UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICAS

CARRERA: BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: BIOQUÍMICA APLICADA

NOMBRE: Kathlen Rodríguez Zambrano

Laboratorio N°2
LEY DE BEER - LAMBERT

A. Resumen:
Se pretende conocer la Ley de Lambert-Beer, como tambien el método espectrofotométrico,
para la obtencion de absorbancia y de transmitancia, para describir la relación entre la
concentración de la solución y la intensidad de la luz que es absorbida / transmitida, y a
partir de una determinada concentración de una solución, poder obtener la longitud de onda
por la cual se trabajó.
En cuanto a los resultados obtenidos, al realizar los calculos y comparar con el simulador,
con respecto a la absorbancia y a la transmitancia, se pudo observar que la mayoría eran
similares.
Se logró relacionar de forma cualitativa la relación entre el color de la solución y la
concentración. Como tambien se pudo describir la relación entre la concentración de la
solución y la intensidad de la luz que es absorbida / transmitida.

B. Abstract:
It is intended to know the Lambert-Beer Law, as well as the spectrophotometric method, for
obtaining absorbance and transmittance, to describe the relationship between the
concentration of the solution and the intensity of the light that is absorbed / transmitted, and
from a certain concentration of a solution, to be able to obtain the wavelength for which it
was worked.
Regarding the results obtained, when performing the calculations and comparing with the
simulator, with respect to absorbance and transmittance, it was observed that most were
similar.
It was possible to qualitatively relate the relationship between the color of the solution and
the concentration. As it was also possible to describe the relationship between the
concentration of the solution and the intensity of the light that is absorbed / transmitted.

C. Introducción:
Los métodos espectrofotométricos tienen como finalidad medir la intensidad de luz para
determinar la concentración del analito presente en una muestra. Estos métodos
espectrofotométricos se dividen en dos:
• Espectrofotometría de absorción: se mide la Absorbancia (A) del analito, esto es
la luz absorbida por el analito, y esta magnitud se relaciona con la concentración (C).
Siendo la absorbancia directamente proporcional a la concentración.
• Espectrofotometría de emisión: En este caso se mide la luz emitida por un analito
 previamente excitado, la señal emitida se relaciona con la concentración de la especie
que emite luz cuando vuelve desde un estado excitado (estado de mayor energía al
que llegó absorbiendo energía) a su estado basal (estado de menor energía posible
tal como se encuentra naturalmente).
Luz o radiación electromagnética: Se define a la luz como una radiación
electromagnética y la describe como una onda trasversal a la dirección de propagación
(Figura 1).

Onda electromagnética en tres

dimensiones.

Cada onda electromagnética se caracteriza por un conjunto de parámetros que la

definen:

1- Longitud de onda (λ): es la distancia que existe entre dos máximos o dos
mínimos de la onda, se mide en unidades de longitud (cm, µm, nm, etc).

2- Número de onda (ν): corresponde a la recíproca (o la inversa) de la longitud de

onda, se mide en (unidades de longitud) -1: cm-1; nm-1

3- Frecuencia de la onda (ν): representa cuantas veces pasa la onda completa por
un punto fijo en la unidad de tiempo, se mide en Hercios (1 Hz= 1Hertz) que
significa la inversa del segundo siendo 1 Hz = 1/s = s-1
4- Amplitud de la onda (A): se mide desde la línea de avance hasta el máximo de la

onda.

Los parámetros que caracterizan a una radiación electromagnética están

relacionados entre sí de la siguiente manera:
ν = c/λ
La unidad de medida que se usa para la longitud de onda (λ) depende de la región del
espectro electromagnético en la que se esté trabajando. Si estamos en la región visible y la
unidad de medida es nm (nanómetros, corresponde a 10-9 metros). La frecuencia (ν) se
mide generalmente en Hertz (1/s) y c es la velocidad de la luz en el vacío, es una constante
cuyo valor es 3 x 108 m/s o 3 x 1010 cm/s.
A partir de la Física Cuántica, se agregó el concepto de “dualidad onda partícula” y se
comenzó a interpretar a la luz como una onda de “fotones” que se propagan. Dichos
fotones representan paquetes discretos de energía denominados “cuantos”. Con este nuevo
concepto, se interpreta a la luz como una onda que propaga energía y la energía de la onda
(radiación electromagnética) queda definida como:
E=hxν
h: constante de Planck, su valor es 6,63 x 10-34 J.s (J: Joules; J=kg·m2/s2)
ν = c/λ, Se puede reemplazar en la expresión de energía:
E = h x c/λ
Cuando mayor es la frecuencia de la luz mayor será su energía y cuanto mayor sea la longitud
de onda menor será la energía.

Espectro electromagnético:
Cada fuente de luz tiene una determinada longitud de onda.

Aquellas longitudes de onda que corresponden al rango entre 400-700 nm pertenecen a lo

que se denomina región visible del espectro ya que estas longitudes de onda afectan nuestra
retina y provocan que observemos colores.

Absorbancia:
Cuando una determinada longitud de onda, atraviesa una solución que contiene una
especie absorbente, la intensidad (o la potencia) de la radiación disminuye como
consecuencia de la absorción de energía por parte de las especies absorbentes presentes

en la solución.

• Transmitancia de una solución a la fracción de luz que deja pasar dicha solución:
T= P/P0
• Absorbancia de la solución a partir de la transmitancia de la solución como:
A = -log T

Cuanto mayor es la A menor será la T, es decir que, si una solución absorbe mucho,
transmitirá poco. Podemos observar además que de acuerdo a la definición de T y A, ambas
propiedades son adimensionales, ya que se definen a partir de un cociente de la misma
magnitud (P/P0).
Ley de Lambert Y Beer:
Cuando un haz de luz monocromática (de determinada longitud de onda) atraviesa una
solución, la absorbancia es directamente proporcional a la distancia recorrida por la luz
atravesando la solución absorbente y a la concentración del analito en la solución. La
distancia recorrida por la luz atravesando la solución se denomina camino óptico y se mide
generalmente en cm.

P P
0

A=εxbxc

A: absorbancia, adimensional.
ε: coeficiente de extinción molar ó absortividad molar, se define como la unidad de
absorbancia por unidad de concentración y por unidad de longitud de la trayectoria de luz;
es una constante definida que depende de la solución y la longitud de onda, en general su
unidad es la inversa de la molaridad por la inversa de cm, es decir (M x cm)-1 ó L/mol x cm
b:es el camino óptico, en general se mide en cm.
c: es la concentración del analito expresada en molaridad (M).

Curva de calibración: Se aplica cuando los valores del coeficiente de Absortividad Molar
no se conoce y en los casos en los que se necesita realizar una reacción previa para lograr
que el analito se transforme en una especie absorbente. En la práctica generalmente el
analito no absorbe luz visible, pero es fácil transformarlo en una especie absorbente
mediante una reacción previa que lo transforme en un compuesto coloreado (por lo tanto
que absorbe en el visible).

y= bx+a → Abs= b × [C] +a

Donde la representación gráfica de la ley de Lambert y Beer, es una recta. En el eje de las
ordenadas (eje Y) se representan los valores de A y en el eje de las abscisas (eje X) se
representan las concentraciones del analito. La pendiente de la recta corresponde al
producto b.
D. Metodología:
Al realizar el manejo del simulador, lo que se hizo fue:
1- Se seleccionó la solución con la que se quería trabajar; por ejemplo: Cromato de
potasio.

2- Posteriormente se seleccionó la concentración a la cual se quiere trabajar

3- Se quiso trabajar con un ancho de cubeta de 1,5 cm, por lo que se utilizó la regla
para medir la cubeta.

4- Se seleccionó variable en longitud de onda para saber en qué color de esta se

estaba trabajando, como tambien para seleccionar las diferentes longitudes de onda
del espectro visible.
 5- Por último, se hizo click en el botón rojo, para conocer la transmitancia y la
absorbancia a la cual se logró llegar, y tambien para poder saber con ello si la
concentración de la solución estaba diluida o concentrada.

1- Resultados y Análisis de datos:

a) Explicar la tabla de absorbancias y transmitancias

ANCH
O DE LONGIT
N COMPUES CONCENTRACI TRANSMITANC ABSORBANC
LA UD DE
° TO ÓN (mM) IA (%) IA
CUBE ONDA
TA (ua)
(nm)
(c
m)

Mezcla 50 mM 1 508 55,76 0,25

1

Nitrato
2 de 175 mM 1 549 14,99 0,82
cobalto
(II)

Cloruro de
cobalto (II)
3 225 mM 1 549 2,37 1,63

Dicromat
o de 100 µM 1,5 392 27,89 0,55
4
potasio

Cromato de
potasio
5 200 µM 1,5 411 3,72 1,43
 Cloruro de
níquel (II)
6 320 mM 1,5 433 0,28 2,55

Sulfato de
cobre (II)
7 20 mM 0,5 780 79,83 0,10

Permanganato
de potasio
8 700 mM 0,5 544 19,99 0,70

1: Con respecto a la mezcla Su transmitancia es de 55,76% y su absorbancia es de 0,25,

por lo que se puede decir que a mayor transmitancia y a menor absorbancia, más diluida
esta la solución.
2: Con respecto al Nitrato de cobalto (II) Su transmitancia es de 14,99% y su absorbancia
es de 0,82, por lo que se puede decir que a mayor transmitancia y a menor absorbancia,
más diluida esta la solución.
3: Con respecto al Cloruro de cobalto (II) Su transmitancia es de 2,34% y su absorbancia
es de 1,63, por lo que se puede decir que a menor transmitancia y a mayor absorbancia,
menos diluida esta la solución.
4: Con respecto al Dicromato de potasio Su transmitancia es de 27,89% y su absorbancia
es de 0,55, por lo que se puede decir que a mayor transmitancia y a menor absorbancia,
más diluida esta la solución.
5: Con respecto al Cromato de potasio Su transmitancia es de 3,72% y su absorbancia es
de 1,43, por lo que se puede decir que es mayor transmitancia y menor la absorbancia,
obteniéndose una solución ligeramente diluida.
6: Con respecto al Cloruro de níquel Su transmitancia es de 0,28% y su absorbancia es
de 2,55, por lo que se puede decir que a menor transmitancia y a mayor absorbancia, menos
diluida esta la solución.
7: Con respecto al Sulfato de cobre Su transmitancia es de 79,83% y su absorbancia es
de 0,10, por lo que se puede decir que a mayor transmitancia y a menor absorbancia, más
diluida esta la solución.
8: Con respecto al Permanganato de potasio Su transmitancia es de 19,99% y su
absorbancia es de 0,70, por lo que se puede decir que es mayor transmitancia y menor
absorbancia, se obtuvo una dilución concentrada.

b) Completar la siguiente tabla de preparación de las soluciones evaluadas: realizar

los cálculos para la preparación de 25mL de las soluciones evaluadas (Tomar en
cuenta que las unidades son uM o mM dependiendo de la solución.
 APARIENCIA DEL CARACTERÍST CONCENTRAC
N REACTIVO ICAS DEL IÓN
° COMPUESTO REACTIVO REQUERIDA
CÁLCULOS

(mM)

𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

175𝑚𝑀 × 1000𝑚𝐿
= 𝐶𝑓 × 25𝑚𝐿
1 Nitrato de Hexahidratad
cobalto (II) o 𝐶𝑓
4,375𝑚𝑀
175𝑚𝑀 × 25𝑚𝐿
=
1000𝑚𝐿
𝐶𝑓 = 4,375𝑚𝑀

𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

225𝑚𝑀 × 1000𝑚𝐿
= 𝐶𝑓 × 25𝑚𝐿
2 Cloruro de Hexahidratad
cobalto (II) o 5,625𝑚𝑀 𝐶𝑓
225𝑚𝑀 × 25𝑚𝐿
=
1000𝑚𝐿
𝐶𝑓 = 5,625𝑚𝑀

𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

100µ𝑀 × 1000𝑚𝐿
= 𝐶𝑓 × 25𝑚𝐿
Dicromato
3 99% de
de potasio 𝐶𝑓
pureza 2,5µ𝑀
100µ𝑀 × 25𝑚𝐿
=
1000𝑚𝐿
𝐶𝑓 = 2,5µ𝑀

𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

200µ𝑀 × 1000𝑚𝐿
= 𝐶𝑓 × 25𝑚𝐿
Cromato
4 99% de
de potasio 5µ𝑀 𝐶𝑓
pureza
200µ𝑀 × 25𝑚𝐿
=
1000𝑚𝐿
𝐶𝑓 = 5µ𝑀
 𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

320𝑚𝑀 × 1000𝑚𝐿
= 𝐶𝑓 × 25𝑚𝐿
5 Cloruro de Hexahidratado
níquel (II) 8𝑚𝑀 𝐶𝑓
320𝑚𝑀 × 25𝑚𝐿
=
1000𝑚𝐿
𝐶𝑓 = 8𝑚𝑀

𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

20𝑚𝑀 × 1000𝑚𝐿
= 𝐶𝑓 × 25𝑚𝐿
6 Sulfato de
cobre (II) 𝐶𝑓
Pentahidratado 0,5𝑚𝑀
20𝑚𝑀 × 25𝑚𝐿
=
1000𝑚𝐿
𝐶𝑓 = 0,5𝑚𝑀

𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓

700µ𝑀 × 1000𝑚𝐿
= 𝐶𝑓 × 25𝑚𝐿
7 Permanganat
o de potasio 𝐶𝑓
99% de pureza 17,5µ𝑀
700µ𝑀 × 25𝑚𝐿
=
1000𝑚𝐿
𝐶𝑓 = 17,5µ𝑀

c) Completar la siguiente tabla indicando la longitud de onda ideal:

N COMPUESTO COLO LONGITUD DE ONDA IDEAL

° R (nm)
 rojo 508 nm
1 Mezcla
rojo 549 nm
2 Nitrato de cobalto (II)
rosado 549 nm
3 Cloruro de cobalto (II)
naranja 392 nm
4 Dicromato de potasio
do

amarillo 411 nm
5 Cromato de potasio

verde 433 nm
6 Cloruro de níquel (II)
celeste 780 nm
7 Sulfato de cobre (II)
morado 544 nm
8 Permanganato de
potasio

1: Con respecto a la mezcla su longitud de onda es de 508nm y es ideal ya que este

proporciona un color verde, siendo el color complementario de la solución de color rojo.
2: Con respecto al Nitrato de cobalto (II) su longitud de onda es de 549nm y es ideal ya
que este proporciona un color verde, siendo el color complementario de la solución de color
rojo.
3: Con respecto al Cloruro de cobalto (II) su longitud de onda es de 549nm y es ideal ya
que este proporciona un color verde, siendo el color complementario de la solución de color
rosado.
4: Con respecto al Dicromato de potasio su longitud de onda es de 392nm y es ideal ya
que este proporciona un color morado, siendo el color complementario de la solución de
color naranjado.
5: Con respecto al Cromato de potasio su longitud de onda es de 411nm y es ideal ya que
este proporciona un color morado, siendo el color complementario de la solución de color
amarillo.
6: Con respecto al Cloruro de níquel su longitud de onda es de 433nm y es ideal ya que
este proporciona un color azul, siendo el color complementario de la solución de color verde.
7: Con respecto al Sulfato de cobre su longitud de onda es de 780nm y es ideal ya que
este proporciona un color café, siendo el color complementario de la solución de color
celeste.
8: Con respecto al Permanganato de potasio su longitud de onda es de 544nm y es ideal
ya que este proporciona un color verde, siendo el color complementario de la solución de
color morado.

d) Obtener absorbancia y transmitancia usando fórmulas (los resultados deben

ser los mismos que los que se obtuvieron en el simulador)
Como se sabe, las fórmulas para hallar absorbancia y transmitancia, son las siguientes:
𝑃
𝑇= 𝑃𝑜
→ 𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑃
𝐴= −𝐿𝑜𝑔 𝑃𝑜 → 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
Mezcla:
𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑇 = 10−0,25 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 0,5623 × 100 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 56,23
𝑇 = 56,23% 𝐴 = 0,25

Nitrato de cobalto (II):

𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑇 = 10−0,82 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 0,1513 × 100 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 15.13
𝑇 = 15,13% 𝐴 = 0,82

Cloruro de cobalto (II):

𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑇 = 10−1,63 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 0,0234 × 100 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 2,34
𝑇 = 2,34% 𝐴 = 1,63

Dicromato de potasio:
𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑇 = 10−0,55 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 0,282 × 100 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 28,2
𝑇 = 28,2% 𝐴 = 0,55

Cromato de potasio:
𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑇 = 10−1,43 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 0,0372 × 100 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 3,72
𝑇 = 3,72% 𝐴 = 1,43

Cloruro de níquel (II):

𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑇 = 10−2,55 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 2,82 × 100 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 0,28
𝑇 = 0,28% 𝐴 = 2,55

Sulfato de cobre (II):

𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠.
𝑇 = 10−0.10 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 0,7943 × 100 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 79,43
𝑇 = 79,43% 𝐴 = 0,10

Permanganato de potasio:
𝑇 = 10−𝐴𝑏𝑠. 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 𝑇
𝑇 = 10−0,70 𝐴 = 2 − 𝐿𝑜𝑔 19,95
𝑇 = 0,1995 × 100 𝐴 = 0,70
𝑇 = 19,95%
2- Conclusiones:
• Se logró relacionar de forma cualitativa la relación entre el color de la solución y la
concentración.
• Se logró describir la relación entre la concentración de la solución y la intensidad de la luz
que es absorbida / transmitida.
• Se conoció de forma teórica la relación entre la absorbancia, absortividad molar, longitud
de trayectoria, y concentración en la Ley de Beer.
3- Preguntas complementarias:
Explica el fundamento e investiga el protocolo del estudio espectrofotométrico de las siguientes
muestras:
1) Glucosa en sangre
La determinación de glucosa en sangre depende de su concentración, ya que permite evaluar las
alteraciones, desde una hiperglicemia o un sindrome como la diabetes mellitus.
Se basa en que la enzima Glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de β- D glucosa a ácido
glucónico , utilizando oxígeno molecular (O2) como aceptor de electrones, con la producción
concomitante de H2O2. Este H2O2 (peróxido de hidrógeno) reacciona con la 4-amino antipirina y el
p-HBS (que es el sustituto del fenol) y en presencia de la peroxidasa se forma un compuesto
coloreado rojo de iminoquinona. Cuya intensidad de color es proporcional a la concentración de
glucosa en la muestra.
GOD
Β-D-Glucosa + H2O + O2 H2O2 + D-Acido glucónico
Peroxidasa
H2O2 + la 4-amino antipirina + p-HBS Iminoquinona + H2O

La concentración de glucosa es medida mediante un espectrofotómetro a una longitud de onda de

505nm, mediante el método Enzimático colorimétrico de Trinder.

2) Proteínas por el método de Lowry

Las proteínas son macromoleculas, ampliamente distribuidos en el organismo, esenciales para la
vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas,
hormonas, anticuerpos, factores de coagulación.
Es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos estados de enfermedad. En
condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas, etc., suelen
presentarse hipoproteinemias, mientras que, en otras como mieloma múltiple, endocarditis
bacteriana y hemoconcentración de diversos orígenes, (ej.: deshidratación) se observan
hiperproteinemia.
Se basa en que las proteínas séricas reaccionan con los iones cúpricos en medio alcalino forman
un complejo coloreado azul. La cantidad de color es proporcional a la concentración de proteína
conocida.
Alcalino
Proteinas + Cu+ + Complejo Cu++ - Proteinas

La concentración de proteínas es medida mediante un espectrofotómetro a una longitud de onda

de 540nm, mediante el método de Lowry o Colorimétrico de punto final.

3) Creatinina en orina
Se basa en que la creatinina reacciona con el picrato de sodio en un medio alcalino formando un
complejo coloreado rojo. Siendo la cantidad de color proporcional a la concentración de creatinina
en la muestra.
Alcalino
Creatinina + Picrato de sodio Complejo Picrato-Creatinina

La concentración de creatinina es medida mediante un espectrofotómetro a una longitud de onda

de 510nm, mediante el método Cinético químico (reaccion de Jaffe).

4) Hierro en harina
Para el análisis de hierro inorgánico en harina, Se basa en la determinación de ion ferroso mediante
espectrofotometria por la formación de un complejo coloreado utilizando los cromógenos
siguientes: α, α'-dipiridilo (2,2" bipiridina); batofenantrolina (sal disulfónica de la 4, 7-difenil-1,10
fenantrolina) o Ferrozina Ácido (3-(2-piridil)-5, 6.bis-(4-fenilsulfónico)-1, 2, 4-triazina). La longitud
de onda de máxima absorción es de 521 nm para el dipiridilo, 535 nm para la batofenantrolina y
562 nm para la ferrozina. La reacción de color debe llevarse a cabo bajo condiciones controladas
de pH según el cromógeno para reducir la competencia de los iones hidronio (H3O + ) por el ligante,
por lo que se agrega una solución de acetato de sodio 2M.

H. Bibliografía:

García, A.Determinación de proteínas en hojas de Citrus. I. Métodos e interferencias. Revisado

de:
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Chambi, E.(2015) Determinación de hierro y metales pesados en harinas fortificadas para evaluar
su calidad e inocuidad. Revisado de:
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Chambi%20Yana%2c%20Eloy.pdf?sequence=1&isAllowed=y

a/a Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 1. Espectrofotometría. Revisado de

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1