UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

RECINTO UNIVERSITARIO SIMON BOLIVAR

Facultad de Ingeniería Química

Departamento de Química
Artículos sobre Escherichia Coli
Alumnos:
Álvaro Antonio Chamorro Calixto
Carlos Eduardo Gutiérrez Centeno
Javier Antonio Espinoza Aguilar
Grupo:
4T2-IQ
Profesora:
Ms. Johana O’Connor
Fecha de entrega:
Domingo 25 de septiembre de 2022
Managua, Nicaragua
Mecanismos de transporte activo en vesículas de membrana
bacterianas activas
Metodología
Efecto de varias fuentes de energía en la captación de aminoácidos por las vesículas de
membrana de E. coli ML 308-225
Se diluyeron 0,20 mg de proteína de membrana hasta un volumen final de 100 µl que contenía, en
concentraciones finales, 50 mM de fosfato de potasio (pH 6,6) y 10 mM de sulfato de magnesio.
Tras una incubación de 2 minutos a 25°, se añadió la fuente de energía que se iba a probar (cuando se
indicaba) a una concentración final de 20 mM, e inmediatamente después se añadió uno de los
aminoácidos radiactivos enumerados a la actividad específica y la concentración final.
Las incubaciones se continuaron a 25° durante 3 minutos, las reacciones se terminaron y las muestras
se analizaron.

Competencia entre aminoácidos para la captación y el intercambio por las membranas de

ML 308-2,25
La competencia por la captación y el intercambio de aminoácidos radiactivos se determinó para
cada uno de los siguientes aminoácidos no marcados: L-prolina, L-lisina, glicina, L-alanina, L-
serina, L-treoína, L-ácido glutámico, L-ácido aspártico, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptófano, L-
histidina, L leucina, L-isoleucina, L-valina, L-cisteína, L-arginina, Lmetionina, L-glutamina, L-
asparagina, L-hidroxiprolina, L-ornitina y D-serina.
Para los experimentos de entrada competitiva, se prepararon mezclas de ensayo que contenían, en un
volumen total de 100 µl, 0,16 mg de proteína de membrana, 50 JilM de fosfato de potasio (pH 6,6),
10 mM de sulfato de magnesio y el aminoácido no marcado que se iba a probar (1,0 mM.).
Tras una incubación de 2 minutos a 25°, se añadió o-lactato de litio a una concentración final de 20
mM, y las reacciones se iniciaron inmediatamente después con la adición del aminoácido radiactivo
indicado.
Las incubaciones se continuaron a 25° durante 1 minuto, y las reacciones fueron terminados y
ensayados.
Para los experimentos de intercambio competitivo, las membranas suspendidas en 50 mM de fosfato
de potasio (pH 6,6) y 10 JilM de sulfato de magnesio se precargaron con el aminoácido radiactivo
indicado en presencia de 20 mM de n-lactato durante 15 minutos a 25° con agitación.
Posteriormente, se transfirieron alícuotas de 100 µl (que contenían 0,040 mg de proteína de
membrana) a tubos que contenían 10 µl del aminoácido no marcado que se iba a analizar para obtener
una concentración final de 1,0 mM de aminoácido no marcado.
 (S)o., y valores de V max para el transporte de varios aminoácidos por las vesículas de
membrana de E. coli ML 308-225
1. Se diluyeron alícuotas de membranas ML 308-225 que contenían 0,080 mg de proteína de
membrana hasta un volumen final de 100 µI que contenían, en concentraciones finales, 50 mM de
fosfato de potasio (pH 6,6) y 10 mM de sulfato de magnesio.
2. Tras una incubación de 2 minutos a 20°, se añadió D-lactato de litio (donde se indicaba) a una
concentración final de 20 mM, seguido inmediatamente de L- [G-3H]triptófano (1490 mCi por
mol) a las concentraciones indicadas.
3. Las incubaciones se continuaron durante 15 s (0--0) o 30 s (---- ,A.--A); luego se terminaron y se
ensayaron.

Efecto de los cationes monovalentes en la absorción de aminoácidos por parte de ML 308-

225 membranas
Las alícuotas (0,5 ml) de las membranas en tampón estándar (fosfato de potasio 0,l M, pH 6,6) se
lavaron tres veces por centrifugación en 5 ml de uno de los siguientes tampones: Fosfato de potasio
0,1 M, pH 6,6 (columnas I y II); fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,6 (columna III); fosfato de colina 0,1
M, pH 6,6 (columna IV).
Los gránulos del último lavado se Re suspendieron en 0,5 ml en el tampón indicado y se analizaron
alícuotas de 20 µl para determinar la absorción de aminoácidos a 25°.
Las mezclas de ensayo, que contenían 0,108 mg de proteína de la membrana en un volumen final de
100 µl, contenían el tampón indicado (pH 6,6) a una concentración final de 50 mM, 10 mM de
MgSO4, 20 mM de D-lactato de litio (donde se indicaba) y el aminoácido 14C indicado a la
concentración final y la actividad específica indicadas en "Métodos".
Las reacciones se iniciaron con la adición del aminoácido radiactivo, las incubaciones se realizaron
durante 1 minuto a 25°, y las muestras se ensayaron.

Bibliografía
Lombardi, F, J. Kaback H. (1972). Mechanisms of Active Transport in Isolated Bacterial
Membrane Vesicles. New Jersey: The Roche Institute of Molecular Biology, Nutley, New Jersey
07110

Recuperado el 24 de Septiembre de 2022

PIIS0021925820817785.pdf
Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano. Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio
se enumeran en:

Suplementos de crecimiento para auxotróficos las cepas cuando no se indicaron en el texto

fueron (en concentraciones milimolares): uracilo, 0,4; timina, 0,3; leucina, 0,4; isoleucina, 0,4;
valina, 1,0; arginina, 0,2; histidina, 0,2; y metionina, 0,5.

Para todos los experimentos, el medio consistió en la solución de sales tamponadas con sulfonato
de morfolinopropano-N-tris(hidroximetil)metilglicina. Los detalles de la preparación de los
medios fueron los descritos en ese papel. El medio mínimo fue preparado por añadiendo 0,4%
(peso/vol) de D-glucosa a MOPS (MOPS-G).

Todas las soluciones de nutrientes suplementarios se esterilizaron por filtración a través de una
membrana de 0,2 µm. filtro (unidad de filtro Nalgene, Nalge Sybron Corp., Rochester, Nueva
York). El agua destilada fue esterilizada por autoclave.

Cultivos (50 ml) para ensayos enzimáticos o de transporte se cultivaron aeróbicamente en

matraces Erlenmeyer de 250 ml en un baño de agua con agitación (New Brunswick Scientific
Co., modelo G-76) que mantuvo una temperatura constante entre 30 y 41 + 0.250C. La
plataforma la rotación fue de aproximadamente 150 rpm. Para la isolación de fluido de choque
para el ensayo de proteínas de unión, 1-cultivos de litro se cultivaron aeróbicamente en Fernbach
matraces Las tasas de crecimiento para cultivos grandes y pequeños. Eran indistinguibles. Para
cambiar las células del medio de una composición o temperatura a otra, el cultivo se enfrió
rápidamente y se centrifugó asépticamente a 10.000 x g durante 10 min, y las células se
suspendieron en medio precalentadas de la composición deseada.

Todos los experimentos reportados aquí fueron realizado en cultivos que crecen a densidades
entre 0,004 y 0,30 mg/ml (peso seco). Medición del crecimiento. La masa bacteriana se estimó
midiendo la densidad óptica de los cultivos. Utilizando un espectrofotómetro Zeiss PMQ2. solo
datos obtenido después de al menos tres generaciones de crecimiento y entre 0,1 y 1,0 unidades
de absorbancia a 420 nm (unidades A420) (paso de luz de 1 cm) para calcular las tasas de
crecimiento. Las muestras de células en crecimiento se transfirieron asépticamente
periódicamente a formaldehído al 0,9% (vol/vol) para detener el crecimiento. Estas muestras
fueron luego diluidas con agua para obtener lecturas A420 entre 0,1 y 0,4. El crecimiento se
expresa como la constante de velocidad específica de primer orden (k), en unidades de hora-',
según a la expresión, k, = (ln 2)/(tiempo de duplicación de masa).

La constante de velocidad de primer orden, k, se calculó a partir de la pendiente de la gráfica de

mínimos cuadrados del natural logaritmo de A420 en función del tiempo, en horas.

Preparaciones de extractos celulares

Extractos sin células fueron preparados por tratamiento sónico de células lavadas como descrito
anteriormente. El contenido de proteína de los extractos se midió colorimétricamente a 750 nm,
usando suero bovino albúmina como estándar.

Ensayos enzimáticos

Treonina desaminasa L-treonina hidroliasa [desaminación]: treonina deshidratasa se analizó en

células libres extractos, excepto que la absorbancia del derivado 2,4-dinitrofenilhidrazona del a-
cetobutirato se midió a 530 nm en un espectrofotómetro Zeiss PMQ2. a-isopropilmalato sintetasa
a-isopropilmalato-a-ceto-isovalerato-liasa [coenzima A acetilación] se midió por el método de
Kohlhaw y Leary.

Para estos ensayos enzimáticos, 1 unidad de actividad es la producción de 1 gmol de producto en

1 min bajo condiciones de ensayo estandarizadas. Todos los valores informados son promedios
de al menos dos determinaciones con se restan los espacios en blanco apropiados.

Ensayos de transporte.

Cultivos de células para transporte, los ensayos se recogieron en fase exponencial mediante
centrifugación y se lavaron tres veces con MOPS a 4 °C. Las células se resuspendieron en MOPS
a 37 °C y se incubaron 5 min a 37 °C. La reacción fue iniciada por agregando la suspensión
bacteriana a una solución del aminoácidos radiactivos y cualquier otro agregado como descrito
en el texto. El curso temporal de la captación fue se mide retirando muestras de 0,5 ml a
intervalos apropiados, filtrándolas a través de filtros de nitrocelulosa de 24 mm, tamaño de poro
de 0,45 µm (Millipore Corp., Bedford, Mass.), y lavar inmediatamente con 5 ml de fosfato de
potasio 0,01 M a 37 °C, pH 7,2, y MgSO4 0,1 mM. Radiactividad de los filtros secos se contó en
un espectrómetro de centelleo líquido Packard con un centelleador basado en Triton que
contenía, por litro: 2,5-difeniloxazol, 8,25 g; 1,4-bis[2(4-metil-5-fenil-oxazolil)]benceno, 0,25 g;
tolueno, 667 ml; y Triton X-100, 333 ml. Tritio se contó con una eficiencia del 39%. La cantidad
de celdas se estimó a partir del A4, w (miligramos/mililitro, peso seco) = 0,1361A + 0,03719
(A2). El uso de esta ecuación ha sido demostrado no estar relacionado con la tasa de crecimiento
de las células. Para los experimentos de transporte, 1 unidad de actividad es la absorción de 1
mol de sustrato en 1 min bajo estas condiciones estandarizadas.

Se determinó la cinética del transporte de leucina midiendo la velocidad de transporte de la

leucina a concentraciones de 8.3 x 10-8 a 5 x 10-6 M. Estos los datos (leul y v5b,) se trazaron
mediante el método LineweaverBurk, y la pendiente y la intersección se determinaron mediante
un análisis de mínimos cuadrados.

Ensayos de unión de aminoácidos

La actividad específica de proteínas en el líquido de choque osmótico que se unen los

aminoácidos de cadena ramificada se determinaron mediante diálisis de equilibrio, en un
dispositivo multicámara de microdiálisis (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco,
California). Una cantidad de 100 ml de una proteína solución que contenía de 1 a 2 mg de
proteína por ml fue dializado frente a 0,7 ml de [3Hlleucina en 10 mM fosfato de potasio, pH 7,4
y MgSO4 10-4 M para dar una concentración final de 8,8 µM de leucina. La diálisis se llevó a
cabo a 4°C hasta alcanzar el equilibrio establecido. Se tomaron muestras de 30 ml y se la leucina
radiactiva se midió mediante espectrometría de centelleo líquido como se ha descrito
anteriormente una unidad de actividad representa la unión de 1 jtmol de leucina en estas
condiciones de ensayo. Los valores informados en este trabajo representan la media de tres
determinaciones y varían con una desviación estándar del 20%.

Fuente de productos químicos

Todos los productos químicos se obtuvieron de fuentes comerciales y eran de grado reactivo o
mejor.

La represión y desrepresión del transporte de leucina, isoleucina y valina en se examinó

Escherichia coli K-12 usando cepas auxotróficas para leucina, isoleucina, valina y metionina. En
experimentos diseñados para limitar cada uno de estos aminoácidos por separado, demostramos
que la limitación de leucina sola desreprimió la proteína de unión a leucina, el amino de cadena
ramificada de alta afinidad sistema de transporte de ácido (LIV-I) y el sistema de baja afinidad
unido a la membrana (LIV-II). Esta regulación no parecía implicar la inactivación del transporte
componentes, pero representó un aumento en la tasa diferencial de síntesis de componentes de
transporte en relación con las proteínas celulares totales. La regulación aparente del transporte
por isoleucina, valina y metionina informado en otros lugares fue demostrado que requiere un
operón biosintético de leucina intacto y que resulta d e cambios en el nivel de enzimas
biosintéticas de leucina. También se requería una sintetasa de ácido ribonucleico de transferencia
de leucil funcional para la represión del transporte. Se demostró que la regulación del transporte
es esencialmente independiente de ilvA o sus producto génico, treonina desaminasa. El papel
central de la leucina o sus derivados en el metabolismo celular en general se discute.

Bibliografía

OXENDER, S. C. (1976). Regulation of Branched-Chain Amino Acid Transport in Escherichia

coli. Michigan: Department ofBiological Chemistry, The University of Michigan Medical
School.

Recuperado el 24 de septiembre de 2022:

file:///C:/Users/javier%20antonio%20espin/Downloads/jb.127.3.1225-1238.1976.pdf
Las bacterias se cultivaron en el medio C. El medio contenía por litro: 7g de K2HPO4, 3g de
KH2PO4, 0.5g de citrato de Na3•3H20, 1g de (NH4)2SO4, 0.1 g de MgSO4•7H2O y 2g de
glucosa (esta última clavado por separado). El pH final fue de 7.
Las células se cosecharon en su fase de crecimiento exponencial tardía. Se lavó con medio C a 4°
y se re suspendió en el tampón a 4° para obtener una concentración final de 10mg/ml
Se añadió cloranfenicol hasta un nivel de 300μg/ml. Las células conservan su máxima capacidad
de transporte hasta 75 minutos cuando se mantuvieron en frío. El transporte se midió pipeteando
0.2 ML de la suspensión celular calentada en un tubo de ensayo que contenía 1.3 ML de una
solución de 14C-aminoacidos a 37° en medio C con 0.02% de glucosa.
Las incubaciones empleadas es difícil utilizar tiempos inferiores de 10 a 15s, por eso un tiempo
de incubación de 30seg se aproxima a la tasa inicial de entrada. Después de los intervalos de
tiempo de incubación, se procede a filtrar pipeteando 1 ml de la mezcla de incubación en un
filtro millipore, la filtración se realizará en 2 o 3 segundos.
Luego las células se lavaron en el filtro con 5 ML de medio C (25°). Se colocó una alícuota del
medio de incubación radioactivo y se contó para determinar la actividad específica. El peso
húmedo de las células calculada parte de la suspensión bacteriana inicial, fue de 0.88 a 0.89 mg,
lo que corresponde aproximadamente a 10^9 células. Las velocidades de transporte suelen
expresarse en milimoles de ácidos transportados por 30 segundos de kg de células
La cuestión de si los aminoácidos cumulado sean modificados por la célula bacteriana investigo
y cuando durante varios intervalos de tiempo. Las suspensiones celulares se expusieron al 14C-
aminoacido durante 2 minutos y luego se centrifugaron y se extrajeron con 5 volúmenes de
etanol al 75% a 0° durante 30 minutos.
Una alícuota del extracto fue sometido a una cromatografía de papel ascendente en alcohol
butílico-ácido (4:1). La posición de la subestancias radiactiva se determinó con contador de tiras
de papel. Cuándo se examinaron los isómeros de los aminoácidos leucina, isoleucina,
fenilalanina y valina una mancha radiactiva correspondiente al aminoácido de prueba podría
representar el 96, 96, 98 y 89%, respectivamente de la radiactividad total. Tras dos minutos de
contacto de la glicina, la alanina y la metionina con las células, se recuperó menos de 50% de la
radiactividad y la mancha que representaba el aminoácido original, lo que indica una actividad
metabólica bastante extenso de E. Coli K12 hacia estos aminoácidos. Con el tiempo de
incubación se redujo a 15 segundos en la recuperación de cada uno de los últimos grupos de
aminoácidos marcados en la forma inalterada cayó en un rango del 75 al 80%.
Constante de inhibición para aminoácidos
Las bacterias se incubaron donde 30 segundo a 37° con aminoácidos marcado a una
concentración igual a la de K. Durante la capacitación hubo concentraciones variables de
aminoácido inhibidores no etiquetados.
El efecto de la temperatura en la composición del medio de lavado en la pérdida de aminoácidos
acumulado
Hacer unas incubaron en medio C con 7 μM de 14-C_L-leucina durante 30 segundos a 37°. Tras
la filtración las células se lavaron con 5 ml de medio C a distintas temperaturas experimento 1.
En el experimento 2 el tampón Na+ se preparó sustituyendo las sales de potasio utiliza
normalmente en el medio C por sales de sodio.
Efecto de varios tratamientos sobre la pérdida de aminoácidos acumulados por Escherichia coli
Las células se suspendieron un medio que contenía 14-C_L-leucina 10 μM durante 2 minutos a
37° y luego se filtraron en un filtro millipore y se lavaron dos veces con porciones de 5 ml de
tampón a 37°. Está célula sirvieron de control para la comparación de otras células que se
lavaron una tercera vez con 10 ml de tampón.
Bibiografia
OXENDER, D. L. (1968). Amino Acid Transport Sistems in Escherichia coli. Michigan:
Department of Biological Chemistry, The University of Michigan. Recuperado el 24 de
septiembre de 2022:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925818945072