“Año del Fortalecimiento de la Soberanía Nacional”

UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA

HUMANA ESCUELA DE MEDICINA

HUMANA

INFORME DE LABORATORIO S3

DOCENTE:

CURSO: BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA.

TURNO:

INTEGRANTES:
 EFECTOS DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN PROCESOS
BIOENERGÉTICOS (COBAYOS)

EXPERIMENTO 1. CADENA RESPIRATORIA EN MÚSCULO DE COBAYO

INTRODUCCIÓN

La cadena respiratoria mitocondrial o cadena de transporte de electrones está embebida en la

membrana interna mitocondrial, y la constituyen cinco complejos multienzimáticos (I, II, III, IV y V o
ATP sintasa) y dos transportadores de electrones móviles (coenzima Q o ubiquinona y citocromo c).
Su principal función es el transporte coordinado de protones y electrones, para producir energía en
forma de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. El transporte de electrones genera energía que es
utilizada para transportar protones de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana situado entre
las membranas mitocondriales externa e interna. Este proceso genera un gradiente electroquímico de
protones, que es utilizado por el complejo V (ATP sintasa) para generar ATP a medida que los
protones fluyen de nuevo desde el espacio intermembrana a la matriz mitocondrial. El ATP generado
es exportado al citoplasma a través del transportador de nucleótidos de adenina (ANT).

PROCEDIMIENTO

A. Obtención del cofactor NAD+

1. Ponga a hervir 20 ml de agua destilada en un vaso de precipitación

2. Sacrificar un cobayo

3. Extraer enseguida los músculos de las patas y colóquelo en el vaso 5 a 10 minutos

4. Enfríe y vacíe el contenido a un mortero con 2 gramos de arena y triturar hasta obtener una masa
fina

5. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos

6. Separar el sobrenadante que contiene los cofactores y colóquelo en un recipiente con hielo

B. Obtención de enzima Lactato Deshidrogenasa y componentes

de la cadena respiratoria

1. Extraer el hígado de cobayo sacrificado y homogenizarlo en un mortero con

aproximadamente 2 gramos de arena

2. Añadir 6 ml de suero fisiológico (NaCl 0.9 %) y obtenga una pasta fina

3. Añadir otros 6 ml de suero fisiológico diluyendo la pasta

4. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos

5. Separar el sobrenadante que contiene la enzima en un tubo y dejarlo incubando a

temperatura ambiente por 15 minutos

6. Conserve la preparación en un recipiente con hielo. Marque el tubo con E

7. Para utilizar la enzima E dilúyala con buffer fosfato pH 7.2 a razón de 1 ml de E por 4 ml de
buffer

8. Con 2 ml, sin diluir de E, realice una centrifugación diferencial a fin de obtener núcleo y
mitocondrias

9. Armar el siguiente sistema:

1 2 3 4 5 6

Tubo ml ml ml ml ml ml

Enzima (E) 1 - 1 1 - -

Cofactor © 1 1 - 1 1 1

Núcleo - - - - 1 -

Mitocondria - - - - - 1

Lactato del 1 1 1 - 1 1
sodio al 2%

Azul de 1 1 1 1 1 1
metileno al
0.005%

Agua - 1 1 1 - -
destilada

10. Observar los cambios en las coloraciones

DISCUSIÓN

● Tubo 1: En este tubo si habrá reacción ya que hay enzima, sustrato, cofactor e
indicador (azul de metileno), se observa un tono incoloro.
● Tubo 2: En este tubo no habrá reacción ya que no hay enzima, solo hay cofactor, sustrato,
indicador y agua destilada. Entonces se mantiene el color azul.
● Tubo 3: Hay enzima, sustrato, indicador y agua destilada, por lo tanto si habrá
reacción y se observa un tono incoloro.
● Tubo 4: Hay enzima, cofactor, indicador y agua destilada. En este tubo no habrá
reacción ya que no hay sustrato (lactato de sodio)
● Tubo 5: Hay cofactor, núcleo, sustrato e indicador. No habrá reacción, ya que no hay enzima,
sigue el color azul.
● Tubo 6: Hay cofactor, mitocondria, sustrato e indicador. No habrá reacción ya que no hay
enzima. Sigue el color azul.

CONCLUSIÓN

En la primera parte de este experimento, gracias a hervir la pata de cobayo,ser mezclado con arena,
triturado y centrifugado se convierte en una textura pastosa, la cual nos da un cofactor, este es
imprescindible para el funcionamiento de una enzima. Después comprobamos si la reacción se daba o
no, en este punto del proceso, el color debería haber cambiado de azul a incoloro, sólo los tubos 1 y 3
nos arrojaron la reacción esperada por la presencia de la enzima, sustrato y cofactor. El color azul en
los tubos, se debe a que agregamos azul de metileno.

EXPERIMENTO 2. ACCIÓN DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN LA RESPIRACIÓN

CELULAR

INTRODUCCIÓN

Este tipo de inhibidores reciben este nombre porque su principal función es inhibir el transporte de
electrones en la cadena de la respiración. Los inhibidores del transporte de electrones más
comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria
donde actúan:
- Sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando la transferencia de electrones entre la flavina y
la ubiquinona. (Inhibidores del sitio I)
○ Barbitúricos, como el amobarbital
○ Piericidina A (antibiótico)
○ Rotenona (insecticida)
- Actúa bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1.
(inhibidores de sitio III)
○ Antimicina
- Actúan sobre el Hemo a3 de la citocromooxidasa impidiendo su interacción con el
oxígeno (inhibidores de sitio IV)
 ○ Cianuro
○ Monóxido de carbono
○ H2S

PROCEDIMIENTO

1. Separe el corazón de un cobayo y córtelo en pequeños trozos y colóquelos en un mortero

2. Agregue aproximadamente 2 gramos de arena y 5 ml de buffer fosfato pH 7.0 y

homogenícelo hasta obtener una pasta fina y agregue otros 5 ml de buffer fosfato pH 7.0

3. Incube esta mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, removiéndola con un agitador
cada 2 a 3 minutos

4. Separe el sobrenadante por centrifugación a 3000 rpm por 2 minutos y consérvelo en un tubo
sumergido en hielo. Rotular como PC (preparado de corazón)

5. Armar el siguiente sistema:

1 2 3 4 5

Tubo Ml Ml Ml ml ml

Preparación 1 1 1 1 1
de corazón

Succinato 1 1 - 1 1
de sodio 0.1
M

Malonato de - 1 - - -
sodio 0.1 M

Cianuro de - - - 1 -
potasio 1%

Bicloruro - - - - 1
de mercurio

Azul de 1 1 1 1 1
metileno al
0.005%

Agua 1 - 2 1 -
destilada

6. Mezclar los tubos. Añadir 1 ml de aceite mineral, suavemente por las paredes

7. Incubar a 37 °C por 30 minutos.

8. Observar los cambios de color.

DISCUSIÓN

● Tubo 1: En este tubo se utilizó preparación de corazón, sustrato, indicador y agua

destilada. Se observa que si hubo reacción (por el color).
● Tubo 2: Se utilizó preparación de corazón, sustrato, inhibidor competitivo reversible
(malonato) e indicador. No hubo reacción por el inhibidor competitivo (se une con enzima
en lugar del sustrato). Observamos un color azul.
● Tubo 3: Hay preparación de corazón, indicador y agua destilada. No habrá reacción ya que
no hay sustrato, se observa un color azul.
● Tubo 4: Hay preparación de corazón, sustrato, cianuro de potasio, indicador y agua
destilada. No hay reacción por el cianuro de potasio.
● Tubo 5: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor IRREVERSIBLE (HgCl 2)(Precipita
proteínas. No hay reacción, actúa a nivel de Complejo I y PDHasa El color azul intenso.

CONCLUSIÓN

- Como pudimos observar en el experimento, al momento de terminar la preparación de

corazón (PC) se coloca en 5 tubos de ensayo (previamente marcados) y a uno de ellos (el
N.º2) se le añade el sustrato, el indicador y además se le añade malonato (inhibidor
competitivo reversible) podemos observar que se mantiene de color azul lo que indica que no
tiene ningún tipo de reacción ya que el inhibidor actúa a nivel del complejo II lo que evita que
el 2,6-diclorofenol-indofenol se reduzca lo que ocasiona el color azul intenso. Luego a otro
tubo con el preparado de corazón (marcado con el N.º 5) al cual se le añadido sustrato y
enzimas, además de le añade un inhibidor irreversible (HgCl2) el cual actúa a nivel del
complejo I y PDHasa por lo que ocasiona que no ocurra reacción.

CUESTIONARIO

1. Haga un esquema de la cadena respiratoria con todos los complejos

La cadena respiratoria mitocondrial o cadena de transporte de electrones está embebida en la
membrana interna mitocondrial, y la constituyen 4 complejos multienzimáticos (I, II, III, IV y V) y
dos transportadores de electrones móviles (coenzima Q o ubiquinona y citocromo c).

★ Complejo I: NADH Deshidrogenasa CoQ reductasa. Cataliza la transferencia de

electrones desde NADH hasta la UQ (ubiquinona). Coenzima FMN. Bombea 4 H+
★ Complejo II. Succinato Deshidrogenasa. Este complejo participa en la transferencia de
electrones desde el succinato hasta la UQ. .NO BOMBEA e-
★ Complejo III: Citocromo c reductasa. Transfiere los electrones desde la coenzima UQ
reducida (UQH2) al citocromo c. Bombea 4 H+
★ Complejo IV: Citocromo c oxidasa. Es un complejo proteínico que cataliza la reducción
de cuatro electrones del oxígeno para formar agua. 2 centros de cobre. Bombea 2 H+
★ ATP sintasa: Enzima transmembranal que cataliza la síntesis de ATP a partir de ADP, un
grupo fosfato y la energía suministrada por un flujo de protones.

No unido a complejos: Coenzima Q y citocromo c. citocromo c transfiere los electrones de uno en

uno al cit a y al CuA.

2. ¿Cómo explica los resultados en el núcleo y en las mitocondrias?

No hay algo resaltante cuando incluímos el núcleo en los tubos de ensayo, excepto la mitocondria
que es el principal productor de especies reactivas de oxígeno durante los procesos normales
oxidativos del metabolismo, principalmente a través de las reacciones de óxido-reducción que
ocurren en los complejos de transferencia de electrones y que tienen al oxígeno como el último
aceptor de electrones.

3. ¿Cómo actúa la coenzima?

La coenzima se une a una enzima. La enzima capta su sustrato específico. La enzima ataca a dicho
sustrato, transfiriendo algunos de sus electrones. En realidad la unión de sustrato y enzima produce
una nueva sustancia.

4. En el esquema de la cadena respiratoria señale el lugar de acción de los inhibidores

COMPLEJOS FUNCIÓN INHIBIDORES

Complejo 1 NADH Interrumpir el paso de los Barbitúricos: Amobarbital Tiopental

Deshidrogenasa electrones del FeS(hierro Fenobarbital
azufre) a la coenzima Q Piericidina A: antibiótico Rotenona:
producto vegetal que se utiliza
como insecticida y veneno para peces.

Complejo 2 Bloquean la transferencia Carboxina

Succinato de los electrones a la Malonato
Deshidrogenasa coenzima Q
 Complejo 3 Bloquea el paso de Actimicida A: antibiotico
Ubiquinona: electrones al complejo de Dimercaprol: Utilizado en casos de
citocromo c citocromos b y c intoxicaciones con metales
oxidoreductasa
Complejo 4 Se combinan con el Sulfuro de hidrógeno
Citocromo oxidasa citocromo-oxidasa y Cianuro
bloquean la transferencia Monóxido de carbono
de electrones al oxígeno
Detienen por completo la
respiración

5. Si se usa el succinato, ¿qué complejo de la cadena

respiratoria está participando?

Participa en el complejo II mitocondrial. El complejo se

caracteriza por intervenir en el ciclo de Krebs y en la
cadena de transporte de electrones.

6. ¿Cómo actúa el malonato?

El malonato es un inhibidor competitivo de la reacción de la succinato deshidrogenasa y bloquea la

transformación del succinato a fumarato. El malonato bloquea el flujo de metabolitos a través del
ciclo, deteniendo completamente la oxidación del piruvato.

7. Explique la acción del bicloruro de mercurio

Es una sal de peso molecular 271,53, punto de fusión 276ºC y punto de ebullición 303ºC ; es
corrosivo y es soluble en agua, alcohol, éter y glicerina. El sublimado de HgCl2 es cáustico y es
irritante de las mucosas, por formación de albuminatos solubles. Los polvos de HgCl2 pueden
perforar la córnea por este motivo . Es muy tóxico para organismos acuáticos, y en la industria
agrícola es utilizado como fungicida e insecticida.
En la biología, este es un inhibidor enzimático irreversible, así que por esta razón la catalasa no
reacciona de alguna manera con el peróxido de hidrógeno. Por lo mismo, este causa náuseas, vómitos,
diarreas, daños renales, vómitos con sangre, hemorragia en el estómago, intestino y otros órganos. La
ingesta de 1 o 2 g causa casi siempre la muerte.

8. ¿A qué nivel actúa el cianuro?

Inhiben la citocromo oxidasa. Complejo IV: El CIANURO (CN- ), la AZIDA (base conjugada del
ácido hidrazoico y también un grupo funcional) y el CO (monóxido de carbono) se unen
al Cu (cobre) del complejo IV. Inhiben el paso final de los e- hacia el O2. Los dos primeros
reaccionan con la forma oxidada del Fe3 +, mientras que el CO lo hace con la forma reducida.

9. ¿Cuál es el rol del azul de metileno?

El azul de metileno se usa como tintura para teñir ciertas partes del cuerpo antes o durante la cirugía.
Su uso es principalmente como antiséptico tópico y cicatrizante interno. También se utiliza como
colorante en las tinciones para la observación en el microscopio, y para teñir resultados en los
laboratorios.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Rodwell V, Bender D, Botham K, Kennelly P, WEIL, P. Harper. Bioquímica Ilustrada 2016.

2. Berneth, Horst. Azine Dyes. Ullmann 's Encyclopedia of Industrial Chemistry. 2008.
3. Dr. Martin Alva. Versión 2.20.2.