UNIVERSIDAD INTERSERRANA DEL ESTADO DE PUEBLA - CHILCHOTLA

Ingeniería agroindustrial

Practica 2. Propiedades de las proteínas usadas para su cuantificación

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

PRESENTA:
Ricardo Martínez García
Diego Nahuacatl Hernández
Cristian Fabio Velásquez Ixtla
Julieta JHanet Teodoro Velásquez
Itzel Guadalupe Luna Reyes

Profesor:
Elena Escobar Garduño
Chilchotla, Puebla, 21 de febrero de 2022

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RESUMEN
Manejar en el laboratorio el método de Biuret para determinar proteínas Observar y determinar
experimentalmente el cálculo de absorbancia con el espectrofotómetro de cada solución, de igual
manera se busca obtener la concentración de proteínas en la clara de huevo, una vez diluido a 1:10 y
agregado el reactivo de Biuret para hacer la prueba de absorbancia lo cual se obtuvo un resultado de
0.404 nm por lo que nos ayudó de saber la concentración de proteínas de clara de huevo.

PALABRAS CLAVE
 Concentración de proteínas
 Absorbancia
 Espectrofotometría
 Cuantificación
 Absorción de luz.
 Reactivo de Biuret

INTRODUCCIÓN

¿Qué son las proteínas?

Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos que están unidos por un tipo de enlaces conocidos
como enlaces peptídicos. El orden y la disposición de los aminoácidos dependen del código genético de cada
persona. Todas las proteínas están compuestas por:

 Carbono
 Hidrógeno
 Oxígeno
 Nitrógeno

Y la mayoría contiene además azufre y fósforo. (dicionario)

Absorción en el ultravioleta (280 nm)

 Se considera que la cantidad de estos dos aminoácidos es siempre constante la absorbancia debe ser
proporcional a la concentración de proteína, es un método más rápido: requiere de muy poca cantidad
de proteína. El sulfato de amonio no interfiere mientras que en la mayoría de los métodos si existe
interferencia. La muestra no se destruye y puede ser usada en otros análisis.

Se puede hacer una corrección por presencia de ácidos nucleicos ya que estos tienen absorción máxima

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a 260 nm. Si se conoce la relación de absorción de la proteína a 280/260 nm es fácil distinguir la
interferencia de ácidos nucleicos. Varía la cantidad de aromáticos entre proteínas.

Biuret

Las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos forman un complejo púrpura-violeta con
sales de cobre en soluciones alcalinas. Es posible que el color se desarrolle por la formación de un ión
coordinado tetracúprico con dos grupos -CO-NHadyacentes.

Ventajas
Es el método más simple para medir la proteína total. Muy pocas interferencias de otros compuestos en
el desarrollo del color.

Limitaciones
Se requiere de 20-40 mg de proteína. Existen varios pigmentos que absorben a 540mm de longitud de
onda. La presencia de NH interfiere con la reacción. El color es diferente para cada proteína.
Interfieren lípidos e hidratos de carbono por formación de complejos con el ion coordinado.

– Lowry

Se basa en el desarrollo de un color azul debido a: 1) Reacción de Biuret. 2) Reducción del reactivo de
fosfomolibdeno-volframato por aminoácidos como tirosima y triptófano presentes en las proteínas.

Este método ha sido modificado muchas veces. La absorbencia se mide a 750 nm (alta sensibilidad o a
500 nm (baja sensibilidad) para proteinas concentradas. Se requiere de una curva patrón que es
recomendable hacer con la misma proteína. La sensibilidad va desde 0.2 ?g hasta 300 ?g.

Ventajas
Es el método más sensible 100 veces más sensible que el Biuret. Más omenos rápido(1 h)

Limitaciones
Requiere de muchos cuidados en la estandarización ya que 1) la intensidad del color varía entre
proteínas. 2) El color no siempre es proporcional a la concentración.

Existe interferencia de lípidos, sacarosa, amortiguadores del PH, monosacáridos y hexosaminas ya que
reaccionan con los reactivos de Lowry. Los sulfatos de amonio, los sulfhidrilos y los fosfatos también
interfieren en la determinación.

– Turbidimétrico

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Principio
Las proteínas se pueden precipitar con ácido tricloroacético, ácido sulfosalicílico o ferrocianuro de
potasio en ácido acético. Se produce turbidez que puede ser estandarizada a una temperatura,
concentración y tiempo de reacción para medirse a 600 nm. Se requiere de curva estándar. El intervalo
recomendado va de 0.5 a 1.5 mg de proteína.

Ventajas
Es el método más rápido (10 a 15 min)

Limitaciones
Tiene muchas limitaciones ya que no todas las proteínas precipitan en la misma forma en presencia de
ácidos. Otras sustancias como los ácidos nucleicos también precipitan en presencia de ácidos.

– Kjeldahl

Principio
Determina nitrógeno total tanto orgánico (nitrógeno amino y amido) como nitrógeno no proteico (urea,
aminoácidos, etc.). El método consiste en la digestión de la muestra con H2SO4, y la formación de
NH2OH que es recibido en ácido para finalmente titularlo con álcali de una concentración conocida.

Ventajas
Es el método más común y por lo tanto permite comparar fácilmente resultados con otros laboratorios.
Determina todo el contenido de nitrógeno del alimento. El nitrógeno no proteico puede ser analizado
después de precipitar la proteína con ácido tricloroacético.

Limitaciones
Puede haber pérdidas de nitrógeno debido a la temperatura de digestión y al catalizador. El contenido
de nitrógeno en la proteína puede variar considerablemente y por lo tanto el factor usado para convertir
nitrógeno a proteína.

El nitrógeno no proteico se debe tomar en cuenta ya que éste se mide junto con el proteico. Se usan
reactivos y condiciones un tanto peligrosas. El proceso es largo.

– Dumas

Principio
Mide nitrógeno total después de la combustión de la muestra (700-900°C). La medición de nitrógeno
elemental desprendido se hace volumétricamente en un nitrómetro.

Ventajas
Se pueden hacer análisis hasta en 10 min. con los equipos automatizados que existen en el mercado.

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Limitaciones
Se requiere de equipo muy costoso. La presencia de nitrógeno no proteico interfiere en las
determinaciones. (puentes para universitarios, 22)

Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un

sistema químico en función de la longitud de onda, de la radiación, y a las mediciones a una
determinada longitud de onda. La principal aplicación de la espectrofotometría es la determinación de
las concentraciones ya sea de sustancias químicas o de microrganismos presentes en una solución.
Cambia de luz debido a que la cantidad de luz es absorbida y la que se refleja es la que se nota a simple
vista. Una curva de concentración es la referencia construida con cantidades conocidas de una
sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas presentes en la muestra.

Linealidad es la capacidad del método analito para obtener resultados directamente proporcionales a la
concentración cantidad del analito en un rango definido. La cuantificación de proteínas nos sirve para
el control de calidad durante el flujo de trabajo de la biología molecular.

OBJETIVO GENERAL
Obtener la concentración de absorbancia de cada analito.

OBJETIVOS PARTICULARES
Obtener la concentración de proteínas de la clara de huevo.

MATERIAL.
1. Tubos de ensayo.
2. Gravilla.
3. Espectrómetro.
4. Reactivo de Biuret.
5. Celdas de espectrofotómetro.
6. Probeta.
7. Pipeta mecánica
8. Plato
9. Huevo
10. balanza analítica

MÉTODOS.

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Reactivos. El reactivo de Biuret preparado con 1.9 g de CuSO 4 pentahidratado, 3.35 g de Na2EDTA
disueltos en 350 mL de agua, posteriormente a la mezcla se le agregaron 100 mL de NaOH 5M y se
aforó a 500 mL con agua destilada (Janairo, 2022). La solución madre de proteína fue preparada a una
concentración de 30 mg/mL con peptona como proteína y agua destilada.
Preparación de diluciones. A partir de la solución madre se prepararon diluciones de 1 mg/mL, 5
mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL y 25 mg/mL, agregando la cantidad adecuada de solución
madre y agua destilada.
Cuantificación de proteínas por el método de Biuret. Para la cuantificación de proteínas se tomó 1
mL de muestra y se agregaron 4 mL de reactivo de Biuret, las soluciones fueron mezcladas y se
dejaron reposar 5 minutos a temperatura ambiente, la absorbancia a longitud de onda de 545 nm
(Janairo, 2022). Los datos fueron registrados en una tabla.
Cuantificación de proteína en clara de huevo. Para la cuantificación de proteínas en clara de huevo
se separó la yema de la clara, la clara fue pesada en una balanza analítica y posteriormente se hizo una
dilución 1:10 utilizando toda la clara y agregando la cantidad de agua necesaria para alcanzar un
volumen 10 veces mayor a la masa de la clara, la dilución 1:10 se coló en una gasa doblada, y se le
hizo la cuantificación de proteínas por el método de Biuret. La disolución de la clara a 1:10 quedo
dentro del método ya que no realizamos otra dilución se le agrego 10 veces su masa.

Análisis de datos.
Se utilizó el método de biuret para determinar la absorbancia de cada analito de igual forma se calculó
c 2∗v 2
los mililitros de agua y de solución madre con la formula V =
c1
C2= mg/mL
V2= Cantidad de solución a preparar
C1= cantidad de solución madre
Con ayuda del espectrofotómetro se calculó la absorbancia y asi obtener la curva de concentración de
proteínas del huevo.

RESULTADOS

Curva de calibracion pra cuantificacion de

Absorbancia a 540 nm

0.7
proteinas por Biuret
0.6
f(x) = 0.0203895161290323 x + 0.104066129032258
0.5 R² = 0.896448582903791
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30
Concentracion de proteinas (mg/mL)
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 Figura 1.grafico

Figura 2. Cálculos para hacer las diluciones.

.

Preparación de diluciones.

Tabla 1. Cálculos obtenidos

mL / mg mL de agua mL de solución absorbancia 545nm
madre
1 4.84 0.16 0.12

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5 4.17 0.88 0.168
15 2.5 2.5 0.394
20 1.67 3.33 0.429
25 0.84 4.16 0.659
10 3.4 1.6 0.404
Se tomaron los cálculos obtenido por la fórmula para calcular los mL de agua y de solución madre que
se necesitó para realizar cada dilución.
c 2∗v 2
Formula: V = = mL H 2 O = V2-V1
c1

C2= mg/mL
V2= Cantidad de solución a preparar
C1= cantidad de solución madre

Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

Para la cuantificación de proteínas se tomó 1 mL de muestra y se agregaron 4 mL de reactivo de

Biuret, las soluciones fueron mezcladas y se dejaron reposar 5 minutos a temperatura ambiente, la
absorbancia a longitud de onda de 545 nm.

Figura 3. Pruebas de Biuret.

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 Figura 4. Muestras para absorbancia.

Análisis de datos.

Se calculó la absorbancia con el espectrofotómetro una vez obtenido y recalcado los resultados en la
tabla 1 se realizó la gráfica de la curva de concentración figura 1, se obtuvo la ecuación de la recta
gracias al programa Excel para poder calcular la concentración de proteínas de cada muestra como se
muestra en la siguiente tabla 2.

Absorbancia Pendiente Constante Concentración

545nm
0.12 0.0204 0.1041 0.77941176
0.168 0.0204 0.1041 3.13235294
0.394 0.0204 0.1041 14.2107843
0.429 0.0204 0.1041 15.9264706
0.659 0.0204 0.1041 27.2009804
0.404 0.0204 0.1041 14.7009804

Cuantificación de proteína en clara de huevo.

Para la cuantificación de proteínas en clara de huevo se separó la yema de la clara, la clara fue pesada
en una balanza analítica y posteriormente se hizo una dilución 1:10 utilizando toda la clara y

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agregando la cantidad de agua necesaria para alcanzar un volumen 10 veces mayor a la masa de la
clara, la dilución 1:10 se coló en una gasa doblada, y se le hizo la cuantificación de proteínas por el
método de Biuret. La disulucion de la clara a 1:10 quedo dentro del método ya que no realizamos otra
dilución se le agrego 10 veces su masa.
El cálculo que e debe hacer es la ecuación de la recta para poder calcular la concentración utilizando
la fórmula de la recta y= mx + b una vez despejado x nos queda que x=(y-b)/m nos da la concentración
en mg/mL.
Y= absorbancia.
B= constante.
M= pendiente.
X= incógnita.

DISCUSIÓN
Los resultados que se obtuvieron son acordes a las proteínas de la clara de huevo así como se llevó
acabo correctamente cada uno de los cálculos correspondientes para realizar la gráfica de curva de la
concentración y comparando los resultados llegamos al concluido que se realizó bien la práctica. Se
requiere de 20-40 mg de proteína. Existen varios pigmentos que absorben a 540mm de longitud de
onda. La presencia de NH interfiere con la reacción. El color es diferente para cada proteína.
Interfieren lípidos e hidratos de carbono por formación de complejos con el ion coordinado. (puentes
para universitarios, 22)

CONCLUSIÓN
Realizamos el método de Biuret para determinar la absorbancia de cada dilución, para obtener la curva
de concentración así mismo obtuvimos la concentración gracias a la tabla 1 y los resultados obtenidos
se recalcaron en la tabla 2 por lo que se logró cuantificar las proteínas. En esta práctica se logró
cuantificar las proteínas de la clara de huevo por medio de la espectrofotometría y se nos hizo
interesante como es que el color de la muestra logra absorber la luz así obteniendo la absorbancia.

REFERENCIAS

Janairo, G., & Linley, M. (2022). Determination of the Sensitivity Range of Biuret Test for
Undergraduate Biochemistry Experiments. Retrieved 15 February 2022, from
http://ejournals.uniwa.gr/index.php/ejst/article/viewFile/713/71
dicionario. (s.f.). cuidateplus. Obtenido de que son las proteinas:
https://cuidateplus.marca.com/alimentacion/diccionario/proteinas.html
Janairo, G. L. (2022). Determination of the sensitivity Range of Biuret Test for Undergraduate
Biochemistry Experiments. e -Journal of Science & Technology.
puentes para universitarios. (21 de 02 de 22). /edukativos.com. Obtenido de Cuantificación de las
proteínas: https://edukativos.com/apuntes/archives/1937

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Anexos
espectrofotómetro

Chara de huevo

Reactivo de Biuret

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