UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA

ACADEMIA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

PRÁCTICA 2: EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO

LABORATORIO DE INGENIERÍA GENÉTICA

Elaboró:

Carrillo Ramirez Katerine Nayeli

Cerón Olvera Cecilia Guadalupe

Gómez Lugo Daniela Jaqueline

Malagón Chávez Enrique Antonio

Pérez González Omar

Introducción 2

Objetivo 3

Metodología 3

Material y equipo 3

Reactivos y soluciones 4

Evaluación de riesgo y COSHH 4

Procedimiento 5

Diagrama de flujo 6

Resultados 7

Discusión y conclusión 8

Referencias 10

1. Introducción

El ADN genómico constituye el total de la información genética de un organismo. El

genoma de casi todos los organismos está compuesto de ADN exceptuando a los virus
de ARN. Las moléculas del ADN genómico son generalmente muy grandes y están
organizadas en la mayoría de los organismos en complejos ADN-proteína
denominados cromosomas. El tamaño, número de cromosomas y naturaleza del DNA
puede variar entre los distintos organismos. El de los virus de ADN es relativamente
pequeño y puede ser de una sóla o doble cadena, lineal o circular. Todos los demás
organismos tienen DNA genómico de doble cadena. Las bacterias tienen un sólo
cromosoma circular. En las eucariotas, la mayor parte del DNA genómico se encuentra
dentro del núcleo en múltiples cromosomas lineales de diferentes tamaños.(Qiagen,
2022)

Al ser la molécula que contiene toda la información que compone a los distintos
organismos, los ácidos nucleicos son el elemento central de las diferentes técnicas y
estudios de la biología molecular. Con ellos es posible realizar diferentes análisis como
la reacción en cadena de la polimerasa, metagenómica, árboles filogenéticos, edición
genética, entre otras. Por ello, su correcta extracción y purificación es un proceso
fundamental para la ingeniería genética.

Los métodos más ampliamente usados para la extracción de ácidos nucleicos pueden
ser divididos en métodos de extracción orgánica (fenol/cloroformo), extracción
inorgánica (salting out) y extracción en fase sólida (en matriz). Para todos, existen 4
pasos básicos e indispensables: lisis celular por disrupción de las membranas,
deshidratación y precipitación de las proteínas celulares (desnaturalización proteica),
separación de las proteínas celulares y demás componentes de los ácidos nucleicos y
precipitación y disolución de los ácidos nucleicos. (EI-Ashram S. 2016).

En este caso, la lisis celular se llevó a cabo químicamente con un detergente, el dodecil
sulfato de sodio (SDS) que se encarga de romper la membrana celular compuesta
principalmente de lípidos, además, se incluye un buffer como el Tris-HCl para mantener
el pH de la solución y asegurar la estabilidad de las moléculas y EDTA, el cual es un
agente quelante que se encarga de atrapar el magnesio, el cual es un cofactor
indispensable para el funcionamiento de las DNasas. Posteriormente se centrifuga para
separar los componentes celulares de acuerdo a su densidad, yéndose al fondo los
elementos más pesados como los restos de la membrana celular. Después se utiliza la
mezcla cloroformo/isopropanol para separar por afinidad los compuestos de la célula,
siendo el ADN afín al alcohol, esté se separará y se suspenderá en el sobrenadante.
Finalmente con etanol se recupera el ADN ya que tiene una afinidad todavía mayor y
podemos volver a suspenderlo en agua destilada. (Promega, 2022).
2. Objetivo
● Extraer ADN genómico de microorganismo seleccionado.

3. Metodología
a. Material y equipo
Material

Microtubos de 1.5 mL estériles

2 Tubos eppendorf de 2 ml
1 juego de micropipetas P10, P200 y P1000
Puntas para micropipeta (10, 200 y 1000 μL)
Tina con hielo
Matraz de 1L
Papel aluminio
2 Vasos de precipitado de 100ml
2 Vasos de precipitado de 500ml
Espátula
Vidrio de reloj
Probeta de 100ml
Probeta de 50ml

Equipo
Minicentrifuga
Plato caliente con agitador.
Barra magnética.

b. Reactivos y soluciones
Tampón Tris-HCl 50 mM pH 8.5
Tripsina 1 mg/mL
 Tampón de extracción, (20 mM EDTA1.4 M NaCl y 100 mM TrisHCl pH8)
Solución SDS 10%
Isopropanol (temperatura ambiente)
Etanol 70% (temperatura ambiente)
Cloroformo
Acetato de amonio 3 M estéril.

c. Evaluación de riesgo y COSHH

Para el desarrollo de la práctica se manipulará una cepa de Salmonella enterica subs.

enterica serovar Senftberg Sal59. Esta se encuentra en el grupo de riesgo 2, ya que
presenta un riesgo individual moderado y riesgo poblacional bajo, existen medidas
preventivas y terapéuticas eficaces y su riesgo de propagación es limitado.
La infección por Salmonella (No tifoidea) es conocida como salmonelosis y
generalmente se caracteriza por la aparición brusca de fiebre, dolor abdominal, diarrea,
náuseas y a veces vómitos.
Para evitar la infección con esta bacteria es necesario contar con las siguientes
medidas de seguridad: 1) uso de guantes y cubrebocas que serán desechados al
término de la sesión, 2) uso de bata cerrada, 3) uso de lentes de seguridad, 4)
desinfección del material y superficies usadas con solución de hipoclorito de sodio al
5% por 10 minutos, 5) manipulación dentro de una zona aséptica y esterilización con
fuego de los instrumentos de inoculación y 6) lavarse las manos con solución de
alcohol al 70% antes y después de manipular al microorganismo.

d. Procedimiento
1. Resuspender células en 0.8 mL de tampón de CTAB pre-calentado a 55°C
2. Incubamos por 1h a 37° C con 1 μL de Tripsina. Durante la incubación mezclar
por inversión cada 20 min.
3. Restablecimos a temperatura ambiente e incubamos por 5 min en hielo.
4. Agregamos 400 μL de cloroformo/isopropanol (24:1) y mezclamos por inversión
durante 2 min.
5. Centrifugamos a 9000 x g a 4° C por 10 min.
6. Recuperamos sobrenadante.
7. Repetimos paso 4 a 6.
8. Agregamos 100 μL de acetato de amonio y mezclamos delicadamente (sin
vortex).
9. Se agregaron 2 volúmenes del sobrenadante de etanol (2/3 isopropanol) 100 %
a -20 °C.
10. Precipitamos sobrenadante a -20°C por una semana.
11. Centrifugamos nuevamente a 9000 x por 10 min.
12. Eliminamos sobrenadante (por decantación), lavamos con 1ml de etanol 70 % y
mezclamos.
13. Incubamos a temperatura ambiente por 5 min.
14. Repetimos paso 11 y eliminamos sobrenadante.
15. Secamos a temperatura ambiente.
16. Resuspendimos en 50 μL de agua destilada estéril.

e. Diagrama de flujo
4. Resultados
Se siguió todo el procedimiento descrito en el manual de laboratorio pero con
algunas modificaciones, al final se obtuvo un pequeño “moquito” que se
presume, es nuestro material genético. Aún no se puede saber si el material
extraído es totalmente puro o posee algunas impurezas como proteínas, para
ello primero se tendrá que hacer una electroforesis y después un conteo en
nanodrop.

5. Discusión y conclusión

La modificación de la metodología permitió la extracción de un pellet de ADN

genómico de Salmonella. Dentro del protocolo se utilizó isopropanol con la
finalidad de precipitar el ADN gracias a las interacciones electrostáticas que este
 solvente tiene con el agua, así mismo se lavó con etanol al 70% para eliminar
todas las sales presentes en el medio.

Aún se desconoce la integridad de la muestra de ADN, dado que esta se

evaluará en la siguiente práctica “Evaluación de la integridad y concentración de
ADN genómico”. Donde se evaluará la integridad a través de electroforesis en
gel de agarosa y su concentración mediante espectrofotometría.

6. Referencias

El-Ashram, S., Al Nasr, I., & Suo, X. (2016). Nucleic acid protocols: Extraction and
optimization. En Biotechnology Reports (Vol. 12, pp. 33–39). Elsevier BV.
https://doi.org/10.1016/j.btre.2016.10.001

Promega. (2022). DNA Purification. Consultado el 04 de marzo de 2022. Disponible en:

https://worldwide.promega.com/resources/guides/nucleic-acid-analysis/dna-purification/
#dna-purification-basics-610cd142-f329-4aa2-8446-8ddd6c7f02ab

Qiagen. (2022). What is Genomic DNA?. Consultado el 05 de marzo de 2022.

Disponible en:
https://www.qiagen.com/kr/knowledge-and-support/knowledge-hub/bench-guide/dna/intr
oduction/what-is-genomic-dna