Revista CENIC.

Ciencias Biológicas
ISSN: 0253-5688
editorial.cenic@cnic.edu.cu
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Cuba

Salgado Bernal, Irina; Cruz Arias, Mario; Durán Domínguez, María del Carmen; Oviedo, Ramona;
Carballo Valdés, María Elena; Martínez Sardiñas, Armando
Bacterias como herramientas potenciales en el mejoramiento de humedales artificiales para el
tratamiento de aguas
Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol. 41, 2010, pp. 1-10
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Ciudad de La Habana, Cuba

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 Bacterias como herramientas potenciales en el mejoramiento de humedales
artificiales para el tratamiento de aguas

Bacteria as potential tools in the improvement of constructed wetlands for wastewater

treatment

Irina Salgado Bernal1, Mario Cruz Arias1, María del Carmen Durán Domínguez2, Ramona
Oviedo3, María Elena Carballo Valdés1, Armando Martínez Sardiñas1
1
Facultad de Biología, Universidad de La Habana. Calle 25 # 455 entre J e I, Vedado, La
Habana (Cuba).
2
Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México. Paseo de la
Investigación Científica, Edificio E-3, Ciudad Universitaria, Coyoacán, D.F (México).
3
Instituto de Ecología y Sistemática (IES) (Cuba).

irina@fbio.uh.cu
 Bacterias como herramientas potenciales en el mejoramiento de humedales
artificiales para el tratamiento de aguas

RESUMEN
El trabajo trata una de las problemáticas actuales de mayor importancia: el tratamiento de
aguas residuales, tomando como referencia los sistemas de humedales artificiales o
construidos, los cuales representan una alternativa sostenible para la remoción de
contaminantes. No obstante, el papel de los microorganismos en estos sistemas no ha sido
totalmente estudiado. Teniendo estos elementos en cuenta, el objetivo del trabajo fue
obtener cepas bacterianas nativas con potencialidades para ser empleadas en el
bioaumento de humedales construidos. Se aislaron bacterias rizosféricas de plantas
hidrófitas de humedales naturales y se les realizó una batería de pruebas fisiológicas como
fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato (para el mejoramiento de las plantas
presentes en los sistemas de humedales) y acumulación de fosfato, reducción de nitrato,
oxidación de amonio, nitrito y amonificación (para la disminución o eliminación de fósforo y
nitrógeno). Se obtuvieron 58 aislados, con los cuales se alcanzaron los siguientes
porcentajes de respuestas positivas, para cada prueba: 79 % en fijación de nitrógeno, 17 %
en solubilización de fosfato, 60 % en acumulación de fosfato, 47 % en reducción de nitrato, 0
% en oxidación de amonio y nitrito y 67 % en amonificación. Como conclusión se cuenta con
aislados bacterianos nativos que podrían ser incorporados en humedales construidos para
mejorar el comportamiento de las hidrófitas en estos sistemas e influir directamente en la
remoción de nitrógeno y fósforo.
Palabras clave: tratamiento de aguas residuales, bacterias rizosféricas, humedales
artificiales, bioaumento

ABSTRACT
The present work approaches one of the most important current problems: the treatment of
wastewaters, taking as starting point the artificial or constructed wetlands systems, which
represent a sustainable alternative for removal of pollutants. Nevertheless, the rol of
microorganisms in these systems has not been completely studied. Taking these elements
into account, the objective of the work was to obtain native bacterial strains with potentialities
to be employees in constructed wetlands bioaugmentation. For that, rhizospheric bacteria
were isolated from hydrophyte plants present in natural wetlands and it were carried out a
battery of physiologic tests as nitrogen fixation and phosphate solubilization (for the
improvement of existent plants in wetland systems) and phosphate accumulation, nitrate
reduction, ammonium oxidation, nitrite oxidation and ammonification (for phosphorus and
nitrogen decrease or elimination). 58 bacterial isolates were obtained, with which the
following percentages of positive answers were reached, for each test: 79 % in nitrogen
fixation, 17 % in phosphate solubilization, 60 % in phosphate acumulation, 47 % in nitrate
reduction, 0 % in ammonium oxidation and nitrite oxidation and 67 % in ammonification.
These results are considered positive, because although in 2 tests it was not positive
answer, as conclusion of the work it were obtained native bacterial isolates that could be
incorporated in constructed wetlands, to improve the behavior of hydrophytes in these
systems and to influence in the nitrogen and phosphorus removal. For that reason the results
constitute an alternative proposal for the treatment of liquid residuals.
Key words: wastewater treatment; rhizospheric bacteria; constructed wetlands;
bioaugmentation
INTRODUCCIÓN
El agua, más que una parte esencial de nuestro planeta, es un elemento indispensable para
mantener la vida, el crecimiento y el desarrollo de los organismos vivos, por lo que la
protección y el saneamiento de este recurso natural constituyen prioridades para la
humanidad y en las que está comprometida la comunidad científica. La alarmante situación
de la contaminación de los recursos hídricos, representa un grave problema ambiental en el
contexto global como consecuencia de la industrialización, globalización, crecimiento
poblacional y urbanización,1 a lo que tributa el vertimiento directo de residuales domésticos
e industriales, sin tratar o con tratamientos deficientes, a los ecosistemas acuáticos.

La carga contaminante de las aguas residuales municipales, dada por la presencia de

materia orgánica, nutrientes (nitrógeno y fósforo), así como por cantidades traza de
compuestos recalcitrantes y metales2, representa un riesgo ambiental por el potencial
impacto que tiene sobre la calidad de las aguas receptoras,3 y por su acción directa en la
eutroficación (crecimiento de algas como resultado del exceso de nutrientes en los cuerpos
de agua).4

Se han empleado numerosas tecnologías para el tratamiento de las aguas contaminadas,

que incluyen fundamentalmente tratamientos físico – químicos, los cuales permiten la
remoción parcial de la carga orgánica, el nitrógeno y el fósforo, aunque el costo de los
reactivos que se utilizan es alto y la remoción de la demanda química de oxígeno es pobre,
por tanto, es deseable el empleo de otros procesos como los biológicos.5 Además, en los
momentos actuales es necesario que se implementen tecnologías óptimas desde el punto
de vista medio - ambiental y económico, sobre todo en países en vías de desarrollo.6

Actualmente se ha puesto gran énfasis en la biotecnología ambiental y el desarrollo

sostenible, en particular las técnicas biológicas pueden ser eficazmente aplicadas en la
remediación de aguas contaminadas.7 La estrategia de las tecnologías de biorremediación
es el uso de diferentes vías metabólicas y el incremento de los procesos de degradación
autóctonos para eliminar, o al menos, reducir las sustancias contaminantes indeseables.
Debido a que casi todos los productos naturales y un gran número de compuestos sintéticos
son degradados por las bacterias, independientemente de su peso molecular o complejidad
estructural, estos microorganismos se han convertido en un factor clave en la
biorremediación2,8,9,10 y desempeñan un papel importante en los sistemas ingenierizados
como las plantas de tratamiento de aguas.11

Existen bacterias con habilidad para solubilizar fosfato y también para acumular fuentes de
fósforo inorgánico a partir de soluciones acuosas y bacterias que participan en diferentes
transformaciones de fuentes de nitrógeno.

Existen numerosos métodos de tratamiento para eliminar el fósforo. En todos los casos es
removido por conversión de los iones de fósforo en el agua en una fracción sólida. Esta
fracción puede ser un precipitado de sal insoluble, una masa microbiana en un lodo activado
o una biomasa de planta en humedales construidos.4 Algunas bacterias tienen la habilidad
de tomar el exceso de ortofosfato y acumularlo como polifosfatos, entonces el fósforo es
removido con la biomasa en la planta de tratamiento de residuales. Existen numerosos
géneros reportados como organismos acumuladores de polifosfato (PAOs por sus siglas en
inglés), por ejemplo: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, grupo
Comamonas-Pseudomonas, grupo Flavobacterium-Cytophaga, Moraxella, Xanthomonas,
Paraecoccua, Bacillus, Corynebacterium y otras muchas bacterias G+ (han sido reportadas
que acumulan polifosfato en lodo activado).12

El nitrógeno total está comprendido por nitrógeno orgánico, amonio, nitrito y nitrato. Los dos
mecanismos para la remoción de nitrógeno son asimilación y nitrificación – desnitrificación.
Debido a que el nitrógeno es un nutriente, los microorganismos presentes en los procesos
de tratamiento pueden asimilar el nitrógeno amoniacal e incorporarlo en su masa celular.
Una porción de este nitrógeno amoniacal retornará al agua residual por la muerte y lisis de
las células. En la nitrificación – desnitrificación, al final se obtiene como producto gaseoso
dinitrógeno.3

Para la selección de microorganismos que puedan potencialmente influir sobre la

disminución de los compuestos de nitrógeno y fósforo inorgánico es importante estudiar la
capacidad para la acumulación de fósforo y la acción de los microorganismos en presencia
de distintas fuentes de nitrógeno inorgánico.13,14 Además para obtener cepas para el
bioaumento de sistemas de tratamiento como los humedales artificiales sería útil contar con
bacterias que influyan sobre la salud de las plantas, lo cual se puede lograr mediante el
estudio de las potencialidades de las bacterias para fijar nitrógeno y para la solubilización
del fosfato.

Los microorganismos rizosféricos, en particular, tienen una importante contribución en la

degradación y remoción de contaminantes;15 han sido reportadas numerosas bacterias
aisladas de la rizosfera de plantas por sus capacidades degradativas.16 Esto sugiere que la
introducción de este grupo de microorganismos, con características fisiológicas para la
eliminación de varios contaminantes, podrían incrementar la remediación en un sistema de
tratamiento determinado.17 Entre una de estas tecnologías se encuentran los humedales
artificiales o construidos, utilizados para tratar aguas de origen doméstico e industrial,
fundamentalmente. Estos sistemas imitan los principios de los sistemas naturales conocidos
como humedales naturales.18 Los humedales construidos representan una opción viable
para el tratamiento de las aguas residuales, a través de la intervención de diferentes
procesos físicos, químicos y biológicos que se llevan a cabo en él, siendo además sistemas
de fácil mantenimiento y operación.

El trabajo con estos sistemas y el papel de las biomasas bacterianas en ellos constituye una
de las temáticas priorizadas, debido a las ventajas que presenta la tecnología para el
tratamiento de residuales líquidos y específicamente el tratamiento de carbono orgánico,
nitrógeno, fósforo y su compatibilidad con el medio ambiente. La obtención y caracterización
de bacterias con potencial biorremediante es imprescindible para la posterior inoculación de
biomasas en sistemas de humedales construidos.

Teniendo en cuenta estos antecedentes el objetivo del presente trabajo fue: determinar las
potencialidades de 58 cepas bacterianas rizosféricas para la fijación de nitrógeno,
solubilización de fosfato, acumulación de fosfato y acción sobre diferentes fuentes de
nitrógeno, con el fin de ser propuestas como herramientas en el bioaumento de humedales
artificiales para el tratamiento de residuales líquidos.

MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas empleadas
Se emplearon 58 cepas bacterianas provenientes de la rizofera de plantas hidrófitas de la
especie (Typha dominguensis). Estas plantas se seleccionaron de humedales naturales de
Ciudad de La Habana, Cuba.

Aislamiento de bacterias rizosféricas

Las bacterias se aislaron de 3 humedales aledaños al río Almendares, ubicación por GPS:
Humedal 1- Lat.23º 02.323’ Long. 82º 24.002’, Humedal 2- Lat. 23º 02.863’Long.082º
23.443’, Humedal 3- Lat. 23º 03.318’Long. 082º 24.014’.

Se siguió el protocolo propuesto por Muratova et al., (2003).19 Se removió el suelo no

rizosférico de las raíces; la raíz con suelo rizosférico adherido se lavó en 100 mL de agua
destilada y se agitó por 30 minutos. Se dejaron sedimentar las partículas de suelo y con la
suspensión se prepararon diluciones seriadas de 10-1 a 10-7. Se plaqueron 3 réplicas de
cada dilución en agar nutriente y se incubó a 30 ºC (temperatura del lugar de muestreo) por
48 horas. Se seleccionaron las colonias con características visibles diferentes de cada
muestra y se conservaron en agar nutriente, plano inclinado, a 4 °C.

Determinación de la capacidad de fijación de nitrógeno

Se empleó el medio Feodorov´s Medium,20 el cual no presenta fuente de nitrógeno. Se
sembraron los aislados por estría y se incubó por 72 horas a 30 °C. La lectura de los
resultados se realizó por observación de la presencia o ausencia de crecimiento en el medio
empleado.

Determinación de la capacidad de solubilización de fosfato

Se empleó el Medio NBRIP-BPB,21 conteniendo fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2) y el indicador
bromofenol azul. Se sembraron los aislados en el medio y se incubó por 72 horas. Se realizó
la lectura mediante la observación de zonas de aclaramiento alrededor del crecimiento
bacteriano.

Determinación de la acumulación de fosfato

Se empleó un medio base líquido con 300 mg de fosfato de potasio.20 Se inocularon los
diferentes aislados, de manera individual y se dejaron en interacción con el medio 72 horas,
a temperatura de 30 ºC y 100 r.min-1. Se analizaron las soluciones antes y después de la
interacción con las bacterias, a través del método analítico del molibdato de amonio y el
cloruro estañoso.3, 22 Se realizó la lectura de las muestras en espectrofotómetro a 450 nm.

Determinación de la utilización de diferentes fuentes de nitrógeno

Reducción nitrato
Se utilizó el medio Agua de peptona nitrato.23 La prueba se reveló empleando los reactivos I
y II de Griess Ilosvay, zinc en polvo y observación de la campana de Durham contenida en
cada tubo de prueba.

Oxidación de amonio
Se empleó un Medio para Bacterias Oxidadoras de Amonio.20

Oxidación de nitrito
Se empleó un Medio para Bacterias Oxidadoras Nitrito.20

Amonificación
Se empleó un medio líquido con peptona y cloruro de sodio. Se incubó por 3 semanas y se
realizó la lectura de las soluciones en espectrofotómetro a 600 nm.20

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fijación de nitrógeno
La Figura 1 muestra que el 79 % de los aislados bacterianos presentaron la habilidad para
fijar nitrógeno atmosférico, resultado muy satisfactorio, pues esta es una acción que no
realizan todas las bacterias, solamente géneros y especies muy específicas y en este caso
se obtuvo que la mayoría de los aislados resultaron positivos para esta prueba. Los aislados
positivos, según la nomenclatura usada para identificarlos, fueron: TAN112, 113, 115, 116,
117, 118, 119, 1110, 1111, 1113, 1114, 1115, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 211, 213, 214,
215, 216, 217, 218, 219, 2110, 2111, 221, 223, 224, 227, 228, 229, 2211, 311, 312, 313,
315, 316, 317, 319, 3110, 322, 323, 325.

En la Figura 2 se observa cómo se detectó el comportamiento en el medio estudiado, a

través del crecimiento o no crecimiento en el mismo.
Figura 1. Porcentaje de cepas bacterianas aisladas de la rizofera de Typha dominguensis
con capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico. Aislados con respuesta positiva (gris
oscuro) y negativa (gris claro).

Figura 2. Fotos con resultados de crecimiento y no crecimiento, respectivamente, en medio

para fijación de nitrógeno.

La característica de fijación de nitrógeno es muy importante en microorganismos que se

pretendan emplear en el bioaumento de sistemas de tratamiento de aguas como los
humedales artificiales, pues las plantas no pueden realizar la fijación del nitrógeno
atmosférico, los únicos organismos en la naturaleza capaces de realizar esta función son los
microorganismos procariontes, ya sean aerobios o anaerobios.24 La fijación del nitrógeno
consiste en la reducción del nitrógeno gaseoso atmosférico a amonio, proceso catalizado
por la enzima nitrogenasa. De esta manera las bacterias nitrofijadoras benefician a las
plantas.

Los aislados bacterianos obtenidos no han sido identificados, pero probablemente dentro del
79 % que fijan el nitrógeno se encuentren algunas cepas bacterianas pertenecientes a los
géneros: Azotobacter, Azospirillum, Klebsiella, Clostridium, Methanococcus, bacterias de
vida libre fijadoras de nitrógeno,24 pues los aislados estudiados fueron obtenidos de la
rizosfera de plantas hidrófitas pertenecientes a humedales naturales.

Solubilización de fosfato

Los microorganismos solubilizadores de fosfato son abundantes en el suelo y pueden ser

aislados de la rizosfera de las plantas. Los resultados mostrados en la Figura 3 muestran
que la mayoría de los aislados no mostraron solubilización de fosfato, no obstante se
encontró un 17 % de los aislados que si mostraron esta habilidad. Como se muestra se
encontraron 2 categorías en la solubilización de fosfato: bacterias que acidificaron el pH del
medio y las que produjeron fosfatasas. Los aislados positivos en esta prueba fueron:
TAN112, 115, 1114, 227, 228, 229, 2211, 315, 317, 323.

Figura 3. Solubilización de fosfato por cepas bacterianas aisladas de la rizofera de Typha

dominguensis. Muestra el porcentaje de aislados que solubilizaron el fosfato, aislados que
solubilizaron fosfato con excreción de ácido y aislados con respuesta negativa a la prueba.

A B C

Figura 4. Fotos con resultados de solubilización de fosfato: solubilización de fosfato sin

excreción de ácido (A), solubilización con excreción de ácido (B) y control negativo (C).

En la mayoría de los ensayos realizados con bacterias solubilizadoras de fosfato la

eficiencia relativa de estas bacterias está basada en la disminución del pH, debido a la
producción de ácidos orgánicos en el medio circundante.21,25 En este caso el 10 % mostró
solubilización sin acidificar el medio y el 7 % solubilización y excreción de ácido.

El medio empleado para el ensayo contenía fosfato insoluble, específicamente fosfato

tricálcico y la indicación de zonas claras alrededor del crecimiento microbiano fue una clara
indicación cualitativa de la presencia de actividad solubilizadora de fosfato.

Es importante contar con este tipo de bacterias para mejorar la eficiencia de sistemas como
los humedales artificiales, donde las plantas tienen un importante papel en la remoción de
contaminantes. En el suelo existe una gran cantidad de fosfatos inorgánicos, los cuales son
inmovilizados y no se encuentran disponibles para las plantas, por tanto, la liberación de
formas de fósforo insolubles y fijadas al suelo constituye un aspecto importante para
incrementar la disponibilidad de fósforo en el suelo.21,25 La inoculación del suelo con
bacterias solubilizadoras de fosfato es conocido que mejora la solubilización del fósforo
fijado al suelo, lo que resulta en un mayor rendimiento de las plantas, acción que tiene lugar
en la rizosfera. Este principio ha sido muy utilizado en la agricultura, pero también podría
constituir un aspecto importante en los humedales artificiales, pues las bacterias
solubilizadoras podrían influir en un mejor desarrollo de las plantas presentes en estos
sistemas, lo que a su vez tributaría a una mayor eficiencia en los procesos de remoción de
contaminantes de las aguas residuales.

En la Figura 4 se muestran 3 fotos que muestra los diferentes resultados obtenidos y la

diferencia observada a simple vista entre las bacterias solubilizadoras de fosfato sin
excreción de ácido y las que excretan ácido, pues el medio azul, alrededor del crecimiento,
se torna amarillo debido a la disminución del pH. Los microrganismos solubilizadores
obtenidos tienen una acción marcada sobre el medio NBRIP-BPB, pues como se observa en
las fotos las zonas de aclaramiento observadas fueron amplias y notables si se comparan
con el color inicial del medio.

Disponer de cepas microbianas que integren más de una característica fisiológica y/o
bioquímica, resulta beneficiosa para su futura aplicación en la biotecnología ambiental. El
análisis integrado, en la presente investigación, permitió identificar 10 bacterias rizosféricas
(TAN112, 115, 1114, 227, 228, 229, 2211, 315, 317, 323) que comparten en común la
capacidad de solubilizar fosfato y de fijar nitrógeno. Estas bacterias constituyen los mejores
candidatos por sus potencialidades para un desarrollo favorable de las plantas en los
humedales artificiales.

Interacción con fuentes de fósforo y nitrógeno por las 58 cepas rizosféricas

Los resultados en cuanto a la acumulación de fosfato por los 58 aislados bacterianos (Figura
5) muestran que el 60 % de estos fue positivo. Este resultado es un indicador de la
capacidad que pudiera tener la mayoría de las bacterias rizosféricas analizadas para la
eliminación de fosfato de las aguas residuales, como una alternativa viable en la
recuperación de este recurso natural.

Como se muestra en la Figura 5, el 47 % de los microorganismos mostró reducción del

nitrato, ya sea reducción parcial hasta nitrito o reducción total hasta dinitrógeno y además un
67 % utilizó nitrógeno orgánico. Estos resultados sugieren la posibilidad que pudieran tener
estas bacterias para eliminar estos compuestos, que constituyen contaminantes importantes
en los residuales. La respuesta negativa de las bacterias con respecto a la oxidación de
amonio y a la oxidación de nitrito, indica la no presencia de bacterias quimiolitotróficas entre
los aislados y además, evidencia la menor incidencia de este grupo microbiano en el
ecosistema analizado, lo que se puede corresponder con la poca probabilidad que tienen de
ser encontrados en la naturaleza.
Figura 5. Acción de las cepas bacterianas aisladas de la rizosfera de Typha dominguensis
sobre fosfato, nitrato, amonio, nitrito y nitrógeno orgánico. Se representa el porcentaje de
cepas con respuesta positiva.

El análisis en conjunto de las cinco pruebas realizadas mostró que hay aislados que
presentaron diferentes actividades frente a los compuestos ensayados, los cuales
constituyen candidatos más completos para ser utilizados en la biorremediación de
nitrógeno y fósforo, contaminantes que contribuyen a la eutrofización de las aguas; entre
ellos destacan los clasificados como TAN229, TAN119 y TAN315, pues mostraron
resultados positivos en 3 de las pruebas.

Estos aislados, a diferencia de los seleccionados en los ensayos de fijación de nitrógeno y

solubilización de fosfato, podrían contribuir directamente a la disminución o eliminación de
fuentes contaminantes de fósforo y nitrógeno en aguas residuales, pues la acción mostrada
por estos 3 aislados se basó en la utilización de un compuesto específico. Estas bacterias
se podrían inocular en humedales artificiales para potenciar la biorremediación mediante su
acción directa sobre los contaminantes. En el caso de los aislados con habilidad para la
fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato podrían constituir herramientas para la
potenciación indirecta de la biorremediación, a través de sus contribuciones a las plantas
presentes en los sistemas de tratamiento.

CONCLUSIONES

• El 79 % de los aislados bacterianos obtenidos mostró habilidad para la fijación de

nitrógeno atmosférico y el 17 % mostró solubilización de fosfato, constituyendo estos
aislados candidatos para el mejoramiento de las plantas presentes en sistemas de
humedales artificiales, destacándose entre ellos los aislados TAN112, 115, 1114,
227, 228, 229, 2211, 315, 317 y 323, por su doble habilidad para realizar las dos
acciones.
• Gran parte de los aislados mostraron respuesta positiva en la acumulación de
fosfato, reducción de nitrato y amonificación, los cuales podrían ser potencialmente
empleados en el bioaumento de humedales artificiales para la eliminación de
nitrógeno y fósforo, destacándose TAN229, TAN119 y TAN315, pues mostraron
resultados positivos en las tres pruebas.
• Los aislados TAN 229 y TAN 315 constituyen herramientas potenciales para su
futuro empleo en la biorremediación de aguas residuales a través del bioaumento de
humedales artificiales, pues mostraron respuestas positivas en todas las pruebas
 realizadas, ya sea en función de mejorar el desarrollo de las plantas o en la
eliminación de nitrógeno y fósforo.

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