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manuscrito aceptado

Título: Caracterización del curso deMycoplasma bovis infección en

hatos lecheros naturalmente infectados

Autores: N. Vähänikkilä, T. Pohjanvirta, V. Haapala, H.

Simojoki, T. Soveri, GF Browning, S. Pelkonen, NK
Wawegama, T. Autio

IIP: S0378-1135 (19) 30124-5

DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2019.03.007
Referencia: VETMIC 8247

Aparecer en: VETMIC

Fecha de recepción: 4 febrero 2019

Fecha revisada: 7 de marzo de 2019
Fecha de aceptación: 9 marzo 2019

Cite este artículo como: Vähänikkilä N, Pohjanvirta T, Haapala V, Simojoki H, Soveri T,

Browning GF, Pelkonen S, Wawegama NK, Autio T, Caracterización del curso de Mycoplasma
bovis infección en hatos lecheros infectados de forma natural,Microbiología Veterinaria
(2019), https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2019.03.007

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Caracterización del curso de Mycoplasma bovis infección en forma natural

hatos lecheros infectados

N. Vähänikkiläa *, T. Pohjanvirtaa, V.Haapala B, H. Simojoki B, T. Soveri B, GF BrowningC, S.

O
Pelkonena, NK WawegamaCy T. Autioa

D
TA
a Bacteriología
EP
y Patología Veterinaria, División de Investigación y Laboratorio, Alimentos Finlandeses
AC
Autoridad, Neulaniementie 4, 70210 Kuopio, Finlandia

B Departamento de Medicina de Animales de Producción, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de

O

Helsinki, Paroninkuja 20, 04920 Saarentaus, Finlandia

T
RI

CCentro de Asia-Pacífico para la Salud Animal, Escuela de Veterinaria de Melbourne, Facultad de Veterinaria y
SC

Ciencias Agrícolas, Universidad de Melbourne, Parkville, Victoria 3010, Australia

U
AN

*
Autor correspondiente. División de Investigación y Laboratorio de Bacteriología y Patología Veterinaria,

Autoridad Alimentaria de Finlandia, Neulaniementie 4, 70210 Kuopio, Finlandia. Teléfono

M

números: +358 44 720 1458, dirección de correo electrónico:nella.vahanikkila@ruokavirasto.fi

1
Reflejos:

- Los anticuerpos fueron detectables mediante un ELISA interno durante al menos 1,5 años en algunos bovinos infectados. Seis de

- las 19 granjas se volvieron de bajo riesgo a medida que la infección se resolvió en ellas.

- Se requieren varias herramientas de diagnóstico para evaluar el estado de bioseguridad de un rebaño

O
D
Abstracto

TA
Mycoplasma bovis causa enfermedad respiratoria bovina, mastitis, artritis y otitis. La importancia de
EP
M. bovis se ha intensificado debido a los brotes recientes y las introducciones en países que antes eran libres
AC
oM. bovis.Caracterizamos el curso deM. bovis infección en 19 granjas lecheras recientemente infectadas

más de 24 meses. Nuestro objetivo fue identificar herramientas de diagnóstico para evaluar la efectividad del control
O

medidas para evaluar el estado de infección de bajo riesgo enM. bovis granjas infectadas. Los ensayos de PCR y el cultivo fueron
PT

usado para detectarM. bovis, y se usaron ELISA internos y BioX para seguir las respuestas de anticuerpos.

Se tomaron muestras de vacas y ganado joven en cuatro ocasiones separadas, y se tomaron muestras de casos clínicos
RI

cuando surgieron. En 17 granjas se detectaron algunos casos de mastitis clínica, la mayoría dentro de los primeros
SC

ocho semanas después del caso índice. Los anticuerpos detectados por ELISA interno persistieron en el suero de

vacas al menos durante 1,5 años en todas las granjas, independientemente de laM. bovis estado de infección o signos de clínica
U

enfermedad o mastitis subclínica en la granja. Seis de 19 granjas se volvieron de bajo riesgo cuando la infección
AN

resuelto. Nuestros resultados sugieren que, por motivos de bioseguridad, se debe realizar un seguimiento regular.

en los rebaños mediante la detección deM. bovis en muestras de vacas con mastitis clínica y terneros con

neumonía, junto con la prueba de animales jóvenes mediante la detección de hisopos nasales recogidos longitudinalmente

porM. bovis y muestras de suero secuenciales para anticuerpos contra antígenos recombinantes.

2
Palabras clave:

Mycoplasma bovis, hato lechero, MilA ELISA, PCR

1. Introducción

Mycoplasma bovis,un patógeno importante del ganado, se asocia más comúnmente con bovinos

enfermedad respiratoria (BRD), mastitis, artritis, queratoconjuntivitis y otitis media (Nicholas y

O
Aylin, 2003). La importancia deM. bovis La infección se ha intensificado en la última década debido a

D
TA
el creciente número de brotes en los principales países productores de lácteos, su reciente introducción en

países que antes estaban libres de M. bovis, incluidos Nueva Zelanda y Finlandia, y la

EP
aparición de un brote causado por una nueva cepa (Pothmann et al. 2015; Bioseguridad Nueva Zelanda

2018; Haapalaet al. 2018). M. bovis afecta significativamente el bienestar animal y la producción y causa
AC
pérdida económica significativa en las industrias de ganado vacuno y lechero (Nicholas y Ayling, 2003). Esfuerzos

desarrollar vacunas eficaces contra M. bovis no han tenido éxito (Pérez-Casal et al. 2017),
O

sin vacunas comerciales disponibles en gran parte del mundo y solo vacunas de
T
RI

eficacia cuestionable disponible en América del Norte (Maunsell et al. 2011). Esfuerzos para controlar las pérdidas

causado por M. bovis han llevado a un mayor uso de medicamentos antimicrobianos y los informes recientes sugieren
SC

La resistencia a varios antimicrobianos ha aumentado en M. bovis (ayling et al. 2014; Gautier-

U

Bouchardon et al. 2014; heuvelinket al. 2016). Por lo tanto, la detección de ganado infectado, especialmente
AN

animales subclínicamente infectados, es de suma importancia en la prevención de la introducción del agente

en rebaños ingenuos y en la prevención de brotes (Caswell et al. 2007).

M

Varios estudios han examinado la prevalencia de la infección por M. bovis utilizando cualquiera de los ensayos de PCR para

detectar el organismo y/o ensayos serológicos, incluidos los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas

(ELISA), para detectar anticuerpos contra ella (Assie et al. 2009; Bednareket al. 2012; Aredeet al. 2016;

Wawegama et al. 2016). A nivel de animales individuales, portadores asintomáticos e intermitentes

3
el desprendimiento dificulta la detección confiable del organismo (Biddle et al. 2003; Hazeltonet al. 2018). Infectado

los animales pueden arrojarM. bovis durante unas pocas semanas a varios meses (Punyapornwithayaet al. 2010;

Hazeltonet al. 2018), pero hay información limitada sobre la circulación deM. bovis en un infectado

rebaño después de la infección natural y las respuestas de anticuerpos de los animales en estos rebaños infectados.

En FinlandiaM. bovis se detectó en 2012, a pesar de que se habían realizado rigurosas pruebas de diagnóstico

detectarlo en el proyecto de investigación BRD de unidades de crianza de terneros en 2001 - 2003 (Autio et al. 2007) y en

muestras clínicas de BRD desde entonces. Además, la detección exhaustiva de patógenos de mastitis en

O
muestras individuales de leche de casos de mastitis clínica y subclínica se han realizado durante décadas

D
en Finlandia, con aproximadamente 140,000 muestras analizadas en 2018 (hay aproximadamente

TA
270.000 vacas lecheras en Finlandia). Un ensayo de PCR multiplex que incluía cebadores para detectarM. bovis posee

EP
estado en uso desde principios de 2012. Entre 2012 y 2018, se encontró que 68 (0,8%) hatos lecheros finlandeses

ser infectado conM. bovis.

AC
La baja prevalencia deM. bovis y la baja densidad de población de ganado en Finlandia lo convierten en un lugar adecuado
O

plataforma para estudiar el curso de la infección conM. bovis a nivel de rebaño. industrias ganaderas
T

en todo el mundo necesitan mejores estrategias y herramientas para la certificación de fincas que tienen un bajo riesgo
RI

de infección conM. bovis con fines de bioseguridad. En este estudio, nuestro objetivo fue identificar las mejores
SC

herramientas de diagnóstico para rastrear la eficacia de las medidas de control para lograr un bajo riesgo de infección conMETRO.

bovisen granjas infectadas. Para ello seguimos el curso deM. bovis infección en 19 recién infectados
U

granjas lecheras durante 24 meses usando PCR en tiempo real y cultivo para detectar el organismo, y serología para
AN

detectar la respuesta de anticuerpos aM. bovis,en los rebaños durante el período de estudio. Utilizamos varios muestreos

técnicas en las granjas, incluida la recolección de muestras de leche de tanque a granel, muestreo individual de ambos
M

vacas y animales jóvenes mediante la recolección de muestras de cuarto de leche, hisopos nasales, hisopos nasofaríngeos y

muestras de suero y recolección de muestras durante los exámenes post-mortem.

2. Materiales y métodos

4
Fincas en estudio

La ETT de Salud Animal ha mantenido un programa voluntario M. bovis programa de control en Finlandia desde 2013, y

se animó a todos los rebaños lecheros infectados a participar en el programa de control y la investigación

proyecto "Mycoplasma bovis en hatos lecheros”. El estudio incluyó 19 granjas lecheras infectadas. Entrevistas

y se realizaron muestreos en cada una de estas fincas. Infección conM. bovis no habia sido detectado

previamente en cualquiera de las granjas, a pesar de las pruebas continuas de patógenos de mastitis (en 18 de las granjas),

incluyendo PCR en tiempo real para la detección deM. bovis. En 17 fincas los casos índice fueron mastitis clínica

O
confirmado por PCR en tiempo real, y en dos granjas los casos índice fueron enfermedad respiratoria en terneros.

D
La Tabla 1 muestra el tamaño de la granja, el sistema de gestión y las muestras de leche y post-mortem que

TA
fueron recolectados por los agricultores. Se aconsejó a las granjas que sacrificaran vacas con mastitis causada porM. bovis, a

EP
evitar comprar animales nuevos, alojar a los terneros separados de las vacas y seguir

Medidas higiénicas.
AC
Muestreo
O

Los veterinarios visitaron cada una de las granjas cuatro veces, en intervalos de aproximadamente 6 meses, entre 2014
T

y 2017. Las fechas de las visitas se muestran en la Tabla 2. Durante cada visita, el veterinario recolectó
RI

Hisopos nasofaríngeos profundos (NP) e hisopos nasales (NS) de terneros entre 1 semana y 9 meses
SC

de edad y muestras de suero de todos los grupos de edad. Se recogieron un total de 5 hisopos NP y de 10 a 20 NS

en cada visita, en función del número de terneros en la explotación. El hisopo NS (Transytem, Copan,
U

Brescia, Italia) se recolectó de cada ternero antes de la recolección del hisopo NP. Los hisopos NP fueron
AN

recolectados utilizando hisopos protegidos de 27 cm de largo (Medical Wire Equipment Ltd., Corsham, Inglaterra) y
M

empapados en caldo de micoplasma D (Friis y Krogh, 1983). En rebaños con un número suficiente de crías

ganado, se recolectaron 15 muestras de suero de cada grupo de edad de ganado joven (3-6, 6-9 y 9-12

meses de edad) y de vacas, con un máximo de 65 muestras recolectadas por rebaño. Se aconsejó a los agricultores

monitorear cuidadosamente el ganado para detectar mastitis y otros signos clínicos y presentar el cuarto de leche (QMS)

muestras de todos los casos de mastitis clínica y subclínica para pruebas de PCR en tiempo real y muestras mensuales a granel

5
muestras de leche de tanque (BTM) para PCR en tiempo real y lipasa A inmunogénica de micoplasma interna (MilA)

ELISA (Wawegama et al. 2014). Como parte del estudio, las granjas podrían enviar otras muestras clínicas,

incluidos los terneros con enfermedades que se sospeche que hayan sido causadas por M. bovis para post-mortem

examen, cultivo y confirmación de M. bovis por PCR en tiempo real. La tabla 1 muestra el número total

de muestras enviadas por los agricultores durante el período de estudio.

Cultura para M. bovis

Se cultivaron hisopos NP y muestras clínicas. Las muestras en caldo de micoplasma D se subcultivaron

en placas de medio F y diluido diez veces en caldo F (Bölske et al. 1988). Los caldos se incubaron

TO
a 37 °C durante 3 - 5 días, y el crecimiento y el cambio de color se controlan cada dos días. Todos los caldos de cultivo

RI
fueron examinados por la presencia de M. bovis por PCR en tiempo real, y los cultivos positivos sospechosos fueron

subcultivadas en placas de medio F. Las placas se incubaron en CO al 5%2a 37°C durante siete días, y
SC
inspeccionados cada dos días bajo el microscopio en busca de colonias de micoplasma.
U

extracción de ADN yM. bovis PCR en tiempo real

AN

Los hisopos nasales y los caldos de cultivo se analizaron mediante un ensayo de PCR en tiempo real dirigido a laoppDgen de
M

M. bovis (Sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch, Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.), como

descrito previamente (Sachseet al. 2010), con las modificaciones menores descritas por Haapalaet al.
R
TA

(2018).
EP

Las muestras de QMS y BTM fueron analizadas por laboratorios privados utilizando una PCR comercial en tiempo real

ensayo para 16 patógenos de mastitis, incluyendoM. bovis (Juego completo de 16 Pathoproof®, Thermo Fisher
AC

Scientific, Finlandia), según las instrucciones del fabricante.

Detección deM. bovis-anticuerpos específicos

Se utilizaron dos ELISA para detectarM. bovis-anticuerpos específicos, el Bio K260 (Bio-X Diagnostics,

Jemelle, Bélgica) ELISA comercial y un ELISA MilA de detección de IgG interno (Wawegamaet

6
Alabama.2014). Este ELISA tiene una sensibilidad y especificidad estimadas a nivel animal de 94,3% y 94,4%,

respectivamente usando un límite de 105 unidades de anticuerpo (AU) (Wawegama et al., 2016). ELISA MilA

se realizó como se describió anteriormente (Wawegama et al. 2014), con la concentración deM. bovis

- anticuerpos específicos en cada muestra calculados en unidades de anticuerpo (AU) por comparación con una serie de

estándares en cada placa utilizando un programa de análisis ELISA (http://www.elisaanalysis.com), con un

resultado de > 135 UA interpretado como positivo (Petersen et al. 2018). Se realizó el ELISA Bio K260

según las instrucciones del fabricante.

O
Las muestras de BTM recolectadas en o cerca de las visitas de muestreo también se analizaron utilizando el MilA ELISA interno.

D
esencialmente como se describió anteriormente, pero a una dilución de 1/20.

TA
Agrupación de las granjas según su estado de infección

EP
Analizar la dinámica del rebaño.M. bovis-concentraciones de anticuerpos específicos, clasificamos el estudio
AC
granjas en seis grupos de estatus de infección, basados en la detección deM. bovis en cada visita (tabla 3). Nosotros

considera una visita positiva siM. bovis fue detectado en la granja por PCR en tiempo real o cultivo de NP o
O

Hisopos NS, o muestras clínicas, post-mortem o de mastitis, con el estado en cada visita clasificado como
T

positivo o negativo. Designamos el estado de infección S0 (n = 2) siM. bovis se detectó solo en

RI

los casos índice, y no después; S1 (n = 4) siM. bovis fue detectado en la primera visita de muestreo; S2
SC

(n = 2) siM. bovis fue detectado en las dos primeras visitas de muestreo; S3 (n = 4) siM. bovis fue detectado en

las tres primeras visitas de muestreo; S4 (n = 3) siM. bovis fue detectado en las cuatro visitas de muestreo; y Sx
U

(n = 4) siM. bovis se detectó en más de una visita, pero no de manera constante durante todo el período
AN

el rebaño fue positivo.

M

análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism versión 7.02. La importancia de la

se calcularon las diferencias en las proporciones de animales positivos en cada visita en cada grupo de infección

usando un ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Tukey. P <0,05 se consideró significativo.

7
Se calculó el tamaño medio del rebaño y se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la

asociación entre el tamaño del rebaño y el estado de infección de las granjas, y la asociación entre el

concentraciones de anticuerpos anti-MilA en leche de tanque a granel y anti-MilA en suero de las vacas.

Resultados

Manifestaciones clínicas y detección de M. bovis

En la mayoría de las fincas el caso índice fue mastitis clínica. Sólo había dos fincas en las que no

O
casos de mastitis causadas por M. bovis fueron detectados durante el período de estudio de dos años. En estas granjas

D
los casos índice fueron neumonía en terneros. En fincas conM. bovis mastitis, sólo unos pocos clínicos

TA
se observaron casos de mastitis y estos ocurrieron principalmente (88%) dentro de las primeras ocho semanas después del índice

EP
caso (tabla 4). En la mayoría de las granjas, las vacas conM. bovis mastitis fueron aislados y sacrificados o sacrificados

tan pronto como sea posible después de la detección de la infección. En una granja se sacrificó una vaca más tarde, el día 9
AC
después de la detección, pero se mantuvo separado de otros animales durante todo este período. La tabla 4 muestra

los resultados de las pruebas en granjas para M. bovis en cada visita y el estado de infección de cada uno de los rebaños.
O

Las granjas fueron examinadas minuciosamente para M. bovis durante el período de estudio de 2 años (Tablas 1, 2, 5). En
T
RI

Se analizaron un total de 3268 muestras de leche de un cuarto y solo 51 vacas tuvieron M. bovis mastitis. Un total de 22

Se enviaron muestras de 10 granjas para su examen post-mortem.. M. bovisfue aislado de 12

SC

de estos animales, de siete fincas. Las pruebas de PCR de 263 muestras BTM, en total, arrojaron sieteMETRO.
U

bovismuestras positivas, de cinco fincas. Todas estas muestras positivas, excepto una, se recogieron
AN

dentro de las cuatro semanas del caso índice de mastitis en el rebaño. En una granja (granja E), una sola muestra BTM

fue positivo 5 meses después del caso índice. Después de este hallazgo positivo, muestras de cuarto de leche de
M

vacas en la granja E con recuentos elevados de células somáticas en la leche fueron analizadas para M. bovis, y todos fueron negativos.

Mientras tanto, se secaron dos vacas con mastitis subclínica sin tomar muestras. Sin embargo, NS

y los hisopos NP de terneros en la granja E fueron positivos.

8
El tamaño medio de los rebaños fue de 61 vacas y hubo una correlación positiva moderada entre

el tamaño del rebaño y el estado de infección de la granja (Pearson r = 0,6). En estado de infección granjas S0 (n = 2)

M. bovis solo se detectó en el caso índice y no se aisló en ningún otro momento a lo largo del

periodo de estudio. En cuatro granjas (estado de infección S1)M. bovis se detectó sólo en la primera mitad del

primer año y en dos fincas (estado de infección S2) se detectó durante todo el primer año. en 11 fincas

(estado de infección S3, S4 o Sx) M. bovis fue detectado después del primer año, y la mayoría de estos

las granjas tenían grandes rebaños en graneros de viviendas sueltas.

O
Anticuerpos séricos contra M. bovis

D
TA
Se analizaron un total de 3317 muestras de suero utilizando dos ELISA diferentes, utilizando valores de corte de 135

AU para el MilA ELISA y un ODC del 37% para el BioX ELISA (Tabla 5). ELISA MilA

EP
detectó más muestras positivas que el BioX ELISA. analizamos elM. bovis anticuerpo específico
AC
perfiles para cada grupo de estado de infección usando ambos ELISA (Figs. 1 y 2). Las proporciones de MilA

Los animales jóvenes positivos por ELISA tenían patrones similares a los detectados por cultivo o PCR paraM. bovis. En
O

Por el contrario, no se obtuvieron dichos patrones con BioX ELISA. Hubo una disminución significativa en
T

la proporción de animales jóvenes que dieron positivo en el MilA ELISA después de la primera visita de muestreo (P
RI

<0.05) en fincas S0 y S1 (Fig. 1 a, b). De la misma manera, hubo una disminución significativa en la proporción
SC

de ganado joven que fueron positivos en el MilA ELISA después de la segunda visita a las granjas S2 (P <0.05,

HIGO. 1c). En contraste, en las granjas S3, S4 y Sx, la proporción de ganado joven que fue positivo en el
U

MilA ELISA permaneció tan alto como 80% en la mayoría de los puntos de tiempo, sin ninguna disminución significativa en la
AN

proporción que fueron positivos durante la duración del estudio (Fig. 1. d, e, f). Sin embargo, del 80 al 100% de

las vacas fueron MilA ELISA positivas a lo largo de la duración del estudio, independientemente de la infección
M

estado de la finca. Hubo algunas excepciones en algunos puntos de tiempo, pero ninguna diferencia significativa

entre los puntos de tiempo. En las fincas S0, hubo una disminución significativa en la proporción de positivos

vacas después de la primera visita, pero la proporción había aumentado de nuevo en la tercera visita. En las granjas S4 y Sx,

todas las vacas analizadas dieron positivo en el MilA ELISA al inicio del proyecto, y aproximadamente

9
El 80 % fueron positivos en cada punto de tiempo a partir de entonces (Fig. 1 e, f). No se detectaron patrones en el BioX

ELISA resulta de los diferentes grupos de estado de infección (Fig. 2), posiblemente porque el número total

de animales que dieron positivo en BioX ELISA fue mucho menor que en MilA ELISA. Sin embargo,

hubo una disminución significativa en las proporciones de ganado joven y vacas en las granjas S4 que fueron

positivo en el BioX ELISA tras la primera toma de muestra (Fig. 2 e).

Anti-METRO. bovisanticuerpos en leche de tanque a granel

O
Las concentraciones de anti-M. bovis Se compararon los anticuerpos en las muestras de leche de tanque a granel (n = 68)

D
a la concentración media de anti-M. bovis anticuerpos en las muestras de suero recolectadas de las vacas

TA
en la manada en la misma visita durante las cuatro visitas. Hubo una correlación positiva entre los anti-METRO.

bovisconcentraciones de anticuerpos en las muestras de leche de tanque a granel y en el suero de las vacas (r = 0,45),

medido usando el MilA ELISA (Fig. 3).

EP
AC
4. Discusión

Este es el primer estudio que examina la circulación deM. bovis y las respuestas de anticuerpos contra él en
O

granjas lecheras naturalmente infectadas durante un período de dos años. Examinamos 19 fincas por la presencia de
T
RI

M. bovis usando leche de mastitis individual repetida y muestreo BTM, y muestreo de ganado joven por

Hisopado nasal y nasofaríngeo profundo y recolección de muestras de suero de ganado joven y vacas
SC

en cuatro ocasiones durante dos años.

U

En la mayoría (88%) de las granjas, clínicaM. bovis la mastitis solo se detectó durante un período corto,
AN

y el número de casos de mastitis asociados conM. bovis permaneció bajo. Un corto período deM. bovis
M

mastitis podría resultar en la detección temprana de mastitis y en una respuesta rápida para retirar a los animales

de la granja Estudios anteriores han encontrado que la duración de un brote de mastitis puede variar de dos

meses a varios años (Bayoumiet al. 1988; Mackieet al. 2000; zorroet al. 2003; Punyapornwithaya

et al. 2012). En seis fincas (J, K, M, O, P y Q),M. bovis no se detectó en tres o más

visitas consecutivas, con todas las muestras de leche (tanto QMS como BTM) negativas paraM. bovis durante ese tiempo.

10
La enfermedad clínica se resolvió en estas granjas con rebaños que despejaronM. bovis volviéndose así bajo

riesgo. Estas granjas parecían no solo haber resuelto la enfermedad clínica, sino que también parecían haber

limpió la manada deM. bovis y por lo tanto alcanzó el estado de bajo riesgo. Estudios previos han demostrado

que el tamaño del rebaño es un factor de riesgo paraM. bovis mastitis (Thomas et al. 1981; Fox et al. 2003; McCluskey

et al. 2003; Lysnyansky et al. 2016). Todos los rebaños en nuestro estudio que parecían haber sido limpiados de

M. bovis tenían menos de 70 vacas, y la mayoría de las granjas en las que persistió la infección tenían vacas más grandes.

rebaños, aunque ninguno exceda de 268. Sin embargo, se ha demostrado que los rebaños con más de 500 vacas son

O
más vulnerables a la mastitis por micoplasma que los rebaños más pequeños (Nicholas et al. 2016). Varios factores son

D
asociados con la minimización de la enfermedad clínica y la resolución de brotes. La mayoría de estos son esencialmente

TA
prácticas de manejo que minimicen el riesgo de transmisión, incluida la separación de

animales afectados del rebaño, eliminación/eliminación de otros animales infectados, ordeño del rebaño del hospital

EP
último y pasteurizar la leche antes de dársela a los terneros (Foxet al. 2003; Hazeltonet al. 2018). A
AC
desarrollar estrategias de control efectivas yM. bovis programas de erradicación, necesitamos más investigaciones

caracterizar las prácticas de manejo de granjas más importantes, para determinar la bioseguridad óptima
O

y determinar el patógeno y los factores del huésped asociados con la eliminación deM. bovis desde
T

una manada.
RI

Estudios sobreM. bovis en hatos lecheros se han centrado en hatos que experimentan brotes de mastitis clínica
SC

(Hazeltonet al. 2018; petersenet al. 2018). En nuestro estudio, la mayoría de las granjas estaban infectadas, pero
U

tenían muy pocos casos clínicos, por lo que podrían definirse como granjas infectadas que no estaban
AN

experimentando un brote. En dos fincas (O y R), no huboM. bovis casos de mastitis, aunque

M. bovis circulaba (Granja O, con estado de infección S1 y Granja R con estado Sx). El
M

las vacas tenían anticuerpos séricos detectables contraM. bovis, demostrando que habían estado expuestos a la

patógeno pero no había desarrollado ningún signo deM. bovis mastitis. De manera similar en dos fincas (A y E),METRO.

bovisestuvo circulando durante más de un año, pero noM. bovis los casos de mastitis se observaron después de los casos índice.

Por lo tanto, las pruebas QMS continuas de mastitis clínica y subclínica paraM. bovis solo no es suficiente

11
para detectar la presencia deM. bovis en un rebaño, aunque es crucial para la detección de casos de clínica

mastitis.

Identificación rutinaria de rebaños conM. bovis la mastitis se ha realizado típicamente usando BTM

cultivo o PCR. La recogida de muestras BTM a intervalos de 3 o 4 días es una forma eficaz de

detección de mastitis por micoplasma en hatos lecheros (Wilsonet al. 2009). Detección deM. bovis en BTM

también se ha recomendado como medida de bioseguridad para reducir el riesgo de introducción deM. bovis

en un rebaño ingenuo (Parkeret al. 2017). En nuestro estudio, las muestras BTM positivas por PCR se detectaron solo en

cinco (26%) de los rebaños, y sólo poco después de los casos iniciales de mastitis, aunqueM. bovis todavía estaba

circulando en muchos de los rebaños durante un tiempo prolongado después de esto. Por lo tanto, un resultado negativo de la prueba de PCR en

T
IP
BTM no es un método preciso para determinar la ausencia deM. bovis en una manada, y, por lo tanto, es

no es adecuada como única prueba para la detección de bioseguridad, aunque es adecuada para detectarM. bovis
SC
mastitis.
U
Nuestro estudio ha demostrado que en todas las granjas la mayoría de las vacas fueron seropositivas en el MilA ELISA,
AN

con anticuerpos contraM. bovis detectada durante al menos 1,5 años, independientemente de la aparente evolución

presencia o ausencia deM. bovis en la granja. La mayoría de los estudios previos han usado otros ELISA y
O

concluyó que los anticuerpos séricos no permanecen elevados durante un período prolongado. Recientemente, Petersenet
D

Alabama.(2018) estudióM. bovis vacas infectadas usando el BioX ELISA y mostró que el anticuerpo sérico
TA

los niveles generalmente disminuyeron dentro de los 2 meses posteriores al inicio de la enfermedad clínica. Llegaron a la conclusión de que

Es improbable que la serología sea útil para el diagnóstico individual de enfermedades asociadas conM. bovis en lácteos
EP

vacas En nuestro estudio, se detectaron vacas seropositivas utilizando BioX ELISA en la mayoría de los puntos de tiempo.
AC

Sin embargo, después de la segunda visita, el 20% o menos de las vacas o ganado joven fueron seropositivos, independientemente

del estado de infección de la granja. Por lo tanto, los resultados de BioX ELISA no reflejaron la circulación

oM. bovis en diferentes grupos de estado de infección. Sin embargo, estos resultados no fueron inesperados, ya que el

Se ha encontrado que BioX ELISA tiene una sensibilidad mucho más baja que MilA ELISA (Wawegamaet

Alabama.2016, Petersenet al. 2018).

12
Anticuerpos séricos contra M. bovis fueron detectables en la mayoría de las vacas usando el MilA ELISA

durante todo el periodo de estudio. Sorprendentemente, hubo una clara disminución en el anticuerpo sérico anti-MilA

concentraciones en ganado joven en las granjas en las que la infección estaba bajo control, y en las que METRO.

bovisno se detectó en el segundo año después del caso índice. En cambio, en las granjas S3, S4 y Sx,

donde M. bovis circuló durante más de 1,5 años, del 60 al 80 % de los animales jóvenes permanecieron seropositivos.

El diagnóstico serológico por sí solo indica una exposición pasada en lugar de una infección actual (Nicholas y

Aylin, 2003). Sin embargo, nuestro estudio sugiere que las pruebas secuenciales de diferentes grupos de edad para

O
anticuerpos contra M. bovis se puede utilizar para evaluar la M. bovis estado de infección de un rebaño y la tendencia

D
hacia la eliminación de la infección de un rebaño para lograr un bajo riesgo M. bovis estado. También hubo un

TA
correlación entre las concentraciones de anticuerpos séricos de las vacas en un rebaño y el anticuerpo BTM

concentraciones Esto sugiere que los anticuerpos BTM pueden reflejar no solo los anticuerpos producidos en el

EP
la ubre sino también las del suero, o alternativamente que las infecciones intramamarias con M. bovis poder
AC
inducir una respuesta inmunitaria sistémica detectable. Más investigación de los valores de corte apropiados y

interpretaciones robustas para el uso de MilA ELISA para probar BTM daría como resultado un poderoso
O

herramienta de diagnóstico para seguir el estado de infección de los rebaños para la erradicación o el control de M. bovis en
T

hatos lecheros.
RI

Estudios previos han demostrado que durante un brote inicial de M. bovis mastitis, colonización de
SC

sitios distantes en el cuerpo pueden ser comunes en las vacas, pero esto disminuye rápidamente (Punyapornwithaya
U

et al. 2010; Hazeltonet al. 2018). Por lo tanto, el momento del muestreo en relación con un brote reciente parece
AN

ser de considerable importancia y el muestreo de sitios del cuerpo por frotis nasales, oculares o vaginales de vacas

es ineficaz para evaluar la presencia de M. bovis en la manada En nuestro estudio, no probamos directamente
M

para la colonización de vacas con M. bovis, pero los altos niveles de anticuerpos contra M. bovis en vacas

en granjas sin enfermedad en curso parece reflejar una infección asintomática frecuente con METRO.

bovis Además, en los animales jóvenes, los patrones de seropositividad parecían reflejar la presencia del

patógeno.

13
Se cree que los terneros arrojan M. bovis en las secreciones respiratorias y así transmitir la infección a través de

contacto cercano continuo (Nicholas, 2011). En nuestro estudio, la prevalencia de detección deM. bovis en

los terneros variaron de 0 a 75% en diferentes visitas. En varias fincas,M. bovis se detectó en nasal y

frotis nasofaríngeos de terneros cuando no ha habido ningún caso de clínica M. bovis mastitis en

vacas en los meses anteriores. Se ha demostrado que la prevalencia dentro del rebaño de detección deMETRO.

bovisen frotis nasales de terneros es generalmente alto (hasta 100%) en rebaños con antecedentes de un brote,

y bajo en hatos que no han experimentado un brote (Maunsell y Donovan, 2009). Estos resultados,

O
combinados con nuestros hallazgos, enfatizan que la detección efectiva de bioseguridad requiere repetidos

D
seguimiento de los terneros para asegurar que la presencia de M. bovis en una granja se detecta.

TA
Para fines de bioseguridad, es de vital importancia prevenir la introducción de M. bovis en una manada

EP
mediante la compra de animales de granjas que hayan demostrado estar libres de infección. derramamiento deM. bovis ha mostrado a

ser intermitente (Caswell et al. 2007; maunsellet al. 2011). Por lo tanto, una sola prueba de un individuo
AC
el animal no es confiable, y el estado de infección de la manada debe determinarse mediante pruebas secuenciales

mediante serología y PCR. No existe un estándar de oro para el muestreo y la prueba de animales asintomáticos.
O

En este estudio, no pudimos interpretar los resultados de Bio-X ELISA con respecto al estado de infección de
T

los rebaños, ya que se observaron niveles similares de seropositividad en los rebaños si había circulación en curso
RI

oM. bovis O no. De manera similar, aunque los resultados de MilA ELISA parecían reflejar el estado de infección
SC

del ganado joven, la proporción de vacas que eran vacas seropositivas fue alta en todos los estados de infección
U

grupos y, por lo tanto, estos animales pueden no ser los mejores centinelas para la detección de bioseguridad. En conclusión,
AN

nuestro estudio sugiere que el monitoreo regular deM. bovis en muestras de vacas con mastitis y terneros

con neumonía, combinado con muestreo longitudinal de animales jóvenes mediante hisopado nasal para PCR
M

y para suero para pruebas en MilA ELISA, y potencialmente pruebas de leche de tanque a granel para anticuerpos

contra M. bovis utilizando MilA ELISA, proporcionar herramientas de diagnóstico adecuadas para la detección de bioseguridad

y programas de control.

5. Conclusiones

14
Si el control de M. bovis debe mejorarse, es de vital importancia evitar la introducción de METRO.

bovisen rebaños comprando animales de granjas libres de infección. Pruebas de individuos

animales o rebaños en una sola ocasión no es confiable, por lo que el estado de infección del rebaño debe ser

basado en pruebas secuenciales de rebaños. Nuestros resultados sugieren que la garantía óptima del estado de infección

de los rebaños sólo puede lograrse mediante un seguimiento regular de M. bovis en muestras de casos clínicos de

mastitis y neumonía de los terneros, combinada con la recolección longitudinal de muestras jóvenes de hisopos nasales

para la detección deM. bovis mediante pruebas PCR y sueros para la detección de anticuerpos contraM. bovis utilizando

O
el MilA ELISA.

D
Expresiones de gratitud

TA
Los autores quisieran agradecer sinceramente a los granjeros y veterinarios que contribuyeron al estudio. Nosotros

EP
agradecen a los técnicos de laboratorio del Laboratorio de Bacteriología Veterinaria de Kuopio y
AC
Patología por una excelente asistencia técnica. El Ministerio de Agricultura y Silvicultura de Finlandia

(subvención número 1876/312/2013) proporcionó apoyo financiero.

T O
RI
SC
U
AN
M

15
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19
 O
D
TA
EP
AC

Figura 1.Proporciones de animales seropositivos a lo largo del tiempo en rebaños con diferentes estados de infección
O

mediante el ELISA MilA. a) estado de infección S0, b) estado de infección S1, c) estado de infección S2, d) infección
T

estado S3, e) estado de infección S4, f) estado de infección Sx.

RI
SC
U
AN
M

20
 O
D
TA
EP
AC

Figura 2.Proporciones de animales seropositivos a lo largo del tiempo en rebaños con diferentes estados de infección
O

utilizando el BioX ELISA. a) estado de infección S0, b) estado de infección S1, c) estado de infección S2, d) infección
T
RI

estado S3, e) estado de infección S4, f) estado de infección Sx.

SC
U
AN
M

21
 O
D
TA
EP
AC
T O
RI

Figura 3.Correlación entre las concentraciones medias de anticuerpos séricos (AU) de las vacas en cada rebaño

y la concentración de anticuerpos en la leche de tanque a granel en los mismos puntos de tiempo de recolección usando el MilA
SC

ELISA. La línea representa r = 0.45

U
AN

Tabla 1.Descripción de los rebaños y número de muestras de leche y post-mortem recolectadas por los ganaderos.
M

Tipos de muestra, método, número de muestras analizadasM. bovis

No o SGC1 Tanque de leche a granel Post mortem

Identificación del rebaño tipo de niño
vacas PCR PCR ELISA Cultura
A 47 carcasa de empate 64 dieciséis 4
B 61 carcasa suelta 252 dieciséis 4 2
C 183 carcasa suelta 154 4 2 2
D 268 carcasa suelta 500 2 2
mi 25 carcasa suelta 27 dieciséis 4
22
 F 50 carcasa de empate 28 18 4 1
GRAMO 157 carcasa suelta 487 19 3
H 60 carcasa suelta 194 17 4 3
I 100 carcasa suelta 96 17 3
j 61 carcasa suelta 595 22 4
k 29 carcasa de empate 51 12 4 1
L 41 carcasa de empate 51 6 3
METRO 66 carcasa suelta 112 18 4 1
A 158 carcasa suelta 309 15 4 4
O 48 carcasa suelta 94 13 4 1
PAGS 18 carcasa de empate 12 11 4
q 28 carcasa de empate 30 18 4
R 66 carcasa suelta 36 12 4 1
S 127 176 11 3 6

O
carcasa suelta
1QMS = cuarto de muestra de leche. Se aconsejó a los granjeros que monitorearan minuciosamente al ganado para detectar

D
mastitis y otros signos clínicos y que enviaran muestras para análisis de patógenos de mastitis en todos los casos de mastitis
clínica y subclínica mediante muestreo de un cuarto de leche. Algunos granjeros también enviaron muestras de animales

TA
clínicamente normales.

Tabla 2. Estado de infección en cada visita a cada rebaño basado en la detección deM. bovis.

Visita 1
EP
No.
Visita 2

No.
Visita 3
AC
positivo / total2 positivo / total

Infección Infección No. infectado Infección No. infectado Infección No. en

Rebaño Caso índice Fecha de visita NS notario público Fecha de visita NS notario público Fecha de visita
estado1 estado1 pantorrillas estado pantorrillas estado pantorrillas

A 29el abril de 2014 S3 10el noviembre de 2014 + 2/19 2/19 2/5 4el mayo 2015 + 3/15 1/15 2/6 10el noviembre de 2015 + 21/1

B 21S t abril de 2015 S2 19el mayo 2015 + 19/11 19/10 4/5 24el noviembre de 2015 + 3/23 3/23 0/5 17el mayo 2016 - 0/23
O

C 14el enero de 2016 S4 25el enero de 2016 + 20/11 20/10 4/5 24el agosto 2016 + 20/12 20/12 3/5 15el febrero de 2017 + 4/19

D 12el agosto de 2013 S4 8el octubre de 2013 + 24/50 24/50 DAKOTA DEL NORTE 10el diciembre de 2014 + 20/10 20/10 2/5 8el septiembre 2015 + 2/20
T

mi 10el marzo de 2015 S3 30el marzo de 2015 + 9/15 9/15 3/5 19el octubre de 2015 + 1/9 0/9 1/5 25el abril de 2016 + 6/12
RI

F 12el mayo 2015 S2 27el mayo 2015 + 4/11 4/11 1/5 1S t diciembre de 2015 + 3/16 2/16 2/5 18el mayo 2016 - 0/13

GRAMO 15el enero de 2016 Sx 21S t febrero de 2016 + 20/10 20/10 3/5 1S t septiembre 2016 - 0/20 0/20 0/5 28el febrero de 2017 + 3/19

H 5el noviembre de 2015 Sx 14el diciembre de 2015 + 4/15 3/15 3/5 8el junio 2016 + 9/19 9/19 3/5 12el diciembre de 2016 - 0/14
SC

I 23rd diciembre de 2015 S3 3rd febrero de 2016 + 3/19 2/19 1/5 9el agosto 2016 + 6/18 6/18 4/5 7el febrero de 2017 + 1/20

j 11el diciembre de 2015 S1 11el enero de 2016 + 15/20 14/20 4/5 12el julio de 2016 - 0/18 0/18 0/5 3rd enero de 2017 - 0/27

k 17el julio de 2014 S0 11el noviembre de 2014 - 0/6 0/6 0/5 11el mayo 2015 - 0/8 0/8 0/5 24el noviembre de 2015 - 0/9
U

L 24el mayo 2014 Sx 10el junio de 2014 + 7/21 7/21 6/6 27el noviembre de 2014 - 0/20 0/20 0/5 25el mayo 2015 + 9/20

S0 - 0/9 0/9 0/5 11el mayo 2015 - 0/15 0/15 0/6 - 0/18
AN

METRO 29el agosto de 2014 12el noviembre de 2014 25el noviembre de 2015

A 18el marzo de 2015 S3 15el abril de 2015 + 23/11 9/23 2/5 10el noviembre de 2015 + 16/25 14/25 4/5 dieciséisel mayo 2016 + 20/11

O 31S t marzo de 2015 S1 28el abril de 2015 + 4/16 4/16 0/6 3rd noviembre de 2015 - 0/19 0/19 0/5 26el abril de 2016 - 0/19

PAGS 29el octubre de 2015 S1 25el noviembre de 2015 + 1/6 1/6 0/5 31S t mayo 2016 - 0/9 0/9 0/4 29el noviembre de 2016 - 0/8
M

q 12el agosto 2015 S1 9el septiembre 2015 + 2/19 2/19 0/5 dieciséisel marzo de 2016 - 0/15 0/15 0/5 20el septiembre 2016 - 0/11

R 1S t septiembre 2015 Sx 20el octubre de 2015 + 5/20 5/20 3/5 18el abril de 2016 - 0/21 0/21 0/5 17el octubre de 2016 - 0/18

S 25el enero de 2016 S4 dieciséisel febrero de 2016 + 8/11 8/11 5/5 dieciséisel agosto 2016 + 7/20 6/20 4/5 13el febrero de 2017 + 5/20

1 S0 = Mb detectado en caso índice. S1 = Mb detectado en el caso índice y en la primera visita. S2 = Mb detectado en el

caso índice y en la primera y segunda visita. S3 = Mb detectados en el caso índice y en la primera, segunda y tercera
visita. S4 = Mb detectado en el caso índice y en todas las visitas posteriores Sx = Mb detectado de forma intermitente.
2No. de muestras NS = hisopo nasal. NP = hisopado nasofaríngeo. ND = no hecho.

23
Tabla 3. Clasificación del estado de infección de los rebaños basada en la detección en M. bovis en visitas repetidas de
muestreo.

Estado de infección Visita 1 Visita 2 Visita 3 Visita 4 Rebaño

S0 1 - - - - K, M
S1 + - - - J, O, P, Q
S2 + + - - B, F
S3 + + + - A, E, I, N
S4 + + + + C, D, S
Sx + - + - GRAMO

Sx + + - + H
Sx + - + + L
Sx + - - + R

O
1 S1 = Mb detectado en el caso índice y en la primera visita. S2 = Mb detectado en el caso índice y en la primera y segunda

D
visita. S3 = Mb detectados en el caso índice y en la primera, segunda y tercera visita. S4 = Mb detectado en el caso índice
y en todas las visitas posteriores Sx = Mb detectado de forma intermitente.

TA
EP
AC
T O
RI
SC
U
AN
M

24
 D
TA
Tabla 4. Detección deM. bovis infección y M. bovis mastitis durante el período de estudio.

No. M. bovis
Infección Después 53
mastitis

EP
Rebaño Caso índice Semana 1 Semanas 2 - 8 Semanas 8 - 26 Semanas 27 - 52
estado semanas
casos
A Mastitis S3 1 1
B S2 2 1 1

AC
Mastitis
C Mastitis S4 8 3 4 1
D Mastitis S4 6 1 3 2
mi Mastitis S3 1 1

TO
F Mastitis S2 1 1
GRAMO Mastitis Sx 1 1
H Mastitis Sx 4 1 3
I Mastitis S3 7 1 4 2
RI
j Mastitis S1 3 1 2
k Mastitis S0 1 1
SC
L Mastitis Sx 1 1
METRO Mastitis S0 1 1
A Mastitis S3 7 2 4 1
U

O Neumonía de ternera S1 0
PAGS Mastitis S1 2 1 1
AN

q Mastitis S1 1 1
R Neumonía de ternera Sx 0
S Mastitis S4 4 1 3
51
M

totales (%) 20 (39%) 25 (49%) 3 (6%) 1 (2%) 2 (4%)

25
Tabla 5. Resultados de la prueba de muestras de suero individuales para anticuerpos contra M. bovis utilizando el

ELISA BioX y MilA (positivo / número total de muestras).

Visita 1 Visita 2 Visita 3 Visita 4

Rebaño BioX MilA BioX MilA BioX MilA BioX MilA
A 2/36 33/36 2/37 20/37 2/38 25/38 1/37 7/37
B 10/54 46/54 5/57 54/57 5/61 33/61 1/47 21/47
C 27/61 54/61 8/61 53/61 5/60 60/60 19/61 57/61
D 15/30 29/30 9/59 48/59 7/60 53/60 6/60 60/60
mi 7/32 31/32 5/30 24/30 3/28 26/28 3/30 22/30
F 17/30 24/30 4/26 22/26 2/30 23/30 0/31 17/31

O
GRAMO 1/61 36/61 5/60 40/60 1/55 54/55 10/47 42/47
H 23/38 38/38 30/7 27/30 2/39 31/39 1/31 14/31

D
I 8/53 45/53 17/44 40/44 3/41 36/41 19/53 50/53
j 18/36 30/36 5/41 28/41 3/34 19/34 2/36 10/36

TA
k 0/25 22/25 22/2 22/11 2/26 16/26 2/26 9/26
L 17/29 29/29 0/44 30/44 3/45 42/45 7/38 33/38
2/35 3/34 4/43 0/40
METRO

A
O
26/65
31/4
34/35
54/65
27/31
18/64
2/32
EP
16/34
53/64
13/32
4/60
1/35
16/43
60/60
28/35
2/60
1/35
16/40
41/60
20/35
AC
PAGS 2/19 16/19 3/21 15/21 2/24 17/24 21/1 21/11
q 7/32 28/32 31/5 24/31 3/33 13/33 1/31 15/31
R 8/42 36/42 3/43 24/43 3/32 14/32 8/46 38/46
S 11/17 15/17 14/35 33/35 30/7 29/30 22/2 22/22
T O
RI
SC
U
AN
M

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