I- ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION MOLECULAR UV-VISIBLE En esta espectrofotometrfa el equipo que se utiliza. se denomina ESPECTROFOTOMETRO UV-VISIBLE, cs un instrumento que mide la ABSORBANCIA de una solucién. Por lo tanto para medi la concentracién de un analito pot este método es necesatio que el analito (0 un producto de teaccién del analito) tenga la propiedad de absorber radiacién electromagnética (luz) en la regién del UV-visible Qué significa que el analito absorbe luz? Significa que cuando un haz de luz incide sobre la soluci6n del analito, éste absorbe energia Ja que utiliza para pasar de su estado basal de energia (el mas bajo, estado fundamental) a un estado excitado (de mayor energia) Energia absorbida por dtomos = E. de transiciones electrinicas Energia absorbida por moltoulas = E de transiciones rotacionales, vibracionalesy electrinicas: 1- DEFINICION DE ABSORBANCIA. Cuando un haz de luz monocromética, es decir de una determinada longitud de onda, atraviesa una solucién que contiene una especie absorbente, la intensidad (0 la potencia) de la radiacién disminuye como consecuencia de la absorcién de energia por parte de las especies absorbentes presentes en la solucién (Figura 6 ) a es Figura 6- Dibujo que representa un haz de luz monocromética que incide en una solucién que absorbe dicho haz. P0: potencia de la luz incidente y P: potencia luego de atravesar la muestea Se define TRANSMITANCIA de una solucién a la fraccién de luz que deja pasar dicha solucién: T=P/P0 Se define la ABSORBANCIA de la solucién a partir de la trasmitancia de la solucién A=-log TMétodos es ct De las expresiones matemiticas podemos deducir que cuanto mayor es la A menor: sera la T, es decir que si una solucién absorbe mucho, transmitiré poco. Podemos observar ademas que de acuerdo a la definicién de T'y A, ambas propiedades son adimensionales, ya que se definen a partir de un cociente de la misma magnitud (P/PO). 2. {COMO SE RELACIONA LA MEDIDA DE ABSORBANCIA CON LA CONCENTRACION DEL ANALITO? ECUACION DE LAMBERT Y BEER ‘Cuando un haz de luz monocromitica (de determinada longitud de onda) atraviesa una solucién, la ABSORBANCIA es directamente proporcional a la distancia recorrida por la luz atravesando la solucién absorbente y a Ia concentracién del analito en Ia solucién. La distancia recortida por la luz atravesando la solucién se denomina camino aptico y se mide generalmente en em (Figura 7) Py —_ HH b Figura 7- Esquema que representa el fendmeno que describe la ley de Lambert y Beer. PO es la potencia de Ia luz monocromatica incidente; P es Ia potencia de la luz luego de atravesar la solucién de concentracién c y b es el camino dptico. A=exb.sc A: absorbancia, adimensional. 8: coeficiente de extincién molar 6 absortividad molar, se define como la unidad de absorbancia por unidad de concentraciéa y pot unidad de longitud de la trayectoria de luz; es una constante definida que depende de la solucién y ta longitud de onda, en general su unidad es la inversa de la molaridad por Ia inversa de cm, es decir (M x cm)’ 6 I./mol x em Dies el camino dptico, en general se mide en em. Cres la concentracién del analito expresada en molaridad (M).Métodos es ct Dado que la Absotbancia y la absortividad molar dependen de la longitud de onda de Ia luz incidente, muchas veces se expresa la ecuacién de Lambert y Beet como una fancién de la longitud de onda: Ag =&a@xbsc Con cierta frecuencia se utiliza como constante de proporcionalidad en la Ley de Lambert y Beer la absortividad especifica (a) en lugar de la absortividad molar. L.as unidades de la absottividad especifica son (L/g x em) y por lo tanto en este caso la concentracién del analito se debe expresar en g/L. A=axbxc Laley de Lambert Beer es una ley limite, es decir que solo se cumple en determinadas condiciones: luz monocromatica y soluciones diluidas. Representacién grafica de la Ley de Lambert y Beer. La Figura 8 representa la Absorbancia medida a una determinada longitud de onda en funcién de la concentracién de analito. 42 1 os 06 oa Absorbanda a determinada A ue 1 ' : o 2 a 6 8 10 2 concentracién del analito Podemos observat que la representacién grifica de la ley de Lambert y Beer es una recta, Ein el eje de las ordenadas (eje Y) se reptesentan los valores de A y en cl eje de las abscisas (eje X) se reptesentan las concentraciones del analito. La pendiente de la recta corresponde al producto & x b, 10Desviaciones de la ley de Lambert Beer (gpor qué se pierde la linealidad entre la A y c?) 1- Sila solucién del analito es concentrada (en general mayor a 0,010 M) se pierde la relacién lineal entre Ia A y la ¢, las moléculas muy préximas entre si comienzan a interferir entre ellas en el proceso de absorcién de nergia. Decimos que la recta se “plancha” a altas concentraciones 2. Desviaciones quimicas: Se pierde la relacién lineal entre A y ¢ cuando existen interferencias en Ia solucién, tales como: - asociacién o disociacién del analito en solucién reacciones del analito con el solvente presencia de otros componentes en Ia muestra que también absorben luz incidente. 3- Desviaciones instrumental La ley de Lambert-Beer se aplica usando luz monocromética. Sin embargo en la prictica, el espectrofotémetro utiliza una fuente policromitica de luz y mediante un sistema éptico adecuado (una red de difraccién o un filtro) se selecciona un segmento de longitudes de onda centrado en la que se desea utilizar, a este segmento se lo denomina “banda”. Por este motivo es muy importante elegir adecuadamente la longitud de onda de trabajo. Para ello se utiliza el ESPECTROGRAMA o ESPECTRO DE ABSORCION que es un grifico, caracteristico para cada analito, en el que se grafican las absorbancias del analito en funcién de la longitud de onda incidente (Figura 9). Figura 9- Representacién de un ESPECTROGRAMA ° ESPECTRO de ABSORCION de un analito. A es la banda de longitudes de onda centrada en My Bes la banda de longitudes de onda centrada en 12. Si analizamos la banda centrada en la longitud de onda 42, vemos que no habri gran vatiacién en la lectura de absorbancia a lo latgo de esa banda, Por el contrario la banda centrada en la Iongitud de onda M1, muestta una variacién importante en la lectura de absorbancia a lo largo de la banda. Concretamente, para tener un pequefio error debemos clegir una longitad de onda ubicada en wna regién plana del espectrograma correspondiente a fin de minimizar este error instrumental. i3- COMPONENTES DEL ESPECTROFOTOMETRO UV-VIS 1- Fuente de luz policromética (para el visible limpara de ‘Tungsteno y para UV impara de deuterio). 2. Sistema éptico necesario para seleccionar una determinada longitud de onda (colimador, monocromador, selector de longitud de onda). 3- Cubeta (recipiente donde se coloca la muestra a medir, para el visible debe ser de vidrio © de plistico; para UV de cuatzo). Muchas veces al camino dptico (b) se lo denomina ancho de la cubeta. 4. Detector (Fototubo). 5- Procesador y leetor de la sefial Selector de longitud Colimador de onda Detector |< Ho ea P Pp Fuente de luz Monocromador Solucion Pantalla digital 1 2 3 4 5. igura 10- Representacién esquemAtica de los componentes del Espectrofotémetro. 4 COMO PUEDO DETERMINAR LA CONCENTRACION DE UN ANALITO UTILIZANDO LA ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION MOLECULAR UV-VIS? 4.1- Utilizando la ley de Lambert y Beer Se aplica cuando se conoce el valor del coeficiente de Absortividad Molar para el analito que queremos cuantificar a la longitud de onda de trabajo y en la solucién utilizada (datos de bibliografia), Ein estos casos medimos la absorbancia de la muestra a analizar y utilizando la Ley de Lambert Beer podemos despejar el valor de la concentracién, Esta modalidad de trabajo es la que se utiliza para medit pigmentos en extractos vegetales 0 productos agroindustriales. 124.2- Utilizando el procedimiento de la curva de calibracién Se aplica cuando los valores del coeficiente de Absortividad Molar no se conoce y en los casos en los que se necesita realizar una reaccién previa para lograr que el analito se transforme en una especie absorbente. Fn la prictica generalmente cl analito no absorbe luz visible, pero es ficil transformarlo en una especie absorbente mediante una reaccién previa que lo transforme en un compuesto coloreado (por lo tanto que absorbe en el visible) En este procedimiento es necesatio prepatar una serie de soluciones de concentracién conocida del analito que queremos cuantificar, hacer la reaccién previa para generar el compuesto absorbente y luego medir la ABSORBANCIA de estas soluciones "TROFOTOMETRO UV-Vis. Tendremos entonces una tabla de datos correspondientes a pares ordenados (x,y) conocidos, los que podremos representar coloreadas en el ESI en un grafico de cjes cartesianos. En el ce de las X se representan las concentraciones conocidas de las soluciones y en el eje de (Figura 12) Y se representan las A medidas en el equipo Tabla de datos conocidos as y= 0,0135x-0,0038 (pares xy) 02 e068 Ppmanalito Abs ix 3 oss 0 og 2 00234 Od 5 00578 og « 8 0,0943, = w 10 0,1443, oe 150.1968 ° 5 10 15 20 0.05 ppm analito Figura 12- Representacién grifica de los datos de la tabla, La recta tiene una ecuacién asociada que es la que figura en el grifico. R? es un control estadistico de Ia curva de calibracién, debe set lo mas cercano 2 1 pos La recta de calibracién (curva de calibracién) obtenida sera nuestra referencia para transformar la medida de A de cualquier muestra desconocida en un valor de concentracién para el analito. Podemos hacerlo grificamente (interpolando el valor de A medido en la grifica) o bien despejando el valor de X que le corresponde a la medida Y (A), en la ecuacién de la recta de calibracién obtenida. Se utilizar las das formas de trabajo al resolver los problemas del euestionariay en el trabajo préctica de laboratorio. 3