on
HERG current activation rate. The time course of voltage-dependent activation was studied by varying the duration
of a depolarizing prepulse and measuring the magnitude of the peak tail current at a constant repolarizing voltage
of −50 mV. Families of currents at a depolarizing potential of +40 mV are shown for a cell before (Control) and
after adding 100 nM TRH (TRH). Current traces corresponding to depolarization steps of 0, 20, 40, 80, 160, 320,
640, 1280, 2560 and 5120 ms are shown superimposed. The dependence of activation rates on depolarization
membrane potential is shown at the bottom. The magnitude of the peak tail current upon repolarization was
determined from recordings as shown at the top. The time necessary to attain half-maximum current magnitude
at different depolarization potentials is plotted in the absence or the presence of TRH.

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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation 729

extrapolated as the mean of those obtained from hyper-
polarized (−80 mV) and depolarized (+40 mV) holding
potentials (Schönherr et al. 1999; Viloria et al. 2000). In
this case a 15 mV shift in V1/2 (from −25.0 to −10.0 mV,
n = 2) was obtained (Fig. 6B). Altogether, this suggests that
two distinct effects on activation contribute to the shifts
when studied with 1 s short depolarization steps: a genuine
shift of the voltage dependence of activation and a marked
slowing of activation rates moving the channels further
away from steady-state conditions.
The deactivation properties of HERG can be obtained
from the time course of current decay during voltage steps
to negative potentials, following depolarizing pulses at a
fixed time and voltage designed to activate (and inactivate)
the channels. In this case, the closing time constants
can be estimated by fitting a bi-exponential function to
the decaying tail current phase that follows the initial
peak once channel inactivation has been removed by the
repolarization. Both the fast and the slow exponential
components of current deactivation were significantly

Figure 6. Effect of TRH on HERG activation voltage dependence under steady-state conditions
A, effect of TRH on activation voltage dependence studied using long depolarization steps of 10 s. Tail currents upon
repolarization to −50 mV were obtained following 10 s depolarizations to different voltages as indicated at the
top. Only the end of the depolarizing steps and the tail currents at −50 mV are shown for clarity. Traces correspond
to a cell before (Control) and 3 min after introduction of 100 nM TRH (TRH). Averaged I–V curves before and after
the hormonal treatments are shown at the bottom. The magnitude of the peak tail current upon repolarization was
determined from recordings as shown at the top and normalized to maximum of tail current magnitude without
TRH. B, effect of TRH on HERG steady-state voltage dependence of activation. Steady-state voltage dependence
of activation was studied following the protocols shown in the two upper panels, with a prepulse of varying
magnitude and a duration ranging from 1 to 10 s, followed by a pulse test to −50 mV. Holding potentials of
+40 mV to keep the channels fully open and −80 mV to hold them fully closed were used as indicated. Families
of currents during the test pulse for Control and TRH-treated cells following 10 s prepulses to different potentials
are shown. Fractional activation curves before and after TRH treatment are shown at the bottom. Open and filled
symbols correspond to data obtained from −80 and +40 mV holding voltages, respectively. Data obtained at
prepulse duration of 1 s (circles), 5 s (squares), and 10 s (triangles) are plotted. In every curve current values were
normalized to tail current magnitude in response to the more depolarized potential of the prepulse series. The
dashed lines represent the deduced position of the activation curves under steady-state conditions obtained as
a mean of those corresponding to both holding voltages and prepulses of 10 s duration. The V1/2 values for the
steady-state curves are indicated by arrows in the graphs.

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730 P. Miranda and others
accelerated by TRH at all voltages between −40 and
−120 mV. As an example, the values of deactivation time
constants at −50 mV for the fast and the slow components
of closing were reduced by the hormone from 213 ± 22
to 119 ± 11 ms (n = 5, P < 0.01) and from 965 ± 135 to
579 ± 77 ms (P < 0.05, Student’s t test), respectively.
The clear effects of TRH on HERG opening and
closing contrast with the almost complete absence
of hormone-induced modifications on inactivation
properties. Thus only a slight but non-significant
acceleration of inactivation rates was observed upon
addition of TRH. Furthermore, both control and
TRH-treated cells showed identical rates of inactivation
recovery when the time course of the initial current
increase in response to hyperpolarizing pulses was
compared (not shown).
Effect of dominant-negative Gα subunits and Gαt on
TRH-induced Ca2+ responses and modifications of
HERG I–V curves in HEK-H36/T1 cells
The influence of the dominant-negatives and Gα t
expression on the hormonal effects in HEK-H36/T1 cells
was studied following procedures analogous to those
described for endogenous channels in adenohypophysial
GH3 cells. Again, dominant-negative Gα q , but not
Gα t or dominant-negative Gα s , Gα 13 and RhoA,
reduced TRH-induced increases of cytoplasmic Ca2+
in the HEK-H36/T1 cells (Fig. 7). The modulation
of HERG channels by TRH in HEK-H36/T1 cells
was not changed by the transfection procedure used
for dominant-negative expression (Control in Fig. 8).
Surprisingly, the TRH-induced HERG current inhibition
at positive voltages was not significantly altered in the
presence of dominant-negative Gα 13 , RhoA or Gα s , but
was strongly reduced by Gα q -QL/DN or Gα t expression
(Fig. 8A and C). On the other hand, the positive
shifts in activation voltage dependence were reduced
by RhoA-TN and nearly abolished by Gα 13 -QL/DN
(Fig. 8A and B). Although the shift in the I–V curves
was almost absent in Gα q -QL/DN-transfected cells, the
basal position of the curves before adding hormone was
clearly displaced to positive voltages in the cells expressing
the dominant-negative form of Gα q (Fig. 8A). This
complicates the interpretation of the dominant-negative
Gα q influence on the hormonal effect in the I–V relation.
Finally, expression of the βγ dimer scavenger Gα t left
unaltered the TRH-induced voltage dependence shift
in 10 of 14 tested cells, but blocked completely the
reductions in maximal tail current magnitude triggered by
the hormone. These results not only indicate a variation
of the dominant-negative effects in different cellular
and/or channel background, but also that these effects
are differently manifested as a function of the channel
parameter being considered.
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J Physiol 566.3
Discussion
In this report we used a dominant-negative strategy to
explore the specificity of TRH-R coupling to G-proteins
for inhibition of the native r-ERG K+ channels present
in GH3 rat anterior pituitary cells. Based in the reported
insensibility of the TRH responses to pertussis toxin
treatment (Bauer et al. 1994) we focused our efforts in
the Gq , G13 and Gs families of G-proteins. Using the
same approach we also compared the results with those
obtained in an heterologous expression system, namely a
HEK293 cell line (HEK-H36/T1) permanently expressing
HERG channels and TRH-Rs. In both cases, xanthine
nucleotide-binding (GαX) double mutants (Gα-QL/DN)
of G-protein α subunits able to act as dominant-negative
inhibitors against specific G-proteins (Yu et al. 2000) were
used. Our results demonstrate that transduction of the
Ca2+ signal during the GH3 cell initial response to TRH
is potently antagonized by dominant-negative Gα q/11 and
that this Ca2+ response remains unaltered in the presence
of the dominant-negative variants of Gα 13 , RhoA and
Gα s . On the other hand, dominant-negative variants of
Gα 13 and Rho, but not of Gα q/11 , are able to significantly
reduce the inhibitory effect of TRH on ERG. A more
prominent reduction of the TRH-induced ERG inhibition
is observed upon introduction of dominant-negative Gα s .
These results indicate that the TRH receptor certainly
couples to a Gq/11 protein for transduction of the Ca2+
signal, but that this G-protein is not involved in the
TRH-induced inhibition of ERG currents. This is coherent
with previous results indicating that appearance of Phase
2 of increased electrical activity in GH3 cells takes place in
the presence or the absence of a detectable initial Ca2+
response (Phase 1; see Barros et al. 1994; Bauer et al.
1994). Our data also indicate that (i) failure to detect any
influence of the Gα 13 , Rho and Gα s dominant-negatives
on the Ca2+ signal is not due to lack of their functional
expression, (ii) coupling of the TRH-R to one (or more)
heterotrimeric G protein(s) carrying Gα s and/or Gα 13 sub-
units takes place in the GH3 cells, (iii) Gα s and perhaps a
Gα 13 - and Rho-dependent pathway can participate in the
transduction cascade linking TRH-R activation to r-ERG
modulation in GH3 cells, and (iv) there is a clear specificity
in the ability of dominant-negatives to antagonize different
physiological responses triggered by TRH in these cells.
In principle, the observed specificity of the
dominant-negatives seems rather surprising according
to the proposed mechanism for negative dominance in
the Gα-QL/DN mutants. Introduction of the QL/DN
mutations shifts nucleotide binding specificity from
guanine nucleotides to xanthine nucleotides. Because
the low concentrations of xanthine nucleotides in vivo,
essentially nucleotide-free Gα-QL/DN proteins would
exist in cells, and these would form stable complexes
with cognate receptors and inhibit them by competing


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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation 731

with endogenous wild-type G proteins (Yu et al. 2000).
Accordingly, it could be expected that all signalling
pathways lying on a given receptor became inhibited by
any Gα-QL/DN variant interacting with it. Our results
demonstrate that this is not the case for the TRH-R.
The presence of a heterogeneous population of binding
sites for TRH in GH3 cells has been previously reported
(Gautvik & Lystad, 1981) and two TRH-R isoforms
derived from the same gene by differential splicing
mechanisms have been shown to be expressed in GH3

Figure 7. Effect of dominant-negative Gα subunits and Gαt expression on Ca2+ liberation from
HEK-H36/T1 cell intracellular stores in response to TRH
Protocols and data evaluation were performed as described in Fig. 2. Only data from the cell subpopulations
showing a visually detectable peak Ca2+ increase are plotted. In all cases the number of averaged cells respect
to the total number of cells present in the field is boxed. Analogous results were obtained in two additional
experiments.

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732 P. Miranda and others J Physiol 566.3

cells (de la Peña et al. 1992). However, no significant
differences in binding or signalling properties of these
receptors seem to exist (de la Peña et al. 1992; Lee et al.
1995; Gershengorn & Osman, 1996). Furthermore, the
presence of two different molecular species of TRH-R
could not explain the dominant-negative specificity
found in HEK-H36/T1 cells in which only an isoform of
the receptor is expressed. Clearly, further work will be
necessary to understand the reason(s) for the observed
specificity of the dominant-negative effects.
Regardless of the exact mechanism by which the
negative dominance takes place, the demonstration of the
functionality and specificity of the Gα-QL/DN variants
allowed us to explore the TRH-R coupling to defined
G proteins for transducing the inhibitory signal to ERG
channels. Our results suggest that Gα s plays a crucial role
transducing the TRH signal to native r-ERG channels
in GH3 cells, since dominant-negative Gα s causes the
greatest reduction of the hormonal effect as well as the
smallest data dispersion in individual cells. These data
are consistent with previous results showing that the
TRH-induced r-ERG inhibition is enhanced by short-term
treatment with cholera toxin (an agent able to specifically
modify Gα s functionality) and nearly abolished when the

Figure 8. Effect of dominant-negative Gα subunits and Gαt on TRH-induced modifications of HERG I–V
curves in HEK-H36/T1 cells
A, effect of Gα subunit expression on HERG activation voltage dependence. Voltage dependence of activation
was studied in the absence (open symbols) or the presence (filled symbols) of 1 µM TRH by varying the magnitude
of a 1 s depolarizing pulse as detailed in the legend of Fig. 5A. Data normalized to maximum of tail current
magnitude without TRH are shown. V1/2 values obtained from the Boltzmann curves that best fitted the averaged
data (continuous lines) and the number of recorded cells are indicated in the graphs. B, comparison of TRH-induced
shifts on activation voltage dependence in cells expressing different Gα subunits. Data from the same cells used
to generate the averaged I–V curves shown in panel A were used. Values of TRH-induced shifts from the different
individual cells were averaged and are shown in the histogram. C, effect of Gα subunit expression on TRH-induced
inhibition of HERG currents at positive voltages. Data from the same cells used to generate the averaged I–V curves
shown in panel A were used. Values of TRH-induced reductions in maximal currents from the different individual
cells were averaged and are shown in the histogram. Statistically significant variations versus controls in Student’s
t or Mann-Whitney tests are indicated in B and C.

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J Physiol 566.3 TRH receptor coupling to G-proteins for ERG K+ channel regulation
treatment with the toxin is prolonged (Barros et al. 1993,
1994; Bauer et al. 1994). They will be also coherent with
the reported inhibition of TRH-induced PLC stimulation
in Xenopus oocytes using nucleotides antisense to Gα s (de
la Peña et al. 1995; but see Gershengorn & Osman, 1996).
The reasons why coupling of TRH-R to Gs in GH3 cells
only modestly stimulates adenylyl cyclase (Paulssen et al.
1992; Gershengorn & Osman, 1996) and why prolonged
stimulation with TRH down-regulates Gq/11 but has no
effect on the Gα s protein levels (Kim et al. 1994) remain
to be established. As suggested previously (Barros et al.
1993, 1994; Bauer et al. 1994), it is possible that a Gs -like
protein that is not Gs itself, but sensitive to cholera toxin
and blocked by Gα s -QL/DN expression, is involved in GH3
cell r-ERG inhibition by TRH.
Using the dominant-negative approach we also studied
the possible implication of Gα 13 and RhoA, two entities
recently proposed as mediators of r-ERG modulation
by TRH (Storey et al. 2002). In this case, expression
of dominant-negative Gα 13 -QL/DN significantly reduced
the TRH-induced inhibition, although a slightly smaller
effect was observed than that with Gα s -QL/DN and
only in around 50% of the recorded cells was the
hormonal effect clearly antagonized. It is unlikely that this
situation is caused by an unspecific inhibition of Gs by
dominant-negative Gα 13 because smaller TRH-induced
inhibitions and wider dispersion of the data were also
observed with dominant-negative RhoA, a component
located downstream of G13 in many cellular systems and
(supposedly) not directly related to Gs . On the other hand,
it seems difficult to conceive a transduction mechanism
involving Gα s , Gα 13 and RhoA (but not Gα q ) either
simultaneously or indistinctly. Our data following the
overexpression of Gα t , an agent known to sequester free
G-protein βγ dimers (Crespo et al. 1994; Faure et al.
1994; Palomero et al. 1998), offer a possible explanation
of this apparent paradox. Thus, prominent reductions of
the TRH-induced r-ERG inhibition equivalent to those
obtained with dominant-negative Gα s are observed in
Gα t -transfected GH3 cells. The specificity of the Gα t
effect was demonstrated by its failure to modify the
Ca2+ response in the same cells. It is tempting to
speculate that a specific set of free βγ subunits released
from Gs heterotrimers (or a similar combination pre-
sent in G13 but not in Gq ) may be responsible for the
TRH-induced inhibition of endogenous r-ERG currents
in GH3 cells. Interestingly, both Gα and Gβγ subunits
have been implicated in activation of Rho (Niu et al.
2003). Furthermore, GH3 cells constitute perhaps the
best characterized example in which specific hormone
receptors have been shown to use G protein heterotrimers
of different αβγ subunit composition to modulate
an ionic channel (reviewed in Robishaw & Berlot,
2004).


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733
Comparison of TRH and dominant-negative effects in
native GH3 cells and a heterologous expression system
such as the HEK-H36/T1 cells reveals some quantitative
and qualitative differences. These include (i) considerably
smaller TRH-induced current inhibitions in HEK-H36/T1
cells, (ii) a clear inability of dominant-negative Gα s
to alter TRH-induced modifications of both activation
voltage dependence and HERG current magnitude in
HEK-H36/T1 cells, (iii) a significant reduction of the
I–V curve shifts induced by TRH in HEK-H36/T1 cells
upon expression of Gα 13 -QL/DN and RhoA-T/N without
any concomitant alteration of current inhibition, and
(iv) the maintenance of a TRH-induced positive shift
of the I–V curves in Gα t -transfected HEK-H36/T1 cells
in which the presence of the βγ scavenger abolishes
the HERG current inhibition induced by the hormone.
Use of perforated-patch conditions excludes uncontrolled
alterations of the intracellular environment as a cause for
these differences. Instead, our results point to differences
in the cellular background and/or the molecular identity
of the channel protein as determinant of them. The
parallel effects of TRH on ERG channels either end-
ogenous or overexpressed in GH3 /B6 cells (Schledermann
et al. 2001) suggest that the cellular background may
influence the transduction mechanism(s) involved in
hormonal regulation of the channels. This is further
supported by recent results showing that Gq/11 , but
not Gi/o or G13 , mediates hormonal inhibition of ERG
currents in tsA-201 cells coexpressing rat ERG1 channels
and another Gq/11 -coupled receptor, the M1 muscarinic
receptor (Hirdes et al. 2004). Some differences between the
signal cascade mediating the TRH-induced modulation
of HERG in Xenopus oocytes and the physiological
pathway modulating the native ERG channels in GH3
cells have been also reported (Barros et al. 1998). It
is important to highlight that the dominant-negative
effects reported here may vary also as a function of
the kinetic parameter being considered. Thus whereas
only an attenuation of the TRH-induced I–V shifts is
observed in HEK-H36/T1 cells in which the G13 pathway
is blocked with dominant-negative G13 or RhoA, only the
hormone-induced current inhibition but not the I–V shift
is antagonized in Gα t -transfected cells. The possibility that
more than one hormone-activated mechanism exists for
regulation of different channel properties is reinforced
by recent data showing that separate protein segments
in the amino terminus and/or different structural
rearrangements of the channel molecule are necessary
for the TRH-induced modifications of HERG activation
and deactivation gating in Xenopus oocytes (Gómez-Varela
et al. 2003a).
In summary, the results presented in this report lead us
to propose that free βγ subunits released from Gs (and
perhaps shared by G13 ) heterotrimers are responsible for
734 P. Miranda and others
TRH-induced inhibition of the endogenous r-ERG current
in GH3 cells, in which reductions of current magnitude
constitute the major component of the hormonal
response. Differences in the subunit composition of the
βγ dimers associated with Gq could explain the inability
of Gq heterotrimers to serve a similar function in these cells.
Variations in the cellular background upon heterologous
expression of the channels may influence the transduction
mechanism(s) involved in hormonal regulation of ERG,
but also the kinetic characteristics modified in response
to an agonist. Thus, as suggested by the similarities in
the effects of Gα q -QL/DN and Gα t , βγ dimers released
from a G protein different from Gs (probably Gq ) are
probably involved in the relatively small current inhibition
detected in HEK-H36/T1 cells. However, it is a Gα 13 -
and RhoA-dependent pathway what seems to determinate
the prominent alterations in HERG activation voltage
dependence triggered by TRH in these cells heterologously
expressing HERG channels and TRH-Rs.
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We thank Noelia S. Durán for technical assistance. We also
thank Drs Maria Sierra, Miguel A. Comendador and Pelayo
Casares for help with statistical analysis. This work was supported
by grants PM99-0152 and SAF2003-00329 from DGICYT and
Ministerio de Ciencia y Tecnologı́a of Spain. Finance support
from Dirección Gral. de Universidades e Investigación of Asturias
for acquisition of the image equipment (ref. EQPT02-36)
is also acknowledged. P.M. holds a predoctoral fellowship
from FICYT of Asturias (ref. BP03-108). D.G., C.A.R. and
D.G.V. are predoctoral fellows from the Spanish Ministerio de
Ciencia y Tecnologı́a (refs AP2000-4363, BES-2004-3872 and
FP2000-5736).

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FRET with multiply labeled HERG K+ channels as a reporter of the in vivo coarse
architecture of the cytoplasmic domains
Pablo Miranda a,1, Diego G. Manso a,1, Francisco Barros a,⁎, Luis Carretero a, Thomas E. Hughes b,
Carlos Alonso-Ron a, Pedro Domínguez a, Pilar de la Peña a
a
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Santiago Gascón, Campus del Cristo, Universidad de Oviedo. E-33006. Oviedo, Asturias, Spain
b
Department of Cell Biology and Neuroscience, Montana State University, Bozeman, Montana 59717, USA

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: The intracellular N-terminus of human ether-a-go-go-related gene (HERG) potassium channels constitutes a
Received 29 November 2007 key determinant of activation and deactivation characteristics and is necessary for hormone-induced
Received in revised form 30 May 2008 modifications of gating properties. However, the general organization of the long amino and carboxy HERG
Accepted 2 June 2008
terminals remains unknown. In this study we performed fluorescence resonance energy transfer (FRET)
Available online 19 June 2008
microscopy with a library of fluorescent HERG fusion proteins obtained combining site-directed and trans-
Keywords:
poson-based random insertion of GFP variants into multiple sites of HERG. Determinations of FRET efficiencies
HERG with functional HERG channels labeled in different combinations localize the fluorophores, introduced in the
Potassium channel amino and carboxy ends, in two quadratic planes of 7.8 and 8.6 nm lateral size, showing a vertical separation of
Cytoplasmic domain architecture nearly 8 nm without major angular torsion between the planes. Similar analysis using labels at positions 345
FRET and 905 of the amino and carboxy terminals, located them slightly above the planes delimited by the amino and
carboxy end labels, respectively. Our data also indicate an almost vertical arrangement of the fluorophores
introduced in the NH2 and COOH ends and at position 905, but a near 45° angular rotation between the planes
delimited by these labels and the 345-located fluorophores. Systematic triangulation using interfluorophore
distances coming from multiply labeled channels provides an initial constraint on the overall in vivo arrange-
ment of the HERG cytoplasmic domains, suggesting that the C-linker/CNBD region of HERG hangs centrally
below the transmembrane core, with the initial portion of the amino terminus around its top and side surfaces
directed towards the gating machinery.
© 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction EAG/erg K+ channels, the T1 domain is lacking and sometimes is subs-

The human-ether-a-go-go related gene encodes a channel (HERG)
that is a member of the EAG family of voltage-dependent potassium
channels, molecularly characterized by a pore-loop transmembrane
region [1] assembled in a tetramer of four identical (or similar) sub-
units surrounding a central pore [2]. To this basic pattern of the central
transmembrane structure, two general arrangements of cytoplasmic
modules have been added through evolution. In the prototypical Kv
voltage-dependent K+ channels, an amino terminal T1 domain
corresponding to a symmetrical tetrameric structure is located below
the transmembrane core, determining the subunit assembly and the
attachment of accessory β-subunits and other modulators. Little is
known about the molecular organization of the remaining cytoplasmic
domains [2–6]. In a second group of channels, including those gated by
intracellular ligands, hyperpolarization-activated channels, sensory
stimuli-sensitive TRP channels and depolarization-gated KCNQ and
⁎ Corresponding author. Fax: +34 98 510 3157.
E-mail address: fbarros@uniovi.es (F. Barros).
1
These authors contributed equally to this work.
tituted by a C-terminal four-fold symmetrical structure hanging below
the core [2,7–9]. In these cases, the relative arrangement of the amino
terminals and/or the rest of the cytoplasmic domains between them
and with respect to the channel core remains unknown.
In HERG channels, the general organization of the cytoplasmic
domains remains obscure. Sequence conservation between HERG and
HCN channels would be consistent with a localization of the carboxy
terminal C-linker/CNBD as a compact tetrameric structure in a central
position immediately below the cytoplasmic pore opening as has been
previously proposed for HCN and TRP channels [8–10]. Indeed, a
participation of this region in the tetrameric assembly of HERG has also
been proposed [11]. However, only defective trafficking to the plasma
membrane but not an impaired ability to assemble into tetramers has
been demonstrated for channels lacking the CNBD or different sections
of the carboxy terminus of HERG [11–15]. A compact oligomeric amino
terminal EAG/PAS domain would also be compatible with the ability of
this region to form tetramers in vitro in the absence of the rest of the
protein, and to inhibit the functional expression of wild-type HERG
[16]. It has also been shown that N-terminal interactions are involved
in the heteromeric assembly of HERG 1a and 1b subunits [17]. How-

0167-4889/$ – see front matter © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbamcr.2008.06.009
1682 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699
ever, this protein segment only forms monomers in crystal structures
[18], and channels truncated at residue 725 of the carboxy terminus are
not able to assemble in spite of the presence of an intact EAG/PAS
domain [11]. It has also been shown that HERG N-terminal truncations
that delete the EAG/PAS domain still allow the formation of functional
channels in the plasma membrane [18–22].
Voltage sensors and gating elements have been mapped to the
transmembrane region of voltage-gated potassium channels. How-
ever, the amino- and carboxy-terminal cytoplasmic domains also play
a key role in activation and deactivation gating of these channels (for
reviews see [7,23,24]). This can be particularly significant for HERG,
since it operates as an inward rectifier although it has the typical
molecular arrangement of depolarization-activated channels [25].
Such a kinetic behaviour is critical for normal cardiac repolarization
and setting electrical parameters in a variety of cells [reviewed in
26–28]. As in other voltage-dependent K+ channels, voltage sensors
and gating elements in HERG are located within the core transmem-
brane region [29–34]. However, it is also known that the initial part of
the HERG N-terminus determines its slow deactivation [18,20–
22,35,36], and that the presence of a structurally intact proximal do-
main, also in the amino terminus, is essential for maintenance of
normal activation properties and hormonal modulation of activation
and deactivation parameters [21,37–39]. Therefore, unravelling the
general structure of those HERG cytoplasmic regions associated with
its gating is important for understanding how this channel controls
fundamental physiological events such as cardiac rhythm and
contraction, hormone secretion, and tumour cell proliferation [26–28].
Given the importance of knowing the relative position and the
structural organization of HERG intracellular structures, in this report
we have tried to get some insight into the basic architecture of the
amino and carboxy HERG terminals in vivo. For this purpose we
generated a library of HERG fluorescent fusion proteins useful for
fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy studies,
combining the directed insertion of the labels in specific positions with
a random insertion of the cyan (CFP) and yellow (YFP) variants of the
green fluorescent protein (GFP) into multiple sites by a transposon-
based technique [40,41]. Next we performed an electrophysiological
screening of the library looking for correctly assembling constructs
that might provide insights about the positioning and functional
implications of some specific regions in the context of the whole
channel. Also, donor de-quenching following photobleaching of the
acceptor fluorophore was used for a quantitative determination of
FRET efficiencies [42–46] of several library constructs. Subsequent
estimation of interfluorophore distances and the performance of
“multiple molecular triangulation” with fluorophores located at va-
rious positions provided a useful initial constraint on the coarse
structure of the channel tetramer, clarifying the relative arrangement
of some key landmarks on the cytoplasmic ends of HERG.
2. Materials and methods
2.1. CFP/YFP tagging of HERG channels
The original plasmid construct containing the cDNA of the HERG
channel was a gift of Dr. E. Wanke (University of Milan, Italy). To gene-
rate HERG channels N-terminally labeled with the enhanced yellow
(EYFP) or cyan (ECFP) fluorescent protein (subsequently named YFP and
CFP throughout the text) a Hind III/BamHI cDNA fragment containing
the entire coding region from HERG was cloned into pEYFP-C1 and
pECFP-C1 vectors (Clontech) in-frame with the fluorescent protein
sequence. For this purpose a forward primer containing a HindIII
recognition site and the coding sequence corresponding to HERG amino
acids 1–7 (5′-GGAAGCTTTCATGCCGGTGCGGAGGGGCCAC-3′) was used
in PCR reactions with a reverse primer containing the coding sequence
corresponding to amino acids 370–378 and covering the unique BstEII
site. The resulting PCR product was digested with HindIII/BstEII, gel
purified and ligated into HindIII/BstEII-digested wild-type HERG in the
pSP64A+ vector. The purified HindIII/BamHI fragment obtained from
this construct was subsequently cloned into the pEYFP/ECFP-C1 vectors.
A similar strategy was used to generate C-terminally labeled HERG
channels using the pECFP-N1 and pEYFP-N1 vectors (Clontech). In this
case it was necessary to construct first a HERG cDNA with an EcoRI
recognition site instead of the stop codon at the end of the coding
sequence. A forward primer containing the coding sequence corres-
ponding to amino acids 859–867 was used in PCR reactions with a
reverse primer containing the coding sequence for amino acids 1151–
1159 and the EcoRI recognition site (5′-GGGAATTCCTGCCCGGGTCCG-
AGCCGTGTCTGTG-3′). The resulting PCR product was digested with
SacI/EcoRI, purified and ligated into the corresponding sites of wild-
type HERG. Finally the Hind III/EcoRI cDNA fragment from this
modified construct was cloned into the pECFP/EYFP-N1 vectors.
The HERG channels with CFP or the venus variant of YFP (VFP) inserted
at different internal positions of the coding sequence were obtained by
random insertion with an in vitro transposition system using a Tn5-
derived hyperactive transposon carrying the fluorescent protein coding
sequence for CFP or VFP as previously described [40,41]. These two
transposons (TcPT-1 encoding CFP and TvPT-0 encoding VFP) use different
reading frames to increase the chance of insertion yielding functional
proteins [40]. Given the low probability of transposition in an in vitro
reaction, the transposons also include as selective marker a kanamycin
resistance gene (Kanr) flanked by SrfI restriction sites that can be used to
subsequently remove it. Two independent in vitro transposition reactions,
one for each transposon, were carried out containing molar equivalents of
the PCR-amplified transposon and the target plasmid (carrying the cDNA
of wild type HERG) with EZ::TN transposase (Epicentre Technologies).
After the transposition reaction and transformation, the transposed
clones expressing dual antibiotic resistance to ampicillin (transformed
clones) and kanamycin (marker for transposition) were transiently
expressed in HEK293 cells to identify and select correctly orientated in-
frame insertions by following the appearance of fluorescent fusion
proteins. The Kanr cassette was further removed by digestion with SrfI
and religation to obtain the full-length fusion constructs. Sequencing and
transient expression of each fusion protein was used to confirm proper
insertion of the fluorescent protein into the HERG coding sequence and
correct folding of the fluorophore regardless of the insertion site. Two
collections of HERG fluorescent fusion proteins containing either CFP or
VFP randomly inserted all along the channel coding sequence were thus
generated. Additionally, some of the fluorescent fusion channel constructs
from each collection were subsequently used as a base for the generation
of identical constructs carrying the complementary fluorophore. For this
purpose, PCR fragments containing the coding sequence of CFP and VFP
fluorescent proteins were generated using as template the plasmids
containing both transposons [40]. After digestion with AscI and SrfI these
PCR products were finally used to replace in the fluorescent fusion
channel constructs the corresponding AscI/SrfI fragment containing the
complementary fluorophore.
To generate HERG channels N and C-terminally double labeled with
both CFP and V/YFP fluorescent proteins, HindIII–BstEII restriction
fragments from channel fusion constructs carrying the fluorescent label
located in the amino end were used to replace the corresponding
segment in HERG fluorescent constructs having the complementary
fluorophore in the caboxy end. In other cases, BstEII–BamHI fragments
from fluorescent fusion channels containing the fluorophore in the C-
terminal domain were used to replace the corresponding wild type
fragment in constructs carrying the complementary fluorophore in the
N-terminal region.
2.2. Cell culture and transfection
Human embryonic kidney (HEK293) and Chinese hamster ovary
(CHO) cells were grown at 37 °C in a humidified atmosphere of 95% air
and 5% CO2 and plated in 35-mm diameter tissue culture plastic dishes
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containing sterile glass coverslips coated with poly-L-lysine, that
constituted the bottom of a recording chamber for electrophysiological
and FRET measurements. The culture medium consisted of Dulbecco's
modified Eagle's medium nutrient mixture F-12 Ham's (DME/F12 1:1
mixture, Sigma) supplemented with 100 U/ml penicillin, 0.1 mg/ml
streptomycin and 10% fetal bovine serum. Cells trypsinized 24 h prior
to transfection seeded on poly-L-lysine-coated coverslips were
transiently transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) with
2–5 µg of plasmid DNA containing either the individual constructs or
the co-transfected CFP- and V/YFP-labeled constructs in an approxi-
mately 1:3 relationship to maintain a proper molar ratio of expressed
donor and acceptor fluorophores, ensuring that most of the cells
contained at least one acceptor-labeled subunit per donor molecule.
The mixture of DNA and Lipofectamine was incubated in serum-free
medium for 20 min and added to the plates with the cells in serum-
containing medium without antibiotics. Recordings were typically
performed 24–48 h after transfection. Electrophysiological character-
ization of the constructs was systematically performed in transfected
HEK293 cells because they are easier to patch and remain more stable
during recordings. As previously reported [47] additional non-HERG
outward currents are frequently detected in these cells during
depolarizing steps, in which the magnitude and the degree of
inactivation and/or rectification of the elicited currents are highly
variable. However, the contribution of the endogenous currents is
negligible along the tail current time course. Therefore, by limiting the
analysis to the tail currents, only HERG current characteristics would
be analysed. Since analogous current parameters were obtained when
CHO cells were used, data from both cell types were pooled in the
Tables. Due to their higher transfection efficiency providing an easier
co-localization of several cells in the microscopy field, transfected CHO
cells were typically used for FRET measurements.
2.3. Acquisition and analysis of ionic current data
Ionic current recordings in HEK293 and CHO cells were performed at
room temperature in the whole-cell configuration of the patch-clamp
technique. To improve the quality of the seals and the stability of the
recordings, cells were sometimes mildly trypsinized and seeded on poly-
L-lysine-coated coverslips to be used for analysis within 2–6 h. No change
in the qualitative or quantitative characteristics of the cell currents was
introduced by this procedure. Patch pipettes with tip resistances of 3–
5 MΩ were pulled from borosilicate or Kimax disposable micropipettes
(Boralex, Rochester Scientific, NY; Fisherbrand, Fisher Scientific, Pitts-
burg, PA or Kimble glass Inc. Vineland, NJ). The standard extracellular
saline contained (in mM): 137 NaCl, 4 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucose,
and 10 HEPES (pH 7.4 with NaOH). The pipette solution contained (in
mM): 140 KCl, 2 MgCl2, 0.7 CaCl2, 1.1 EGTA, and 10 HEPES (pH 7.4 with
KOH). An EPC-7 patch-clamp amplifier (HEKA Elektronic, Lambrecht,
Germany) was used to record membrane currents. Stimulation and data
acquisition were controlled with the Pulse+ PulseFit software (HEKA
Elektronic) running on Macintosh computers. Ionic currents sampled at
1 kHz were elicited using the voltage protocols indicated in the figures.
Data analysis and exponential fits to ionic currents were performed with
the programs PulseFit and Igor-Pro (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR,
USA). A P/n method was used for leak and capacitive current subtraction.
Kinetic parameters of activation and deactivation were obtained as
previously described [21,38,47]. When tail current analysis was used for
studying activation voltage dependence, tail current magnitudes
normalized to maximum following 1 s depolarizations were fitted with
a Boltzmann function to estimate the half-activation voltage (Vhalf) and
equivalent gating charge (zg):


Itail =Imax ¼ 1= 1 þ exp ðVhalf −V ÞZg F=RT ð1Þ
where V is the test potential and F, R and T are Faraday constant, gas
constant and absolute temperature, respectively. The time course of
1683
activation was monitored using an indirect envelope of tail current
protocol [21,38,47], varying the duration of the depolarization pulse
and following the variation in the magnitude of the tail currents
recorded after going back to a negative voltage. The time necessary to
reach a half-maximal tail current magnitude was used to compare the
speed of activation of the different channels. Deactivation parameters
were obtained from tail currents upon membrane repolarization at
the indicated potentials, following 1 s depolarization pulses to +40 mV
that displaced the channels to open (and inactive) states. The time
constants of deactivation were determined from negative-amplitude
biexponential fits to the decaying phase of the tail currents using a
function of the form:


Y ¼ Af exp −T=τf þ As expð−T=τ s Þ þ C ð2Þ
where τf and τs are the time constants of fast and slow components,
Af and As are the relative amplitudes of these components, and C is a
constant. In this case, the first cursor of the fitting window was
advanced to the end of the initial hook due to the recovery of
inactivation.
2.4. FRET measurements
FRET measurements were performed in CHO cells bathed in
standard extracellular saline following the increase (dequenching) in
donor (CFP) fluorescence signal during incremental photobleaching
of acceptor (V/YFP). Background fluorescence of both fluorophores
was determined from a region of the same field located outside the
cell and the averaged pixel intensity of this area was subtracted from
the mean intensities measured in the regions of interest correspond-
ing to the individual fluorescent cell areas. A Zeiss Axiovert 100
microscope with a 40×/0.75 Plan-NeoFluar objective (Carl Zeiss) was
used. The fluorescence imaging system (Till-Photonics, Gräfelfing,
Germany) consisted of a monochromator Polychrome IV, a dual band
CFP/YFP filter set and a 12-bit CCD camera (IMAGO) combined with
a DUAL-View Micro-Imager (Optical Insights, Santa Fe, USA) for dual
emission image acquisition. Control of monochromator and camera
as well as image recording and processing were performed with
TILLvisION software (Till-Photonics). The standard acceptor bleach
protocol consisted of 30 cycles every 2 s with 50–100 ms of
exposure of donor and acceptor near their excitation maximum (at
440 and 515 nm, respectively) to detect CFP and V/YFP fluorescence
without V/YFP-bleaching, followed by 180–240 additional cycles
separated by periods in which the V/YFP remains permanently
illuminated at 515 nm to photobleach it. Linear regression was used
to obtain the steady-state values of FCFP increase from scatter plots
of CFP fluorescence increase versus FYFP decrease with incremental
bleaching for each cell. Photoconversion of V/YFP into CFP-like
species was negligible under our photobleaching conditions as
evidenced by the total absence of fluorescence in the CFP channel
when cells expressing exclusively V/YFP-labeled proteins were
submitted to the standard acceptor bleaching protocol. Individual
cells showing dim fluorescence leading to very low signal-to-noise
ratios and those in which the fluorescence of V/YFP did not average
at least 13 or 10 fold that of the lower intensity CFP probe,
respectively (see below), were discarded to prevent low acceptor-to-
donor ratio contributing to uncontrolled and reduced FRET signals.
This implies that almost exclusively 2:2 and/or 1:3 CFP:V/YFP-tagged
subunit stoichiometries will contribute to FRET in the HERG tetra-
meric structure. Quantitative FRET levels were expressed as FRET
efficiency (EFRET), defined as the proportion of the excited states of
the donor that become transferred to the acceptor. As previously
pointed out [43,46,48,49] the true or “maximal” FRET efficiency can
be obtained from donor dequenching fluorescence data as the
product of the measured or “apparent” efficiency and αD, the
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fraction of total donor molecules forming donor-acceptor complexes,
according to the expressions:
EFRET ¼ EFRET ðAPPÞ α D ¼ ½1−ðFDA =FD Þα D
in which FDA and FD are the fluorescence intensities of the donor
before and after complete photobleaching of the acceptor, respec-
tively, and αD would correspond to DA/(D + DA) or the fraction of
donor-acceptor complexes (DA) with respect to total donor molecules
[free (D) plus complexed (DA) donors]. In our case, the contribution of
the αD factor was minimized i) systematically converting the
fluorescence intensities into molar ratios by normalizing the intensity
ratios to those of a donor-acceptor tandem imaged at the same
settings, and excluding from the analysis those cells showing a low
acceptor to donor ratio, and ii) by systematic subtraction of signals
coming from donor molecules co-expressed with non-interacting
acceptor pairs. Measuring donor fluorescence changes as a function of
time during the bleaching process and extrapolation of fluorescence
intensity to zero acceptor level [45,50] also eliminated the influence of
incomplete acceptor bleaching [49] in donor fluorescence increases.
To estimate distances from the intrasubunit FRET measurements
the conventional formulas
EFRET ¼ Ro6 =ðRo6 þ d6 Þ ¼ ðRo=dÞ6 =1 þ ðRo=dÞ6
and
d ¼ RoðEFRET1  1Þ1=6
were used in which d corresponds to the interfluorophore distance
and Ro (the Förster distance) is the distance at which the FRET
efficiency (EFRET) is 50%. Ro was taken as 5 nm for the CFP:V/YFP pair
[48,51,52] assuming an orientation factor of 2/3 corresponding to a
random interfluorophore orientation. Unless otherwise indicated the
distance estimates from the FRET efficiencies were interpreted in a
two-dimensional way by assuming that the fluorophores located at
identical positions in different subunits were located in an x–y plane
parallel to the cell membrane due to maintenance of a fourfold
symmetry of the channels around the central pore.
Due to the several geometries adopted by the fluorophores in the
tetrameric channel structures, two general situations were considered
for the EFRET expressions as a function of the donors and acceptors
present in a single oligomeric molecule [53,54]. Thus, for the case of a
donor surrounded by several acceptors at distances d1 to dn, the
averaged EFRET is given by:


EFRET ¼ Ro6 1=d61 þ 1=d62 þ :::: þ 1=d6n =1
 6

þ Ro 1=d61 þ 1=d62 þ N þ 1=d6n
also meaning that for n equivalent acceptors at the same distance, an
operational nRo6 factor can be used. On the other hand, for several
donors surrounding one acceptor, the averaged EFRET is the average of
the transfer efficiency originating from each donor:
EFRET ¼ ½EFRET ðD1 Þ þ EFRET ðD2 Þ þ N þ EFRET ðDn Þ=n
or
EFRET ¼ 1=n½ððRo=d1 Þ6 =1 þ ðRo=d1 Þ6 Þ þ ððRo=d2 Þ6 =1Þ
þ ðRo=d2 Þ6 þ N þ ððRo=dn Þ6 =1 þ ðRo=dn Þ6 Þ
Application of these mathematical expressions to different
donor:acceptor combinations and determination of the correspond-
ing EFRET vs. distance curves are detailed in the figures. Equivalent
expressions and procedures for the estimation of vertical distances
between the square planes delimited by fluorophores located in two
different positions are also shown in the figures. According to the
Pythagorean theorem, the interfluorophore distance for two diag-
onally located labels in the same plane will correspond to 1.4142d in
which d represents the adjacent distance between fluorophores
ð3Þ arranged in a quadratic symmetrical way and 1.4142 stands for the
square root of 2. Equivalent triangulations using the Pythagorean
theorem were performed to calculate interfluorophore distances as a
function of the vertical separation between the planes delimited by
labels introduced in two different positions of the channel sequence.
2.5. Statistics
All data are presented as the mean ± S.E.M. for n number of cells
and the number of transfections indicated by N. Statistical signi-
ficance was tested with the unpaired two-tailed Student's t-test.
Extrapolation of EFRET deviations to distance error values was per-
formed applying the propagation of errors method to the distance
estimations using the aforementioned equations and the experi-
mentally determined EFRET. The uncertainty calculator (http://www.
takesomeshortcuts.com/sigdig/sigdigs.shtml) was used for this
purpose.
3. Results
ð4Þ 3.1. Generation and functional expression of libraries of fluorescent HERG
fusion proteins with cyan and yellow variants of GFP
To obtain a number of constructs carrying fluorescent proteins
ð5Þ
inserted into multiple sites of the HERG channel protein large enough
to support our experimental approach, we used a transposon-based
technique in which the sequence of either the cyan fluorescent
protein (CFP) or the venus variant of the yellow fluorescent protein
(VFP) contained in a modified hyperactive Tn5 transposon were
randomly inserted into the HERG coding sequence by in vitro
transposition reactions ([40,41]; see also Materials and methods for
details). When these transposons were inserted into the HERG coding
sequence in the correct orientation and reading frame they produced
fluorescent channel fusion proteins. Following in vitro transposition
reactions, transformation and selection of successfully transposed
clones, we initially screened 1728 clones (864 CFP and 864 VFP
transposed recombinants) for fluorescence by transient expression in
HEK293 cells. From the 189 constructs that produced fluorescent
fusion proteins, 68 recombinants were discarded due to insertions
out of the HERG sequence or being inversely oriented or out-of-
frame. This yielded 121 correct insertions (7% of the transposed
clones) from which 44 additional recombinants were also discarded
due to duplication of the insertion position. Thus, we finally obtained
ð6Þ two collections of HERG fusion proteins with 37 unique insertions of
CFP and 40 of VFP (Fig. 1A and Table 1). In our system, taking into
account the size of the HERG cDNA target sequence (3500 bp) and the
GW1-CMV plasmid vector carrying it (8650 bp), a random transposi-
tion would be expected to result in an in-frame correctly orientated
insertion into the HERG coding region with a probability of 6.7%. This
percentage value compares favourably with the 7% of correct inser-
ð7Þ
tions obtained. Nevertheless, it is important to note that once the
duplicated insertions are discarded, only 4.4% of the recovered fusion
proteins correspond to unique insertions. This is consistent with the
not entirely random behaviour of the Tn5 transposon, showing a
preference for some particular locations that tends to limit the
ð8Þ number of unique insertions recovered within a given target
sequence [40]. It is important to note also that the transposition
process involves a duplication of the 9 bp flanking the transposon
insertion site. This generates a three amino acid duplication that adds
to the linker flanking the fluorescent protein [40]. Therefore we
identified the insertion site in the HERG coding region by the number
of the amino acid residue preceding the inserted amino acid triplet.
Interestingly, the 77 constructs carrying in-frame CFP or VFP protein
 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699 1685

Fig. 1. Schematic representation of a HERG channel subunit showing the position of fluorophore insertions (A) and differences in cellular localization of HERG and TRH-R fluorescent
fusion proteins in living cells (B). (A) Localization of CFP or V/YFP insertions into the different regions of the HERG subunit. Refer to Table 1 for the exact position in the sequence where
the insertions occurred and the type of fluorophore used for labeling. Different regions/domains in the channel molecule are highlighted and signaled with numbers, corresponding to
the amino terminal EAG/PAS and proximal domains (residues 1–135 and 136–397, respectively), the central channel core (residues 397 to 672) including S1 to S6 transmembrane
helices and the pore region between S5 and S6, and the CNBD (residues 764–836) in the carboxy terminus that extends up to residue 1159 [21,25]. Black circles, functional constructs;
white circles, non functional constructs; gray circles, not tested in the functional screening. The transposon-derived insertions and those introduced in the amino and carboxy ends by
conventional cloning procedures are shown. The five positions subsequently used for FRET measurements are marked with arrows. (B) HEK293 cells were transiently transfected with
expression plasmids encoding HERG channels labeled with YFP in the amino terminus and TRH receptors fused at the carboxy end to GFP. Cells were imaged by standard bright field
(top) and epifluorescence (middle) microscopy. Fluorescence intensity profiles along the depicted white line are shown at the bottom. Calibration bars: 10 µm. A.u.: arbitrary units.

labels at different positions along the HERG coding sequence yielded
in all cases fluorescent fusion proteins indicating that, as previously
reported, GFP variants are able to fold properly and form a
fluorophore after insertion in a variety of protein backgrounds
[40,41]. The distribution of the insertions shown in Table 1 (in which
the eight labeled variants obtained by conventional fluorescent
labeling are also listed), indicates that they are spread over most of
the HERG coding sequence (see also Fig. 1A). Five and seventeen
insertions corresponded to the EAG and the proximal domains,
respectively, with four additional insertions located up to the
beginning of the first transmembrane helix around residue 400
[25]. This means a total of 26 insertions (33.7%) covering the initial
400 residues (34.5%) of the channel protein that correspond to the
amino terminal region. Fourteen constructs (18.1%) had insertions in
1686 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699

Table 1 Table 1 (continued)

Characteristics of the fluorescent HERG fusion proteins Construct # Insertion site Fluorescent Functional HERG domain
(residue #)a protein expressionb
Construct # Insertion site Fluorescent Functional HERG domain
(residue #)a protein expressionb 76 1065 VFP Yes COOH terminal
1 1 (Amino end) CFP Yes EAG 77 1082 VFP Yes COOH terminal
2 1 (Amino end) YFP Yes EAG 78 1102 VFP – COOH terminal
3 43 VFP No EAG 79 1116 VFP – COOH terminal
4 78 CFP No EAG 80 1123 CFP Yes COOH terminal
5 87 VFP No EAG 81 1123 VFP Yes COOH terminal
6 88 VFP No EAG 82 1158 CFP Yes COOH terminal
83 1158 VFP Yes COOH terminal
7 104 VFP No EAG
84 1159 (Carboxy end) CFP Yes COOH terminal
8 144 VFP Yes Proximal
9 158 VFP No Proximal 85 1159 (Carboxy end) YFP Yes COOH terminal
10 162 CFP Yes Proximal Protein constructs obtained by conventional fluorescent labeling are marked in bold.
11 195 CFP Yes Proximal a
Residue immediately before insertion except for the amino end.
12 213 VFP Yes Proximal b
– Not determined
13 219 VFP Yes Proximal
14 226 VFP – Proximal
15 227 CFP No Proximal
16 231 VFP Yes Proximal the transmembranal channel core extending from residues 400 to
17 232 CFP – Proximal 670 (270 residues or 23.3% of the 1159 HERG amino acids). Finally,
18 237 CFP Yes Proximal nine constructs hold insertions in the linker between the S6
19 251 VFP Yes Proximal transmembrane segment and the cyclic-nucleotide binding domain
20 264 VFP Yes Proximal
(CNBD), five insertions were in the CNBD, and the remaining twenty-
21 314 CFP – Proximal
22 329 CFP Yes Proximal three were in the remaining COOH terminus of the HERG sequence.
23 345 CFP Yes Proximal This means that 48% of the insertions are located within the 42.1% of
24 345 VFP Yes Proximal the protein corresponding to the carboxy terminus beyond residue
25 376 VFP – Proximal-S1
670. Notably, almost no insertions were recovered in the segment
26 379 CFP No Proximal-S1
27 379 VFP No Proximal-S1 between the beginning of the S1 helix and the S3–S4 loop. If this
28 390 CFP – Proximal-S1 absence is due to the not totally random behaviour of the Tn5 trans-
29 399 CFP – S1 helix poson or is the result of aberrant proteins that are rapidly removed by
30 408 CFP – S1 helix cell degradation, remains to be established.
31 411 VFP – S1 helix
One of the main goals of this work was to obtain some indications
32 422 CFP – S1 helix
33 515 CFP No S3–S4 loop about the in vivo structural organization of HERG. Although the im-
34 526 CFP – S4 helix pairment of specific protein functions upon the introduction of fluo-
35 535 CFP – S4 helix rescent labels in defined positions could yield information about the
36 556 CFP – S5 helix
relevance of specific domains/structures for normal channel function-
37 580 VFP No S5–Pore loop
38 596 CFP No S5–Pore loop
ality, we sought to select for further work only fluorescent constructs
39 598 VFP No S5–Pore loop able to form functional channels at the plasma membrane. Apart from
40 603 VFP No S5–Pore loop demonstrating the presence of properly assembled HERG channels in
41 626 VFP No Pore the membrane, the detection of characteristic and robust HERG
42 649 CFP – S6 helix
currents excludes the occurrence of major defects in folding, tetra-
43 671 VFP – S6–CNBD linker
44 673 VFP No S6–CNBD linker merization and trafficking, or the presence of gross structural altera-
45 696 VFP No S6–CNBD linker tions as a result of fluorophore insertion. In our case, this became
46 708 CFP No S6–CNBD linker particularly important because, as shown in Fig. 1B and unlike the
47 718 VFP No S6–CNBD linker
distinct fluorescent ring at the cell perimeter exhibited by cells ex-
48 719 CFP – S6–CNBD linker
49 742 CFP – S6–CNBD linker
pressing another typical membrane protein (the thyrotropin-releasing
50 755 CFP – S6–CNBD linker hormone receptor labeled with GFP variants in the carboxy terminal
51 760 CFP – S6–CNBD linker end), only a diffuse fluorescence pattern showing a reticular distribu-
52 766 VFP No CNBD tion throughout the cell sparing the nucleus was systematically
53 772 CFP – CNBD
observed in the fluorescent HERG-labeled expressing cells, regardless
54 776 VFP – CNBD
55 778 CFP – CNBD of the construct used. Such a pattern was obtained both in CHO and
56 828 CFP No CNBD HEK293 cells and did not significantly change up to 72 h after trans-
57 846 CFP – COOH terminal fection. We then tested by patch-clamp the function of 50 different
58 857 VFP No COOH terminal constructs (Table 1), corresponding to 43 internal insertions and also to
59 878 VFP – COOH terminal
60 905 CFP Yes COOH terminal
those channels terminally labeled on the amino and carboxy ends (see
61 905 VFP Yes COOH terminal Methods).
62 911 VFP No COOH terminal The results of the electrophysiological screening summarized in
63 913 VFP – COOH terminal Table 1 indicate that, except for the label introduced at the amino
64 936 VFP Yes COOH terminal
terminal end of the protein, HERG-like currents are not detectable
65 938 CFP – COOH terminal
66 947 VFP – COOH terminal with any of the five fusion constructs carrying the fluorophore in the
67 961 CFP – COOH terminal EAG/PAS domain extending up to residue 135. In contrast, 11 of the 13
68 963 CFP – COOH terminal positions tested corresponding to the proximal domain (located bet-
69 976 VFP – COOH terminal ween residues 136 and 373 of HERG), yielded typical HERG currents
70 988 VFP – COOH terminal
71 993 CFP No COOH terminal
(see also below) when tested electrophysiologically. Remarkably, no
72 1025 CFP – COOH terminal detectable ionic currents were observed upon expression of other
73 1030 CFP Yes COOH terminal constructs with insertions up to residue 905 of the carboxy terminal
74 1040 VFP Yes COOH terminal region. This included the five fusions carrying the fluorophore extra-
75 1062 CFP – COOH terminal
cellularly either at residue 515 corresponding to the S3–S4 loop, or at
 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699 1687

Fig. 2. Functional characteristics of HERG channels labeled with CFP and V/YFP in the amino and carboxy terminal ends and quantification of FRET signals by acceptor photobleaching.
(A) Comparison of WT and fluorescent HERG functional characteristics in transfected HEK293 cells expressing channels with or without the fluorescent protein fused to the amino
(YFP/NH2-HERG) or the carboxy (YFP/COOH-HERG) ends, either before residue 1 or following residue 1159. Representative ionic currents in response to the indicated voltage protocol
are shown on the left. Fractional activation curves obtained by standard tail current analysis in the same cells are shown on the right. I vs. V curves normalized to maximum for
currents at the end of the depolarization step generated from cells expressing WT and YFP/NH2-HERG channels are shown in the inset. (B) Determination of donor fluorescence
recovery during disruption of energy transfer by selective acceptor photobleaching. Transiently transfected CHO cells were imaged for co-expressed HERG amino terminally fused to
CFP and YFP as indicated in Methods. Shown are the relative increases in CFP intensities (in percentages) over initial levels and the remaining fluorescence intensity of YFP. The
symbols represent the calculated mean ± SEM, whereas the thin lines correspond to single cell traces. The acceptor was bleached as indicated by the box. A linear regression analysis of
donor recovery vs. fractional acceptor photobleach is depicted in the inset.

positions 580, 596, 598 and 603, all located in the linker between S5
and the pore loop. On the other hand, a complete lack of functional
expression was also obtained for all tested fusions carrying the labels
in the segment linking the sixth transmembrane helix and the CNBD
or in the CNBD domain itself. However, prominent HERG-type
currents were observed in 10 out of 13 tested positions carrying
insertions in the C-terminal segment that extends from amino acid
905 to the carboxy end corresponding to residue 1159.
3.2. Implementation of a FRET system to detect intersubunit interactions
between functional HERG channels fluorescently labeled in the amino
and carboxy termini
The relative positions of the HERG N- and C-terminal structures and
their relationship to the channel core are unknown. It has been
proposed that interactions between the initial part of the EAG domain
and the S4–S5 linker are involved in slowing HERG closing, and that
1688 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699

this linker could act as a docking site for the N-terminal region to
modulate activation gating [18,22,29,31,35]. According to this idea and
due to the short length of the HERG S4–S5 linker, we reasoned that
(unless the four-fold symmetrical organization is not maintained), the
initial segments of the four amino termini should lie relatively close
and packed below the central transmembrane pore structure. There-
fore, we started generating and characterizing N-terminal fusion cons-
tructs of HERG with CFP and YFP that could help us to implement a
FRET system useful in assessing the predicted proximity of the co-
expressed subunits. Additionally, fluorescent channels labeled at the
C-terminus were also constructed for comparison.
Labeling N- and C-termini with CFP and YFP yielded totally func-
tional fusion channels as demonstrated by the appearance of typical
HERG-like currents in HEK293-(Fig. 2A) and CHO-(not shown)
transfected cells. These currents showed similar activation voltage
dependence and inward rectification properties as those of unlabeled
channels (Fig. 2A and Table 2). However, the N-terminal fluorescent
channels showed faster deactivation kinetics. Thus, the values of deac-
tivation time constants for the major fast deactivation current com-
ponent upon repolarization at −50 and −100 mV were significantly
reduced in the presence of the amino terminal fluorophore, but not in
the constructs carrying the fluorescent protein at the end of the HERG
sequence at positions 1158 or 1159 (Table 2). The behaviour of the N-
terminally labeled channels is equivalent to that obtained after intro-
duction of a short HA epitope at the beginning of the amino terminus
[39] and mimics the accelerations of deactivation caused by impair-
ment of the EAG/PAS domain due to deletion of the initial sixteen
residues [22,35] or the complete domain (Δ2–135 channels, ref. [18]).
Altogether, these results indicate that the labeled subunits reliably
reproduce the normal assembly and function of the unlabeled HERG
channels.
To detect and quantify FRET signals, we measured the increase in
donor (CFP) emission during selective photobleaching of the acceptor
fluorophore (YFP) under static conditions. Thus the recovery of donor
fluorescence emission (a measure of steady-state FRET efficiency) was
monitored and expressed as the percentage of CFP emission during the
acceptor bleach. As shown in Fig. 2B, direct recording of CFP and YFP
fluorescence signals from N-terminally labeled HERG constructs at
successive time points after the onset of YFP photobleaching, reveals
an increased CFP fluorescence emission concomitant with progressive
YFP bleaching, which is direct evidence for FRET. Plotting normalized
CFP fluorescence against that of YFP also indicated that the extent of
CFP recovery linearly correlated with decaying YFP fluorescence (inset
of Fig. 2B). As an indication of FRET efficiency, the extrapolated
intersection of the linear regression line with the y axis at FYFP = 0
yielded an FCFP increase of 15.64 ± 1.34% (n = 15) that corresponds to a
FRET efficiency of 13.53 ± 1.16 (see Methods). These data demonstrate
the existence of a substantial FRET between the N-labeled subunits of
HERG, suggesting a relatively close packing of their amino terminal
structures in the tetramer.
To demonstrate that the recorded FRET signals are due to properly
assembled HERG complexes and not to unordered aggregates formed in
defined cell compartments or to random encounters between diffusing
overexpressed channel subunits, we performed some additional con-
trols. Although the detection of robust HERG currents unequivocally
demonstrates the presence of properly assembled fusion proteins in the
plasma membrane, the diffuse fluorescence pattern consistently
observed in HERG-expressing cells (see above), made it necessary to
ensure that the detected FRET signals were not mainly due to miss-
assembled channels retained in intracellular structures. As shown in Fig.
3A for an illustrative construct, the averaged FRET efficiency was
indistinguishable when the determination was performed using the
total cell area, the central part of the cells, or only the region corres-
ponding to the outer border, mostly representing the plasma membrane.
Statistically equivalent FRET values were observed when data derived
from whole cell images were compared with those of the same
construct, using the fluorescence signals detected at the tip of patch
pipettes carrying membrane patches excised from the fluorescent
HERG-expressing cells (Fig. 3B).
As a further demonstration of FRET coming from specifically
assembled protein complexes, we always verified that the FRET effi-
ciency did not significantly vary with different CFP or YFP fluorescence
intensities, and that it was independent of the channel density and/or
the expression levels over a wide range (Fig. 3C). Only experiments and
channel constructs showing a similar absence of correlation between
measured EFRET and fluorochrome expression levels were subsequently
considered for analysis. Finally, as shown in Fig. 3D, the FRET efficiency
became much lower than that obtained with N-terminally labeled
pairs after using two presumably non-interacting proteins, namely
HERG channels and the rat vanilloid receptor VR1, both labeled in the
amino terminus [3.78 ± 0.45 (n = 76) vs. 13.53 ± 1.16 (n = 15); P b 0.0001],
or the TRH receptor and HERG also labeled at the amino end (not
shown). This indicates that FRET is only observed between labeled
subunits assembled in one channel but not between merely co-loca-
lized subunits. It also defines a lower limit of EFRET below 4 as an
indication of FRET not coming from specific homotetrameric assembly
of HERG channel subunits.
Next, we assessed FRET efficiency upon the expression of C-
terminally labeled HERG constructs either alone or in combination
with N-terminal fusion constructs. Currents analogous to those
mediated by native HERG channels were obtained in cells expressing
fluorescent channels labeled at the C-terminus either at position 1159

Table 2
Electrophysiological characteristics of the fluorescent HERG fusion proteins

Label position and/or transfection V0.5 (mV) ZG Activation t0.5 (ms) Deactivation τ (MS) n

(0 mV) (+20 mV) (− 50 mV) (−100 mV)

Fast Slow Fast

Wild-type − 2.2 ± 2.8 2.2 ± 2.8 465 ± 56 152 ± 6 176 ± 23 1190 ± 51 63 ± 10 3–12
1 −7.8 ± 1.4 2.3 ± 0.2 305 ± 31 – 63 ± 5a 386 ± 20a 18 ± 2a 3–11
345 −16.6 ± 1.9a 2.5 ± 0.2 226 ± 25a – 120 ± 10 856 ± 106a 30 ± 10 4
905 −20.9 ± 4.5a 2.2 ± 0.1 218 ± 35a – 136 ± 7 1195 ± 131 40 ± 22 3
1123 − 4.0 ± 3.9 2.3 ± 0.3 271 ± 19a – 150 ± 27 873 ± 30 42 ± 2 5
1158 − 9.0 ± 1.3 1.9 ± 0.2 230 ± 25a – 181 ± 16 901 ± 25 46 ± 12 4
1159 4.0 ± 4.0 1.9 ± 0.3 – – 98 ± 4 654 ± 7 – 4
Double 1 + 345 − 6.8 ± 4.2 3.0 ± 0.5 298 ± 89 142 ± 26 42 ± 3a 202 ± 14a 14 ± 1a 4
Double 1 + 905 − 3.7 ± 5.9 2.9 ± 0.2 154 ± 31a – 59 ± 3a 411 ± 85a – 3
Double 1 + 1158 0.3 ± 3.9 2.3 ± 1.5 279 ± 48 145 ± 26 57 ± 6a 318 ± 82a 21 ± 4a 4–9
Double 345 + 905 −13.5 ± 5 3.4 ± 0.3 270 ± 110 101 ± 17 152 ± 10 811 ± 82a 39 ± 2a 4
Double 345 + 1158 − 6.7 ± 2.7 2.5 ± 0.1 331 ± 37 – 132 ± 7 705 ± 17a – 4
Co-transfected 1 and 1158 −15.5 ± 2.0a,b 2.9 ± 0.4 125 ± 18a,b 82 ± 15a 85 ± 8a,b 596 ± 64a,b 29 ± 3a,b 4–6
a
Pb 0 .05 versus Wild-type.
b
P b 0.05 versus 1- and 1158-labeled channels.
 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699 1689

Fig. 3. Verification of FRET signals specificity between assembled tetramer subunits of amino terminus-labeled HERG channels. (A) Comparison of whole-cell (top a) FRET levels and
those determined separately either in a defined region over the plasma membrane (bottom a) or in the rest of the cell body. Calibration bar: 10 µm. The fluorometric determinations
were performed on regions of interest as indicated in a, defined over the whole-cell area of the transfected CHO cells (b,c left), the outer border mostly representing the plasma
membrane (b,c middle) or only the cell center excluding the outer border (b,c right) of the same cells. The donor fluorescence recovery during selective photobleaching of the
acceptor was determined as described in Fig. 2B. Quantitative EFRET levels obtained as indicated in Methods for the indicated areas are compared in panel c. (B) Comparison of FRET
levels in the whole-cell and in membrane patches excised from cells expressing the same HERG protein construct. a, microphotographs of the imaged cells and excised membrane
patches under epifluorescence (left) or bright-field (right) illumination. Calibration bar: 10 µm. The white circle indicates the area from which fluorescence recordings were obtained
upon patch excision. b, time-course of donor and acceptor fluorescence variation in excised patches submitted to acceptor photobleaching. Averaged EFRET levels from four
independent measurements are indicated. c, comparison of EFRET in excised patches and whole-cell recordings from cells expressing the same fusion construct. (C) Independence of
EFRET on fluorescent protein expression levels. Single cell data plotted against the expression level of YFP-HERG are shown. The results of a linear regression to the data are overlaid.
(D) Comparison of FRET levels between the N-terminally-labeled CFP-HERG/YFP-HERG pair and YFP-HERG co-expressed with VR1 labeled with CFP in the amino terminus. Linear
regression analysis of donor recovery vs. fractional acceptor photobleach for the CFP-HERG/YFP-HERG and CFP-VR1/YFP-HERG pairs is shown in the central panel. The donor
fluorescence recovery during selective photobleaching of the acceptor for the pair CFP-VR1/YFP-HERG is shown in the inset. n.s.: not significant vs. whole-cell.

(see above) or after residues 1123 or 1158 (not shown). However, only a
basal FRET signal was observed following co-expression of N-terminally
CFP-labeled channels with those carrying V/YFP fluorophores at
positions 1158 or 1159 (EFRET 3.07 ± 0.68, n = 16 and 3.06 ± 0.5, n = 19;
Fig. 4). These data further support the specificity of the FRET detected
between the amino terminals. Interestingly, FRET signals significantly
elevated above the control HERG/VR1 pair were obtained when C-
terminally V/YFP-labeled HERG (with the fluorophore at residues 1158
or 1159) were co-expressed with subunits labeled with CFP in the same
positions [EFRET 7.52± 1.48 (n = 6) and 9.37 ± 0.48 (n = 31), respectively;
Fig. 4]. Similar FRET efficiencies were measured in cells co-expressing
fluorescent channels with CFP and VFP both at positions 1123 (9.9 ± 0.47,
n = 21) and when channel subunits labeled at residue 1123 were co-
expressed with those labeled at residue 1158 (8.32 ± 0.82, n = 7). These
results and the functional integrity of the fluorescent constructs suggest
that failure to detect significant FRET signals between channel subunits
1690 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699

Fig. 4. FRET efficiencies between HERG subunits labeled in the amino and carboxy termini. Different combinations of HERG channels labeled with CFP or Y/VFP at residues indicated
on the abscissa were co-expressed in CHO cells and FRET efficiencies were quantified as described in Methods. Each bar represents the mean ± SEM of 2–5 co-transfection experiments
for the indicated number of cells. FRET levels following co-expression of the putatively non-interacting VR1 and HERG proteins are shown for comparison. Combinations showing a
significantly increased (P b 0.05) FRET signal as compared with the VR1/HERG pair are marked with an asterisk. N.s.: not significant vs. VR1/HERG. A schematic representation of a
HERG channel subunit topology showing the position of the fluorescent labels (black circles) is shown in the inset. Transmembrane helices S1–S6, the position of the pore region
between S5 and S6 and the situation of the EAG and CNBD domains in the amino- and carboxy-terminals, respectively, are highlighted. No significant differences are present between
the EFRET values of 1158/1158, 1159/1159, 1123/1123 and 1123/1158 pairs.

labeled at residues 1 and 1158 or 1159 is not due to the inability of C-
terminally labeled subunits to assemble properly as a result of
disruption of a putative tetramerization domain located in the carboxy
terminus. It can be argued that even though C-terminally labeled
homotetrameric channels are readily assembled, the low FRET levels
observed in cells co-expressing N- and C-terminally labeled subunits
are due to lack of heterotetrameric assemblies. Two lines of evidence
indicate that heteromers are indeed formed in these cells. First, robust
HERG-like currents with electrophysiological characteristics unlike
those observed in cells expressing channels only labeled in the amino or
the carboxy termini are observed in the co-transfected cells. As shown
in Table 2, the activation voltage dependence and kinetics of these
currents do not correspond to those expected from a simple mixture of
amino- and carboxy-labeled channels, strongly arguing in favor of the
presence of additional subunit combinations. Second, properly
assembled functional channels are obtained with double-labeled
constructs carrying fluorophores attached to both the amino and the
carboxy termini, demonstrating that up to eight fluorescent proteins
can be introduced in these positions without impairing channel
function (see below). Interestingly, the lower EFRET values in cells
expressing carboxy-labeled constructs as compared to those obtained
upon expression of subunits labeled in the amino terminus, also
indicate that although the C-terminal labels of the channel subunits are
separated by a distance yielding a detectable FRET signal, such a
distance is likely higher than that between the amino termini labels.
Moreover, the detection of similar FRET values with the 1123/1123,
1158/1158, 1159/1159 and 1123/1158 pairs suggests that the smaller
FRET signals between C-terminally labeled subunits are not only due to
variations in the relative orientation of the fluorophores, but they
reflect increased distances between the carboxy termini of the subunits
in the channel tetramer as compared with those separating the amino
terminal ends.
3.3. Estimations of intramolecular distances between fluorophores
introduced in the amino and carboxy ends
In a tetrameric structure, both adjacent and diagonal distances
between the fluorophores will contribute to the distance estimated
from FRET measurements. As indicated in the Methods section, almost
exclusively 2:2 and/or 1:3 CFP:YFP-labeled subunit stoichiometries are
expected to produce FRET under our experimental conditions. As
schematically illustrated in Fig. 5A, in a 2:2 stoichiometry two
equivalent arrangements of donor and acceptor labels are produced
in which a given donor is surrounded by an adjacent- and a diagonally-
located (2:2a combination) or two adjacent (2:2b) acceptors. In a 1:3
stoichiometry the energy transfer of the donor will be directed towards
two adjacent and a diagonal acceptor. Assuming a Ro value of about
5 nm see (Methods) and since the same residues in the different
subunits of the tetramer must be located in an x–y plane parallel to the
cell membrane maintaining a symmetrical structure with respect to
the central axis of the channel, the calculation of FRET efficiencies as a
function of the interfluorophore distances for adjacent CFP/YFP pairs
arranged in a 2:2 or 1:3 tetrameric structure yields the curves shown in
Fig. 5B. Considering our FRET measurements once the non-specific
FRET (3.78 of the HERG/VR1 pair) is subtracted and using the 2:2
arrangement as a standard, the specific EFRET value obtained with the
co-expressed CFP/YFP amino terminal constructs (9.75 ± 1.61) would
mean a separation of 7.76 ± 0.24 nm between the labels in adjacent
subunits (with a ≈11 nm diagonal separation), when the fluorophores
are located in the amino termini of the four HERG channel subunits
 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699 1691

Fig. 5. Determination of intramolecular distances between labels introduced in identical positions of the four subunits assembled in a HERG channel tetramer. (A) Diagrammatic
representations of possible energy transfer pathways for labeled subunit tetramers in a fourfold symmetrical arrangement and 2:2 or 1:3 stoichiometry. Mathematical expressions for
EFRET calculation as a function of the distance “d” between adjacent fluorophores for a single pair (1:1) and 2:2 or 1:3 stoichiometries are shown. The product of d times square root of
2 (1.4142d) corresponds to the diagonal distance according to the Pythagoream theorem. Donor and acceptor fluorophores are represented by solid and open circles, respectively. (B)
Dependence of EFRET on adjacent distance between fluorophores in individual tetramer subunits. Calibration curves were obtained using the expressions indicated in A and
correspond to a 1:1 single pair (dashed line), 2:2a and 2:2b combinations (lower and upper dotted lines, respectively), the averaged EFRET in the 2:2 stoichiometry (lower solid line)
and the EFRET in the 1:3 arrangement (upper solid line). Extrapolated distance values for EFRET obtained with HERG channels labeled in the amino terminal end or following residues
345, 905 or 1159, are signalled with arrows. Net or specific EFRET values after subtraction of unspecific FRET obtained with the VR1/HERG pair were used. For more explanations see
text. (C) Schematic representations of interfluorophore distances corresponding to specific EFRET values obtained from expressed HERG channels labeled with the fluorophores as
indicated.

(Fig. 5C). Performance of an equivalent analysis using the FRET value
for C-terminal labeled channel subunits (specific EFRET 5.59 ± 0.93)
suggests that the carboxy terminal labels would be placed at a distance
of 8.58 ± 0.26 nm between adjacent subunits (corresponding to ≈12 nm
of diagonal separation).
The localization of the four amino and carboxy end labels in two
square planes of ≈7.8 and ≈8.6 nm lateral sizes and the absence of
specific FRET between pairs of constructs labeled in the amino and the
carboxy termini, excludes the possibility that the N-termini are copla-
nar with the carboxy ends. This lack of FRET signals could be consi-
dered as an indication that a considerable distance exists between the
planes limited by the amino- and the carboxy-located fluorophores.
However, since in this case the donor and acceptor labels are in
different subunits and they can be located at different distances from
the membrane (z), the number of possible pathways for energy
transference is increased due to positioning of the labels in two planes
for which torsion angles are unknown. Due to the high sensitivity of
FRET to distance, it could be possible that even though a relatively short
vertical distance between both planes could exist, only a negligible
EFRET is observed due to the diagonal separation between fluorophores
in different subunits. To solve this uncertainty, we generated a double-
labeled HERG construct carrying the donor and acceptor fluorophores
in the amino and carboxy ends of the same subunit. Since this construct
has an inherent 1:1 CFP:YFP stoichiometry, it was also used to calibrate
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Fig. 6. Functional expression and determination of FRET level of the construct double-
labeled in the amino and carboxy terminal ends. (A) Functional expression of double-
labeled HERG channel subunits. A schematic representation of the construct indicating
the location of the yellow and cyan labels in residues 1 and 1158 is shown in the inset.
Representative ionic currents from transiently transfected CHO cells in response to the
indicated voltage protocol are shown. Averaged fractional activation curves normalized
to maximum for currents at the end of the depolarization step (open circles) or obtained
by standard tail current analysis (closed circles) in the same cells are shown at the
bottom. (B) Determination of donor fluorescence recovery during photobleaching of the
acceptor. Relative increases in CFP fluorescence over initial levels and the remaining
fluorescence intensity of YFP were obtained from transiently transfected CHO cells as
detailed in the legend of Fig. 2. The symbols represent the calculated mean ± SEM,
whereas the thin lines correspond to single cell traces. The averaged value of EFRET is
indicated on the graph.
the difference in fluorescence intensity of CFP versus YFP in our optical
system, by measuring the FYFP/FCFP ratio of the transfected cells. Thus,
we verified that the YFP fluorescence appeared 10.1 ± 0.6 fold brighter
than that of CFP (n = 32). Unexpectedly, robust HERG-type currents
were systematically observed in patch-clamped cells transfected with
the CFP/YFP double-labeled channel. These currents showed the
typical rectification properties of HERG at positive voltages and a
voltage dependence slightly shifted to more depolarized values (Fig. 6A
and Table 2). As expected from the presence of an EAG/PAS function
blocker particle in the amino terminus (see above), they also exhibited
a faster deactivation time course than the unlabeled channels. This
demonstrates that the tetrameric channel with eight fluorescent
proteins attached at the ends of the subunits is still able to correctly
assemble in the membrane and recapitulate the function of conven-
tional HERG channels.
Performance of FRET measurements with the double-labeled
channels yielded a significant amount of FRET (EFRET 11.64 ± 0.62,
n = 23; Fig. 6B] between the amino and carboxy terminal labels. To
interpret these data in terms of intramolecular distances, we consi-
dered the two extreme situations in which the square planes delimited
by the amino and carboxy terminal labels are arranged with no angular
torsion or with a maximal 45° rotation between them (Supplemental
Fig. 1A). Subsequently, calibration curves for FRET efficiencies as a
function of the vertical distance between both planes were generated,
considering all possible triangulations between points at the vertices
of the squares (Supplemental Fig. 1B). Extrapolation of the net EFRET
(7.86 ± 1.07) obtained with the double-labeled construct to these cali-
bration curves, yielded a vertical distance between the planes deli-
mited by the amino and carboxy terminal labels ranging from 7.30 to
7.79 nm.
Knowing the vertical separation between the amino and carboxy
end labels, we turned back to our FRET data with co-expressed CFP and
YFP individual constructs, and considered all possible combinations for
arranging them in the 2:2 or 1:3 stoichiometries expected to produce
FRET under our experimental conditions and under the two extreme
situations: no angular torsion or maximal 45° rotation between planes
(Supplemental Fig. 2). Next, calibration curves corresponding to these
arrangements were generated relating FRET efficiencies and vertical
distance between planes. As shown in Supplemental Fig. 3, calculations
of expected FRET efficiencies as a function of vertical distances fol-
lowing all possible triangulations indicated that, for a vertical sepa-
ration between planes of 7.30 to 7.79 nm, the only arrangement for
which no significant FRET is expected (as observed after co-expression
of amino terminus CFP-labeled subunits with V/YFP-labeled channels
at positions 1158 or 1159; see above), corresponds to a combination
with the unlabeled carboxy terminus of a given subunit directly below
the labeled amino of the same subunit and with no remarkable angular
torsion between planes.
3.4. FRET measurements and estimations of intramolecular distances
with HERG channels labeled at residues 345 and 905
Whereas FRET can give a measure of the proximity of fluorescent
molecules, FRET efficiencies can be affected by other variables leading
to misinterpretation of the data in terms of intramolecular distances
(see below). To avoid this possibility, we tried to obtain further con-
viction from the availability of multiple labeled constructs, performing
additional triangulations with new reference points that could help us
to validate our distance estimations. Our initial goal of using cons-
tructs with fluorophores located close to the transmembrane helices
to gain some insight on the position of the amino and the carboxy
termini with respect to the central channel core, were hampered by
the fact that none of the fusion proteins tested with insertions
between residues 345 and 905 yielded functional HERG channels
(Table 1). Thus, we chose to use channels labeled at these two posi-
tions for further work. To perform an analysis similar to that described
for the amino and carboxy ends, we generated two additional
constructs in which the CFP and VFP labels introduced by transposi-
tion after residues 345 and 905 were changed to VFP and CFP, respec-
tively see (Methods). Four double-labeled proteins carrying donor and
acceptor fluorophores in the same subunit were also constructed with
CFP and VFP at residues 1 and 345, 345 and 1158, 1 and 905, or at
residues 905 and 1158. In this case, an FVFP/FCFP ratio of 13.1 ± 0.7
(n = 78) was observed in cells expressing these double-labeled cons-
tructs, indicating a thirteen-fold increased brightness of VFP versus
CFP for a 1:1 molar ratio in our optical set-up.
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Fig. 7. Functional expression and FRET measurements with HERG channels labeled at residue 345 and in different combinations. (A) Representative ionic currents from transiently
transfected cells expressing HERG channels labeled with GFP variants at residues 379, 345 or either both 1 and 345 (Double 1/345) or 345 and 1158 (Double 345/1158). 1 s
depolarization pulses up to + 60 mV in 20 mV increments from a holding voltage of −80 mV were delivered to the cells, followed by a 2 s repolarization period at −50 mV. Note the
complete absence of HERG-like currents using the 379-labeled construct and the expanded time scale and the fast deactivating tail currents for the double 1/345 construct. (B)
Determination of donor fluorescence recovery during acceptor photobleaching in cells either co-expressing HERG channels carrying CFP and VFP at residues 345/345, 1/345 and
345/1159, or transfected with double-labeled subunits with donor and acceptor fluorophores at residues 1 and 345 or 345 and 1158. Relative increases in CFP fluorescence over
initial levels and the remaining fluorescence intensity of YFP were obtained from transiently transfected CHO cells as detailed in the legend of Fig. 2. The symbols represent the
calculated mean ± SEM, whereas the thin lines correspond to single cell traces. (C) Comparison of EFRET for channels labeled as indicated in panel B. FRET levels from the HERG/VR1
pair and from co-expressed channels labeled with CFP and YFP in the amino end are also shown for comparison. Bars represent the mean ± SEM of 2–5 transfections for the indicated
number of cells. Data corresponding to co-transfections with 4 µg DNA of the double-labeled constructs plus 4 µg of the plasmid containing wild-type HERG are also shown.

Patch-clamp analysis of all these constructs indicated that they are
able to form functional channels in the plasma membrane, as de-
monstrated by the presence of HERG-like currents in transfected
HEK293 and/or CHO cells (Figs. 7A and 8A). Interestingly, whereas slow
deactivating currents with similar kinetics as those of unlabeled HERG
were observed in cells expressing 345, 905 and double-labeled 345/
1158 constructs, very fast decaying tail currents at −50 mV were
observed in cells transfected with double-labeled 1/345 and 1/905
channels (see also Table 2). Again, this indicates that whereas blockade
of EAG/PAS domain functionality by introducing the protein fluoro-
phore in the amino terminus does not impair the ability of the fusion
proteins to assemble, tetramerize and be functionally expressed in the
plasma membrane, it effectively constrains the ability of this domain to
slow down HERG channel closing.
The results of FRET measurements using channel subunits labeled at
position 345 combined with those labeled in the amino and carboxy
termini in several combinations are summarized in Fig. 7B,C. It can be
observed that a substantial amount of specific FRET is exhibited by cells
co-expressing HERG subunits labeled with CFP and VFP both at positions
345 (12.85 ± 0.55, n = 11) or 1 and 345 (18.48± 0.87, n = 15) and also in
cells expressing the double labeled 1/345 construct (10.55 ± 0.66, n = 29).
However, only a basal FRET efficiency is obtained in cells carrying
double-labeled 345/1158 channels (4.36± 0.35, n = 34: not significant
versus HERG/VR1 expressing cells). A small but significant EFRET was
1694 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699

Fig. 8. Functional expression and FRET measurements with HERG channels labeled at residue 905 and in different combinations. (A) Representative ionic currents from cells co-
expressing HERG channels labeled with CFP and VFP at residue 905 (top) or transfected with double labeled subunits carrying fluorophores both at residues 1 and 905 (Double 1/905)
or 345 and 905 (Double 345/905). 1 s depolarization pulses up to +60 mV in 20 mV increments from a holding voltage of −80 mV were delivered to the cells, followed by a 2 s
repolarization period at −50 mV. Note the expanded time scale and the fast deactivating tail currents obtained with the double labeled 1/905 construct. (B) Determination of donor
fluorescence recovery during acceptor photobleaching in cells either co-expressing HERG channels carrying CFP and VFP at residues 905/905, 1/905, 905/1158 and 345/905, or in cells
transfected with subunits double-labeled at residues 1 and 905 or 345 and 905. Relative increases in CFP fluorescence over initial levels and the remaining fluorescence intensity of
YFP were obtained from transiently transfected CHO cells as detailed in the legend of Fig. 2. The symbols represent the calculated mean ± SEM, whereas the thin lines correspond to
single cell traces. (C) Comparison of EFRET for channels labeled as indicated in panel B. Bars represent the mean ± SEM of 2–5 transfections for the indicated number of cells. FRET levels
from the non-interacting HERG/VR1 pair and from co-expressed channels labeled with CFP and YFP in the amino end are also shown for comparison. Data corresponding to co-
transfections with 4 µg DNA of the double labeled constructs plus 4 µg of the plasmid containing wild-type HERG are also shown.

present in cells co-transfected with constructs labeled at residues 345
and 1159 (6.14 ± 0.38, n = 20; P b 0.05 vs. HERG/VR1).
It is important to note that EFRET remained almost the same when
4 µg of plasmid DNA coding for unlabeled HERG plus 4 µg of DNA
containing the double-labeled 1/345 construct was used for transfec-
tion (Fig. 7C). These total amounts and proportions of plasmid DNA
were chosen to maintain as much as possible the viability of the
transfected cells and also enough of a fluorescence level of the double-
labeled protein to perform the FRET measurements. Similar results
were obtained when unlabeled wild-type HERG was co-expressed
with double-labeled constructs 345/1158, 1/905 and 345/905 (Figs. 7C
and 8C) or 1/1158 (EFRET 8.6 ± 0.42, n = 20). In all cases, only moderate
reductions in EFRET ranging from 7% with the double 1/345 to 27% with
the double 345/1158 constructs were observed. As expected, the
relatively small effect caused by introduction of an excess of unlabeled
HERG is not due to reduced expression of this protein, as shown by the
appearance of slowly deactivating HERG currents in cells co-expres-
sing the fast deactivating 1/1158, 1/345 or 1/905 double-labeled
channels and wild-type HERG (not shown). These results add further
support to the interpretation that the FRET signals are mainly due to
 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699
specific assembled proteins and not to random collisions of over-
expressed molecules. It should also be noted that depending on the
stoichiometry and torsion of the channel oligomers, some EFRET
reductions are possible even with specifically assembled tetramers in
which unlabeled subunits are combined with double-labeled ones.
Thus, as illustrated by the possible transference pathways shown in
Supplemental Fig. 1A, lower efficiencies will be obtained if only a single
donor and acceptor pair carried by a given subunit is included in the
tetrameric channel schemes, eliminating the additional energy
transferences to unlabeled adjacent partners. It might also be possible
that some subtle modification of the relative orientation of both
fluorophores takes place in the otherwise specifically assembled
molecules, when part of the eight fluorophore tetramers produced by
expressing the double labeled constructs alone are changed to lower
order fluorescent oligomers by introduction of non-fluorescent
subunits, leading to some variation in the observed FRET levels.
Equivalent data to those corresponding to 345-labeled channels,
but obtained with different combinations of channel subunits labeled
at residue 905 and other positions, are shown in Fig. 8B,C. In these
cases, cells co-expressing donor- and acceptor-labeled subunits at
position 905 yielded an EFRET value of 11.9 ± 0.85 (n = 31). The FRET
efficiency was even higher upon expression of the double-labeled
constructs 1/905 (17.5 ± 0.8, n = 18) and 345/905 (15.03 ± 1.1, n = 16). On
the other hand, a considerably smaller EFRET was recorded in cells co-
expressing HERG subunits labeled with CFP and VFP at positions 1 and
905 (7.0 ± 0.75, n = 9) or at positions 905 and 1158 (6.51 ± 0.33, n = 30).
Finally, a FRET efficiency of 9.23 ± 0.57 (n = 22) was obtained upon co-
expression of 345- and 905-labeled HERG channel subunits.
Interpretation of these FRET efficiencies as previously detailed for
the case of the amino and carboxy end pairs indicates that, for the
9.07 ± 1.0 net EFRET obtained after co-expressing CFP and VFP pairs
labeled at residue 345, the square x–y plane corresponding to the
labels at position 345 of the tetrameric structure would have a side
size of 7.87 ± 0.16 nm (Fig. 5B,C). According to this value and given
the ≈8.6 nm lateral size of the plane delimited by the carboxy end
labels, the negligible specific FRET obtained with the double labelled
345/1158 channel means that the vertical separation between the
345 and the 1158 label planes is at least 9–10 nm regardless of the
angular torsion established between them (see Supplementary Fig. 1
for a detailed description of the procedures analogously used to find
the corresponding vertical distance with 1/1158 double labeled
channels). Since these data indicate a slightly longer vertical distance
separating the 345 and COOH label planes than the NH2 and COOH,
the 345-located fluorophores are slightly above those introduced at
the amino termini. Application of an equivalent analysis to the
double-labeled 1/345 data predicts a vertical separation of between
7.7 (with 45° torsion) and 8.1 nm (without torsion) for the planes
corresponding to the 1 and 345 labels (but see below).
Knowing the lateral size of the NH2, COOH and 345 planes and
the vertical separation between them, it should be possible to use
the data obtained by co-expressing pairs of subunits labeled at those
positions to further define their relative arrangement and, more
importantly, to validate the previously calculated distances. The
results of this analysis are presented in Supplemental Fig. 4A,B. It can
be observed that for a vertical distance of 9–10 nm separating the
345 and 1159 fluorophore planes, a FRET efficiency of around 2
would be expected, providing that a sizeable torsion is present (see
Supplemental Fig. 4B). This nicely fits with the 2.36 ± 0.83 value of
net EFRET exhibited by cells co-expressing 345- and 1159-labeled
subunits (Fig. 7C), but not with the total absence of FRET expected
for channels in which the vertices of the 345 and 1159 label planes
are perpendicular without any angular torsion.
Interestingly, since the planes delimited by the amino and carboxy
end-located labels do not show any sizeable torsion between them (see
above), an angular rotation similar to that encountered between the
labels in the 345 and 1159 positions should also exist between the 1-
1695
and 345-located labels. This is confirmed by the FRET level obtained
with the 1 and 345 pair co-expressing cells. The 14.7 ± 1.32 specific
EFRET obtained in this case (Fig. 7C), the highest value of all the tested
combinations, is not consistent with the EFRET value below 10 expected
for any vertical distance separating the 1 and 345 label planes if no
angular torsion exists between them. Note also that if this torsion does
not occur, such distances would never be lower than 4–5 nm due to the
dimensions of the GFP-based fluorophores. Therefore, only an effective
range of FRET efficiencies of around 2 or less can be expected under
these circumstances. Finally, even though the high EFRET observed with
the 1/345 pair seems to lie above that expected for the 7.7–8.1 nm
vertical separation predicted by the double-labeled 1/345 data (see
above), it is likely that this distance became increased in the double-
labeled construct (but not so much in the co-transfected pair) by some
steric collision between labels. It is also possible that in this case the
physical proximity of both labels could force a more unfavorable
orientation of both fluorophores, someway contributing to reduce the
observed FRET level.
The performance of an analogous analysis using the results obtain-
ed with different combinations of 905-labeled channels indicates that
the 8.12 ± 1.3 net EFRET of cells co-expressing subunits labeled at residue
905 means an 8.12 ± 0.24 nm side size for the quadratic plane corres-
ponding to the labels at this position (Fig. 5B,C). The 13.72 ± 1.25 net
EFRET obtained with the double-labeled 1/905 construct (Fig. 8B,C)
predicts a vertical separation of 6.33 to 6.96 nm between the amino
and 905 fluorophore planes, both for arrangements with no angular
torsion or maximal 45° rotation, respectively. According to these
distances, a FRET efficiency of between 5 and 19 would be expected for
co-expressed 1- and 905-labeled channels if torsion is present, but
only of around 3 with no angular torsion (Supplemental Fig. 4C).
Therefore, the 3.32 ± 1.2 net EFRET obtained under these circumstances
(Fig. 8C) suggests that no angular torsion exists between the planes
defined by the amino terminus- and 905-located labels. This is further
supported by the data from cells co-expressing 905- and 1158-labeled
subunits. In this case, the 2.73 ± 0.78 net EFRET (Fig. 8B,C) would also be
consistent with the EFRET value below 5 expected for an almost vertical
positioning of the 905 and 1158 labels, but very different from the EFRET
above 10 predicted with torsion between them (Supplemental Fig. 4E).
Finally, a rotated 345 plane with respect to non-torsioned NH2, 905 and
COOH planes, predicts a 4–7 EFRET level after co-expression of 345- and
905-labeled subunits. This is indeed coherent with the 5.45 ± 1.02 net
EFRET measured in these cells (Fig. 8B,C), a FRET level that would not be
obtained if fluorophores at the 345 and 905 positions were vertical to
each other, since in this situation almost no FRET would be expected
(Supplemental Fig. 4D).
4. Discussion
Here, we have generated a library of fluorescent HERG channel
constructs carrying CFP and V/YFP in multiple positions of the HERG
coding sequence, to study by FRET the relative arrangement of
different regions in the protein. The labeled channels were functionally
expressed in HEK293 and CHO cells. Remarkably, despite the insertion
of a large fluorescent domain in the channel protein, many HERG fusion
proteins are still fully functional. Essentially, we found that fusion of
the fluorescent proteins to the cytoplasmic regions corresponding to
the proximal domain in the amino terminus or the final segment of the
carboxy terminus do not compromise channel function. However,
apart from the construct carrying the label at the first amino acid of the
protein, no functional channels were detected upon insertion of the
reporter fluorophores in the initial portion of the amino terminus
corresponding to the EAG/PAS domain, in the central channel core, or
in the segment after the sixth transmembrane helix including the
linker between S6 and the CNBD and the CNBD itself.
The localization of the permissive insertions only in specific areas
of the sequence may provide some insights about the structural
1696 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699

arrangement and/or the functional implications of these regions in
the context of the whole channel. Thus, it is likely that more
deleterious effects are expected by insertion of the labels in an
internally located domain when compared to insertions in a surface
aqueous-exposed region. The lack of functionality of the C-linker- and
CNBD-labeled constructs would be coherent with the localization of
this region as a compact tetrameric structure in a central position
immediately below the cytoplasmic pore opening as previously
proposed for HCN and TRP channels [8,10]. Indeed, the participation
of this region in the tetrameric assembly of HERG has been also
proposed [11]. Similarly, a compact EAG/PAS domain would also be
compatible with its ability to form tetramers in vitro in the absence of
the rest of the protein, and to inhibit the functional expression of wild-
type HERG [16]. However, this protein segment only forms monomers
in crystal structures [18] and channels carrying N-terminal truncations
that delete the EAG/PAS domain can form functional channels in the
plasma membrane [18–22], even though reduced current densities are
systematically obtained upon expression of constructs lacking either
the EAG/PAS domain or most of the amino terminus (e.g., Δ2–135 of Δ
2–370 deletions; C. Alonso-Ron et al. unpublished). Interestingly,
relatively long distances (corresponding to around 8–9 and 11–12 nm
for adjacent and diagonal separations) between labels at equivalent
positions of the four subunits, are suggested from our FRET-derived
measurements using fully functional HERG channels. This suggests
that in our case the fluorescent labels may be mainly localized in
peripheral positions, including those introduced in the amino end.
We propose therefore that the C-linker/CNBD region hangs cen-
trally below the transmembrane core, in a similar fashion to that
described for the same tetrameric region of HCN2 [10]. Unlike the
central T1 domain position underneath the core of Kv channels [2–6],
the amino terminus of HERG probably tracks to the periphery
surrounding the C-linker/CNBD and extending to its bottom, where
the proximal domain and the distal carboxy terminus might interact.
As depicted in the homology model shown in Fig. 9A, it is likely that
the EAG/PAS domain is establishing extensive contacts with the top
and side surfaces of the C-linker/CNBD, helping to explain the
functional interaction of the initial part of the N-terminus with the
gating machinery, but also the disruptive effects of introducing
voluminous labels in the EAG/PAS that could considerably perturb
the central channel structures. Remarkably, the five positions in the
EAG/PAS domain carrying a label (residues 43, 78, 87, 88 and 104)
appear in quite different locations encircling the surface of the crystal
EAG/PAS structure [18], making unlikely that all of them are directed
towards a central space in the channel. However, all of them appeared
non-functional. This opens the possibility that the EAG/PAS is still
surrounded by other portions of the protein as recently proposed for
the T1 domain of Kv2.1 [55]. Thus, further work would be necessary to
check if the proximal domain and/or the carboxy terminus extend to

Fig. 9. Molecular arrangement of the fluorescent labels introduced in the HERG cytoplasmic domains and homology model of the channel. (A) Homology models of the HERG channel
(a) and the amino terminus-labeled construct (b). The models were constructed using surface representations of the Kv1.2 pore region (PDB ID: 2A79), the C-linker/cNBD region from
HCN2 (PDB ID: 1Q5O) and the HERG EAG/PAS domain (PDB ID: 1BYW) or a ribbon representation of YFP (PDB ID: 1F0B) showing the position of the chromophore in the center of the
molecule (yellow spheres). The different components are shown at the same scale. The Kv1.2 representation presents the four subunits of the tetramer differently coloured in green,
blue, yellow and magenta. The position of the S4–S5 loop has been marked in red. Note that the fourth C-linker/cNBD, EAG/PAS and YFP structures located nearest the viewer have been
removed for a better view of the assemblies. The rotation of these structures around the central vertical axis of the complex is arbitrary. The position of the EAG/PAS has been fixed to
direct its amino terminal end (red spheres) towards the S4–S5 loop in the channel core. Both the EAG/PAS and the YFP structures have been docked against the channel complex
preventing any superposition of the molecular volumes. Note also the good correspondence of the interfluorophore distances in the construct represented in panel b (carrying the YFP
molecules in the position corresponding to the amino ends) and those calculated from FRET measurements. The unknown structures of the proximal domain and the remainder of the
C terminus possibly located below the illustrated compositions, are not shown. (B) Relative position and approximated distances between fluorophores introduced in positions 1 (NH2),
345, 905 and 1159 (COOH) of HERG. The transmembrane core of Kv1.2 is shown at the top as a reference. A ribbon representation of YFP showing the approximate dimensions of the
molecule at the same scale is shown in the upper inset. The positions of the amino and carboxy ends of the fluorescent protein and the approximate location of the insertion point in the
host (black circle) are indicated. Lower inset. Ribbon diagram of Kv1.2 viewed from the cytoplasmic face with the S4-S5 in red. Molecular representations and combinations were
generated using the UCSF Chimera from Computer Graphics Laboratory, University of California, San Francisco (supported by NIH P41 RR-01081).
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the bottom of the channel either running parallel to the EAG/PAS or
wrapping around it.
A question about the structural combinations shown in Fig. 9A is
whether the volume of the EAG/PAS domain and the distances and
volumes of the attached GFP variants could fit into the general
dimensions of the model. In this respect it is worth noting that the
separation between the channel core and the CNBD domains is pro-
bably longer than the arbitrarily set distance shown in Fig. 9A. Since the
three-dimensional structure of the HERG channel transmembrane core
is unknown, we used as a reference the atomic structure recently
determined by X-ray crystallography for Kv1.2 [56], a voltage-depen-
dent K+ channel showing a 26% identity and 43% similarity to HERG in
the transmembrane helices and pore regions (data not shown). Thus,
whereas in the Kv1.2 core structure the C-terminal end of the S6 helix
lies closely associated to the internal surface of the plasma membrane
due to its angular bending at the level of the PVP sequence, in HERG
which lacks such a motif, the S6 should emerge from the trans-
membrane channel core in a more linear and tubular-like way. This
topology has been recognized in the three-dimensional organization
of other channels lacking the PVP signature such as KcsA [57] and in
the recently determined crystal structure of the cyclic nucleotide-
regulated channel MlotiK [58]. As previously suggested [8,59], it is
likely that at least in some channel states the C-linker region
following S6 also exists in an extended and more tubular-like
tetrameric arrangement than the vertically collapsed crystal structure
of the isolated HCN C-linker/CNBD depicted in Fig. 9A [10]. This would
increase the separation between the membrane surface and the CNBD
structures allowing for a better approximation of the EAG/PAS and/or
the GFP variants to the central axis of the tetramer. Finally, assuming
a peripheral localization of the GFP-derived fluorophores either
longitudinally or transversely projecting from the channel structure
(Fig. 9Ab), the ≈8 nm lateral size of the planes defined by the centre of
the labels would localize their insertion points at a shorter distance
(4–6 nm at both sides) from the central axis. For the labels introduced
in the amino termini, that seem to interact with the S4–S5 loop, this
distance would be consistent with the 3–6 nm range in which this
loop is located relative to the central axis (lower inset of Fig. 9).
Unfortunately, the use of non-functional HERG constructs to check a
more compact localization of other labels towards the protein centre
is hampered by the possibility of strong structural alterations in these
constructs as a result of fluorophore insertion. Subsequently, we
focused our efforts in those channel constructs exhibiting an intact
functionality, indicative of no major distortions as a result of labeling.
There are two possible concerns regarding the utility of our FRET
measurements to obtain information about the molecular organiza-
tion of HERG. The first one relates to the specificity and quantification
of the obtained signals and the second refers to the real meaning of
the calculated interfluorophore distances. Due to the dependence of
FRET from intra- and intermolecular distances between fluorophores,
it could be expected that measuring the amount of energy transfer
allows the determination of donor-acceptor distance [60–62]: the
farther apart the fluorophores, the less energy transfer. However, it is
also possible to obtain a considerable FRET signal in spite of a
relatively long intramolecular distance due to unspecific random
encounters produced by overexpression of labeled molecules. Con-
versely, a low FRET signal and/or a long estimated distance may be
obtained even when a short interfluorophore separation exists if an
inappropriate Förster distance (Ro, see below) is used or a complex
(e.g., tetrameric) stoichiometry is present.
Regarding the first concern, our measurements of donor de-quen-
ching upon acceptor photobleaching provide a simple and practical
approach to unequivocally identify the existence of FRET signals,
since such an increase in fluorescence would be achieved only if FRET
is present. Conversion of the fluorescence intensities into molar ratios
by normalizing the intensity ratios to those of a donor–acceptor
tandem imaged at the same settings, and exclusion from the analysis
1697
of those cells showing a low acceptor-to-donor ratio, ensured that
only cells in which most of the donor is coupled to an acceptor were
considered. This minimized the possible influence of unpaired donors
(αD factor, see Methods) to measured EFRET ensuring that the
measured values closely approach the true FRET efficiency. Control
of EFRET independence from the fluorochrome expression levels over
a wide range, the demonstration of equivalent FRET levels when
measurements are done with the whole cell fluorescence or when
they are restricted to plasma membrane regions in which properly
assembled functional channels are located, and the systematic
subtraction of signals coming from non-interacting molecules were
used as an indication that our signals came from the specific
assembly of ion channel subunits and not from random encounters
or formation of bulk aggregates as a result of construct over-
expression.
Performance of a quantitative analysis of FRET signals obtained
with a pair of fluorophores provides a unique opportunity to discern
the distance between donor and acceptor under physiological
conditions and in a natural environment within the intact cell, using
the Förster equation EFRET = Ro6/Ro6 + d6 [45,48,49,52,60,62], where d
stands for the interfluorophore distance and Ro corresponds to the
distance at which EFRET is 0.5 (≈5 nm for the CFP/YFP pair assuming a
random orientation distribution corresponding to a relative dipole
orientation factor κ2 of 2/3; [48,51,52]). As indicated previously, our
data with the 1/1123, 1/1158 and 1/1159 pairs and the equivalent EFRET
values between the 1123-, 1158- or 1159-located fluorophores of the
four subunits suggest a quite random orientation of the labels.
Previous analysis of the possible errors introduced by assuming κ2 = 2/
3 also indicated that the uncertainty in distance introduced by the
orientation factor is relatively small, usually less than 20% [43,60,61].
There is also evidence that covalently attached GFP variants are quite
mobile under physiological conditions and anisotropy measurements
indicate that they adopt random orientations [63,64]. Altogether, this
indicates that within certain limits our FRET data can be interpreted in
terms of distance, allowing a reasonable view of the global dimensions
of HERG. It is important to emphasize that our measurements using
different combinations of fluorescent labels located in different
positions also provide an additional method to validate the measured
distances. Thus, the final estimation of the distance between two
given positions lies not only in the FRET data from channel constructs
carrying the fluorophore partners in these positions, but also in the
combination of measurements done with a number of labels in order
to confirm that the calculated distances are coherent with those
obtained with other pairs.
A limitation of inferring distances and/or structures from GFP-
based fluorophores is that the GFP chromophores are located in the
centre of a barrel-like entity ≈2.5 nm in diameter and ≈4 nm long
(see inset of Fig. 9B). Apart from restricting the minimum distance
detectable by FRET with a single CFP/YFP pair to the 5–10 nm range
due to donor–acceptor steric collision, the calculated distances
would correspond to those separating the CFP and V/YFP chromo-
phores, not to those between the residues to which the labels are
attached, limiting the spatial resolution of our measurements and
the interpretation of FRET in terms of intramolecular distances. The
interfluorophore distances estimated here have been incorporated
into the models shown in Fig. 9 that are mostly consistent with our
FRET measurements. Evidently the absolute coordinates shown
cannot be considered as indicative of the real distances separating
the protein residues, but they can contribute to better define the
relative position of some channel domains. Our data indicate that the
amino and carboxy end-located fluorescent labels and those
introduced at position 905 of the four channel subunits delimit
three parallel square planes without sizeable torsion between them,
placing the centre of the labels introduced after residues 905 and
1158/1159 almost vertically aligned with those attached to the amino
terminal end. This contrasts with the near 45° rotation of the
1698 P. Miranda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1783 (2008) 1681–1699
fluorophores inserted after position 345. Due to the short vertical
separation predicted between the planes delimited by the 1 and 345
labels, it could be argued that the proposed rotation of the 345-
located labels is not related to a non-vertical arrangement of the
corresponding positions in the protein structure, but forced by
competing packing problems due to the big size of the tags.
However, our data also predict a similar torsion between the 345-
and the 905- or 1158-located labels that are separated from the 345
fluorophores by a long distance. Note that if the 345-attached label
rotation is simply due to an angular trajectory of the 345-attached
label that rotates it (clockwise or counter clockwise), or if it is the
result of a structural torsion of the channel protein that places the
345 position near the amino end of a non-adjacent subunit remains
to be established.
Our data also indicate that whereas a vertical distance of around
8–9 nm exists between the planes limited by the amino and carboxy
end labels, only around 1–2 nm separate the 345 and 905 planes from
the amino and the carboxy terminal ends, respectively. Interestingly,
the accuracy of these values is basically confirmed by the coincidence
of distances reported by the 345/NH2, 345/905, 345/COOH, 905/NH2
and 905/COOH pairs.
Even though our analysis only includes the four positions for which
the measured distances were unequivocally assessed and validated by
“multiple molecular triangulation”, it can yield some valuable infor-
mation about the overall channel arrangement. In fact, an upside-
down organization of the cytoplasmic labels with respect to that
schematized in Fig. 9B could also be compatible with the calculated
distances. We find the proposed location of the amino and carboxy
termini towards the central core as the most probable arrangement of
the channel protein for three reasons. First, placing the 345 position
away from the channel core and the carboxy end close to it would
imply a very long distance between the limit of the first transmem-
brane helix and residue 345, due to the ≈10 nm vertical separation
reported here between the 345 and the carboxy planes, plus an
additional separation from the membrane surface (top vertical arrow
and question mark in Fig. 9B), corresponding to the cavity that sepa-
rates the cytoplasmic domains from the transmembrane core in the
two-layered architecture of the HERG-related Kv and CNG channels
[4,56,65,66]. Second, residue 345 lies only a few amino acids away from
the short HERG sequence (residues 362–366) recently recognized as a
key modulator of HERG activation by electrostatic interactions with the
gating machinery in the channel core [21,37]. Third, the closest posi-
tion of the amino termini towards the central channel core as shown in
Fig. 9 is mostly compatible with the previously proposed interaction(s)
of the initial part of the EAG/PAS domain with the transmembrane
channel structure [22,29,31,35]. It is also tempting to speculate that the
position of the 345 label, closer to the membrane surface but sizeably
rotated with respect to the amino ends might be related to the
presence of a pathway allowing for a physical interaction between the
initial portion of the amino terminus and the gating machinery, likely
at the level of the S4–S5 loop [22,29,35]. It is possible that in this case,
the position of residue 345 above the amino terminus could be due to
its location in the connectors linking the transmembrane core and the
hanging bulk of the cytoplasmic domains [4,56,65,66].
We believe that the qualitative features of this model certainly
provide a useful initial constraint on the coarse structure of the
channel oligomer, clarifying the relative arrangement of some key
landmarks on the cytoplasmic domains of HERG. Even though our data
were obtained with large fluorophores, making it possible that they
are forced into a limited number of vacant spaces in the channel
periphery, our results delimit at least two clearly differentiated and
spatially separated spots for the amino and the carboxy ends of the
protein. Additional triangulation with other members of our fluor-
escent HERG channel library using the general methodology depicted
here should render very helpful data to position other parts of the
protein. On the other hand, it can be anticipated that our collection of
HERG fusion proteins could constitute an excellent basis for subs-
tituting the GFP variants with shorter peptides to which small fluo-
rophores such as biarsenical dyes [67] can be specifically attached. The
use of these smaller fluorophores combined with the procedures,
triangulations and expressions detailed in this report could also help
to confirm the relative dimensions reported here.
Acknowledgments
We thank Dr. Hugo Cabedo from University Miguel Hernández in
Alicante (Spain) the gift of the N-terminal-tagged VR1 construct. We
also thank Dr. Luisa María Sierra for her geometrical considerations.
This work was supported by grants SAF2003–00329 from Ministerio
de Ciencia y Tecnología and BFU2006–10936 from Ministerio de
Educación y Ciencia of Spain (both partially co-financed by FEDER
European funds), and grant IB05–002 from Principado de Asturias
(Spain). Finance support from Dirección General de Universidades e
Investigación of Asturias for acquisition of the image equipment (ref.
EQPT02–36) is also acknowledged. P.M. holds a predoctoral fellowship
from FICYT of Asturias (ref. BP03–108). D.G.M. and C.A.R. are pre-
doctoral fellows from the Spanish Ministerio de Ciencia y Tecnología
(refs. AP2000–4363 and BES-2004–3872).
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found, in
the online version, at doi:10.1016/j.bbamcr.2008.06.009.
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