norma UNE-EN 26461-1

española
ICS 07.100.20 Junio 1995

TÍTULO Calidad del agua

Detección y recuento de los esporos de microorganismos

anaerobios sulfito-reductores (clostridia)

Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido

(ISO 6461-1:1986)

Water quality. Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia). Part 1:
Method by enrichment in a liquid medium. (ISO 6461-1:1986)

Qualité de l'eau. Recherche et dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies sulfito-

réducteurs (clostridia). Partie 1: Méthode par enrichissement dans un milieu liquide. (ISO 6461-1:1986)

CORRESPONDENCIA Esta norma UNE es la versión oficial en español de la Norma Europea EN 26461-1
de fecha enero de 1993, que a su vez adopta íntegramente la Norma Internacional
ISO 6461-1:1986.

OBSERVACIONES

ANTECEDENTES Esta Norma Española ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN 77 Medio
Ambiente cuya Secretaría desempeña AENOR.

Editada e impresa por AENOR LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:
Depósito legal: M 18450:1995
9 Páginas

© AENOR 1995 Fernández de la Hoz, 52 Teléfono (91) 310 48 51 Grupo 9

Reproducción prohibida 28010 MADRID-España Telefax (91) 310 36 95
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD
EN 26461-1
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Enero 1993

CDU: 628.1/.3:620.1:543.39:579.852.13

Descriptores: Agua, calidad, ensayo de aguas, análisis, microbiológico, microorganismo, bacteria sulfito-re-
ductora, clostridium.

Versión en español

Calidad del agua

Detección y recuento de los esporos de microorganismos
anaerobios sulfito-reductores (clostridia)
Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido
(ISO 6461-1:1986)

Water quality. Detection and Qualité de l'eau. Recherche et Wasserbeschaffenheit. Nachweis

enumeration of the spores of sulfite-
reducing anaerobes (clostridia). Part 1:
Method by enrichment in a liquid
medium.
(ISO 6461-1:1986)
dénombrement des spores de micro-
organismes anaérobies sulfito-réducteurs
(clostridia). Partie 1: Méthode par
enrichissement dans un milieu liquide.
(ISO 6461-1:1986)
und Zählung der Sporen
sulfitreduzierender Anaerobier
(Clostridien). Teil 1:
Flüssigkeitsanreicherung.
(ISO 6461-1:1986)

Esta Norma Europea ha sido aprobada por CEN el 1993-01-20. Los miembros de CEN están sometidos al Regla-
mento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modifica-
ción, la Norma Europea como norma nacional.

Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales, pueden
obtenerse en la Secretaría Central de CEN, o a través de sus miembros.

Esta Norma Europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua reali-
zada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretaría Central, tie-
ne el mismo rango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria,
Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países
Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza.

CEN
COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN
European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
SECRETARÍA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles

© 1993 Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

EN 26461-1:1993 -4-

ANTECEDENTES

Esta Norma Europea es la adopción de la Norma ISO 6461-1.

La adopción de la Norma ISO 6461-1 fue recomendada por el Comité Técnico CEN/TC 230
Análisis del agua, bajo cuya competencia de ahora en adelante recae esta Norma Europea.

Esta Norma Europea deberá recibir el rango de norma nacional, bien por la publicación de un
texto idéntico, o bien por ratificación, lo más tarde en julio de 1993, y deberán ser retiradas
todas las normas nacionales en contradicción lo más tarde en julio de 1993.

La norma ha sido adoptada y conforme al reglamento de Régimen Interior de CEN/CENELEC,

los países siguientes deben poner esta norma en aplicación: Alemania, Austria, Bélgica, Dina-
marca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega,
Países Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza.

DECLARACIÓN

El texto de la Norma Internacional ISO 6461-1:1986 ha sido adoptado por CEN como Norma
Europea sin ninguna modificación.
 -5- EN 26461-1:1993

NORMA INTERNACIONAL ISO 6461-1:1986

Calidad del agua

Detección y recuento de los esporos de microorganismos
anaerobios sulfito-reductores (clostridia)
Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido

0 INTRODUCCIÓN
Los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) están ampliamente difundidos en el am-
biente. Están presentes en la materia fecal humana y animal, en las aguas residuales y en el suelo. A diferencia de
Escherichia coli y de otros organismos coliformes, los esporos sobreviven en el agua durante grandes períodos de
tiempo y son más resistentes que los organismos vegetativos en lo que respecta a la acción de los factores químicos
y físicos. De ahí que ellos puedan representar una señal de contaminación remota o intermitente. Incluso, dichos
microorganismos pueden ofrecer resistencia al cloro a los niveles que normalmente se utilizan en el tratamiento de
agua, y por tanto resultan útiles para las necesidades de control.

La Norma ISO 6461 está compuesta de las partes siguientes:

Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido.
Parte 2: Método de filtración por membrana.

1 OBJETO
Esta parte de la Norma ISO 6461 especifica un método para la detección y el recuento de los esporos de los micro-
organismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) por enriquecimiento en un medio líquido.

2 CAMPO DE APLICACIÓN
Este método es válido para todos los tipos de agua, incluyendo el agua turbia.

3 NORMAS PARA CONSULTA

ISO 3696 – Agua para uso en laboratorios. Especificaciones.

ISO 5667-2 – Calidad del agua. Muestreo. Parte 2: Guía general sobre las técnicas de muestreo.

ISO 5667-3 – Calidad del agua. Muestreo. Parte 3: Guía general para la conservación y manipulación de las muestras.

ISO 8199 – Calidad del agua. Guía general para el análisis microbiológico mediante la enumeración de microor-
ganismos en un medio de cultivo.

4 DEFINICIÓN
Para los fines de esta parte de la Norma ISO 6461, se aplica la definición siguiente:

clostridia: Microorganismos anaerobios sulfito-reductores que forman esporos y que pertenecen a la familia de
las Bacillaceae y al género Clostridium.
EN 26461-1:1993 -6-

5 PRINCIPIO
La detección de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) en un volumen específico
de una muestra de agua pasa por las etapas siguientes:

5.1 Selección de los esporos

La selección de los esporos presentes en la muestra se realizará mediante la aplicación de calor durante un período
de tiempo suficiente para destruir las bacterias vegetativas.

5.2 Cultivo de enriquecimiento

Se detectan y recuentan los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores por medio de la inoculación
de volúmenes de la muestra en un medio líquido de enriquecimiento, seguida de la incubación a una temperatura de
37 °C ± 1 °C durante de 44 h ± 4 h en condiciones anaerobias.

6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

6.1 Materiales básicos

Con objeto de mejorar la reproducibilidad de los resultados, se recomienda que, en el momento de la preparación
de los diluyentes y los medios de cultivo, se utilicen compuestos básicos deshidratados. Asimismo, también se pue-
den emplear reactivos comerciales. Deben seguirse rigurosamente las instrucciones del fabricante.

Los productos químicos que se utilicen en la preparación de los medios de cultivo y los reactivos deben ser de cali-
dad analítica reconocida.

El agua que se emplee debe ser destilada o desionizada y debe estar libre de sustancias que puedan inhibir el desa-
rrollo de los microorganismos durante la realización del ensayo (véase la Norma ISO 3696).

Las mediciones del pH se llevarán a cabo con un pH-metro y a una temperatura de 25 °C.

Si los medios de cultivo preparados no se van a utilizar inmediatamente, deben guardarse en la oscuridad a una
temperatura aproximadamente de 4 °C por un período de tiempo no mayor de un mes, a menos que se especifique
lo contrario.

6.2 Medios de cultivo y diluyente

6.2.1 Diluyente. Debe utilizarse uno de los diluyentes que se establecen en la Norma ISO 8199.

6.2.2 Medio reforzado especial para la clostridia (DRCM)

6.2.2.1 Medio base de concentración simple

Composición

Carne digerida en la triptona 10 g

Extracto de carne 10 g
Extracto de levadura 1,5g
Almidón 1g
Acetato de sodio dihidratado 5g
Glucosa 1g
Hidrocloruro-L-Cistina 0,5 g
Agua 1 000 ml
 -7- EN 26461-1:1993

Preparación

Se diluye la triptona, el extracto de carne, el acetato de sodio y extracto de levadura en 800 ml de agua.

Con los otros 200 ml de agua destilada se prepara una solución de almidón de la manera siguiente: se mezcla el
almidón con un poco de agua fría con el fin de formar una pasta. Se calienta el resto de agua hasta el punto de ebu-
llición y se añade lentamente a la pasta, con agitación constante.

Posteriormente, se agrega esta solución de almidón a la primera mezcla y se calienta hasta alcanzar su punto de
ebullición con el fin de que se disuelva completamente.

Finalmente, se agrega la glucosa y el hidrocloruro-L-Cistina, y se disuelve toda la mezcla.

Se ajusta el pH entre 7,1 y 7,2 con una solución de hidróxido de sodio (1 mol/l).

Se transfieren alícuotas de 25 ml del medio a frascos de tapa roscada de 25 ml de capacidad. Se esterilizan dichos
frascos en autoclave a una temperatura de 121 °C ± 1 °C durante 15 min.

6.2.2.2 Medio base de concentración doble. Se prepara el medio de concentración doble según se muestra en el
apartado 6.2.2.1 pero se reduce el volumen de agua a la mitad.

Se transfieren alicuotas de 10 ml y de 50 ml del medio a frascos de tapa roscada de 25 ml y de 100 ml de capaci-

dad respectivamente.

6.2.3 Sulfito de sodio (Na2SO3), solución al 4% (m/m). Se diluyen 4 g de sulfito de sodio anhidro en 100 ml de
agua. Se esteriliza la solución por filtración.

Se guarda la mezcla a una temperatura comprendida entre los 2 °C y los 5 °C.

6.2.4 Citrato de hierro (III) (C6H5O7Fe), solución al 7% (m/m). Se disuelven 7 g de citrato de hierro (III) en
100 ml de agua. Se esteriliza la solución por filtración.

Se guarda la mezcla a una temperatura comprendida entre los 2 °C y los 5 °C.

Se aconseja preparar una solución nueva cada 14 días.

6.2.5 Medio completo

6.2.5.1 El día del análisis, se mezclan volúmenes iguales de las soluciones de sulfito de sodio (véase apartado 6.2.3)
y citrato de hierro (III) (véase 6.2.4).

6.2.5.2 Se añaden 0,5 ml de la mezcla (véase 6.2.5.1) a cada frasco que contenga el medio de concentración sim-
ple (véase 6.2.2.1), el cual se habrá calentado y enfriado recientemente.

6.2.5.3 Se añaden 0,4 ml de la mezcla (véase 6.2.5.1) a cada frasco de 10 ml, y 2 ml a cada frasco de 50 ml, que
contenga el medio de concentración doble (véase 6.2.2.2), el cual se habrá tratado de manera similar a como se
realizó en el apartado anterior.

7 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO

Material de laboratorio empleado normalmente en bacteriología y,

7.1 Frascos o matraces de tapa roscada de cristal o boro silicatados, de 200 ml, 100 ml y 25 ml de capacidad.
EN 26461-1:1993 -8-

7.2 Pipetas volumétricas, de 10 ml y 1 ml de capacidad.

7.3 Baños María, controlados termostáticamente.

7.4 Tubos de ensayo, 150 mm × 13 mm.

7.5 Alambre de hierro

7.6 Estufa de cultivo, que se pueda mantener a una temperatura de 37 °C ± 1 °C.

8 MUESTREO
Véanse las Normas ISO 5667-2 e ISO 8199 para las técnicas de muestreo.

9 PROCEDIMIENTO OPERATORIO

9.1 Tratamiento de las muestras

Véanse las Normas ISO 5667-3 e ISO 8199 relativas al método a seguir para la conservación y manipulación de las
muestras.

9.2 Selección de los esporos (técnica)

Antes de la realización del ensayo, la muestra de agua se debe calentar en un baño María a 75 °C ± 5 °C durante
15 min a partir del momento en que se alcanza la mencionada temperatura. Un frasco similar que contenga el mis-
mo volumen de agua que la muestra de ensayo se debe utilizar periódicamente como medida de control a fin de
verificar el tiempo de calentamiento que precisa. La temperatura del agua del frasco de control se puede registrar
constantemente con la ayuda de un termómetro.

9.3 Inoculación e incubación

Se añaden 50 ml de la muestra (véase apartado 9.2) a un frasco de 100 ml con tapa roscada que contenga 50 ml del
medio completo de concentración doble (véase 6.2.5.3).

Se añaden 10 ml de la muestra (véase 9.2) a una serie de cinco frascos de 25 ml con tapa roscada que contenga
10 ml del medio completo de concentración doble (véase 6.2.5.3).

Se añade 1 ml de la muestra (véase 9.2) a una serie de cinco frascos de 25 ml con tapa roscada que contenga 25 ml
del medio completo de concentración simple (véase 6.2.5.2).

Si es necesario, se añade 1 ml de una solución 1:10 de la muestra (véase 9.2) a una serie de cinco frascos de 25 ml
con tapa roscada que contenga 25 ml del medio completo de concentración simple (véase 6.2.5.2).

Con objeto de realizar un examen cualitativo de 100 ml de agua potable o embotellada sin llevar a cabo un conteo
NMP, se utiliza un matraz de 200 ml lleno con una mezcla de 100 ml del medio completo de concentración doble
(véase 6.2.5.3) y 100 ml de la muestra (véase 9.2).

Si fuera necesario, se llenan todos los frascos con el medio completo de concentración simple (véase 6.2.5.2) para
así llevar el volumen del líquido hasta el cuello de los frascos y garantizar que exista sólo un pequeño volumen de
aire. Posteriormente, se sellan herméticamente los frascos en cuestión o se incuban en condiciones anaerobias.
 -9- EN 26461-1:1993

Se incuban los frascos que han sido inoculados a una temperatura de 37 °C ± 1 °C durante 44 h ± 4 h.

Los frascos de cristal herméticamente sellados que contengan grandes volúmenes de cultivos pueden estallar debido
a la producción de gases. La adición de alambre de hierro, calentado al rojo vivo y colocado dentro del medio de
cultivo con anterioridad a la inoculación, puede ayudar a la anaerobiosis.

9.4 Interpretación
Los frascos en los que se observe un ennegrecimiento como consecuencia de la reducción del sulfito y la precipita-
ción del sulfuro de hierro (III), se considerarán como positivos.

10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Expresar los resultados conforme se establece en la Norma ISO 8199.

11 INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe indicar el método empleado y expresar los resultados obtenidos como el número más
probable de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) por volumen de la muestra. También se debe
mencionar cualquier detalle del procedimiento operatorio no especificado en esta parte de la Norma ISO 6461 que
no se considere como opcional. Así como cualquier otro incidente que pueda haber influido en los resultados del
ensayo.

El informe del ensayo debe incluir toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra.
Dirección Fernández de la Hoz, 52 Teléfono (91) 432 60 00 Telefax (91) 310 36 95 Telegrama AENOR
28010 Madrid-España