NETosis en la curación de heridas: Cuando lo suficiente

es suficiente
Resumen: Las trampas extracelulares de los neutrófilos (NETs) son un entramado de
cromatina, proteínas histónicas y no histónicas, y agentes microbicidas que se extienden fuera
de la célula mediante una serie de eventos nucleares y citoplasmáticos, denominados
colectivamente NETosis. La NETosis, inicialmente considerada sólo un mecanismo
defensivo/apoptótico, se considera ahora una solución defensiva extrema, que en situaciones
particulares induce fuertes efectos negativos en la fisiología de los tejidos, causando o
exacerbando patologías, como se ha demostrado recientemente en el daño de órganos
mediado por NETs en pacientes con COVID-19. Los efectos positivos de las NETs en la
cicatrización de heridas se han relacionado con su actividad antimicrobiana, mientras que los
efectos negativos parecen ser más comunes en una plétora de condiciones patológicas (como
la diabetes) y están vinculados a una regulación al alza de la NETosis. Las pruebas recientes
sugieren que existen otros efectos fisiológicos positivos de las NETs en la cicatrización de
heridas que merecen un esfuerzo de investigación más amplio.
Palabras clave: netosis; curación de heridas; inflamación; inmunidad innata

1. Introducción
Los neutrófilos, también conocidos como granulocitos neutrófilos o leucocitos
polimorfonucleares (PMN), son los glóbulos blancos más abundantes en el sistema circulatorio
humano. Desempeñan un papel crucial en la defensa inmunitaria innata contra bacterias,
hongos y virus, y también son potencialmente dañinos para el huésped. Los neutrófilos son
reconocidos como células muy versátiles y sofisticadas, capaces de prolongar enormemente su
vida útil en función de su estado de activación y de la interacción con otras células
inflamatorias. Actualmente se cree que la vida media circulatoria de los neutrófilos es más
larga de lo que se estimaba anteriormente (varios días en lugar de varias horas) [1]. Su
activación y su actividad microbicida están estrictamente controladas por una plétora de
estímulos, y las pruebas recientes sugieren que son bastante versátiles y que pueden
desempeñar funciones antes insospechadas, como la transmigración inversa, el crosstalk y la
regulación de otras poblaciones de leucocitos [1]. Los mecanismos de acción antimicrobiana y
citotóxica de los neutrófilos consisten en la fagocitosis, la generación de especies reactivas de
oxígeno (ROS) y la degranulación de varios factores microbicidas como las α-defensinas, la
catelicidina, la elastasa, la catepsina G y la lactoferrina. Los neutrófilos también presentan una
notable capacidad biosintética de novo para las quimiocinas C-X-C y C-C; citoquinas
proinflamatorias, antiinflamatorias e inmunorreguladoras; así como factores angiogénicos y
fibrogénicos y metaloproteinasas de matriz [1-4]. Además de las numerosas acciones que
caracterizan la respuesta defensiva de los neutrófilos, se ha observado otra forma particular de
atrapar y eliminar patógenos. En 2004, Brinkmann et al. [5] informaron de la extrusión por
parte de los neutrófilos de una malla de fibras de cromatina decoradas con péptidos
antimicrobianos derivados de los gránulos y enzimas capaces de matar bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas. Debido a la modalidad de acción defensiva, esta malla defensiva ha
recibido la denominación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). También se ha
observado que las NETs son eficaces en la defensa del huésped contra los hongos [6], aunque
no son necesarias contra los virus con envoltura [7]. Las NETs están compuestas por fibras de
cromatina altamente descondensadas, con un diámetro de 15 a 17 nm, derivadas de
componentes nucleares acompañadas de proteínas histónicas y complejas con proteínas
globulares microbicidas, como la elastasa, la catepsina G y la mieloperoxidasa, que
normalmente se almacenan en los gránulos de los neutrófilos [5,8]. Las NET se liberan en el
espacio extracelular, donde la malla de cromatina atrapa a los microbios, limitando su difusión
y concentrando los factores neutrófilos, y aumentando así los efectos microbicidas [9]. La
liberación de NET es fundamental como mecanismo defensivo, cuando el tamaño de los
patógenos hace que la fagocitosis sea un proceso poco fiable [10]. Otro mecanismo a través
del cual las NET llevan a cabo su actividad microbicida está relacionado con la capacidad del
ADN para inducir la quelación del manganeso y otros iones. En particular, el manganeso
desempeña un papel importante en la proliferación y supervivencia de los microbios. Junto
con otros cationes divalentes, se utiliza para el transporte de electrones a través de la
membrana celular, un proceso fundamental utilizado por las bacterias para obtener energía
química para su actividad vital [11]. Como consecuencia de la actividad quelante del ADN en la
malla de las NET, la disminución del transporte de iones impide la supervivencia de los
microbios [12,13]. Además, se ha observado que las NET no sólo tienen una función activa en
la eliminación de patógenos, sino que también regulan el proceso inflamatorio local [14,15].
Inicialmente, la formación de NETs se interpretó como una forma particular de muerte celular,
diferente de la apoptosis o la necrosis (no se produce la activación de las
caspasas/fragmentación del ADN o de las señales de muerte por necrosis) [15], responsable de
terminar la corta vida de los neutrófilos activados durante un evento explosivo que produce
efectos microbiocidas. Siguiendo esta interpretación, el proceso se denominó NETosis [16]. Sin
embargo, la identificación de las etapas de formación de NET ha llevado recientemente a los
investigadores a revisar el concepto de muerte de NETosis (Figura 1). La formación de NETs se
inicia a partir de la disolución de la envoltura nuclear, liberando hilos de cromatina
descondensados en el citoplasma. Posteriormente, las membranas granulares también
desaparecen, permitiendo la mezcla de los componentes nucleares y granulares; durante todo
este proceso, la membrana celular está intacta. En el último paso, los hilos de cromatina y los
componentes granulares se liberan mediante un proceso que preserva la integridad de la
membrana citoplasmática de las células polimorfonucleares (PMN) [15]. Aunque enucleados,
los restos de los neutrófilos continúan su actuación antimicrobiana defensiva mediante
fagocitosis activa, aunque sólo durante unas horas [14,15,17]. Esta última observación condujo
a la hipótesis de que este proceso no puede entenderse propiamente como un proceso de
muerte celular, porque los neutrófilos siguen vivos después de la extrusión de la NET. En estos
términos, el proceso de NETosis no es diferente de otros efectos defensivos de estallido, como
los que utilizan ROS, que además de sus eficientes efectos microbicidas, resultan en la muerte
de las células inmunes [18]. Desde este punto de vista, algunos investigadores han criticado el
uso del término NETosis, prefiriendo el término formación de NET [19]. La formación de NET
parece ser un fenómeno generalizado dentro de las respuestas de las células inmunitarias, y
además de los neutrófilos, se ha informado de que otras células inmunitarias desarrollan el
proceso de formación de NET [20-23], por lo que se ha propuesto un término más amplio de
trampa extracelular (ET)osis [24]. Los neutrófilos, al igual que los monocitos, trabajan para
mantener la integridad y la salud del organismo. Controlan los patrones moleculares de los
microbios, conocidos como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), y/o las
moléculas de las células dañadas de origen del huésped, conocidas como patrones moleculares
asociados a daños (DAMP), utilizando receptores de reconocimiento de patrones (PRR). La
activación de la respuesta del sistema inmunitario está mediada por la detección de PAMPs
y/o DAMPs. Los PAMP son una estructura molecular; un componente de la pared celular, como
el lipopolisacárido (LPS), el peptidoglicano, los ácidos lipoteicoicos y las lipoproteínas de la
pared celular; componentes flagelares como la flagelina; o el β-glucano, que es un
componente de la pared celular de los hongos [25].

Los DAMP son moléculas producidas normalmente por las células, y en condiciones sanas
permanecen dentro de ellas. Cuando los DAMP se detectan fuera de las células, debido al
estrés o a una lesión, pueden desencadenar una fuerte reacción del sistema inmunitario. Los
DAMPs típicos incluyen proteínas nucleares, histonas, ATP, componentes mitocondriales como
el ADN mitocondrial y ácido úrico [26,27]. Cuando los DAMPs son detectados por PRRs como
los receptores tipo toll (TLR) se produce una activación de la respuesta del sistema inmune.
Esto elimina las células muertas, lo que desencadena la inflamación y es necesario para la
regeneración de los tejidos [26,28]. La formación de NET comienza con la activación de los
neutrófilos mediante el reconocimiento de estímulos, lo que les lleva a empaquetar y activar el
complejo NADPH oxidasa (NOX) a través de la proteína quinasa C (PKC)/Raf/MERK/ERK, así
como a aumentar el Ca2+ citosólico [29,30]. Las bacterias pueden inducir la producción de NET
mediante la activación de TLR4 [22,31]. La estimulación de TLR4 activa una vía que tiene como
intermediarios principales la NADPH oxidasa 2 (NOX2), una enzima que genera especies
reactivas de oxígenos (ROS), la enzima mieloperoxidasa (MPO) y la peptidilarginina desaminasa
4 (PAD4) [32]. Este proceso tarda de 1 a 4 horas en completarse tras el estímulo inicial.
Durante la formación de NET, se pierde la separación de la cromatina en eu-cromatina y
heterocromatina [33]. En este proceso están implicadas las enzimas del granulocito azurófilo,
la elastasa y la mieloperoxidasa, que se trasladan al núcleo en la fase inicial de la NETosis de
forma desconocida. La elastasa es la primera en entrar en el núcleo, donde determina la
escisión del enlazador de la histona H1, y modifica el núcleo de la histona [33]. La acción de la
elastasa la convierte en el primer factor limitante fundamental en la formación de las trampas;
los ratones deficientes en esta enzima no pueden producir NETs [33]. Posteriormente, la MPO
entra en el núcleo, aumentando la descondensación de la cromatina, probablemente por
síntesis de hipoclorito; los sujetos con un gen de MPO alterado no pueden formar NETs
[29,34]. Otra enzima implicada en esta vía es la peptildarginina deiminasa 4 (PAD4), que induce
la desaminación de los residuos de arginina a citrulina en las histonas 3 y 4 (citrulinación o
desmetilación de las histonas), produciendo una unión más débil al ADN y la descondensación
de la cromatina [8,29,30,34]. El papel de PAD4 en la formación de NET se ha estudiado en
ratones knock-out que no pudieron formar NETs [8,29,35,36]. Por último, se ha demostrado
que la proteína formadora de poros gasdermina D está implicada en la NETosis, permitiendo la
extrusión del ADN y de las proteínas asociadas [30,37,38]. Recientemente, se ha demostrado
que la autofagia dependiente de la NADPH oxidasa está implicada en las NETs [39]. La
estimulación de los neutrófilos mediante acetato de forbol miristato (PMA) produce una
vacuola gigante similar al autofagosoma [40,41]. El citoesqueleto también está implicado en la
regulación de la formación de NET, ya que la formación de túbulos puede dirigir el movimiento
de los gránulos durante la exocitosis y la fagocitosis [42]. Recientemente se ha observado una
vía particular de formación de NET de corta duración, en la que se libera ADN mitocondrial en
lugar de ADN nuclear, dependiendo de la formación de ROS. Este rápido proceso se produce
en el 80% de los neutrófilos en 15 minutos, tras el reconocimiento de C5a o LPS [43].

2. El lado oscuro de la NETosis

Se considera que los neutrófilos desempeñan sobre todo un papel beneficioso para el
huésped, pero su activación inadecuada también puede provocar daños en los tejidos durante
una reacción inflamatoria autoinmune o exagerada [44-47] Los neutrófilos participan en las
infecciones agudas y en la inflamación. La activación excesiva de los neutrófilos puede
conducir al desarrollo de un síndrome de disfunción orgánica múltiple, en el que los pulmones
son el principal objetivo, como la lesión pulmonar aguda (LPA) y, en su forma más grave, el
síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) [48]. Las NETs actúan promoviendo la
diferenciación de los fibroblastos pulmonares en miofibroblastos activos responsables del
efecto fibrótico, y se han encontrado NETs en estrecha proximidad a los fibroblastos que
expresan actina de músculo liso (α-SMA) en biopsias de pacientes con enfermedad pulmonar
intersticial fibrótica [49].

Las NETs han sido implicadas en trastornos inflamatorios crónicos o enfermedades

relacionadas con el envejecimiento, como la aterosclerosis, la psoriasis, la artritis reumatoide,
la enfermedad inflamatoria intestinal, la diabetes y el cáncer [36]. En el cáncer, la doble cara
de la formación de NET es evidente, ya que las NET muestran actividad antitumoral pero
pueden estimular la invasividad del tumor [50], y proteger a las células tumorales de la
actividad de los linfocitos citotóxicos [51]. En particular, en un modelo murino de cáncer de
mama, las NETs promueven la progresión de la metástasis tumoral, debido a factores proteicos
estrictamente asociados a la malla de ADN. Se observó la presencia de NETs alrededor de las
células metastásicas, y la actividad de la DNAse bloqueó la invasión celular [52]. En particular,
se ha sugerido que la cuantificación de la formación de NETs es un biomarcador pronóstico en
el trastorno neoplásico [52-55], o un objetivo potencial para nuevos enfoques terapéuticos
que utilicen DNAse I para interrumpir el efecto de la malla de ADN o inhibidores de PAD4
[52,56]. En un paciente diabético, los neutrófilos mostraron un aumento de la NETosis
espontánea que indujo una importante alteración en la cicatrización de heridas [57]. En el
lupus eritematoso sistémico, se ha afirmado que las NET son responsables de la respuesta
autoinmune [37,58,59]. En un modelo experimental de autoinmunidad similar al lupus en un
ratón, se produjo una formación aberrante de NET y la consiguiente liberación incontrolada de
mediadores inflamatorios. Estos sucesos pueden inducir un retraso en la desregulación de la
inflamación dependiente de los macrófagos, causando una persistencia inapropiada del
autoantígeno [60], responsable del agravamiento de la condición en el lupus eritematoso
sistémico [58]. En particular, el uso de elementos de la cromatina en la formación de NETs ha
planteado la cuestión de si la formación de NETs es la causa del desarrollo de varias formas de
autoinmunidad, porque los antígenos ocultos se vuelven accesibles a la vigilancia de las células
inmunitarias [61]. Los macrófagos participan en la eliminación de los NETs: Los macrófagos M1
(de tipo proinflamatorio) y los M2 (de tipo antiinflamatorio y de remodelación tisular) están
igualmente implicados en la eliminación de los tejidos [62]. El retraso en el aclaramiento
dependiente de los macrófagos podría ser responsable de la persistencia de los factores
desencadenantes de la autoinmunidad [60,63]. El ADN y las histonas de los NETs activan las
plaquetas y la cascada de coagulación y los NETs forman agregados denominados AggNET, que
son andamios para los eritrocitos y las plaquetas activadas. Al mismo tiempo, la elastasa
inactiva los principales inhibidores de la coagulación, la antitrombina III y el inhibidor de la vía
del factor tisular (TFPI), y se produce una mayor formación de trombos en los vasos sanguíneos
con el consiguiente daño para los pulmones, el corazón y los riñones [64]. Ya se han descrito
moléculas capaces de contrarrestar la producción de NETs por parte de los neutrófilos [65,66].
Además, dada la implicación de los neutrófilos en la coagulación, merece la pena evaluar la
actividad de los neutrófilos y la formación de NETs en pacientes con coagulopatías congénitas
(por ejemplo, hemofilia A) o adquiridas (por ejemplo, coagulación intravascular diseminada).
Por lo tanto, según Barnes et al. y Tomar et al., el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas
dirigidas a los neutrófilos, como los inhibidores del reclutamiento de neutrófilos o la formación
de NET, podría ayudar a reducir la trombosis y la mortalidad en los pacientes con COVID-19
[67,68], así como las complicaciones circulatorias en las infecciones causadas por otros
patógenos. Recientemente, se ha sugerido que la respuesta exacerbada de los neutrófilos y la
producción de NET están implicadas en la neumonitis y/o el SDRA asociados a la COVID-19
[67,69], ya que la producción excesiva de NET también causa las lesiones cardíacas y renales
agudas comunes en los pacientes con COVID-19 grave [70]. En la COVID-19 se produce una
inflamación incontrolable y progresiva, debida a una tormenta de citoquinas, por la alteración
de la diafonía entre macrófagos y neutrófilos [67]. La neutrofilia predice malos resultados en
pacientes con COVID-19 [71]. En conclusión, la formación excesiva de NET afecta a la respuesta
inflamatoria, empeorando el daño tisular en condiciones patológicas.

3. El lado bueno de la NETosis

Además de que la formación de NETs es un proceso implicado en los mecanismos defensivos
contra los microbios, varios autores han demostrado que las NETs desempeñan un papel en la
resolución de la inflamación, como se ha demostrado en el caso de la artritis gotosa [72],
aunque no sean suficientes para resolver completamente la artritis gotosa [73,74]. En el caso
de los neutrófilos, el reclutamiento a la zona de inflamación induce la liberación de una forma
particular de NETs denominada NETs agregados, que modulan la inflamación al unirse y
secuestrar citoquinas inflamatorias como la IL-1β y la IL-6, que luego son degradadas por las
serina proteasas unidas a su malla [75]. Por lo tanto, las NETs también actúan como
reguladores en el proceso inflamatorio cuando pueden actuar como un componente clave en
la iniciación y resolución de la inflamación. El efecto de la NETosis como agente pro o
antiinflamatorio depende de la cantidad, la calidad y la longitud de las NETs, lo que pone de
manifiesto nuevos mecanismos sofisticados y complejos adoptados por los neutrófilos para
desempeñar su papel en la defensa inmunitaria y la inflamación [36]. Sin embargo, la variedad
de condiciones experimentales adoptadas en el estudio de la formación de NET todavía no ha
mostrado una correlación clara entre los efectos de las NET y su cantidad/calidad [75,76]. Al
resumir la información sobre los lados oscuros y claros de los NET de los neutrófilos, nos
encontramos con un mecanismo que aumenta las propiedades microbicidas de los neutrófilos
y regula la respuesta inflamatoria. Los neutrófilos equilibran su acción pro y antiinflamatoria,
pero en presencia de condiciones que exacerban la formación de NET, se convierten en
agentes patógenos [30,36].

4. Formación de NETs en la cicatrización de heridas

En la cicatrización de heridas, el comportamiento de las NETs, con cara de Jano, no está bien
documentado (Figura 3). En particular, se ha demostrado que el aumento de NETosis perjudica
la cicatrización de heridas en una plétora de condiciones patológicas [77], incluso en la
tumorigénesis de la piel [78]. Además, el retraso en la cicatrización de las heridas debido a la
formación de NET ha sido bien documentado en pacientes diabéticos [46,79].
En estos pacientes, el aumento de la formación de NET mediada por PAD4 se ha asociado a
una mayor liberación de elastasa, responsable de la degradación de la matriz extracelular y del
retraso en la cicatrización de las heridas [80-82]. Además, en ratones diabéticos Padi4-/-, la
cicatrización de las heridas se aceleró [83].
La importancia de la producción excesiva de NET en relación con la manifestación o la
progresión de la enfermedad ha obtenido más pruebas en la eficacia del tratamiento de la
diabetes con metformina. La metformina, un conocido fármaco de primera línea para el
tratamiento de la diabetes de tipo 2, además de su mecanismo de reducción de la glucosa, que
no se conoce bien, ha revelado la capacidad de reducir las concentraciones de componentes
de NET por el efecto inhibidor sobre la vía PKC-NADPH oxidasa, responsable de los primeros
pasos metabólicos que conducen a la producción de NET [84]. De nuevo, estos hallazgos
confirman que el daño tisular observado inducido por NET es un reflejo de una producción
alterada, y no una manifestación de un mecanismo defensivo dañino en sè. La desregulación
de la NETosis también puede ser inducida por la inflamación crónica, un mecanismo
responsable del retraso en el proceso de curación de las heridas, como se ha demostrado en
pacientes con úlceras de pie diabético (DFU), en los que el eje de la proteína del receptor
similar a la NOD (NLRP)-3 inflammasoma-NETs estaba regulado al alza en comparación con los
controles y los pacientes diabéticos sin úlcera [85,86]. Por lo tanto, las NETs han sido
reconocidas como marcadores del deterioro de la cicatrización de las heridas en pacientes con
úlceras de pie diabético [87]. El modelo de desregulación de la NETosis que induce la
inflamación crónica está bien representado en la psoriasis. La patogénesis de la psoriasis
depende de los niveles de IL-17 e IL-23, y se utilizan fármacos dirigidos a estas citocinas para
controlar la enfermedad [88]. La eficacia de estos tratamientos se ha atribuido al bloqueo de
un subconjunto particular de células T (llamadas Th17) en la producción de IL-17 y en el
bloqueo de su expansión inducida por IL-23, IL-21 e IL-1 β [89-92]. Sin embargo, los mastocitos
y los neutrófilos son los principales productores de IL-17 en la piel, y en la psoriasis. En
particular, la IL-17 se libera durante la formación de trampas extracelulares por parte de los
neutrófilos, mientras que la IL-23 y la IL-1β participan en la degranulación y la formación de
trampas extracelulares en los mastocitos [22,37]. Otro proceso mediado por la IL-17 ha sido
comunicado por Frangou et al. Los andamios NET decorados con factor tisular (TF) e
interleucina-17A (IL-17A) están implicados en la tromboinflamación y la fibrosis pulmonar en
pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) [93]. La IL-17A es una citoquina
proinflamatoria que ha demostrado estar asociada a un aumento y propagación de un proceso
fibrótico en varios tejidos, incluyendo el pulmón, la piel, el hígado y otros, con la excepción del
riñón [94]. En los pacientes con LES, las NET derivadas de un mecanismo autofágico
deteriorado están enriquecidas con TF e IL-17A, que funcionan como proteínas activas: El TF
induce la generación de trombina, y la IL-17A se comporta como promotora del depósito de
colágeno [93]. Además de los efectos de las NETs en la matriz extracelular y en la respuesta
inmunitaria, se observaron sus efectos directos en las poblaciones celulares implicadas en la
cicatrización de las heridas. Por ejemplo, las NETs en la inflamación de ALI/ARDS indujeron la
polarización proinflamatoria de los macrófagos M1 [48], mientras que en las heridas
diabéticas, las NETs aumentaron los niveles de NLRP3 y pro-IL-1β a través de la vía de
señalización TLR-4/TLR-9/NF-κB en los macrófagos, manteniendo una respuesta inflamatoria
local [85]. Las NETs aumentaron la expresión de factores de crecimiento del tejido conectivo, la
producción de colágeno y la proliferación/migración en los fibroblastos que expresan actina de
músculo liso alfa (α-SMA) [49], y se detectaron en estrecha proximidad a esta población celular
en biopsias de pacientes con tejido cicatricial de la piel [49]. En particular, los efectos de las
NET en las células endoteliales (CE) y en la angiogénesis durante la cicatrización de las heridas
no se han explorado ampliamente. La única información que tenemos sobre la interacción
entre las células endoteliales y las NETs procede de estudios sobre la fisiopatología de la
aterosclerosis [95] o de otras enfermedades vasculares. Altos niveles de NETs indujeron la
muerte de las células endoteliales en la vasculitis [96] y la transición endotelial-mesenquimal
en la nefritis lúpica [97]. Sin embargo, los NETs fueron capaces de inducir la proliferación,
desestabilizar las uniones intercelulares y aumentar la motilidad celular en las CE, junto con la
angiogénesis in vitro vía TLR4 [98]. Curiosamente, no se midieron las concentraciones de NET
capaces de estimular la angiogénesis. En la cicatrización de heridas, los queratinocitos
desempeñan un papel fundamental durante el proceso defensivo inicial, reclutando
neutrófilos, macrófagos y otros leucocitos, y son esenciales en el proceso de reparación. Los
queratinocitos expresan diferentes tipos de TLR en su superficie celular [99,100], y el TLR-4
parece estar implicado en la cicatrización de heridas agudas, ya que el bloqueo del TLR4
retrasa la migración de queratinocitos epidérmicos humanos primarios normales (NHEK) y
suprime la fosforilación de p38 y JNK/MAPK, así como la producción de IL-1β [101]. Los TLR
externos 1, 2, 4, 5 y 6 se encuentran en la superficie celular y reconocen ligandos de origen
principalmente bacteriano y fúngico. Los miembros internos de la familia TLR (TLR 3, 7, 8 y 9)
se localizan en los endosomas, donde su función principal es detectar ácidos nucleicos
microbianos y derivados del huésped [100]. Recientemente, se ha demostrado que los TLR
endosomales contribuyen potencialmente a la inflamación en diferentes estudios humanos y
modelos de roedores [102,103]. TLR9 reconoce y se une a residuos CpG no metilados en el
ADN captado por endocitosis [104], y el ectodominio de TLR9 se escinde posteriormente para
producir un receptor funcional para el reclutamiento de moléculas adaptadoras y la activación
de NF-κB o interferón (IFN) [103]. El clivaje proteolítico de TLR9 es un requisito previo para su
activación, ya que tras el clivaje, uno de sus fragmentos se une a Myd88 para inducir la
señalización descendente en una amplia variedad de células [103]. El TLR9 es expresado por
subconjuntos de células B y células dendríticas en humanos, y está implicado en la inflamación
local y sistémica [105]. Además, el receptor TLR-9 está implicado en la internalización del ADN
de doble cadena a través de la captación vesicular en los macrófagos [106]. Los queratinocitos
expresan TLR9, y su activación induce INF de tipo I [100]. En la psoriasis, un aumento de la
respuesta de TLR9 induce la producción de una mayor cantidad de IFN-β que caracteriza la
lesión psoriásica [107]. Las NETs también pueden ejercer un papel positivo estimulante en el
proceso de curación de heridas, aunque sólo se está empezando a investigar. Los NETs actúan
sobre los queratinocitos a través de la internalización de ADN de doble cadena por los
receptores TLR9, que inducen una proliferación de queratinocitos dependiente de NF-kB [108].
Este fenómeno depende de la concentración de NET, ya que las concentraciones bajas y altas
de NET inducen un efecto opuesto en la cicatrización de heridas in vitro [108], y una
concentración fisiológica baja de NET aumenta la proliferación de queratinocitos. Este efecto
dependiente de la concentración de NETs sobre la proliferación de queratinocitos in vitro y la
cicatrización de heridas fue fuertemente reducida en los sujetos de edad avanzada (mayores
de 65 años). Además, los neutrófilos estimulados por LPS de sujetos de edad avanzada
produjeron una mayor concentración de NET en comparación con los sujetos adultos (de 20 a
40 años), pero los NET fueron menos eficaces para inducir la toxicidad bacteriana y la
proliferación de queratinocitos (Sabbatini et al., resultados no publicados). Estos resultados
contrastan con los obtenidos por Tseng et al. en un modelo murino de infección por
Staphylococcus aureus, en el que se observó una menor producción de NET en los neutrófilos
obtenidos de animales de edad avanzada en comparación con los obtenidos de animales más
jóvenes [109], mientras que en los seres humanos se ha observado una reducción asociada a la
edad en la formación de NET inducida por IL-8 y LPS [110]. La diferencia en el modelo
experimental y en la estimulación de los neutrófilos podría explicar, al menos en parte, los
diferentes hallazgos. Además, las NET de sujetos humanos de edad avanzada tenían
fragmentos de ADN más grandes en comparación con la producción de NET de sujetos jóvenes
(Sabbatini et al., resultados no publicados) y los fragmentos de ADN grandes tienen menos
eficacia en la quelación de iones, una cualidad clave para el rendimiento microbicida [111].
Además, los fragmentos de ADN más grandes son menos eficientes en la interacción y
activación de TLR9 [112], lo que explica la ausencia de proliferación inducida por los NETs de
los queratinocitos. Por último, en un modelo murino, la actividad/NETosis de PAD4 aumentó
con la edad, y las PAD4/NETs se han implicado en la fibrosis de órganos relacionada con la
edad [80]. La cara de Jano de la producción de NET también puede apreciarse al comparar la
ineficacia de la defensa antimicrobiana y el proceso de cicatrización de heridas observado en
los pacientes diabéticos. Se sabe que los pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (T2D) tienen un
mayor riesgo de padecer infecciones y deficiencia en la cicatrización de las heridas, lo que se
ha relacionado en parte con una liberación retardada de NETs de vida corta [57,113]. Los
pacientes con T2D presentan NETs decoradas con un bajo nivel de catelicidina (LL-37), que
poseen una pobre acción antimicrobiana, probablemente debido a los defectos del andamiaje
en los hilos extracelulares de NET, inducidos por la hiperglucemia constante. Cuando los
pacientes son tratados con el macrólido claritromicina, la capacidad antibacteriana se
restablece gracias a la regulación al alza de LL-37 en las NET [114]. Al mismo tiempo, se
observó una mejora en la cicatrización de las heridas debido a la activación y diferenciación de
los fibroblastos dérmicos [114]. Estos hallazgos indican un papel fisiológico positivo directo de
las NET en la cicatrización de heridas, más allá de su acción antimicrobiana defensiva. Sin
embargo, la importancia fisiológica de las NET en la cicatrización de heridas sigue sin
investigarse suficientemente.

5. Observaciones finales
La formación de NET es una respuesta fisiológica de los neutrófilos que frena la invasión tisular
por agentes externos y regula la inflamación. Este proceso es altamente resolutivo y necesita la
acción equilibrada de limpieza de los macrófagos, pero niveles más altos de NETosis
espontánea o inducida pueden revelar los efectos negativos de las NETs, ya que pueden
convertirse en efectores de la inflamación crónica, perjudicar la cicatrización de las heridas y
causar daños tisulares y fallos orgánicos. No obstante, la información sobre los efectos
positivos de las NET, aparte de su capacidad antimicrobiana, aunque limitada en número, es
prometedora. Podrían convertirse en útiles herramientas terapéuticas en el futuro.