BACTERIOLOGÍA DETERMINATIVA (24981)

PRACTICA No.2.
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN GÉNERO Streptococcus y
Enterococcus

INTRODUCCIÓN

Reino: Bacteria, filo: Firmicutes, clase: Bacilli, orden: Lactobacillales, familia: Streptococcaceae,
género: Streptococcus.
Reino: Bacteria, filo: Firmicutes, clase: Bacilli, orden: Lactobacillales, familia: Enterococcaceae,
género: Enterococcus.

El género Streptococcus comprende un grupo heterogéneo de bacterias Gram positivas con

importancia en el campo médico y la industria. Los miembros de este género bacteriano son
cocos Gram positivos que generalmente se disponen en parejas o cadenas, no son mótiles,
no forman esporas y son catalasa negativo. La mayoría de las especies son anaerobios
facultativos, pero algunos crecen únicamente en atmosfera enriquecida con dióxido de
carbono (CO2)1. Sus exigencias nutricionales son complejas por lo que su aislamiento
requiere el uso de medios enriquecidos con sangre. Varias especies de estreptococos se
encuentran como flora microbiana normal de animales y humanos; sin embargo, algunas
especies pueden causar enfermedades.

Este género incluye tres de los patógenos más importantes de los seres humanos: el S.
pyogenes, S. agalactiae y S. pneumoniae2.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

- Observar y describir las características macroscópicas y microscópicas de las especies

de Streptococcus y Enterococcus.
- Seleccionar y realizar pruebas microbiológicas que permitan la identificación de
Streptococcus y sus especies.
- Diferenciar las especies bacterianas según las características bioquímicas.

CONTENIDO DE LA PRÁCTICA

Materiales y reactivos:

- Asa recta y curva - Encendedor

- Gradilla - Microscopio
- Elementos de protección personal - Aceite de inmersión
- Láminas portaobjetos - Solución salina estéril
- Coloración de Gram - Desoxicolato de sodio
- H2O2 al 3%
- Sensidisco: bacitracina, Optoquina, SXT

- Medios de cultivo: caldo tioglicolato, BHI salado 6.5% NaCl, agar sangre, caldo Mueller-Hinton,
agar bilis esculina, agar BHI salado (NaCl 6,5%), caldo BHI suplementado con PYR 0,01%, agar
base con telurito 0,8%.

TRABAJO DE LABORATORIO

Día # 1:

1. Limpiar, desinfectar y preparar el área de trabajo. Poner un retaso de papel Kraft en el mesón
y trabaje él.
2. A partir de la muestra entregada realizar frotis directo, colorear con Gram y observar al
microscopio morfología y agrupación. Describa lo que observa y realice el reporte.
3. Sembrar en los medios agar sangre utilizando el método de estrías por agotamiento.
4. Incubar los medios inoculados a 35°C por 24 horas en atmósfera de CO2.

Día # 2:

5. Luego de 24 horas de incubación, analizar e interpretar el crecimiento microbiano

observado: describir las características macroscópicas, microscópicas, presencia de hemólisis
y cambios bioquímicos en el medio.
6. Realice coloración de Gram para observar morfología y agrupación de los cocos.
7. Realice las pruebas de identificación de especies de Streptococcus.

Pruebas de identificación de Streptococcus

A. Catalasa: los Streptococcus no producen catalasa por ende todas las especies de este género
son catalasa-negativos.

- Procedimiento:
1. Poner una o dos gotas de H2O2 al 3% en una lámina porta objetos.
2. Tomar una colonia con un palillo y mezclarla con la gota de H2O2
3. Mezclar por 10 segundos y observar la producción de burbujas.
4. Utilizar como control positivo una cepa de Staphylococcus aureus.

- Resultado:
Catalasa positiva: producción de burbujas (producción de O2) al contacto de la colonia evaluada
con el H2O2 que confirma la producción de catalasa.
Catalasa negativa: ausencia de burbujas luego de 20 segundos de mezclar la colonia con el H2O2.
Aislamiento del género Streptococcus.
 B. Hemólisis: el crecimiento de los Streptococcus en agar sangre permite la visualización de la
hemólisis producida por diversas especies. La lisis de los eritrocitos es causada por una
exotoxina denominada estreptolisina (S y O)1. Basado en el tipo de hemólisis los
Streptococcus pueden agruparse en alfa, beta y gamma hemolíticos:

Hemólisis alfa (α): aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias con una coloración
verde.
Hemólisis beta (β): aclaramiento completo de la sangre alrededor de las colonias.
Hemólisis gamma (γ): no hay cambio en el medio alrededor de la colonia, no hay lisis de los
eritrocitos.
Doble zona de hemólisis: lisis completa alrededor de la colonia con una segunda zona de hemólisis
parcial alrededor de la lisis completa.

Nota: La hemólisis en medios de cultivo puede variar según el agar base y la fuente de sangre
utilizada. Por ejemplo; si se utiliza sangre equina los enterococos pueden ser α, β o γ-hemolíticos;
en medio con sangre humana son β-hemolíticos y en medio con sangre ovina γ-hemolíticos.

Pruebas para identificación de Streptococcus β-hemolíticos.

C. Prueba de aglutinación: permite la identificación de serotipos entre los Streptococcus β-

hemolíticos, que constituyen los patógenos humanos más frecuentemente aislados entre
los representantes de este género2,3. La mayoría de los Streptococcus β-hemolíticos poseen
antígenos de carbohidratos específicos que han sido utilizados para clasificarlos en
diferentes serotipos (grupos). Rebecca Craighill Lancefield (1895-1981), dedicó su vida al
estudio de este género bacteriano y con sus investigaciones demostró que los antígenos
estreptocócicos pueden extraerse en forma soluble e identificarse mediante reacciones de
precipitación con antisueros homólogos (específicos de antígeno)2,3,4.

El método de identificación de grupos utilizado en el BD BBL Streptocard Enzyme Latex Test

Kit implica la extracción enzimática de los antígenos y aglutinación con partículas de látex
(poliestireno) de color azul conjugadas con inmunoglobulinas (anticuerpos) de conejo
específicas del grupo permitiendo la identificación de los grupos A, B, C, D, F y G. Las
partículas de látex se aglutinan rápidamente en presencia del antígeno homólogo y no se
aglutinan en su ausencia.

Procedimiento:
Nota: Todos los componentes deben estar a temperatura ambiente antes del uso.
1. Resuspender los reactivos del kit mezclando cada frasco por inversión varias veces.
2. Marcar un tubo de ensayo para cada cepa aislada que se va a analizar.
3. Añadir 200 µL de enzima extractora a cada tubo.
4. Seleccione de 2 a 4 colonias β-hemolíticas con un asa de argolla y suspéndalas en la
solución de la enzima extractora del tubo de ensayo.
5. Incubar en un baño maría a 37°C por 10 minutos. Mezclar cada tubo a los 5 minutos de
incubación.
 6. Dispensar una gota de anticuerpo específico de cada grupo (anti-A, -B, -C, -D, -F y -G)
en círculos independientes de las tarjetas de análisis etiquetadas para cada cepa aislada
que se va a analizar (ver figura 1).
7. Añada una gota del antígeno extraído sobre cada gota de anticuerpo específico.
8. Mezclar las dos gotas con un palillo de madera cubriendo el área del círculo por
completo. Se debe usar un palillo nuevo para cada círculo (anticuerpo).
9. Agitar con cuidado las tarjetas para que la mezcla fluya lentamente sobre toda el área
de los círculos de análisis.
10. Observar si la aglutinación se produce en un tiempo máximo de 30 segundos

Figura 1. Tarjeta de análisis para la prueba de aglutinación.

Resultados:
Resultado positivo: aglutinación rápida y fuerte en 30 segundos con uno de los anticuerpos.
Aglutinación (débil) con más de un anticuerpo específico de grupo, con fuerte aglutinación con un
único anticuerpo, Streptococcus duales5.
Resultado negativo: ninguna aglutinación de las partículas de látex.
Resultado no concluyente:
- Si se observan una aglutinación débil o una reacción no específica (viscosidad) en el círculo de
análisis después de 30 segundos, el análisis se debe repetir con un subcultivo reciente. Si se
observa el mismo resultado después de repetir el análisis, se debe realizar un análisis bioquímico
para identificar la cepa aislada.
- Si el grado de aglutinación es similar en más de un grupo, es preciso comprobar la pureza del
cultivo usado para realizar el análisis. Si parece puro, repita el análisis y confirme la identificación
de la cepa aislada mediante análisis bioquímicos.

D. Susceptibilidad a la bacitracina: se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus

β-hemolíticos del grupo A ya que estos son sensibles a este antibiótico mientras que los del
grupo B son resistentes. El sensidisco de bacitracina se utiliza a una concentración de 0,04
U 6.

Procedimiento:
1. Tomar con asa recta una colonia pura y aislada de la cepa a estudiar y sembrar en agar
sangre con siembra masiva y uniforme utilizando media caja.
2. Colocar el disco de bacitracina en el centro de la siembra.
3. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas en aerobiosis.
 Resultados:
Bacitracina sensible: formación de halo de inhibición.
Bacitracina resistente: no hay halo de inhibición.

Nota: cualquier halo de inhibición frente a bacitracina debe considerarse como positivo para
Streptococcus del grupo A.

E. Susceptibilidad al trimetropin sulfametoxasole (SXT): la evaluación de la susceptibilidad

a SXT permite diferenciar los Streptococcus β-hemolíticos del grupo A y B, que son
resistentes a este antibiótico, de otros grupos (C, F y G) que son sensibles. Se utiliza un
sensidisco de SXT de concentración 1,25 mg de trimetropin y 23,75 mg de sulfametoxasole 6.

Procedimiento:
1. Tomar con asa recta una colonia pura y aislada de la cepa a estudiar y sembrar en agar
sangre con siembra masiva y uniforme utilizando media caja.
2. Colocar el disco de SXT en el centro de la siembra.
3. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas en aerobiosis.

Resultados:
SXT sensible: formación de halo de inhibición.
SXT resistente: no hay halo de inhibición.

F. Prueba de CAMP: se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus del grupo B

los cuales secretan una proteína llamada “factor CAMP” o β-lisina que interactúa con la β-
hemolisina producida y liberada por S. aureus produciendo una hemolisis mayor o sinérgica.
Para esta prueba se utiliza una cepa de S. aureus productora de β-hemolisina (β-lisina) que
se siembra en una sola estría y perpendicular a esta se siembra el aislamiento a evaluar.
Cuando el factor CAMP entra en contacto con la β-lisina de S. aureus se forma una cabeza
de flecha en el punto de unión de las dos estrías6. Esta prueba es altamente sensible, e
incluso cepas del grupo B no hemolíticas serán CAMP positivas.

Procedimiento:
1. Tomar con un asa de argolla una colonia de S. aureus productor de β-lisina y sembrar
una estría horizontal en la mitad de un agar sangre.
2. Tomar una colonia del aislamiento de a evaluar y sembrarlo en una estría recta
perpendicular a la siembra de S. aureus, sin unir las dos estrías (ver figura 2).
3. Usar control positivo (cepa de S. agalactiae productora de factor CAMP) y negativo (cepa
no productora de factor CAMP).
4. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas en aerobiosis.
Figura 2. Siembra de prueba CAMP en agar sangre. Estría de S. aureus
en la mitad del agar, estrías de controles positivo y negativo y cepa a
evaluar perpendiculares a la siembra de S. aureus.

Resultados:
Positivo: se observa una hemolisis en forma de cabeza de
flecha en la intersección de las dos estrías.
Negativo: no se observa la hemolisis en cabeza de flecha en la
intersección de las dos estrías.

Pruebas para identificación de Streptococcus α-hemolíticos.

G. Prueba de susceptibilidad a la Optoquina: es una sustancia química, clorhidrato de

etilhidrocupreína (optoquina). Es un derivado del alcaloide hidroquinina que se obtiene
mediante hidrogenación, desmetilación y etilación de la quinina6. Esta prueba se utiliza para
diferenciar entre S. pneumoniae y otras especies de Streptococcus α-hemolíticos (viridans).
La sensibilidad a la Optoquina prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana ya
que cambia la tensión superficial induciendo la lisis celular de las bacterias sensibles y se
produce una zona de inhibición por el contacto con esta sustancia5.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia pura y aislada de la cepa a estudiar, y sembrar en agar sangre con
siembra masiva y uniforme utilizando media caja.
2. Colocar el disco de bacitracina en el centro de la siembra.
3. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas con atmósfera de 5% de CO 2.

Resultados:
Optoquina sensible: formación de halo de inhibición de >14 mm. Positivo para S. pneumoniae.
Optoquina resistente: no hay halo de inhibición.

Nota:
-Si se presenta un halo menor a 14 mm (9 – 14 mm) se debe realizar la prueba de solubilidad en
bilis para confirmar la especie.
-Es importante tener en cuenta que para el crecimiento de S. pneumoniae es necesario proveer
atmósfera de 5% de CO2, por ende, la prueba de la Optoquina y otras utilizadas en la identificación
del neumococo se realizan proporcionando este requerimiento.

H. Prueba de solubilidad en bilis: esta prueba mide la capacidad de las células bacterianas de
sufrir un proceso de lisis en presencia de sales biliares en un tiempo y a una temperatura
específica. Permite la diferenciación entre S. pneumoniae soluble en bilis y otras especies de
Streptococcus α-hemolíticos insolubles. Para esta prueba se utilizan comúnmente las sales
biliares: desoxicolato de sodio (10%) o taurocolato de sodio.
 Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada de la cepa a evaluar con el asa recta e inocular dos tubos con
caldo Mueller-Hinton.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en atmósfera de 5% de CO2.
3. Luego de la incubación y con los medios turbios, adicionar 0,5 ml de desoxicolato de
sodio al 10% a un tubo y 0.5 ml de solución salina al tubo control.
4. Incubar de 35-37°C por dos horas en incubadora o baño maría.

Resultados:
Positivo: se presenta aclaramiento de la turbidez en el tubo de la muestra con desoxicolato de sodio
y no en el tubo control. El microorganismo es soluble en bilis lo que indica identificación de S.
pneumoniae.
Negativo: no hay aclaramiento en el tubo de la muestra con desoxicolato de sodio, indicando que
es un Streptococcus del grupo viridans

Pruebas para identificación de Streptococcus del grupo D y Enterococcus.

I. Prueba de bilis esculina: se basa en la capacidad de algunas especies como los

Streptococcus del grupo D y Enterococcus para hidrolizar esculina en presencia de bilis (1%
al 4%), produciendo glucosa y esculetina. La esculetina reaccionan con las sales de hierro
presentes en el medio para formar un complejo fenólico de color café/negro6.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada del microorganismo a evaluar con asa recta.
2. Sembrar en medio agar bilis esculina por agotamiento en medio servido en caja o en el
pico de flauta del medio en tubo.
3. Incubar a 35°C de 24 – 48 horas.

Resultado:
Positivo: se observa ennegrecimiento difuso en el pico del agar (tubo) o un halo marrón o negro
alrededor de la colonia en la prueba realizada en caja. Aislamiento presuntivo de Streptococcus del
grupo D y Enterococcus.
Negativo: no hay cambio de color.

J. Prueba de tolerancia al cloruro de sodio al 6.5%: permite la diferenciación entre los

Streptococcus del grupo D y los Enterococcus, ya que los últimos crecen en medios con alto
contenido de sal.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia del aislamiento a evaluar con asa recta e inocular un medio BHI salino
(6.5% NaCl).
2. Incubar a 35°C de 24-48 horas.

Resultados:
Positivo: crecimiento en el medio que se evidencia por turbidez.
Negativo: no hay crecimiento.

K. Prueba de hidrólisis de pirrolidonil-β-naftilamida (PYR): en esta prueba se detecta la

presencia de la enzima L-pirrilidonil arilamidasa o pirrolidonasa. Sirve para diferenciar
Streptococcus del grupo A y D, que hidrolizan el sustrato PYR, de cualquier otro estreptococo.
Se utiliza un agar como tripticasa de soya o caldo de enriquecimiento suplementado con el
sustrato PYR al 0,01%6.
Procedimiento:
1. Inocular 3 ml de caldo BHI suplementado con PYR al 0,01% con las colonias a evaluar.
2. Incubar 18-24 horas 35°C en aerobiosis.
3. Revelar con reactivo p-dimetilaminocinamaldehído (cianamaldehído).

Resultados:
Positivo: desarrollo de un color rojo alrededor del crecimiento al agregar el reactivo p-
dimetilaminocinamaldehído.
Negativo: no hay cambio de color al agregar el reactivo

L. Reducción del telurito: el crecimiento de aislamientos presuntivos de Enterococcus en

medio con telurito permite diferenciar el Enterococcus faecalis de E. faecium u otros
enterococos. La presencia de telurito de potasio en el medio inhibe la mayoría de los
gérmenes asociados a enterococos y la diferenciación se basa en la capacidad del
microorganismo para reducir el telurito de potasio en teluro. El teluro producido colorea las
colonias de negro.

Procedimiento:
Para esta prueba se utiliza un agar base suplementado con telurito de potasio al 0,8%.
1. Tomar una colonia con el asa y sembrar por agotamiento en el agar.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas.

Resultados:
Positivo: colonias negras (Enterococcus faecalis)
Negativo: ausencia de colonias o colonias blancas (Enterococcus faecium u otros enterococos)

M. Determinación de la susceptibilidad a antibióticos: permite la determinación del perfil de

susceptibilidad de un microorganismos identificado. Los agentes antimicrobianos utilizados
para las pruebas de susceptibilidad han sido agrupados según el CLSI * en grupo A:
evaluación primaria y reporte, grupo B: evaluación primaria opcional y reporte de forma
selectiva, grupo C: suplementarios reporte de forma selectiva y grupo U: suplementarios
solo para aislamiento de orina7. Aquellos antibióticos que hacen parte del grupo A y B, son
en general, los utilizados en las pruebas de susceptibilidad realizadas de rutina en el
laboratorio.

*
CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute.
 La susceptibilidad puede ser evaluada utilizando el método de difusión de disco (método
Kirby-Bauer o difusión en agar), al menos que se indique la necesidad de determinar la
concentración mínima inhibitoria (CMI) para un antimicrobiano (Revisado en referencia 7).

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Streptococcus spp. β-hemolíticos:

Grupo A: clindamicina, eritromicina, penicilina o ampicilina.
Grupo B: cefepime o cefotaxima o ceftriaxona; vancomicina.
Grupo C: ceftarolina, cloranfenicol, daptomicina, levofloxacina, linezolid, tedizolid.

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Streptococcus pneumoniae:

Grupo A: eritromicina, penicilina (evaluada con disco de oxacilina), SXT.
Grupo B: cefepime, cefotaxima, ceftriaxona, clindamicina, doxiciclina, levofloxacina, moxifloxacina,
meropenem, tetraciclina, vancomicina.
Grupo C: amoxicilina, amoxicilina-clavulanato, ceftarolina, cloranfenicol, linezolid, rifampicina.

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Streptococcus spp. Grupo viridans:

Grupo A: ampicilina y penicilina.
Grupo B: cefepime, cefotaxima, ceftriaxona, vancomicina.
Grupo C: ceftolozano-tazobactam, cloranfenicol, clindamicina, eritromicina, linezolid.

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Enterococcus spp.:

Grupo A: ampicilina y penicilina.
Grupo B: daptomicina, linezolid, tedizolid, vancomicina.
Grupo C: gentamicina, estreptomicina.
Grupo U: ciprofloxacina, levofloxacina, fosfomicina, nitrofurantoina, tetraciclina.

Procedimiento:
1. Suspender varias colonias en un caldo Mueller-Hinton suplementado con sangre lisada (2.5-
5%) y llevar a una turbidez de 0.5 escala Mcfarland.
2. Tomar un hisopo estéril de algodón y humedecerlo en el caldo Mueller-Hinton crecido a 0.5
Mcfarland.
3. Sembrar en un medio Mueller-Hinton con 5% de sangre usando el hisopo de algodón
humedecido realizando siembra masiva en tres direcciones.
4. Poner los sensidiscos.
5. Incubar a 35°C con atmosfera de CO2 cuando sea pertinente.
6. Medir los halos de inhibición.

Nota: revise el último reporte del CLSI-2019 que contiene los parámetros aceptados para definir
resistencia o sensibilidad a los antibióticos evaluados.
BIBLIOGRAFÍA

1. Murray, P., Rosenthal, K. y Pfaller, M. (2014). Microbiología médica. Barcelona:

Elsevier. Edición 8, capítulo 19.
2. Ryan, K., Ray, C. y Sherris, J. (2017). Microbiología médica Sherris. Nueva York:
McGraw Hill Medical. Edición 6, capítulo 25.
3. Carroll, K., Morse, S., Mietzner, S., Miller, S. (2016). Microbiología médica. Edición 27,
capítulo 14
4. Elliot, S.D. and Tai, J.Y. (1978). The Type-Specific Polysaccharides of Streptococcus
suis. J. Exp. Med.,148, 1699.
5. Facklam R. (2002). What Happened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and
Nomenclature Changes. Clinical Microbiology Reviews. p. 613–630 Vol. 15, No. 4
6. MacFaddin J.F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3era Edición. Médica Panamericana. Capítulo 1, 2, 4, 37; pag 73-
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7. CLSI, (2019). M100: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.
Edición 29.