Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Sondas enzimáticas
Glicobiología
Si bien el ADN, el ARN y las proteínas están codificados a nivel genético, los glicanos
(polímeros de azúcar) no están codificados directamente desde el genoma y hay menos
herramientas disponibles para su estudio. Por consiguiente, la glicobiología es una
esfera de investigación activa para los biólogos químicos. Por ejemplo, se puede
suministrar a las células variantes sintéticas de azúcares naturales para investigar su
función. El grupo de investigación de Carolyn Bertozzi ha desarrollado métodos para
que las moléculas de la superficie de las células reaccionen de forma específica en cada
lugar a través de azúcares sintéticos.
Química combinatoria
Empleando la biología
Síntesis de péptidos
Para crear cadenas de polipéptidos del tamaño de una proteína a través de los pequeños
fragmentos de péptidos obtenidos por síntesis, los biólogos químicos utilizan el proceso
de ligadura química nativa. La ligadura química nativa implica el acoplamiento de un
tioéster C-terminal y un residuo de cisteína N-terminal, lo que finalmente resulta en la
formación de un enlace de amida «nativo». Otras estrategias que se han utilizado para la
ligadura de fragmentos de péptidos mediante la química de transferencia de acilos
introducida por primera vez con la ligadura química nativa son la ligadura de proteínas
expresadas, las técnicas de sulfurización/desulfurización y el uso de auxiliares de tiol
extraíbles. La ligadura de proteínas expresadas permite la instalación biotecnológica de
un tioéster C-terminal utilizando inteínas, lo que permite el apéndice de un péptido N-
terminal sintético a la porción C-terminal producida recombinantemente. Tanto las
técnicas de sulfurización/desulfurización como el uso de auxiliares de tiol extraíbles
implican la instalación de una fracción de tiol sintético para llevar a cabo la química de
ligadura química nativa estándar, seguida de la eliminación del auxiliar/tiol.
Evolución dirigida
Existen varios métodos para crear grandes bibliotecas de variantes de secuencias. Entre
los más utilizados se encuentran el sometimiento del ADN a la radiación UV o a
mutagénicos químicos, la PCR propensa a errores, los codones degenerados o la
recombinación. Una vez que se crea una gran biblioteca de variantes, se utilizan
técnicas de selección o cribado para encontrar mutantes con un atributo deseado. Entre
las técnicas de selección o cribado más comunes se incluyen el FACS, la visualización
del ARNm, la visualización de fagos y la compartimentación in vitro. Una vez que se
encuentran variantes útiles, su secuencia de ADN se amplifica y se somete a nuevas
rondas de diversificación y selección.
Reacciones bio-ortogonales
El éxito en el etiquetado de una molécula de interés requiere una funcionalización
específica de esa molécula para que reaccione químicamente con una sonda óptica. Para
que un experimento de etiquetado se considere robusto, esa funcionalización debe
perturbar mínimamente el sistema. Lamentablemente, estos requisitos suelen ser
difíciles de cumplir. Muchas de las reacciones de las que normalmente disponen los
químicos orgánicos en el laboratorio no están disponibles en los sistemas vivos. Las
reacciones sensibles al agua y al redox no se producirían, los reactivos propensos al
ataque nucleófilo no ofrecerían ninguna quimioespecificidad y cualquier reacción con
grandes barreras cinéticas no encontraría suficiente energía en el entorno de calor
relativamente bajo de una célula viva. Así pues, los químicos han desarrollado
recientemente un panel de química bioortogonal que procede químicamente, a pesar del
entorno de materiales reactivos de distracción in vivo.
Los avances en las modernas tecnologías de secuenciación a finales del decenio de 1990
permitieron a los científicos investigar el ADN de las comunidades de organismos en su
entorno natural («eDNA»), sin cultivar especies individuales en el laboratorio. Este
enfoque metagenómico permitió a los científicos estudiar una amplia selección de
organismos que antes no se caracterizaban debido en parte a una condición de
crecimiento incompetente. Entre las fuentes de eDNA figuran los suelos, el océano, el
subsuelo, las fuentes termales, las fuentes hidrotermales, los casquetes polares, los
hábitats hipersalinos y los entornos de pH extremo. De las muchas aplicaciones de la
metagenómica, investigadores como Jo Handelsman, Jon Clardy y Robert M. Goodman,
exploraron enfoques metagenómicos para el descubrimiento de moléculas
biológicamente activas como los antibióticos.
Kinasas
La modificación postraduccional de las proteínas con grupos de fosfato por las cinasas
es un paso regulador clave en todos los sistemas biológicos. Los eventos de
fosforilación, ya sea la fosforilación por cinasas de proteínas o la desfosforilación por
fosfatasas, dan lugar a la activación o desactivación de las proteínas. Estos eventos
tienen un impacto en la regulación de las vías fisiológicas, lo que hace que la capacidad
de disección y estudio de estas vías sea esencial para comprender los detalles de los
procesos celulares. Hay una serie de problemas —a saber, el mero tamaño del
fosfoproteoma, la naturaleza fugaz de los acontecimientos de fosforilación y las
limitaciones físicas conexas de las técnicas biológicas y bioquímicas clásicas— que han
limitado el avance de los conocimientos en esta esfera.
Los avances en biología química también han mejorado las técnicas clásicas de imagen
de la acción de la cinasa. Por ejemplo, el desarrollo de biosensores peptídicos —
péptidos que contienen fluoróforos incorporados— mejoró la resolución temporal de los
ensayos de unión in vitro. Una de las técnicas más útiles para estudiar la acción de la
cinasa es la FRET. Para utilizar FRET para estudios de fosforilación, las proteínas
fluorescentes están acopladas tanto a un dominio de unión de fosfoaminoácidos como a
un péptido que puede ser fosforilado. Al fosforilar o desfosforilar un péptido sustrato, se
produce un cambio de conformación que resulta en un cambio en la fluorescencia. El
FRET también se ha utilizado en tándem con la Microscopia de Imágenes de
Fluorescencia durante la Vida (FLIM) o con anticuerpos conjugados fluorescentemente
y con la citometría de flujo para proporcionar resultados cuantitativos con una excelente
resolución temporal y espacial.
Fluorescencia biológica
Los biólogos químicos suelen estudiar las funciones de las macromoléculas biológicas
mediante técnicas de fluorescencia. La ventaja de la fluorescencia frente a otras técnicas
reside en su alta sensibilidad, su no invasividad, su detección segura y su capacidad para
modular la señal de fluorescencia. En los últimos años, el descubrimiento de la proteína
verde fluorescente (GFP) por Roger Y. Tsien y otros, los sistemas híbridos y los puntos
cuánticos han permitido evaluar con mayor precisión la ubicación y la función de las
proteínas. Se utilizan tres tipos principales de fluoróforos: pequeños tintes orgánicos,
proteínas verdes fluorescentes y puntos cuánticos. Los pequeños tintes orgánicos suelen
ser de menos de 1 kDa, y se han modificado para aumentar la fotoestabilidad y el brillo,
y reducir el auto-apagado. Los puntos cuánticos tienen longitudes de onda muy agudas,
alta absorción molar y rendimiento cuántico. Tanto los tintes orgánicos como los tintes
cuánticos no tienen la capacidad de reconocer la proteína de interés sin la ayuda de
anticuerpos, por lo que deben utilizar el inmuno etiquetado. Las proteínas fluorescentes
están genéticamente codificadas y pueden fusionarse con la proteína de interés. Otra
técnica de marcado genético es el sistema biarsenical de tetracisteína, que requiere la
modificación de la secuencia objetivo que incluye cuatro cisteínas, que se unen a las
moléculas biarsenicales permeables a la membrana, los colorantes verde y rojo «FlAsH»
y «ReAsH», con afinidad picomolar. Tanto las proteínas fluorescentes como la
tetracisteína biarsenical pueden expresarse en células vivas, pero presentan grandes
limitaciones en la expresión ectópica y podrían causar una pérdida de función.
Se han utilizado técnicas fluorescentes para evaluar una serie de dinámicas de las
proteínas, como el seguimiento de las proteínas, los cambios de conformación, las
interacciones entre proteínas, la síntesis y la renovación de las proteínas y la actividad
de las enzimas, entre otras. Tres enfoques generales para medir la redistribución y
difusión de la red de proteínas son el rastreo de una sola partícula, la espectroscopia de
correlación y los métodos de fotomarcado. En el seguimiento de una sola partícula, la
molécula individual debe ser lo suficientemente brillante y dispersa como para ser
rastreada de un vídeo a otro. La espectroscopia de correlación analiza las fluctuaciones
de intensidad resultantes de la migración de objetos fluorescentes hacia y desde un
pequeño volumen en el foco de un láser. En el fotomarcado, una proteína fluorescente
puede ser secuenciada en un área subcelular con el uso de una intensa iluminación local
y el destino de la molécula marcada puede ser visualizado directamente. Michalet y sus
compañeros de trabajo utilizaron puntos cuánticos para el seguimiento de una sola
partícula usando puntos cuánticos de biotina en las células HeLa. Una de las mejores
maneras de detectar cambios conformacionales en las proteínas es etiquetar la proteína
de interés con dos fluoróforos en estrecha proximidad. FRET responderá a los cambios
conformacionales internos resultantes de la reorientación de un fluoróforo con respecto
al otro. También se puede utilizar la fluorescencia para visualizar la actividad de las
enzimas, típicamente utilizando una proteómica basada en la actividad saciada (qABP).
La unión covalente de una qABP al sitio activo de la enzima objetivo proporcionará
evidencia directa sobre si la enzima es responsable de la señal al liberar el apagador y
recuperar la fluorescencia.