Biología Celular y Molecular: Familiarización con literatura científica

Nombre: Ashley Marie Mejía

ID: 1107489

Fecha: 12-07-22

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Nombre del articulo: La corrección del gen Cas9-AAV6 de beta-globina en HSC autólogas mejora la
eritropoyesis de la enfermedad de células falciformes en ratones

DOI: 10.1038/s41467-021-20909-x 

Autor principal: adam c wilkinson

Autores: Daniel P Dever, Ron Baik, Joab Camarena, Ian Hsu, Carsten T Charlesworth, chika morita,
Hiromitsu Nakauchi, Mateo H. Porteus.

Fecha de publicación: 29 de enero de 2021

Revista científica: Nature

Volumen: N/H

Páginas: N/H

1. Objetivos de la investigación
El objetivo fue la evaluación del gen de la beta-globina humana a través de la tecnología Cas9-
AAV6 en el ratón Townes-SCD para la corrección de beta- globina a largo plazo con el fin de
lograr la terapia curativa con relación a la enfermedad de células falciformes.

2. Resumen de la metodología empleada

Básicamente como parte del experimento se necesitaron los ratones, esto fue aprobado por el
panel administrativo sobre el cuidado de animales de laboratorio en la universidad de Stanford,
los ratones se alojaron a temperatura ambiente en condición libre de patógenos y con libre
acceso a alimentos y agua. Para el aislamiento del HSC de los ratones se usó clasificación de
células activadas por fluorescencia. Las HSC se cultivaron en medios compuestos por medios
F12 1 % de insulina-transferrina-selenio-etanolamina, 1 % de
penicilina/estreptomicina/glutamina, alcohol polivinílico al 0,1 % trombopoyetina 100 ng/ml y
factor de células madre 10 ng/ml en placas recubiertas de fibronectina. Los cultivos de HSC se
analizaron para determinar la expresión de GFP el día 14 mediante citometría de flujo utilizando
un BD FACS AriaII o BD Fortessa. Para analizar los datos de citometria de flujo se utilizó el
software FlowJo 10 y el análisis estadístico se realizó con Prism 7.

Para la edición de genes se utilizó electroporación usando un nucleofector lonza. Para el

transplante de HCS con génicas C57BL/6 se inyectaron por vía intravenosa (IV) junto con 2 × 10 5
 o 1 × 10 6 WBMC de ratones C57BL/6-CD45.1/CD45.1 en hembras C57BL/6-CD45 .2 ratones
después de una dosis letal de irradiación (9,5 Gy).
Para cuantificar las frecuencias de edición genómica se utilizó PCR digital de gotas utilizando
ADN genómico extraído con la solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicenter).

el ADN genómico se extrajo con la solución de extracción de ADN QuickExtract y los amplicones
de PCR (longitud de 1410 pb) que abarcan la región objetivo se generaron con el HBBpar de
cebadores de entrada y salida. Las condiciones del ciclo de PCR para la PCR de entrada y salida
son las siguientes: 98 °C (30 s); seguido de 35 ciclos de 98 °C (10 s), 60 °C (30 s) y 72 °C (1 min); y
finalmente 72 °C (10 min).
Y para terminar, para evaluar los parámetros de sangre se realizó un hemograma completo
utilizando Horiba Micros ESV 60.

3. Resultados más importantes

Con relación a la introducción del casete de expresión GFP no hubo una disminución significativa
en los alelos dirigidos al gen después del trasplante primario y secundario.
Luego de esto se confirmó que se podía hacer un direccionamiento génico preciso en HSC
funcionales del ratón luego de evaluar las consecuencias funcionales de la corrección del gen.
Se observó HgbA estable en la sangre periférica y los parámetros hematológicos mejoraron en
estos ratones, en particular las frecuencias de reticulocitos PB, que cayeron de un promedio de
~60 a ~9%.
Los ratones trasplantados se siguieron cada 4 semanas después del trasplante para evaluar la
retención de alelos dirigidos por genes en múltiples linajes hematopoyéticos diferenciados, la
expresión de hemoglobina (tanto humana como de ratón transfundido) y la generación de
reticulocitos, se pudo detectar la corrección de alelos multilinaje en todos los receptores a largo
plazo.
La corrección de HBB previene el recambio prematuro de glóbulos rojos y la formación de
células falciformes, después de realizar una evaluación detallada del recambio de glóbulos rojos
in vivo y la formación de células falciformes después de un HSCT autólogo de HSC corregidas
por HBB se pudo observar enfoque en una cohorte de tres ratones receptores donde 2 ratones
(ratón A y B) mostraron altas frecuencias de corrección del gen mieloide y hHgbA estable ,
mientras que el tercero (ratón C) no lo hizo. Dado que una de las principales causas de
morbilidad y mortalidad en la SCD es la formación de células falciformes en los glóbulos rojos, se
hizo la evaluación de la morfología de los glóbulos rojos mediante la tinción de Wright-Giemsa y
ensayos de formación de células falciformes con metabisulfito de sodio esto confirmo además
una frecuencia reducida de morfología de glóbulos rojos anormales y una reducción de la
formación de células falciformes de RBC. Sobre la base de estos datos, por lo tanto, se concluye
que el trasplante autólogo de HSC corregidas con Cas9-AAV6 HBB puede reducir
sustancialmente las anomalías de glóbulos rojos asociadas con SCD in vivo
4. Conclusiones de la investigación
Para la corrección del gen HSC que se basa en CRISPR/Cas9 puede abrir la puerta a curar muchas
enfermedades congénitas de la sangre, pero hay falta de evaluación de las consecuencias
funcionales de estos enfoques de corrección de genes en la hematopoyesis in vivo. Aunque se
están desarrollando modelos de ratón para respaldar mejor la hematopoyesis humana, como los
ratones que expresan citoquinas humanas o la creación de un nicho humano, estos modelos aún
no recapitulan completamente la hematopoyesis humana. El poder de los modelos de ratón
para la validación preclínica fue destacado recientemente por Schiroli et al., quienes
establecieron un ratón SCID-X1 humanizado y lo usaron para evaluar una terapia de corrección
génica basada en Cas9. Los resultados de esta investigación destacan el posible beneficio
preclínico de usar modelos de ratones humanizados para estudiar enfermedades hematológicas
in vivo y evaluar la seguridad, viabilidad y eficacia de los reactivos dirigidos al gen HSC humano
que se están desarrollando actualmente como productos celulares de investigación.

Otra ventaja de realizar experimentos de selección de genes en HSC de ratón es la capacidad de

realizar un HSCT autólogo para evaluar las frecuencias de corrección de genes en todos los
linajes sanguíneos y del sistema inmunitario y evaluar la capacidad de las HSC modificadas
genéticamente para respaldar la supervivencia del receptor a largo plazo. Un hallazgo
importante de este estudio fue la correlación positiva entre las frecuencias de corrección génica
en el linaje mieloide y la expresión estable de HgbA, y con la corrección fenotípica de los índices
eritropoyéticos in vivo, incluidas las frecuencias de reticulocitos PB y el recambio de glóbulos
rojos.
En conclusión, este estudio demuestra que las LT-HSC multipotentes funcionales se pueden
editar genéticamente utilizando la tecnología Cas9-AAV6 y que la corrección del gen de la beta-
globina en las HSC SCD mejora los índices de glóbulos rojos in vivo después del trasplante
autólogo. Juntos, los datos respaldan la investigación clínica de las terapias de corrección del
gen Cas9-AAV6 al mismo tiempo que identifican áreas para la optimización futura de esta
poderosa tecnología.

5. Opinión y crítica al articulo

La terapia génica abre un mundo completo a la cura de muchas enfermedades, el uso de la
tecnología CRISPR-Cas9 donde se corrige o modifica esos cambios de las enfermedades en el
genoma trae grandes beneficios en la vida humana. Con relación a las enfermedades
hematológicas como la enfermedad de células falciformes el trasplante alogénico de células
madre hematopoyéticas es una gran terapia curativa, pero hay un gran problema con relación a
donantes inmunocompatibles, y no es un secreto que la mayoría de los pacientes no tienen esta
compatibilidad, por ello, es tan importante los estudios y experimentos con este tipo de
tecnología. Una de las cosas más interesantes que note del artículo fue el estudio en los ratones
humanizados del locus de hemoglobina para portar HBA humana, esto sin duda crea una
simulación perfecta de la enfermedad en humanos, y una investigación mucho más precisa y
efectiva, lo que garantiza que exista una seguridad mayor cuando esto se aplique en seres
humanos. Este estudio también demostró la correlación que hay entre frecuencias de corrección
génica del linaje mieloide y la expresión estable de HgBA, y este grupo de células sanguíneas son
las que participan en la defensa del organismo contra agentes patógenos infecciosos, esto
también demuestra la importancia de este tipo de estudios, que sin duda cambiaran la dinámica
con relación a muchas enfermedades que al día de hoy son difíciles para el organismo, hasta
capaces de llevar a la persona a la muerte. Sin duda, un artículo interesante que sigue abriendo
la puerta a la tecnología en el ADN.