ESCALADO EN LA PRODUCCIÓN DE UNA

POLIGALACTURONASA DE INTERÉS EN TECNOLOGÍA DE

ALIMENTOS

S.A.Maidana; E.R.Zubreski; V. P. Esteche;V. Fernández Muller; L. A. Brumovsky;

M.A. Martos

Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Ciencias Exactas,

Químicas y Naturales (FCEQyN). UNaM. Félix de Azara 1552. (3300) Posadas,
Misiones, Argentina, silvana.a.maidana@gmail.com

RESUMEN

Wickerhamomyces anomalus, levadura autóctona de la Provincia de Misiones,

Argentina, produce una poligalacturonasa (PGasa) en forma extracelular. Esta enzima es
capaz de desintegrar tejidos de mandioca, liberando los gránulos de almidón de su
interior. En estudios previos se optimizó, a escala frascos agitados, un medio de cultivo
de bajo costo y simple de preparar, compuesto por glucosa (FCE: fuente de carbono y
energía), pectina de citrus (inductor), urea, KH2PO4, MgSO4, CaCl2 y extracto de
levadura, pH 5,0, para la producción de la enzima.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el escalado del proceso de producción
de la enzima PGasa por W. anomalus, en el medio de cultivo optimizado, desde el cultivo
en frascos agitados a un biorreactor de laboratorio.
Los cultivos se realizaron en frascos Erlenmeyers de 500 mL, conteniendo 100
mL del medio de cultivo optimizado, a 30 °C y 180 rpm, hasta 16 h. Luego se escaló a un
fermentador de laboratorio de 5 L, conteniendo 3 L del mismo medio y bajo las mismas
condiciones de cultivo, a 450 rpm y con suministro constante de aire estéril (2,82 L/min).
La evolución del cultivo se siguió por medidas de densidad óptica, actividad PGasa,
glucosa residual y pH. Finalizado el cultivo, se centrifugó para remover las células de
levadura y obtener el sobrenadante, denominado extracto enzimático (EE). Luego, se
evaluó la capacidad del mismo de extraer almidón de mandioca. El proceso de extracción
se realizó en frascos Erlenmeyers conteniendo cilindros de mandioca cruda, EE y buffer
de reacción, a 40 ºC, 180 rpm, durante 6 h, pH 4,5. Se realizó una caracterización
microscópica de los gránulos de almidón.
En ambos cultivos, el microorganismo creció en fase exponencial hasta
aproximadamente las 10 h de cultivo. A partir de este tiempo entró en fase estacionaria,
en coincidencia con el agotamiento de la fuente de carbono y energía. La síntesis de la
enzima comenzó a las 2 h y estuvo asociada al crecimiento. Al finalizar el cultivo se
obtuvo un valor de actividad PGasa de 23,2 UE/mL, a escala frascos agitados y de 25,52
UE/mL a escala biorreactor. A partir de este momento, las medidas de actividad
enzimática del sobrenadante dieron valores constantes. El pH permaneció cercano a 4,0
durante el transcurso del proceso. El EE fue capaz de producir la lisis celular y la
liberación del almidón de su interior. El examen microscópico de los gránulos de almidón
de mandioca, presentaron una forma redonda y/o esférica, truncada en uno de sus
extremos y con un hilum o cruz de malta bien definido en el centro, sin evidenciarse daño
de los mismos.
La producción de PGasa mostró un aumento del 10% en el fermentador de
laboratorio respecto al cultivo realizado en frascos Erlenmeyers, demostrándose la
factibilidad de escalar la producción de la enzima PGasa por W. anomalus, en un medio
de cultivo simple y de bajo costo, para su futura aplicación en tecnología de los alimentos,
fundamentalmente en la extracción de almidón de mandioca, proceso de interés en la
Provincia de Misiones, Argentina.
Palabras claves: poligalacturonasa, escalado, producción enzimática, extracción de
almidón.

1. Introducción

Las enzimas pecticas o pectinasas son las responsables de la degradación de las

sustancias pécticas presentes en la laminilla media y en la pared celular primaria de las
plantas superiores. Según su modo de acción se clasifican en: poligalacturonasa (PG),
pectinesterase (PE), pectinliasa (PL) y pectatoliasa (PAL). Estas enzimas juegan un
importante rol en la industria de alimentos, principalmente en la maceración de tejidos
vegetales y en la clarificación de jugos de frutas y vinos, (Jayani et al. 2005; Tari et al.
2007; Rehman et al. 2012). Las enzimas pécticas son producidas por una gran variedad
de microorganismos como hongos filamentosos, levaduras y bacterias (Souza et al. 2003;
Anuradha et al. 2014). Las levaduras representan una fuente alternativa para la
producción a gran escala de enzimas comerciales. Las levaduras son organismos
unicelulares por lo que su crecimiento es relativamente simple y fácil de cambiar de escala
y a muchas de ellas se las considera como microorganismos GRAS (da Silva et al. 2005).
Wickerhamomyces anomalus, es una levadura autóctona aislada a partir de frutas
cítricas en la Provincia de Misiones, Argentina, y produce una PGasa extracelular (Martos
et al. 2013a; Martos et al. 2013b). Esta enzima es de gran importancia industrial ya que,
a diferencia de otras PGasas, posee la capacidad de desintegrar tejidos de mandioca,
produciendo la lisis celular, con la consecuente liberación de los gránulos de almidón de
su interior, proceso este de gran importancia en la Provincia de Misiones, Argentina. En
estudios previos se optimizó, el medio de cultivo para la producción de la enzima,
mediante diseños estadísticos, obteniéndose un medio de bajo costo y simple de preparar,
apropiado para procesos a mayor escala.
El presente trabajo tuvo como objetivo demostrar la factibilidad de escalar la
producción de la enzima PGasa por W. anomalus, en el medio de producción optimizado,
desde escala frascos agitados a un biorreactor de escala laboratorio.
2. Materiales y Métodos

Microorganismo
Wickerhamomyces anomalus, levadura aislada de cáscaras de frutas cítricas en la Facultad
de Ciencias Exactas Químicas y Naturales (UNaM) (Martos et al. 2013a).
Medios de cultivo
Medio de conservación (g/l): Extracto de levadura (Britania), 5; triptona, 5; glucosa
(Britania), 10; agar, 18, pH 5.
Medio de producción optimizado (MPO)(g/l): glucosa (Britania), 10; pectina (Parafarm),
6; urea, 1,4; extracto de levadura, 0,75(Britania); KH2PO4, 0,5; MgSO4, 0,25; CaCl2, 0,05;
pH 5,0.
La glucosa y la pectina, el sulfato de amonio, el fosfato, el resto de las sales (MgSO4,
CaCl2) y el extracto de levadura, fueron esterilizados por separado, en autoclave 15 min
a 121 ºC, previo ajuste del pH a 5,0. La urea fue esterilizada por filtración, utilizando
membranas de nitrato de celulosa de 0,22 μm de tamaño de poro (Sartorius). Antes de su
utilización, se mezclaron las cantidades correspondientes de cada una de las soluciones
en forma aséptica.

2.1.Producción de la enzima
a) Frascos agitados
Precultivos: se inocularon frascos Erlenmeyers de 500 ml que contenían 95 ml del medio
de fermentación (MPO), con 5 ml de una suspensión en agua destilada de la levadura
(Abs620=0,96), proveniente de una estría joven (24 h) en medio de conservación. Los
frascos Erlenmeyers se incubaron a 30 °C y 180 rpm, en baño termostatizado rotatorio
(MRC, TOU-50N, 25 mm de excentricidad), durante 20 h. Al cabo de este tiempo, los
cultivos se cosecharon por centrifugación a 2350 × g, durante 10 min. El sobrenadante se
descartó y las células se resuspendieron en 100 ml de agua destilada estéril.
Fermentación
Se inocularon frascos Erlenmeyers de 500 ml que contenían 95 ml de MPO, con 5 ml de
la suspensión de células proveniente del precultivo y se incubaron bajo las mismas
condiciones que las mencionadas anteriormente. En el transcurso de la fermentación se
tomaron muestras de 5 ml c/u a ciertos intervalos de tiempo, hasta las 16 h. Se midió
crecimiento microbiano por medida de DO a 620 nm, y luego las muestras se
centrifugaron para remover las células de levadura. El sobrenadante, denominado extracto
enzimático (EE) se utilizó para evaluar actividad PGasa y glucosa residual.
En todos los casos, las experiencias se realizaron por triplicado y se tomaron para los
cálculos valores promedios.
b) Fermentador escala laboratorio
Precultivos
Se inocularon cuatro frascos Erlenmeyers de 500 ml que contenían 95 ml del medio de
fermentación con 5 ml de inóculo (DO620 = 0,96) proveniente de un cultivo joven (24 h)
de W. anomalus en medio de conservación. Los mismos se incubaron a 30 °C con
agitación (180 rpm), durante 20 h. Al cabo de este tiempo, los cultivos (400 ml) se
cosecharon por centrifugación a 2350 × g, durante 10 min. El sobrenadante se descartó y
las células se resuspendieron en 100 ml de agua destilada estéril y constituyó el inóculo
para la etapa siguiente de fermentación.
Fermentación
Se utilizó un biorreactor de 5 l de capacidad (New Brunswick Scientific CO. INC.;
Edison, N. J., U. S. A.; Modelo MA 107), conteniendo 3 l de MPO. El fermentador se
esterilizó en autoclave (121 °C, 15 min) con la solución de glucosa y pectina a la que se
le agregó 300 μl de aceite de silicona como antiespumante (Sigma). El resto de las
soluciones de nutrientes y el inóculo, se mezclaron, antes de su utilización, en un frasco
Erlenmeyer de 1000 ml con salida lateral y se utilizó inmediatamente para inocular el
biorreactor e iniciar el proceso fermentativo. El cultivo se agitó a 600 rpm y se le
suministró aire estéril con un caudal de 2,82 l/min. Se tomaron muestras en función del
tiempo y se midió crecimiento microbiano por medida de DO a 620 nm. Luego las
muestras se centrifugaron y el sobrenadante (EE), se utilizó para medir pH, glucosa
residual y actividad PG.

2.2.Determinaciones analíticas
Medida de la actividad PGasa:
Se ensayó midiendo los grupos reductores liberados a partir de una solución de ácido
poligalacturónico 2 g/l (Sigma), en una solución tampón de acetato sódico/ácido acético
(BAc, 0,2 M, pH 5,0) usando el método Somogy-Nelson. La reacción se llevó a cabo a
37 ºC durante 10 minutos. Se realizó una curva de calibración usando ácido galacturónico
(GA) como estándar. Una unidad de PGasa se definió como la cantidad de enzima que
libera 1 μmol de GA por minuto (Herbert et al. 1971; Cavalitto et al. 2000; Ferreyra et al.
2002).
Determinación de biomasa:
El crecimiento microbiano (g/l) se siguió por medias de densidad óptica (DO) a 620 nm
y por peso seco.
Glucosa residual:
Se utilizó el método de glucosa oxidasa-peroxidasa (Glicemia, Wiener, Argentina).

2.3. Aplicación tecnológica de los extractos enzimáticos: Extracción de almidón

de mandioca
Se evaluó la capacidad del EE producido por W. anomalus de extraer almidón de
mandioca. Para ello, se utilizó mandioca variedad Concepción obtenida de un local
comercial de la ciudad de Posadas, Misiones. Las raíces de mandioca se lavaron bajo el
agua de canilla de manera que cualquier suciedad adherida a ella fuera eliminada, se
pelaron manualmente con ayuda de un cuchillo y se cortaron en láminas de 3 mm. El
proceso de extracción se llevó a cabo en frascos Erlenmeyers de 250 ml conteniendo 3 g
de material vegetal y 25 ml de EE (Dilución 1/10 con BAc, pH 5,0). Los frascos
Erlenmeyers se incubaron en baño termostatizado rotatorio (MRC, TOU-50N, 25 mm de
excentricidad) a 180 rpm, durante 6 h, a 40 ºC, dentro del rango de estabilidad de la
enzima (Martos et al. 2013b). La extracción se evaluó por examen microscópico de los
gránulos de almidón liberados, utilizando un microscopio de luz invertido OLYMPUS®,
modelo IX51® (Olympus América, Inc., Melville, NY, USA) y las imágenes se captaron
utilizando un aumento a 100× (Vargas Aguilar et al. 2012).

3. Resultados y Discusión

3.1.Producción de la enzima
En las Figuras 1 y 2 se presentan los perfiles de crecimiento, concentración
remanente de lafuente de carbono y energía (glucosa) y valores de actividad PGasa de los
cultivos realizados a escala frascos agitados y biorreactor, respectivamente. En la Tabla
1 se presentan los valores alcanzados de biomasa y actividad PGasa al finalizar los
cultivos.
 Figura 1: Producción de PGasa, biomasa y glucosa residual a escala frascos agitados

Figura 2: Producción de PGasa, biomasa y glucosa residual a escala fermentador de

laboratorio.

Tabla 1: Producción de PGasa a escala Erlenmeyer y fermentador

Volumen del Volumen del Biomasa PGasa
Escala
recipiente (ml) cultivo (ml) (g/l) (UE/ml)
Erlenmeyer 500 100 2,11 ± 0,485 23,2 ± 0.784
Fermentador 5000 3000 3,03 ± 0,905 25,52 ± 0.147

Las Figuras 1 y 2 muestran que, a ambas escalas, el microorganismo creció en

fase exponencial hasta aproximadamente las 10 h de cultivo, en coincidencia con el
agotamiento de la FCE. La síntesis de PGasa estuvo asociada al crecimiento de la
levadura, alcanzando un valor máximo de producción al finalizar la fase exponencial, a
partir de este momento, las medidas de actividad enzimática del sobrenadante dieron
valores constantes. El pH permaneció en valores cercanos a 4,0 durante todo el proceso.
Como se observa en la Tabla 1, la producción de PGasa alcanzó valores de 23,2
UE/ml a escala frascos agitados y de 25,52 a escala biorreactor. Esto indica que hubo un
aumento de casi el 10% en el fermentador de laboratorio respecto al valor alcanzado a
escala frascos agitados. Estos resultados están de acuerdo con los reportados por otros
autores(Kaur and Satyanarayana 2005; Sharma and Satyanarayana 2006).

3.2.Aplicación tecnológica de los extractos enzimáticos: Extracción de almidón de

mandioca
La Figura 3 muestra microfotografías del almidón extraído con el EE producido
por W. anomalus. Los tejidos vegetales mostraron lisis de la pared celular con liberación
de los gránulos de almidón.
Los gránulos de almidón presentaron una forma redonda y/o esférica, sin
evidenciarse daño de los mismos.

Figura 3: Microfotografía de la mandioca luego del tratamiento enzimático con PGasa

producida por W. anomalus

4. Conclusiones
El trabajo realizado demostró la factibilidad de escalar la producción de la enzima
PGasa por W. anomalus, en un medio de cultivo de bajo costo y de simple de preparar.
La producción de PGasa mostró un aumento del 10% en el fermentador de laboratorio
respecto a los cultivos realizados a escala frascos agitados.
La aplicación del EE obtenido sugiere que sería posible extraer almidón de
mandioca mediante el tratamiento del tejido vegetal con la PGasa producida por W.
anomalus, proceso este de interés en la Provincia de Misiones.

5. Agradecimientos
Este trabajo forma parte de un Proyecto financiado por la Secretaria de Políticas
Universitarias (Resol Nº SPU 4508/14) y el Consejo Interuniversitario Nacional (PDTS
Resol. Nº 1055/15).
 Los autores del trabajo cuentan con becas otorgadas por UNaM (Universidad
Nacional de Misiones), CEDIT (Comité Ejecutivo de Desarrollo e Innovación
Tecnológica) y el CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y
Tecnológicas).

6. Referencias

Aguilar, Pedro Vargas, Yorleny Araya Quesada, Raquel López Marín, Ana Ruth, and Bonilla Leiva. 2012. “Quality
Characteristics and in Vitro Digestibility of Sour Cassava ( Manihot Esculenta ) Starch Produced in Costa Rica”.
Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 3 (1): 1–13.

Anuradha, K, P Naga Padma, S Venkateshwar, and Gopal Reddy. 2014. “Selection of Nutrients for Polygalacturonase
Production by Aspergillus Awamori MTCC 9166 Using Plackett-Burman Design”. Indian Journal of Biotechnology,
13 (October): 502–7.

Cavalitto, S F, R A Hours, and C F Mignone. 2000. “Growth and Protopectinase Production of Geotrichum Klebahnii
in Batch and Continuous Cultures with Synthetic Media”. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 260–
65.

Da Silva EG, Borges MF, Medina C,Piccoli RH, Schwan RF. 2005. “Pectinolytic Enzymes Secreted by Yeasts from
Tropical Fruits” FEMS Microbiology Letter 5: 859–65. doi:10.1016/j.femsyr.2005.02.006.

Ferreyra, Oscar A., Sebastián F. Cavalitto, Roque A. Hours, and Rodolfo J. Ertola. 2002. “Influence of Trace Elements
on Enzyme Production: Protopectinase Expression by a Geotrichum Klebahnii Strain.” Enzyme and Microbial
Technology 31 (4): 498–504. doi:10.1016/S0141-0229(02)00146-1.

Herbert, D, P J Phipps, and R E Strange. 1971. “Chemical Analysis of Microbial Cells.”

Jayani, Ranveer Singh, Shivalika Saxena, and Reena Gupta. 2005. “Microbial Pectinolytic Enzymes : A Review” 40:
2931–44. doi:10.1016/j.procbio.2005.03.026.

Kaur, Parvinder, and T. Satyanarayana. 2005. “Production of Cell-Bound Phytase by Pichia Anomala in an Economical
Cane Molasses Medium: Optimization Using Statistical Tools.” Process Biochemistry 40 (9): 3095–3102.
doi:10.1016/j.procbio.2005.03.059.

Martos, María Alicia, Emilce Roxana Zubreski, Mariana Combina, Oscar Alfredo Garro, and Roque Alberto Hours.
2013a. “Isolation of a Yeast Strain Able to Produce a Polygalacturonase with Maceration Activity of Cassava Roots”
Food Science and Technology 33 (June): 332–38.

Martos, María A, Emilce R Zubreski, Oscar A Garro, and Roque A Hours. 2013b. “Production of Pectinolytic Enzymes
by the Yeast Wickerhanomyces Anomalus Isolated from Citrus Fruits Peels”. Biotechnology Research International.
1: 1-7.
Rehman, Haneef Ur, Shah Ali Ul Qader, and Afsheen Aman. 2012. “Polygalacturonase: Production of Pectin
Depolymerising Enzyme from Bacillus Licheniformis KIBGE IB-21.” Carbohydrate Polymers 90 (1). Elsevier Ltd.:
387–91. doi:10.1016/j.carbpol.2012.05.055.

Sharma, D. C., and T. Satyanarayana. 2006. “A Marked Enhancement in the Production of a Highly Alkaline and
Thermostable Pectinase by Bacillus Pumilus dcsr1 in Submerged Fermentation by Using Statistical Methods.”
Bioresource Technology 97 (5): 727–33. doi:10.1016/j.biortech.2005.04.012.

Souza, V B. 2003. “Screening of Fungal Strains for Pectinolytic Acti v Ity : Endopolygalacturonase Production by
Peacilomyces Cla v Isporus” Process Biochemistry, 39:455-458. doi:10.1016/S0032-9592(03)00092-X.

Tari C, Gögus N, Tokatli F. 2007. “Optimization of Biomass , Pellet Size and Polygalacturonase Production by
Aspergillus Sojae ATCC 20235 Using Response Surface Methodology” Enzyme and microbial Technology 40: 1108–
16. doi:10.1016/j.enzmictec.2006.08.016.