Producción de biosurfactantes por un suelo

cepa de pseudomonas que crece sobre hidrocarburos

aromáticos policíclicos.

E Deziel, G Paquette, R Villemur, F Lepine y J Bisaillon

Apl. Reinar. Microbiol. 1996, 62 (6): 1908.

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UN CUMPLIDO Y mi AMBIENTAL METRO ICROBIOLOGÍA, Junio de 1996, pág. 1908-1912 Vol. 62, núm. 6
0099-2240 / 96 / $ 04,00 1 0
Derechos de autor q 1996, Sociedad Americana de Microbiología

Producción de biosurfactantes por suelo Pseudomonas Presion

Cultivo de hidrocarburos aromáticos policíclicos
ÉRIC DÉZIEL, GILLES PAQUETTE, * RICHARD VILLEMUR,
FRANÇOIS LÉPINE, Y JEAN-GUY BISAILLON

Descargado de http://aem.asm.org/ el 29 de abril de 2014 por INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Centre de Recherche en Microbiologie Appliqu´ée, Institut Armand-Frappier,
Universit´é du Qu´ébec, Laval, Qu´ébec, Canadá H7V 1B7

Recibido el 9 de octubre de 1995 / Aceptado el 18 de marzo de 1996

Se investigó la capacidad de las bacterias que utilizan hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) para producir biosurfactantes. Veintitrés
bacterias aisladas de un suelo contaminado con desechos de petróleo pudieron formar zonas de limpieza en placas de agar de sal mineral rociadas
con soluciones de PAH. Se utilizaron naftaleno y fenantreno como únicos sustratos. La producción de biosurfactantes se detectó mediante
actividades de reducción de la tensión superficial y emulsionantes de 10 de estas cepas cultivadas en un medio salino limitado en hierro
suplementado con altas concentraciones de dextrosa o manitol, así como con naftaleno o fenantreno. Las determinaciones de glicolípidos
mostraron que en cultivos de Pseudomonas aeruginosa 19SJ sobre naftaleno, la productividad máxima de los biosurfactantes se retrasó en
comparación con la de los cultivos desarrollados en manitol. Sin embargo, cuando estaban presentes pequeñas cantidades de biotensioactivos e
intermedios de degradación de naftaleno al inicio del cultivo, el retraso se acortó notablemente. La producción de biosurfactantes estuvo
acompañada de un aumento en la concentración acuosa de naftaleno, lo que indica que el microorganismo estaba promoviendo la solubilidad de su
sustrato. También se produjeron cantidades detectables de glicolípidos en fenantreno. Este es el primer informe de producción de biosurfactantes
como resultado del metabolismo de PAH.

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son contaminantes ubicuos que se
producen principalmente como resultado de la combustión de combustibles fósiles y como
subproductos de actividades industriales. Dado que muchos son carcinógenos y
mutágenos conocidos o sospechosos, la exposición a los HAP puede representar un
riesgo significativo para la salud de las poblaciones humanas (43) y, por lo tanto, su
destino en la naturaleza es de gran preocupación ambiental. Se han descrito
microorganismos con capacidad para degradar muchos HAP y se han estudiado sus
mecanismos de acción (7).
La biorremediación de suelos contaminados con HAP se ve limitada por la escasa
disponibilidad de estos contaminantes hidrófobos para los microorganismos (24). Los
tensioactivos pueden ayudar, por solubilización o emulsificación, a liberar los
hidrocarburos absorbidos a la materia orgánica del suelo y aumentar las concentraciones
acuosas de compuestos hidrófobos, lo que resulta en mayores tasas de transferencia de
masa (1). Se encuentran resultados contradictorios en la literatura sobre los efectos de la
adición de tensioactivos sintéticos y biológicamente producidos sobre la biodegradación
de los HAP (33). Sin embargo, estudios recientes indican que pueden mejorar la
biodegradación de hidrocarburos al aumentar la accesibilidad microbiana a sustratos
insolubles (38,
decano porque no pudo secretar sus ramnolípidos extracelulares. Se ha sugerido
que la actividad estimulante del crecimiento de los biosurfactantes es más específica
para el sustrato hidrófobo utilizado para producirlo (3, 10) y está restringida
principalmente al organismo productor en sí (15, 18, 26).
Un mayor conocimiento sobre los mecanismos específicos que utilizan los
microorganismos para acceder a los HAP puede proporcionar información útil para
mejorar las aplicaciones de biodegradación de los HAP. Dado que el crecimiento
microbiano en hidrocarburos alifáticos inmiscibles en agua se ha asociado con la
producción de tensioactivos, estábamos interesados en averiguar si las bacterias
metabolizadoras de PAH podrían secretar agentes tensioactivos.
Nuestro objetivo es determinar si la producción de tensioactivos por
microorganismos metabolizadores de PAH es parte de su estrategia para crecer en
sustratos tan poco disponibles. Como primer paso hacia este objetivo, informamos
aquí el aislamiento de cepas bacterianas que producen tensioactivos mientras
crecen sobre naftaleno o fenantreno. Un estudio detallado de uno de los aislados, P.
aeruginosa 19SJ, se llevó a cabo.

45). Varios investigadores han estudiado la adición de biotensioactivos para mejorar

la biodegradación de los hidrocarburos (15, 17, 28, 45).
MATERIALES Y MÉTODOS

Se han descrito la composición, estructura y propiedades de una variedad de
tensioactivos producidos por bacterias, levaduras y hongos (2, 11). Entre los
biosurfactantes mejor estudiados se encuentran los ramnolípidos de Pseudomonas
aeruginosa ( 15). La mayoría de los compuestos tensioactivos extracelulares son
sintetizados por microorganismos que crecen sobre sustratos poco solubles,
principalmente norte-
alcanos (16). La producción de biosurfactantes a menudo se asocia con la capacidad
de los microorganismos para utilizar hidrocarburos como sustratos (18, 27). Koch y col.
(22) han aislado un mutante de P. aeruginosa PG201 que había perdido su capacidad
de crecer en hexa-
Fuente de microorganismos. Se aislaron bacterias de un arenero que recibió importantes cantidades de
desechos de refinería de petróleo durante la década de 1960. Cepas de referencia productoras de
biosurfactantes P. aeruginosa UG2 y PG201 se obtuvieron de H. Lee y JT Trevors (Universidad de Guelph,
Guelph, Ontario, Canadá) y J. Reiser (Instituto de Biotecnología, Zurich, Suiza), respectivamente.
Mantenimiento e identificación de bacterias. Los microorganismos se almacenaron en
2 70 8 C en glicerol y se subcultivó en placas de agar tríptico de soja (Difco) antes de su uso como inóculo. Los
aislados bacterianos seleccionados se caracterizaron mediante el uso de tiras API 20E (bioM´érieux Vitek, Inc.,
Hazelwood, Missouri) y varias pruebas fisiológicas y bioquímicas (23).
Aislamiento de microorganismos degradantes de PAH. Los aislados se sembraron en Bush-
agar nell-Haas (BH) (Difco) y se pulverizó (20, 37) con una solución madre de PAH al 2% en acetona. Los
presuntos usuarios de PAH se distinguieron por la formación de una zona clara o una coloración alrededor de las
colonias. Los experimentos con placas rociadas se realizaron por duplicado. La actividad de la naftaleno
dioxigenasa se detectó mediante la formación de colonias azul-índigo cuando se añadió indol (1 mM) al agar (9).

* Autor correspondiente. Teléfono: (514) 687-5010. Fax: (514) 686- La capacidad de crecer sobre naftaleno y fenantreno (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) Se confirmó
5501. Correo electrónico: Gilles_Paquette@IAF.UQUEBEC.CA. usando matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían

1908
V OL. 62, 1996 PRODUCCIÓN BIOSURFACTANTE POR SUELO PSEUDOMONAS PRESION 1909

25 ml de BH y se incuban en la oscuridad a 29 8 C y 150 rpm. La utilización de PAH se evaluó inicialmente

visualmente mediante la desaparición de cristales de PAH, cambios de color y aumento de la densidad óptica del
medio. Para la determinación de HAP residuales, los cultivos completos se ajustaron a pH 12,0 con NaOH 1 N
para evitar posibles interferencias de biosurfactantes como la formación de emulsiones, se extrajeron con éter
dietílico y se analizaron con un cromatógrafo de gases (Hewlett-Packard modelo 5890A) equipado con un
detector de ionización de llama.

Detección de actividad biosurfactante. Las bacterias que utilizan PAH se cribaron en primer lugar para determinar
la capacidad de producir tensioactivos mediante el cultivo en BH líquido suplementado con dextrosa al 2%. Muchos Pseudomonas
Se sabe que las cepas producen biosurfactantes en dextrosa, glicerol o manitol (31, 39). La prueba de caída-colapso se
utilizó para la determinación rápida de la disminución de la tensión superficial (19). La actividad emulsionante de los

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sobrenadantes de cultivo se estimó añadiendo 0,5 ml de líquido de muestra y 0,5 ml de hexadecano a 4,0 ml de agua
destilada. El tubo se agitó con vórtex durante 10 s, se mantuvo estacionario durante 1 min y luego se examinó
visualmente para determinar la turbidez de una emulsión estable.

Placas de agar azul que contienen bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (0,2 mg / ml; Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) y azul de metileno (5 metro g / ml) (34) para detectar la producción extracelular de glicolípidos con
dextrosa al 2% o manitol como sustrato. Los biosurfactantes se observaron mediante la formación de halos azul
oscuro alrededor de las colonias.

Producción y cuanti fi cación de biosurfactantes. El medio de sal mineral uti-

lizado para las placas de agar azul (34) se complementó con 10 mg de
FeSO 4 z 7H 2 O litro 2 1 para su uso como medio optimizado (denominado medio SWF) para la producción de
biosurfactantes en cultivos líquidos (pH 6,7). Condición de crecimiento
Las condiciones favorables para la producción de tensioactivos requieren una relación C-N elevada y
concentraciones limitantes de hierro (14). Por lo tanto, se utilizó como sustrato una alta concentración (2%) de HIGO. 1. Producción de biosurfactantes (glicolípidos) por P. aeruginosa 19SJ en medio de sal mineral SWF
manitol, naftaleno o fenantreno. Para la producción de biosurfactantes en PAH, las cepas se cultivaron primero con 2% de manitol. La incubación se realizó a 25 8 C con agitación a 200 rpm. OD, densidad óptica. Los niveles
en naftaleno para inducir sus genes catabólicos de naftaleno. El crecimiento se controló midiendo de biosurfactantes se expresan como equivalentes de ramnosa (RE).

ing el UN 600. La tensión superficial se midió mediante el método del anillo con un tensiómetro du Nouy (Fisher
Scienti fi c, Toronto, Ontario, Canadá).
Suponiendo que los tensioactivos secretados por nuestro P. aeruginosa fueron ramnolípidos, la
concentración de glicolípidos extracelulares se evaluó por triplicado midiendo la concentración de ramnosa con
un método de orcinol modificado (8, y emulsiones estabilizadas de hexadecano-agua. Formaron halos en placas de agar
22). Un volumen de 200 metro Se extrajo 1 ml del sobrenadante del cultivo acidificado tres veces con 1 ml de éter azul con dextrosa y manitol.
dietílico, y luego se reunieron las fracciones, se secaron y se resuspendieron en 1 ml de bicarbonato sódico 0,05
Estas 10 cepas también sintetizaron biosurfactantes con naftaleno o fenantreno
M. Un 200- metro l muestra fue tratada
con 1,8 ml de una solución de 100 mg de orcinol en 53% de H 2 ENTONCES 4 y hervida por 20
como único sustrato. Cuando se cultivó en medio SWF con 2% de naftaleno, se
min. Después de enfriar a temperatura ambiente durante 15 min, el UN 421 fue medido. Las concentraciones de observaron indicios de producción de biosurfactante dentro de los 3 días posteriores
ramnolípidos se calcularon a partir de curvas estándar preparadas con a la incubación. Se observó actividad emulsionante de hexadecano y la tensión
ramnosa y expresada como equivalentes de ramnosa (en miligramos por mililitro).
L-
superficial de los sobrenadantes del cultivo se redujo a entre 30 y 35 mN / m
Determinación de la solubilidad aparente del naftaleno. Para estimar el
efecto solubilizante de los tensioactivos producidos cuando las bacterias se cultivaron en naftaleno, las muestras
después de 4 a 6 días, dependiendo de la cepa. Las cantidades de biotensioactivos
de cultivo (1,3 ml) se centrifugaron a 3 gramo durante 30 min y se cuantificó la concentración de naftaleno producidas fueron, por tanto, suficientes para alcanzar la tensión superficial más
pseudosolubilizado a partir de 1 ml de sobrenadante. baja posible, la concentración micelar crítica.

Ensayo de hidrofobicidad de la superficie celular. Se utilizó un ensayo modificado de adhesión

microbiana a hidrocarburos (32) para determinar cambios en la hidrofobicidad de la superficie celular durante el
crecimiento en medio líquido SWF con naftaleno como sustrato. Se agitaron con vórtex hexadecano (0,5 ml) y
células lavadas (2 ml) en un tubo de ensayo. Después del equilibrio, se midió la pérdida de absorbancia de la
fase acuosa con respecto a la de la suspensión celular inicial y se estimó la hidrofobicidad calculando el
porcentaje de células adheridas al hexadecano. Los resultados informados son medios de mediciones
duplicadas.
Análisis de intermedios polares de naftaleno. La concentración de hidroxi
Los metabolitos aromáticos derivados de la degradación del naftaleno se determinaron mediante una adaptación
(13, 21) del método descrito en el Recuadro (6), que utiliza el reactivo de Folin-Ciocalteu. Se preparó una curva
estándar con salicilato de sodio y se estimó la concentración de intermediarios metabólicos como equivalentes
de salicilato en miligramos por mililitro.
RESULTADOS
Utilización de PAH. Veintitrés bacterias capaces de formar zonas de limpieza en
placas de agar BH recubiertas con naftaleno o fenantreno (designado PAH 1 cepas)
fueron aisladas. Los experimentos con cultivos líquidos de BH confirmaron su
capacidad para crecer en estos HAP como sustratos únicos. Todos los PAH 1 las
bacterias formaron colonias azul-índigo en placas que contenían indol, lo que indica la
presencia de actividad naftaleno dioxigenasa (10, 23). Las cepas de referencia
productoras de biosurfactantes UG2 y PG201 no aclararon las placas rociadas con
PAH ni convirtieron el indol en índigo. Todos los PAH 1 las cepas fueron pseudomonas fl
uorescentes.
Detección de la capacidad de producir biosurfactantes. Cuando se cultiva en BH
con 2% de dextrosa, 10 de los PAH 1 las cepas disminuyeron la tensión superficial del
medio de cultivo por debajo de 35 mN / m
La cepa que mostró la mayor productividad de biosurfactante se seleccionó para
un análisis más detallado. Fue identi fi cado como P. aeruginosa 19SJ. La Figura 1
muestra el perfil de producción de biosurfactante obtenido cuando esta cepa se
cultivó en medio SWF con manitol. Como se esperaba, dado que los biosurfactantes
son metabolitos secundarios, la producción máxima de glicolípidos comenzó cerca del
final de la fase de crecimiento exponencial.
Producción de biosurfactantes durante el crecimiento de PAH. En el estudio de
la producción de biosurfactantes en PAH con la cepa 19SJ, el inicio de los cultivos con
células lavadas en comparación con el caldo de cultivo completo afectó la cinética de la
producción de biosurfactantes, el comportamiento celular y la degradación del naftaleno.
La acumulación de glucolípidos (expresada como equivalentes de ramnosa) se retrasó
cuando se utilizaron células lavadas como inóculo (Fig. 2a) en lugar de caldo de cultivo
completo (Fig. 2b). Sin embargo, se secretaron suficientes glicolípidos al final de la fase
de crecimiento exponencial para provocar una caída importante en la tensión superficial
(Fig. 2a). La acumulación de productos de degradación de naftaleno en el sobrenadante
estuvo acompañada de una disminución del pH. En realidad, el principal metabolito fue
el ácido salicílico, según lo determinado por cromatografía de gases y espectrometría de
masas. Como se esperaba, Se observó un aumento en la solubilidad acuosa aparente
de naftaleno cuando las concentraciones de glicolípidos excedieron la concentración de
micelas crítica (que está indicada por la tensión superficial reducida). Debido a su
volatilidad, la concentración real de naftaleno solubilizado fue probablemente
ligeramente superior a la indicada por los datos obtenidos. La degradación bacteriana
del naftaleno no fue
1910 DÉZIEL ET AL. UN PPL. mi NVIRON. METRO ICROBIOL.

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HIGO. 2. Producción de biosurfactantes (glicolípidos) por la cepa 19SJ cultivada en 150 ml de medio SWF con 2% de naftaleno como sustrato. Los resultados mostrados son de un experimento de experimentos duplicados. (a)
Inoculación con células lavadas de 5 ml de un cultivo de 15 días. (b) Inoculación con 5 ml de un cultivo de 15 días. La incubación se realizó a 27 8 C con agitación a 200 rpm. OD, densidad óptica. Los niveles de metabolitos de
degradación de naftaleno se expresan como equivalentes de salicilato (EE); Los niveles de biosurfactantes se expresan como equivalentes de ramnosa (RE).

cuanti fi cado directamente por su volatilidad y utilización de concentraciones muy DISCUSIÓN

altas (20 g / litro). Por lo tanto, la degradación del naftaleno se muestra
indirectamente por la acumulación de glucolípidos e intermediarios metabólicos.
Las células lavadas de la cepa 19SJ se cultivaron en medio SWF con fenantreno al
2% en las mismas condiciones utilizadas anteriormente para el naftaleno. Después de 10
días de incubación, la prueba de colapso de gotas fue positiva y una emulsión de
sobrenadante y hexadecano fue estable. Sin embargo, las concentraciones de
biosurfactantes obtenidas fueron bajas (alrededor de 40 metro g de equivalentes de
ramnosa por ml; la tensión superficial mínima alcanzó alrededor de 45 mN / m, después
de 450 h de incubación) en comparación con las obtenidas con naftaleno.
La observación de las actividades tanto tensioactivas como emulsionantes indicó
que los biosurfactantes fueron producidos por 10 de 23 PAH utilizando cepas
bacterianas. Esta producción se observó cuando las células se cultivaron en
sustratos solubles, como manitol o dextrosa, o en PAH poco solubles, como
naftaleno o fenantreno. Nuestro método de selección de cepas probablemente
aseguró resistencia a altas concentraciones de naftaleno, que se ha informado que
es tóxico para muchas bacterias metabolizadoras de PAH (5, 25, 42).
Los biosurfactantes sintetizados por P. aeruginosa 19SJ son probablemente una
mezcla de ramnolípidos, los glicolípidos anfifílicos de superficie activa generalmente
secretados por P. aeruginosa ( 15,
V OL. 62, 1996 PRODUCCIÓN BIOSURFACTANTE POR SUELO PSEUDOMONAS PRESION
36). En consecuencia, esta cepa formó halos en placas de agar azul, que detectan la
producción de glicolípidos aniónicos extracelulares por Pseudomonas spp. (34). La
sobreproducción de biosurfactantes en manitol ocurrió cuando las células dejaron de
crecer. Esto era de esperar, ya que se requieren condiciones limitantes del crecimiento
para la producción de ramnolípidos por P. aeruginosa ( 14, 39).
El patrón de producción de biotensioactivo a partir de naftaleno en cultivos
inoculados con células 19SJ lavadas fue muy diferente al de los cultivos inoculados
con el caldo completo. La producción de biosurfactantes, como el crecimiento celular,
depende de la disponibilidad del sustrato. La solubilidad del naftaleno (31 mg / litro)
fue lo suficientemente alta como para permitir el crecimiento sin restricciones de las
células lavadas y no lavadas, como lo ilustra su aumento similar de turbidez (Fig. 2).
Sin embargo, a alta densidad celular, la disponibilidad de sustratos poco solubles se
vuelve limitante (40) porque los HAP se utilizan solo en estado disuelto (44). El hecho
de que la acumulación de glicolípidos comenzara más rápidamente cuando los
cultivos se inocularon con el caldo completo puede explicarse parcialmente por la
adición concomitante de biotensioactivos que podrían aumentar la disponibilidad de
naftaleno y por lo tanto la utilización bacteriana. El fluido de cultivo del inóculo
también puede haber contenido algunas cantidades de autoinductores difusibles que
se sabe que regulan la síntesis de ramnolípidos en P. aeruginosa ( 29). Por otro lado,
las células lavadas requerían una adaptación antes de alcanzar la etapa de secreción
máxima de surfactante. Se observó un aumento importante de la hidrofobicidad
superficial al inicio de la fase estacionaria de crecimiento, coincidiendo con la primera
etapa de producción de biosurfactante. Esto puede facilitar la adhesión celular y el
acceso a la naftalina, como sugiere la acumulación subsiguiente de intermedios de
degradación.
Se produjeron cantidades más pequeñas de glicolípidos a partir de fenantreno
que de naftaleno. Dado que es mucho menos soluble en agua (1,3 mg / litro) que el
naftaleno, es probable que las células requirieran más tiempo para adaptarse a la
utilización de este HAP poco accesible.
El fundamento de la producción de biosurfactantes en los HAP es que debe
estimularse a sí mismo mejorando la disponibilidad del sustrato. Se observó una
acumulación de metabolitos de degradación de naftaleno cuando las
concentraciones de glicolípidos en el medio comenzaron a aumentar abruptamente.
Esto puede explicarse por la creciente cantidad de naftaleno disponible debido al
efecto solubilizante de los biosurfactantes (como lo indica la concentración de
naftaleno pseudosolubilizado). Se han informado observaciones similares en
presencia de tensioactivos sintéticos (12, 25, 38).
La razón exacta por la que algunos microorganismos producen tensioactivos no está clara. Sin
embargo, las bacterias productoras de biosurfactantes se encuentran en concentraciones más altas
en suelos contaminados con hidrocarburos (30). En consecuencia, nuestros resultados también
sugieren que la capacidad de secretar agentes tensioactivos es una característica común entre las
bacterias del suelo que degradan los PAH.
Hasta ahora, los pocos investigadores que han buscado la producción de surfactante
por bacterias que degradan los PAH no han tenido éxito (35, 41). Se informó que UG2
exhibía alguna actividad emulsionante cuando se cultivaba sobre naftaleno (4), pero en
nuestras condiciones experimentales no podía utilizar naftaleno ni expresar ninguna
actividad naftaleno dioxigenasa. Hasta donde sabemos, este es el primer informe
publicado de microorganismos que producen compuestos activos en la superficie
mientras crecen en PAH. Se están realizando experimentos para caracterizar las
condiciones óptimas para la producción de biotensioactivo en PAH y para determinar el
papel potencial que pueden desempeñar los biosurfactantes en el metabolismo de los
PAH por parte del organismo productor.
1911
RECONOCIMIENTO
Agradecemos a Zeina Yared por su excelente asistencia técnica en la identificación bacteriana y
la detección de la utilización de PAH.
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