Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec (TESE)

División de Ingeniería Química y Bioquímica

Equipo: 1

Número de práctica 5:
Tinción de Gram

Presenta:
• Acevedo Sánchez María Guadalupe.
• Álvarez Zarate Irving Damián.
• Antonio González David de Jesús.
• Arenas García Areli Patricia.

Profesor de la asignatura de Microbiología

Dr. Hugo Minor Pérez

Ecatepec de Morelos, junio de 2022

1. Resumen
En el siguiente protocolo experimental se presenta la técnica de Tinción de Gram utilizando las
bacterias de Listeria Monosytogenes, Escherichia coli, Contol, para obtener más información sobre la
morfología y composición química de las bacterias, el uso de tinción involucra el uso de varios
reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen y así poder separar a las bacterias
en dos grandes grupos como lo son gran - positivas y gran – negativas.

Se realiza la observación y el manejo por medio del microscopio. El microscopio es un conjunto de

lentes que concentran y enfocan la luz sobre una muestra para formar imágenes visuales.

2. Introducción.
Tinción de gran es una técnica de tinción que permite separar a las bacterias en grupos: gram positivas
y gram negativas, basados en si retienen o no, el colorante primario (cristal violeta) luego del proceso
de decoloración. Los organismos que retienen el cristal violeta luego de la adición del agente
decolorante, el alcohol, aparece como azul oscuro o violeta, y se designan como gram positivos;
aquellos que pierden el cristal violeta y se tiñen con el colorante secundario, la safranina, aparecen
como rojos y se signan como gram negativos.

Listeria Monosytogenes es un organismo ubicuo encontrándose en todo el medio ambiente. Se ha

aislado en el suelo, agua, vegetales, forrajes, áreas húmedas de fábricas de procesamiento de alimentos
y contenido fecal de una amplia gama de animales, siendo un contaminante común de alimentos frescos
y procesados, de origen animal y vegetal. (Gorris)

Escherichia coli es un bacilo gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae,

tribu Escherichia. Esta bacteria coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y
se le considera un microorganismo de flora normal, pero hay cepas que pueden ser patógenas y causar
daño produciendo diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea. (Rodríguez, A.G., 2002)

Se realizan las diversas muestras con las bacterias antes ya mencionadas sometidas a un proceso de
tinción en el cual se usaron reactivos como: cristal violeta, solución Lugol, etanol al 95%, y safranina
enjuagando en cada adición con agua destilada, para después ser observadas en el microscopio y
obtener resultados.
Se obtuvieron resultados distintos en cada una de las muestras, obteniendo bacterias como Cocos, en
la muestra que contiene bacteria Control y Escherchia, sin embargo, en listeria se obtuvieron muy
pocas bacterias sin poder distinguirse con claridad.

3.0 Objetivo general

• Aprender a realizar una tinción de gran

4.0 Objetivos específicos

• Realizar en procedimiento correcto de la tinción de gran en la bacteria Listeria Monocytogenes.

• Realizar en procedimiento correcto de la tinción de gram en la bacteria Escherichia Coli.
• Realizar en procedimiento correcto de la tinción de gran en una muestra control.
• Analizar en el microscopio las muestras realizadas mediante tinción de gram.

5.0 Metodología

5.1 Limpieza y desinfección de los materiales de laboratorio

Empezamos a lavar los materiales como los portaobjetos y los cubreobjetos con alcohol y jabón liquido
para retirarle la mayor parte de los contaminantes externos y al final secarlos con una franela lo mas
precavidamente para no rallar los materiales ya que son de vidrio.

5.2 fijando la muestra de la bacteria

En un portaobjetos colocamos una gota de agua destilada para poder diluir la muestra de la bacteria,
posteriormente tomamos el tubo donde se enceuntra la bacteria y tomamos una buena muestra con el
asa bacteriológica y diluirlo en la gota de agua extendiéndola un poco, después la dejamos pasar cerca
de la llama del mechero para que el calor pueda quitarle la humedad de la muestra dejando que se
seque para que la bacteria se quede fijada en el porta objetos y después la dejamos un momento a
temperatura ambiente.
5.3 Tinción de gram

Colocar las láminas extendidas y fijada en una base solida y por debajo colocar una bandeja de agua
para dejar caer el resto del agua. Primero dejamos caer unas 2 o 3 gotas en la superficie de cristal
violeta por un minuto y después lavar con agua destilada y dejar escurrir, hacerlo de manera delicada.

Después dejamos caer unas 2 o 3 gotas de Lugol por un minuto y posteriormente lavar con agua
destilada y dejar escurrir.

Posteriormente dejamos inclinado el portaobjetos para descolorar con alcohol al 95% durante 10 o 15
segundos, después lavar con agua destilada y dejar escurrir, esta es la parte mas delicada ya que
debemos hacerlo despacio para evitar que la muestre se escurra junto con el agua y se eche a perder
todo el trabajo.

Luego dejamos caer 2 o 3 gotas de safranina por 30 segundos y lavar con agua destilada y dejando
escurrir dejando secar por completo usando papel absorbente para que no escurra ni una gota de líquido
y después analizar la muestra en el microscopio dejándole caer una gota de aceite de inmersión
poniéndole el cubreobjetos e introduciéndolo al microscopio con los objetivos x10, x65 y x100.

6.0 resultados y discusión

En la muestra control observamos que las bacterias se tiñeron de color purpura, con unas formas de
cocos se puede decir que la bacteria se trató de la Listeria monocytogenes que fue la bacteria que no
conocíamos que tipo de muestra era.

En la muestra de L. monocytogenes no se pudo observar nada durante el uso del microscopio ya que
no se quedaron fijadas adecuadamente las bacterias durante el proceso de fijación y debido a eso todo
el procedimiento de la tinción fallo ya que el uso de las soluciones no se usó de la manera más
precavida y el lapso de los tiempos.

En la bacteria que si se conocía de E. coli si se pudo realizar bien la tinción de gram dando a conocer
que las bacterias si se tiñeron de color rojizas como resultado de las bacterias gram negativas (-) y con
una forma de cocos con diámetro muy pequeño.
Muestra control con un Se observan pequeñas
objetivo de 10x colonias de bacterias de color
purpura

Muestra control con objetivo Se observan pequeñas

de 25x cantidades de cocos
Muestra control con un Lucen mas a detalle las
objetivo de 66x colonias fijadas dando como
resultado bacterias gram
positivas (+)

Muestra control con un Se ven mas a detalle las

objetivo de 1.25x colonias y con ello las
morfologías de cada una de
ellas
E. coli con un objetivo de 25x Se observan pequeños puntitos
en los que se observan pocas
colonias

Se observan con mayor detalle

E. coli con un objetivo de 65x las colonias de color rojizas
 Listeria monocytogenes con un En esta muestra no se pudo
objetivo de 10x. observar nada ya que no quedo
bien fijada la muestra.

7.0 Conclusiones

• Se realizo la tinción de gram con los pasos y tiempos adecuados para observarlo en el
microscopio.
• No se pudo observar con éxito la tinción de gram de la Listeria monocytogenes debido a que
no se respetaron los tiempos de cada solución durante el procedimiento.
• De la muestra control se observó que se tiño de color purpura, llegando a la conclusión de que
eran bacterias gram positivas (+) analizando de que se tratara listeria monocytogenes.
• En la bacteria de Escherichia coli se observó cómo se tiño de color rojizo observando las
bacterias y su morfología.
8.0 bibliografías

• Gorris, B., 2017. Ficha Peligro 04 listeria - achipia.gob.cl. Microsoft Word - Ficha
Peligro 04 Listeria.docx. Available at: https://www.achipia.gob.cl/wp-
content/uploads/2018/03/Ficha-Peligro-04-Listeria-v01.pdf
• Rodríguez, A.G., 2002. RTÍCULO de Revisión Rodríguez-Angeles G Principales.
ADIVETER. 11-patog.pm. Available at: https://www.adiveter.com/ftp_public/E.coli.pdf
[Accessed June 8, 2022].

Anexos

• E. coli: es el nombre de un tipo de bacteria que vive en el intestino. La mayoría de las E. coli no
causan problemas. Pero, algunos tipos pueden producir enfermedades y causar diarrea. Uno de
ellos causa la diarrea del viajero. El peor tipo de E. coli causa una diarrea hemorrágica y a veces
puede causar insuficiencia renal y hasta la muerte. Esto, en general, ocurre en niños y en adultos
con sistemas inmunitarios debilitados.
• Cristal violeta: El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de
genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados como indicadores de
pH y colorantes.
Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-rosanilinas. Mediante la
mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el colorante
final.
• El lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en
agua destilada.