1 Tinción de Gram

Gram, bacteriológo dinamarqués, descubrió en 1884, que algunos gérmenes (Gram

positivos) contienen ciertos elementos químicos en gran cantidad, peptidoglicano, en su
membrana dispuestos estructuralmente en forma muy diferente a la de otros (Gram
negativos) y forman con los colorantes derivados de la rosanilina (violeta de genciana,
cristal violeta) más el yodo, un compuesto que resiste la acción de decolorantes (alcohol
absoluto, alcohol acetona).

En consecuencia aplicando éste método de coloración diferencial los gérmenes que

contienen esos elementos químicos quedan coloreados violeta y se denominan Gram
positivos, aquellos que los contienen en pequeña cantidad se decoloran y para observarlos
es necesario teñirlos nuevamente, para este fin se utilizan colorantes como la fucsina y la
safranina y se denominan Gram negativos.

MATERIAL:

Porta objetos
Asa de platino
Equipo de tinción de Gram
Muestra Clínica (exudado Nasal, faríngeo, u ótico)

TECNICA:
1. Se toma una pequeña alicuota de la muestra.
2. Se realiza una extensión en un portaobjetos limpio y desengrasado.
3. Dejar secar el frotis. Y fijarlo por calor.
4. Colocar en una varilla de tinción; y agregar Cristal Violeta y dejar actuar por 1 a 2
minutos.
5. Enjuagar al chorro de agua.
6. Agregar la solución de Yodo-Lugo. Y dejar actuar por 30 segundos.
7. Enjuagar al chorro de agua.
8. Decolorar con alcohol-cetona durante 30 segundos.
9. Enjuagar al chorro de agua.
10. Agregar safranina y dejar por 15 a 20 segundos.
11. Enjuagar al chorro de agua.
12. Dejar secar al aire libre, o colocar el frotis en un papel absorbente.
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13. Agregar una gota de aceite de inmersión.
14. Observar al microscopio en objetivo 10x para observar el campo y pasar a objetivo de
100x sin pasar por objetivo 40X.

2 Tinción de Zielh Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen demuestra la capacidad que tienen algunas bacterias teñidas

de resistir a la decoloración por ácidos y alcoholes. Esta propiedad de algunas
micobacterias y actinomicetos se correlaciona con el alto contenido en lípidos de su
envoltura celular, que confiere un ambiente muy hidrófobo. Además, estos grupos poseen
unos lípidos característicos llamados ácidos micólicos que aumentan este carácter
hidrófobo.

MATERIAL:

Porta objetos
Asa de platino
Muestra de Espectoración
Equipo de tinción de Ziehl-Neelsen

La tinción Ziehl-Neelsen requiere tres colorantes:

1. Mezcla de fucsina-fenol: capaz de teñir las células en caliente. El fenol facilita la

penetración de la fucsina en la envoltura celular.
2. Decolorante orgánico: mezcla de ácido y alcohol.
3. Colorante de contraste: azul de metileno.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes, tras la unión de la fucsina, resisten el tratamiento

orgánico y se verán teñidas de rosa. El resto de las bacterias se decolorarán y se
contrastarán con el azul de metileno.

1. Prepara un frotis con la muestra.

2. Cubrir completamente con carbolfucsina la preparación.
3. Calentar la preparación cuidadosamente en un mechero Bunsen (puede ser a baño
maría, o bien en plancha electrica), sin que hierva la muestra durante 5 min.
También puede utilizarse una parrilla electrica, o calentar en vapores de baño maría.
Nota: añadir más carbolfucsina conforme ésta se evapora; la preparación no debe
quedar seca en ningún momento.
4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
5. Decolorar con la solución ácido-alcohol hasta que la muestra adopte un color rosa
claro (unos 30 seg.)
6. Lavar con agua para detener la decoloración.
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7. Teñir con azul de metileno 1 min.
8. Lavar con agua el exceso de colorante.
9. Secar la preparación.
10. Examinar al microscopio. Anotar las diferencias existentes entre los dos grupos
bacterianos.

3 Tinción Negativa. Método de Gin.

MATERIAL Y EQUIPO: REACTIVOS:

• Portaobjetos • Agua destilada

• Asa bacteriológica • Azul de metileno

• Tinta china • Aceite de inmersión

• Mechero Bunsen MATERIAL BIOLÓGICO:

• Microscopio

• Puente de tinción

TÉCNICA:

1.- En un portaobjetos mezclar una gota de agua y una gota de tinta china.

2.- Añadir una asada de la bacteria y hacer una suspensión con la mezcla.

3.- Extender la suspensión suavemente por el portaobjetos.

4.- Secar al aire el frotis. No fijar a la llama.

5.- Contrateñir con azul de metileno.

6.- Lavar con agua corriente y dejar secar. Observar con aceite de inmersión.

INTERPRETACIÓN:

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 Las cápsulas se observan transparentes en un fondo negro y el cuerpo de la bacteria
se observa de color azul.

4 Método de Hiss
REACTIVOS:
MATERIAL Y EQUIPO:
• Azul de metileno
• Portaobjetos • Sulfato de cobre al 20%
• Asa bacteriológica • Aceite de inmersión
• Mechero Bunsen
• Microscopio MATERIAL BIOLÓGICO:
• Puente de tinción

TÉCNICA:

1.- Realizar un frotis.

2.- Teñir con azul de metileno durante un minuto.
3.- Lavar con agua corriente.
4.- Lavar con la solución de sulfato de cobre al 20%.
5.- Dejar secar y observar con aceite de inmersión.
6.- Anotar observaciones.

INTERPRETACIÓN: Las cápsulas se observan de un ligero color café.

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5 Método de Schaeffer – Fulton

MATERIAL Y EQUIPO: 5.- Lavar con agua corriente y dejar

secar.
• Portaobjetos
6.- Observar con aceite de inmersión.
• Asa bacteriológica
• Mechero Bunsen y lámpara de
INTERPRETACIÓN: Las esporas se
alcohol
observan como una estructura de
• Microscopio
color verde en el centro o en la orilla
de la bacteria.
REACTIVOS:
• Aceite de inmersión
• Verde de malaquita
• Safranina
• Desinfectante

• Puente de tinción

MATERIAL BIOLÓGICO:

1. Teñir con verde de malaquita.

2.- Calentar hasta emisión de vapores
de 3 a 5 minutos.
3.- Lavar con agua corriente durante
30 segundos.
4.- Contrateñir con safranina durante
1 minuto.

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