1 Wilsonetal.2012.en - Es

Vea discusiones, estadísticas y perfiles de autores para esta publicación en: https://www.researchgate.
net/publication/259333843
Enzimas de restricción en microbiología, biotecnología y bioquímica
Artículo · Noviembre 2012
CITACIÓN LEE
1 4.886
4 autores , incluso:
Geoffrey Graham Wilson Daniel Heiter
Biolabs de Nueva Inglaterra Biolabs de Nueva Inglaterra
136 PUBLICACIONES 5.380 CITACIONES dieciséis PUBLICACIONES 243 CITACIONES
VER EL PERFIL VER EL PERFIL
Algunos de los autores de esta publicación también están trabajando en estos proyectos relacionados:
Enzimas de corte de ADN Ver Proyecto
Todo el contenido que sigue a esta página fue subido por Geoffrey Graham Wilson el 17 de diciembre de 2013.
El usuario ha solicitado una mejora del archivo descargado.

19
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Enzimas de restricción en microbiología,

biotecnología y bioquímica
Geoffrey G. Wilson, * Hua Wang, ** Daniel F. Heiter y *** Keith D.

Lunnen ****
Recibido: octubre de 2012 / Aceptado: noviembre de 2012
Desde su descubrimiento en los años setenta, una colección de enzimas simples denominadas endonucleasas de
restricción Tipo II, elaboradas por microbios para protegerse de infecciones virales, han transformado la biología
molecular, engendraron la industria de la biotecnología multimillonaria y aportaron conocimientos fundamentales
sobre la bioquímica de vida, salud y enfermedad. En este artículo describimos cómo se descubrieron estas enzimas
y repasamos sus propiedades, organizaciones y genética. Resumimos las ideas actuales sobre el mecanismo
subyacente a su notable capacidad para reconocer y unirse a secuencias de pares de bases específicas en el ADN,
y discutimos por qué estas ideas podrían no ser correctas. Concluimos proponiendo una explicación alternativa para
el reconocimiento de secuencias que resuelve ciertas inconsistencias y proporciona, en nuestra opinión, una
descripción más satisfactoria del mecanismo.
Palabras clave: ADN, especificidad, reconocimiento, discriminación, restricción, modificación,

endonucleasa, metiltransferasa, cristalografía de rayos X, surco mayor, surco menor, enlace
de hidrógeno, choque estérico, atracción electrostática, repulsión
“La consecuencia de mayor alcance del surgimiento de la tecnología del ADN recombinante han
sido los grandes avances logrados en la comprensión de los procesos fundamentales de la vida y la
capacidad de investigar problemas que antes eran inaccesibles. De innumerables investigaciones ha
surgido la apreciación de que nada en el mundo creado por el hombre rivaliza con la complejidad y
diversidad de este
* New England Biolabs, Inc., 240 County Road, Ipswich, MA 01938, EE. UU. Tel: 978-380-7370; correo
electrónico: wilson@neb.com
20
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
organismos terrestres. Ningún sistema de información creado por el hombre inventado hasta la fecha se acerca a
contener la cantidad de información codificada en sus genomas o abarcar la complejidad de la intrincada maquinaria
para su funcionamiento. Hemos aprendido lo suficiente como para revelar cuánto desconocemos y para reconocer
que los secretos de la naturaleza no están más allá de nuestras capacidades de descubrimiento ".
Paul Berg y Janet Mertz. 'Reflexiones personales sobre los orígenes y aparición de la tecnología de
ADN recombinante' (Berg & Mertz, 2010)
Introducción
El ADN es el depósito bioquímico de información genética, pero es más que eso. A lo largo de su
longitud se encuentran incrustadas secuencias de "reconocimiento" a las que se unen las proteínas para
convertir esta información en un organismo vivo. Estas proteínas regulan procesos bioquímicos como la
transcripción, la replicación y división del ADN, la recombinación y reparación, la modificación epigenética y
probablemente otros aún por descubrir. El reconocimiento de secuencias es fundamental para muchos
procesos celulares y, para las proteínas implicadas, puede significar buscar entre miles de secuencias de ADN
diferentes para encontrar la correcta, el equivalente molecular de encontrar una aguja en un pajar. Se ha
investigado y debatido mucho cómo ocurre esto, pero aún no se ha encontrado una explicación satisfactoria.
Entre todas las proteínas que se unen a la secuencia de ADN, específicamente de esta manera, las enzimas
de restricción se consideran las más exigentes. Estas enzimas se encuentran naturalmente en bacterias y arqueas y
actúan para proteger a los microbios de infecciones por virus y moléculas de ADN parasitarias. Las enzimas de
restricción se unen a secuencias cortas de pares de bases en el ADN y catalizan la escisión de las dos cadenas de ADN
en la vecindad de los sitios de unión, rompiendo el ADN en fragmentos. Esta escisión se puede detectar con gran
sensibilidad. in vitro, y así, la tasa de error de las enzimas de restricción (la frecuencia con la que se unen y cortan las
secuencias "incorrectas") se puede medir con precisión. Para la mayoría, la tasa de error es muy baja, 10- 5 a 10- 6, o
menos (Halford, Baldwin y Vipond, 1993; Taylor y Halford, 1989). Para algunos, es demasiado bajo para medirlo.
Debido a que las enzimas de restricción discriminan con tanta precisión, durante mucho tiempo se las ha
considerado el estándar de oro para estudiar el mecanismo molecular de reconocimiento de secuencias. Comenzando
con EcoRI a fines de la década de 1980 (McClarin et al.,
1986) y luego EcoRV (Winkler et al., 1993) y PvuII * (X. Cheng, Balendiran, Schildkraut y Anderson, 1994) a
principios de la década de 1990, los cristalógrafos de rayos X han resuelto las estructuras de numerosos
complejos de enzima de restricción-ADN en parte para comprender cómo ocurre el reconocimiento. Según
estos y otros estudios, tres
* Las enzimas de restricción se nombran de acuerdo con una convención propuesta por Smith y Nathans (HO Smith & Nathans, 1973) y
posteriormente modificada por Roberts et al., (Roberts et al., 2003)). La primera letra de la enzima (impresa en mayúsculas) se
deriva del nombre de género del organismo que produce la enzima, y la segunda y tercera letras (en minúsculas) se derivan del
nombre de la especie. Estos son seguidos por identificadores de cepas o aislamientos, cuando es necesario, y luego por números
romanos en mayúsculas para distinguir entre diferentes enzimas producidas por el mismo organismo. Por ejemplo, la enzima de
restricción producida por la bacteria Escherichia coli cepa 53k se denomina Eco53kI, y las tres enzimas de restricción elaboradas por
Deinococcus radiophilus se denominan DraI, DraII y DraIII. Dado que las dos primeras letras de la especie, 'ra', nombre se aplican a
las enzimas D.radiophilus,
21
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Se han propuesto procesos, todos dependiendo de una forma u otra de los enlaces de hidrógeno. Estos se
denominan "lectura directa", "lectura indirecta" y "mediada por agua" (Otwinowski et al., 1988).
La "lectura directa" está mediada por enlaces de hidrógeno (enlaces H) entre los aminoácidos y los bordes
de los pares de bases en los surcos mayor y menor del ADN (Seeman, Rosenberg y Rich, 1976). Cada secuencia de
ADN puede soportar un patrón único de enlaces H y, según esta idea, las proteínas se unen solo a secuencias que
proporcionan un patrón exacto (McClarin, et al., 1986). La "lectura indirecta" está mediada por enlaces H entre los
aminoácidos y los grupos fosfato de la cadena principal del ADN. Estos normalmente son inespecíficos pero pueden
volverse específicos, de acuerdo con esta idea, si el ADN se distorsiona de una manera dependiente de la secuencia
y los fosfatos ocupan posiciones en las que pueden proporcionar un patrón de enlaces H que ninguna otra secuencia
puede (Otwinowski, et al. al., 1988). La idea detrás de los enlaces H 'mediados por agua' es que los contactos que
determinan la secuencia se pueden transmitir a través de moléculas de agua colocadas entre los átomos donantes y
aceptores participantes. Un enlace H entre un aminoácido y una molécula de agua que está en sí mismo unido a una
base de ADN puede facilitar el reconocimiento, según esta idea, al igual que un enlace H directo entre el aminoácido
y la base.
Hay motivos para sospechar que esta no es toda la historia. Estos factores podrían explicar cómo una
proteína adquiere afinidad por su secuencia de reconocimiento, pero no por qué no se une a todas las demás
secuencias, es decir, por qué es específica para una sola secuencia. Si los enlaces H median la especificidad,
tenemos que suponer que
es el ausencia de uno u otro de estos que impida la unión a las otras secuencias. Eso
no está del todo claro cómo podría suceder esto. El análisis de las estructuras cristalinas muestra que a menudo
hay múltiples enlaces H (40, 50 o incluso más) entre una proteína y la secuencia que reconoce. Entonces, ¿cómo
podría la ausencia de solo uno o dos de estos ser suficiente para precipitar la fuerte caída de un millón de veces en
la unión a secuencias "incorrectas" que es típica de las enzimas de restricción?
1. Sistemas de restricción-modificación
Las enzimas de restricción, o más formalmente 'endonucleasas de restricción' (REase), se encuentran

naturalmente en todas las bacterias y arqueas de vida libre y sirven para proteger a estos microbios de
infecciones por virus y moléculas de ADN parasitarias. Las enzimas de restricción 'reconocen' y se unen a
secuencias cortas de pares de bases en el ADN y escinden las dos cadenas de ADN dondequiera que ocurran
estas secuencias. La escisión ('hidrólisis de hebras') rompe el ADN en fragmentos y altera su contenido genético.
El propio ADN de los microbios está protegido de esta escisión por una o más enzimas acompañantes
denominadas "metiltransferasas de modificación" (MTasas). Estos reconocen la misma secuencia de ADN que la
REase, pero en lugar de escindir esta secuencia, agregan un grupo metilo a una base en cada hebra de la
secuencia. Los grupos metilo 'disfrazan' la secuencia de tal manera que ya no es reconocida por REase, y por lo
tanto ya no es susceptible de escisión. Juntos, un REase y su (s) MTasa (s) correspondientes forman un sistema
de modificación de restricción (RM). Las secuencias de ADN reconocidas por REasas y MTasas, sus
'especificidades', varían de cuatro a ocho pb de longitud y varían considerablemente (Tabla 1). Muchos tipos
diferentes de sistemas de modificación de restricciones
22
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
se han descubierto con cientos de especificidades de secuencia diferentes (Roberts y Macelis, 1998).
1.1 Restricción y modificación de virus
Las enzimas de restricción deben su descubrimiento a las investigaciones que comenzaron en la década
de 1950 sobre el fenómeno microbiano de la 'variación controlada por el huésped' de los virus (Bertani y Weigle,
1953). La infectividad de los virus bacterianos ('bacteriófagos' o 'fagos' para abreviar) se encontró, sobre la cepa
bacteriana ('huésped') en la que creció el fago por última vez (Anderson y Felix, 1952; Luria y Human, 1952); ver
(Luria,
1953) para una revisión temprana integral. Cuando se cultivan en el mismo hospedador en el que crecieron previamente,
cada partícula de virus es infecciosa y, si se aplica a un césped de células bacterianas en una placa de agar, da lugar a
una pequeña zona clara, o 'placa', con una 'eficiencia de siembra '(eop) de uno (Figura 1A). Sin embargo, cuando se cultiva
en un nuevo huésped, el fago a menudo crece muy deficientemente al principio, solo una partícula de virus de cada
100.000, normalmente, da lugar a una placa (eop = 10 5). Sin embargo, los raros supervivientes que crecen en esta nueva
cepa, se propagan normalmente a partir de entonces (eop = 1), pero ahora crecen muy mal en el huésped anterior (eop =
10- 6, Por ejemplo) La re-propagación en este huésped anterior da como resultado fagos que crecen bien en él nuevamente
(eop = 1), pero ahora crecen pobremente una vez más en el segundo huésped (Figura 1B).
La barrera contra la infección que encuentran los fagos cuando infectan una nueva bacteria se
denominó "restricción" y se descubrió que se debía a la degradación del ADN viral. La adaptación que
experimentan los sobrevivientes que les permite propagarse de manera eficiente se denominó ``
modificación '', y se descubrió que se debía a un cambio no heredable conferido a su ADN por la bacteria
(revisado por (Arber,
1965)). Ahora sabemos que (Figura 1C):
1. La restricción está causada por la escisión específica de secuencia del ADN viral y la subsiguiente
degradación exonucleolítica de los fragmentos;
2. La modificación está provocada por la adición de un grupo metilo a una base de adenina
(A) o citosina (C) en cada hebra de la secuencia;
3. La modificación es el medio por el cual las células protegen su propio ADN de la autorrestricción;
y,
4. Cuando el ADN viral se modifica, es un error biológico, un caso de identidad equivocada.
Cuando el ADN viral no modificado ingresa a una célula bacteriana, la enzima de restricción y la enzima de
modificación compiten por las mismas secuencias de reconocimiento en el ADN. Si la enzima de restricción los
encuentra primero, el ADN se escinde. Pero si la enzima de modificación los encuentra primero, en cambio, las
secuencias se metilan y se vuelven resistentes a la escisión. Un virus típico puede tener de 10 a 20 sitios de
reconocimiento en su ADN para cualquier enzima de restricción en particular. Todos estos deben estar metilados para
que el ADN se modifique, mientras que solo es necesario escindir uno o dos para que el ADN se destruya. Los REases
tienen una clara ventaja en su competencia con los MTases, entonces, lo que podría explicar por qué los sistemas de
RM son tan efectivos. La 'eficiencia del enchapado' es una medida, de hecho, de la probabilidad de que MTase
modifique todos de las secuencias de reconocimiento antes de que REases se escinda incluso uno.
23
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Para permanecer resistentes a la restricción, las moléculas de ADN deben replicarse continuamente en
presencia de la misma MTasa. Esto se debe a que la modificación se pierde cuando el ADN se replica; es un
cambio epigenético, más que genético. Cuando una bifurcación de replicación se mueve a través de una
secuencia completamente modificada, los dos dúplex hijas resultantes son "hemi-metilados". Sus cadenas de ADN
parentales permanecen metiladas, pero sus cadenas recién replicadas no están metiladas, porque la ADN
polimerasa incorpora citosina y adenina en lugar de la citosina metilada y la adenina metilada anteriores (Figura
1C) .Al igual que el ADN completamente metilado, el ADN hemi-metilado suele ser resistente a la restricción, pero
si se produce otra ronda de replicación, dos de los cuatro dúplex nieta ahora carecen de metilación y están
expuestos a la escisión de REase. Si la MTase está presente, La escisión se evita mediante la remetilación de las
cadenas de ADN recién replicadas una vez que emergen de la horquilla de replicación. Pero si la MTasa no está
presente, la modificación de las moléculas de ADN de la progenie desaparece. Es por esta razón que los virus
deben propagarse continuamente en la misma bacteria para mantener la resistencia a las enzimas de restricción de
esa célula. Y por qué, cuando infectan una nueva bacteria y se vuelven resistentes a los sistemas de restricción de
esa célula, automáticamente pierden resistencia a los del huésped anterior.
La forma en que operan los sistemas de RM se desentrañó en gran medida durante la década de 1960
mediante el uso de equipo de laboratorio común, un puñado de cepas bacterianas, una pequeña colección de fagos
y técnicas convencionales de genética microbiana. El tema era académico y tenía pocas promesas obvias de
beneficios para la sociedad (Arber & Linn, 1969). Sin embargo, sentó las bases para los descubrimientos que han
transformado disciplinas tan variadas como la biología, la medicina, la agricultura, la paleontología y la medicina
forense y dio lugar a la industria biotecnológica multimillonaria. Las lecciones aquí, cuya importancia difícilmente se
puede exagerar, son que las grandes recompensas pueden provenir de rincones inesperados de la investigación
pura y de simples experimentos con organismos simples. Estas lecciones son especialmente relevantes para los
científicos en desarrollo
países, donde la escasez de equipo y financiación puede frenar fácilmente el entusiasmo.

24
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Figura 1. Restricción y modificación de bacteriófagos.

Figura 1A. Cambios en la infectividad del fago (eop: "eficacia de la siembra en placa") causados por la restricción y
por la modificación. Tres placas de Petri que contenían medios sólidos de crecimiento bacteriano (agar rico) se
sembraron con césped de E. coli que no contiene el sistema RM (placa izquierda), el sistema PstI RM clonado (placa
central) o el sistema PstII RM clonado (placa derecha). Se colocaron gotas de 10 microlitros de diluciones de
bacteriófago phi80 sobre las superficies de estas placas. Las placas se incubaron durante la noche a 37 grados.
C., y luego fotografiado. El número aproximado de partículas virales aplicadas al césped en cada gota de 10
microlitros se indica encima de cada placa; las gotas menos concentradas contenían aproximadamente 100
partículas virales. En ausencia de un sistema de RM, cada partícula viral, más o menos, da lugar durante la
incubación a una pequeña zona clara (una "placa") como resultado de ciclos repetidos de infección, muerte celular
bacteriana y liberación del virus de la progenie. En las gotas que contienen muchas partículas virales, las placas se
fusionan para formar una gran zona circular de aclaramiento. La muestra de fago utilizada en la fila superior ( φ 80.O)
se cultivó previamente en E. coli carece de un sistema de RM. El fago continúa creciendo bien en esta cepa (fila
superior, placa izquierda; eop = 1), pero la infectividad se reduce en gran medida en las otras dos cepas debido a
la restricción del PstI (fila superior, placa central; eop = 10- 5), o el PstII (fila superior, placa derecha; eop = 10- 6)
enzimas de restricción. Sin embargo, surgen algunas placas en estas bacterias, de

25
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
fagos que se han modificado y ahora pueden crecer eficientemente como resultado. El fago en la fila del
medio ( φ 80.PstI) creció anteriormente en E. coli que contiene el sistema PstI RM. Este crece eficientemente
en ausencia de un sistema RM (fila central, izquierda; eop = 1) porque no hay enzima de restricción
presente, y también en presencia de PstI (fila central, centro; eop = 1) porque el ADN del fago lleva el
modificación protectora, PstIspecific. Sin embargo, crece mal en el sistema PstII RM, porque esta
modificación no protege al ADN viral de la restricción por PstII (fila central, placa derecha; eop = 10- 6). Por el
contrario, el fago de la fila inferior ( φ 80.PstII) creció anteriormente en E. coli que contiene el sistema PstII
RM. Esto también crece de manera eficiente en ausencia de un sistema de RM (fila inferior, izquierda; eop =
1) y en presencia de PstII (fila inferior, derecha; eop = 1) ya que el ADN lleva la modificación específica de
PstII, pero la fago crece mal, ahora, en PstI (fila inferior, placa del medio; eop = 10- 5).
Figura 1B. El efecto de la restricción y modificación sobre la infectividad de los fagos. Esta figura resume los
resultados que se muestran en la Figura 1A. Los círculos representan partículas virales y los oblongos representan
bacterias. Los virus con ADN modificado debido al crecimiento previo en células que contienen un sistema RM se
muestran en color. Estos crecen de manera eficiente (eop = 1) en las mismas células porque su ADN está protegido de la
restricción por ese sistema de RM. También crecen de manera eficiente (eop = 1) en células que no restringen. Estos
están representados con caras sonrientes. Sin embargo, su infectividad es mucho menor (eop = 10- 5
o 10- 6) en células que tienen un sistema de RM diferente porque la modificación es específica del sistema; no protege
contra las enzimas de restricción de diferente especificidad de secuencia.
Figura 1C. Caricatura de sistemas de modificación-restricción. Las enzimas de restricción sirven para
proteger a las bacterias y arqueas de las moléculas de ADN y los virus parásitos. Estas enzimas se unen a
secuencias específicas de pares de bases en el ADN no modificado y escinden el ADN en fragmentos
("restricción"). Posteriormente, estos fragmentos son degradados por exonucleasas. Las células protegen su propio
ADN de la restricción metilando las secuencias diana ("modificación"), haciendo que las secuencias sean
resistentes a la escisión. La modificación es epigenética, pero el modo semiconservador de replicación del ADN
asegura que una hebra de ADN de cada dúplex hijo permanece modificada después del paso de la horquilla de
replicación. Los sistemas RM son efectivos, pero fallan con una probabilidad característica igual a la eficiencia del
enchapado (eop). La falla ocurre cuando el ADN viral en lugar de estar restringido, se modifica por error. Una vez
que se produce dicha modificación, el ADN viral es inmune a la restricción por parte de ese sistema de RM durante
el tiempo que se replica en su presencia.
1.2 El descubrimiento de las enzimas de restricción
Fue la aplicación de la bioquímica, y en particular la purificación de proteínas, al campo de la

restricción y modificación a finales de los sesenta lo que lo cambió todo. El primer REase en ser purificado,
EcoKI de Escherichia coli K12 (Meselson y yuan, 1968), demostró ser de la clase, más tarde denominado Tipo
I que corta el ADN al azar lejos de su secuencia de reconocimiento. Las enzimas de este tipo son muy
grandes: aproximadamente 4000 aminoácidos en total, con una masa molecular de más de 400 kDa.
Comprenden cinco subunidades de tres proteínas diferentes y reconocen de forma característica secuencias
de ADN discontinuas, en el caso de EcoKI, AACNNNNNNGTGC, donde N = cualquier base (Kan,
Lautenberger, Edgell y Hutchison, 1979). Además de requerir
26
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
iones de magnesio (Mg 2+), que la mayoría de las REases necesitan, las enzimas de tipo I también requieren los
cofactores adenosina trifosfato (ATP) y S-adenosil metionina (AdoMet) para su actividad. EcoKI continúa siendo
estudiado hasta el día de hoy, pero si bien es fascinante desde un punto de vista enzimático, no se han encontrado
usos prácticos para las enzimas de Tipo I, y no los discutiremos más aquí. Los lectores pueden obtener más
información consultando revisiones recientes como (Bourniquel y Bickle, 2002; McClelland y Szczelkun, 2004; NE
Murray, 2000; youell y Firman, 2008).
Poco después de la purificación de EcoKI, se informaron las propiedades de HindII, una enzima de
restricción de diferente tipo que ahora se llama Tipo II. Aislado de la bacteria Haemophilus influenzae Rd,
HindII era más simple que EcoKI y solo requería Mg 2+ iones para la actividad (HO Smith y Wilcox, 1970).
Después de un análisis minucioso, se descubrió que HindII reconoce y escinde una secuencia de ADN
continua, GTy | RAC, donde y = pirimidina (C o T), R = purina (A o G) y '|' indica la posición de división en
cada hebra (Kelly y Smith, 1970). El laboratorio de Smith descubrió y purificó la MTasa HindII
correspondiente ('cognada'), y demostró que reconocía la misma secuencia de ADN que HindII (Roy & Smith,
1973a, 1973b), demostrando que las dos enzimas formaban un sistema de RM de exactamente del tipo
predicho anteriormente (Arber, 1965).
La secuencia de reconocimiento de HindII tiene una simetría rotacional doble, también

denominada 'palindrómica', lo que significa que las mitades derecha e izquierda son idénticas
pero invertidas, y que las secuencias de las dos cadenas son las mismas cuando se leen en el
mismo (convencionalmente 5 ' a 3 ') dirección. Posteriormente, se demostró que HindII actúa
como un homodímero compuesto por dos subunidades idénticas de 258 aminoácidos que se
asocian entre sí en orientaciones opuestas. Esta organización molecular explica claramente la
simetría de la secuencia de reconocimiento, porque lo que una subunidad reconoce en una
orientación, la otra subunidad reconoce inevitablemente en la orientación opuesta. El tiempo
ha demostrado que esta organización es común entre las ERA Tipo II. Se han caracterizado un
gran número de estos (Tabla 2), y se han resuelto las estructuras cristalinas de rayos X de
muchos, incluida la de HincII,
Es importante destacar que Smith descubrió que HindII escinde el ADN en un fijo ubicación dentro de
su secuencia de reconocimiento (GTy | RAC) dividiéndola en dos y produciendo fragmentos con extremos
'romos', que no sobresalen. Esta propiedad permitió a Nathans y sus colaboradores utilizar HindII, y
posteriormente otras REasas, como herramientas moleculares para analizar moléculas de ADN (Nathans et
al., 1974). Los fragmentos producidos por HindII se pudieron separar y visualizar mediante electroforesis en
gel (Danna & Nathans, 1971). Y las posiciones en las que se escindieron las moléculas de ADN podrían
usarse como puntos de referencia físicos para construir 'mapas de restricción' físicos para compararlos con
los 'mapas genéticos' correspondientes (Nathans y Smith, 1975; Roberts, 1976) .Juntos, los tres
descubrimientos de cómo funcionan los sistemas de modificación de restricciones; de la enzima de restricción
HindII; y de los nuevos procedimientos que permitieron tales enzimas, Werner Arber, Hamilton Smith,
Medicina en 1978 “Por el descubrimiento de enzimas de restricción y su aplicación a problemas de genética molecular” .
Una nota a pie de página interesante sobre el descubrimiento de HindII ejemplifica el papel de la buena suerte,
la "casualidad", en la ciencia (Halford, 2009). H. influenzae Rd contiene
27
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
un segundo REase, HindIII, que co-purifica con HindII. HindIII reconoce una secuencia completamente diferente,
AAGCTT, y la escinde de una manera diferente para producir fragmentos con extremos monocatenarios que
sobresalen. Smith no sabía que su preparación enzimática era una mezcla de ambas enzimas, pero por casualidad,
el sustrato de ADN utilizado para analizar esta preparación, el del fago T7, no tiene sitios de reconocimiento para
HindIII, solo sitios para HindII. Debido a que no había sitios para que HindIII se escindiera, su actividad estaba
enmascarada, dejando solo la escisión por HindII para ser observada y analizada. La mayoría de las moléculas de
ADN grandes contienen sitios para ambas enzimas, y si se hubiera usado uno de estos en lugar del ADN T7, ¡el
resultado habría sido demasiado confuso para desentrañar! La existencia de HindIII surgió más tarde, durante el
análisis de la H. influenzae
Rd MTases (Roy & Smith, 1973a, 1973b), y durante el trabajo de otros (Old, Murray y Roizes, 1975).
Antes de este trabajo, siempre se habían identificado sistemas de restricción en vivo, por su efecto sobre la
infección por fagos. Esto limitó las investigaciones a bacterias que podrían manipularse fácilmente en el laboratorio,
principalmente E. coli y Salmonela —Y para qué fagos se habían aislado. Quizás el efecto de mayor alcance del
trabajo de Smith y Nathans fue su demostración de que las enzimas de restricción útiles podían identificarse
bioquímicamente, fraccionando extractos de células y analizando la escisión del ADN mediante electroforesis en gel.
Ahora se podría examinar cualquier bacteria o arqueón para detectar la presencia de enzimas de restricción, o más
exactamente, la presencia de endonucleasas específicas de secuencia, siempre que el microbio pudiera cultivarse.
Este hallazgo abrió las puertas para el descubrimiento de enzimas de restricción, y las enzimas de restricción de Tipo
II con nuevas especificidades de secuencia y nuevas propiedades de escisión comenzaron a encontrarse
dondequiera que se buscaran. En 1976, seis años después de HindII, se habían descubierto enzimas de tipo II que
reconocían más de 40 secuencias de ADN diferentes ("especificidades") (Roberts, 1976). Para 1980, Se han
encontrado diferentes especificidades (Roberts, 1980); y en 1990, más de 160 (Roberts, 1990). Hoy en día, este
número es de alrededor de 300, pero el recuento importa menos, ahora, porque las especificidades de ciertas
enzimas de Tipo II pueden cambiarse por intercambio de dominio (Jurenaite-Urbanaviciene et al., 2007) y por
mutagénesis racional (Morgan & Luyten, 2009). permitiendo que se creen potencialmente cientos de nuevas
especificidades a voluntad en el laboratorio.
1.3 ADN recombinante
Además de permitir la fragmentación y el mapeo físico de las moléculas de ADN, el descubrimiento de las
REasas de Tipo II estimuló un avance aún mayor: la clonación de genes, o más formalmente, la "Tecnología de
ADN recombinante". Las secciones manejables de cualquier molécula de ADN de cualquier organismo ahora
podrían aislarse, unirse a vectores virales o plásmidos autorreplicantes, devolverse a las células y multiplicarse, y
luego analizarse, secuenciarse y manipularse experimentalmente. Un número incalculable de descubrimientos que
de otro modo no se podrían haber hecho se han derivado de la clonación de genes, lo que ha aumentado
considerablemente nuestra comprensión de los procesos vivos en la salud y la enfermedad. En reconocimiento a
esto, el Premio Nobel de Química de 1980 fue otorgado a uno de sus inventores (Jackson, Symons y Berg, 1972) ,
Paul Berg de Sanford
Universidad, “Por sus estudios fundamentales de la bioquímica de los ácidos nucleicos, con particular
con respecto al ADN recombinante ”. Curiosamente, otros inventores como Stanley Cohen
28
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
de la Universidad de Stanford y Herbert Boyer de la Universidad de California en San Francisco, no

recibieron este premio, aunque sus contribuciones también fueron originales y decisivas. (Chang y
Cohen, 1974; Cohen, Chang, Boyer y Helling, 1973; Morrow, Cohen y Chang, 1974) .
Un área muy mejorada por la tecnología del ADN recombinante es la purificación de enzimas. Antes de la
clonación de genes, las proteínas solo podían obtenerse de su fuente natural y en la abundancia que dictaba la
naturaleza. A menudo, solo se pueden recuperar pequeñas cantidades y la pureza es marginal. La clonación permitió
que los genes de las proteínas de interés se trasladaran a organismos convenientes como E. coli, y luego se transcribe
y traduce en proteína a ritmos órdenes de magnitud mayores que antes. Se pueden lograr aumentos de rendimiento
de 100 a 1000 veces, o incluso más, mediante esta 'sobreexpresión', lo que da como resultado rendimientos finales
más altos y niveles más altos de pureza. La clonación también separa las proteínas de las actividades contaminantes
presentes en el organismo fuente, evitando mezclas del tipo Smith et al encontrado sin saberlo. Hoy en día, el primer
paso en la purificación de cualquier proteína nueva es el aislamiento o síntesis de su gen, la transferencia a un vector
plasmídico de alta copia y luego la sobreexpresión.
Aquellos que han obtenido el mayor beneficio de la clonación y la sobreexpresión son quizás
los investigadores que utilizan técnicas de ADN recombinante todos los días en sus laboratorios. A los
pocos años de desarrollo del ADN recombinante, se aplicó a las mismas enzimas que permiten esta
tecnología en primer lugar: a las ADN polimerasas (Lin, Rush, Spicer y Konigsberg, 1987; NE Murray y
Kelley,
1979); ADN ligasas (Gottesman, 1976; NE Murray, Bruce y Murray, 1979; Panasenko, Cameron, Davis y
Lehman, 1977; Wilson y Murray, 1979) y polinucleótido quinasa (Midgley y Murray, 1985); y luego a las
propias enzimas de restricción (Lunnen et al., 1988; Walder, Hartley, Donelson y Walder, 1981). Ahora, casi
todas las enzimas disponibles comercialmente que se utilizan para manipular el ADN o el ARN se purifican a
partir de un E. coli sobreexpresión de clon. Como resultado, estas enzimas son más puras, más activas y
estables, y mucho menos costosas, de lo que eran cuando comenzó la tecnología del ADN recombinante.
2. Enzimas de restricción
Se han identificado y caracterizado miles de enzimas de restricción de microbios en

todo el planeta y de la mayoría de los nichos imaginables (Roberts, Vincze, Posfai y Macelis,
2010). Todas las bacterias y arqueas de vida libre las poseen; los intracelulares no. Los genes
de las enzimas de restricción y modificación son principalmente cromosómicos, pero algunos
se encuentran en plásmidos y fagos lisogénicos. Un grupo de virus gigantes que infectan a las
algas unicelulares, Chlorella, también codifican enzimas de restricción (Nelson, Zhang y Van
Etten, 1993; Van Etten y Meints, 1999), pero aparte de estos, las REasas parecen estar
limitadas a los procariotas. REases de tipo II, el tema de este artículo, por definición se
escinden en posiciones fijas dentro o fuera de sus secuencias de reconocimiento,
29
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
2.1 Variedad de enzimas de restricción
Las enzimas de restricción de diferentes microbios a menudo reconocen la misma secuencia de ADN. La
primera enzima descubierta con una especificidad de secuencia particular se denomina 'prototipo', y los ejemplos
posteriores se denominan 'isosquizómeros' (Roberts,
1976). Se han encontrado aproximadamente 300 especificidades de secuencia diferentes entre los miles
de enzimas caracterizadas. Algunas especificidades son comunes y se conocen decenas de
isosquizómeros; otros son raros con quizás sólo uno o dos ejemplos conocidos. Los isosquizómeros a
menudo tienen una similitud obvia en la secuencia de aminoácidos (aa), lo que implica que sus genes
divergieron de un ancestro común y se movieron lateralmente entre especies. Otros isosquizómeros no
muestran ninguna similitud detectable, tal vez implicando orígenes evolutivos independientes.
Sorprendentemente, los REases que reconocen diferentes secuencias de ADN, o que reconocen la
misma secuencia pero la escinden en diferentes posiciones ('neoschizomers'), por lo general no muestran
más similitud aa que las secuencias elegidas al azar, lo que sugiere que, en lugar de divergir de unos
pocos ancestros comunes en el curso de la evolución microbiana,
Las secuencias de reconocimiento de REase de tipo II varían de 4 a 8 pb específicos de longitud, lo que

corresponde a una densidad promedio en el ADN de un sitio cada 4 4 (= 256) pb a uno cada 4 8 (= 65,536) pb. Las enzimas
son a menudo homodímeros que comprenden dos, o a veces cuatro, subunidades idénticas y, como resultado, sus
secuencias de reconocimiento son simétricas y las posiciones de escisión son simétricas (Pingoud, Fuxreiter, Pingoud
y Wende,
2005). La mayoría reconoce secuencias de ADN continuas (por ejemplo, EcoRI: G | AATTC), pero algunas reconocen
secuencias discontinuas (por ejemplo, BglI: GCCNNNN | NGGC), lo que refleja una organización estructural en la que
las dos subunidades de la enzima están más separadas (Tabla 1).
Algunas REasas de Tipo II son proteínas de cadena única ('monómeros') en lugar de dímeros.
Reconocen secuencias que normalmente no son simétricas y se escinden en posiciones fijas fuera de la
secuencia, varias bases en un lado. FokI es un ejemplo bien conocido: reconoce y une la secuencia
dúplex GGATG (complemento: CATCC) y escinde el ADN 9 bases en la misma hebra y 4 bases más
abajo en la hebra complementaria (Tabla 1). Estas enzimas, denominadas Tipo IIS (S = escisión
"desplazada"), comprenden dos dominios, uno para el reconocimiento del ADN y otro para la escisión del
ADN (Szybalski, Kim, Hasan y Podhajska, 1991). Los dos dominios están unidos por una `` bisagra ''
corta y flexible de polipéptido que se cree que mantiene el dominio de escisión alejado del ADN hasta que
se une la secuencia de reconocimiento, después de lo cual se libera el dominio para que tenga lugar la
escisión (Wah, Hirsch,
Varias enzimas de tipo IIS tienen dos sitios catalíticos diferentes. Cada uno escinde una hebra de
ADN específica y, al inactivar un sitio catalítico u otro, estas enzimas se pueden convertir en enzimas de
corte de ADN específicas de la hebra: proteínas que reconocen la misma secuencia de ADN que la enzima
madre, pero escinden solo una hebra de ADN en lugar de ambos (Figura 2B). Varias de estas enzimas
melladoras se han diseñado en nuestro laboratorio (Heiter, Lunnen y Wilson, 2005; Xu et al., 2007) y
proporcionan a los investigadores nuevas herramientas moleculares útiles para investigar y alterar el ADN
(revisado por (Chan, Stoddard Y Xu, 2011)).
30
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
La mayoría de las REasas se descubrieron analizando extractos de células para determinar la actividad de
escisión de ADN específica del sitio, pero rara vez se descubren de esta manera en la actualidad. Se ha aprendido
tanto sobre los sistemas de RM que podemos identificarlos con un alto grado de confianza mediante el análisis de
genomas procarióticos secuenciados. Desde que se secuenciaron los primeros genomas bacterianos (Fleischmann et
al., 1995) y archaeal (Bult et al., 1996) a mediados de la década de 1990, se han secuenciado miles de genomas
procarióticos más, y este número está aumentando rápidamente. Pocos de estos microbios han sido evaluados para
detectar actividades REase, y el análisis bioinformático puede indicarnos cuáles tienen enzimas nuevas o interesantes
que vale la pena perseguir y cuáles no. Rich Roberts, pionero y líder en el campo de las enzimas de restricción y
metiltransferasas, mantiene una base de datos completa de estas enzimas, tanto caracterizadas como putativas
(Roberts, et al., 2010). Se puede acceder a esto libremente en http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html. Con un
promedio de 4-5R-Msystems en cada genoma secuenciado, el número de supuestas enzimas enumeradas en REBASE
ahora excede en gran medida el número de las caracterizadas.
2.2 Genética de enzimas de restricción
Los genes que codifican las enzimas de restricción casi siempre se encuentran junto a los genes que
codifican las metiltransferasas correspondientes. Las orientaciones y órdenes de los genes varían: en algunos
sistemas, los genes R y M divergen; en otros, convergen; y aún en otros, tienen las mismas orientaciones de R luego
M, o M luego R (Wilson y Murray, 1991). Cuando los genes R y M divergen, sus codones de inicio a menudo están
separados por 50-100 pb de secuencia que contiene los promotores individuales y sitios de unión a ribosomas.
Cuando los genes convergen, sus codones de parada suelen estar separados por 30-50 pb que contienen una
repetición invertida que se cree que funciona como un terminador de transcripción bidireccional. En sistemas en los
que los genes tienen las mismas orientaciones, el codón de terminación de un gen a menudo se superpone al codón
de inicio del otro. La organización de un sistema RM tipo II típico, EcoRI, se muestra en la Figura 2C. El estrecho
"vínculo" entre los genes R y M del mismo sistema probablemente se deba a la ventaja de que estar juntos confiere al
receptor durante la transferencia horizontal de genes entre células bacterianas y arqueales.
Por lo general, solo una MTasa acompaña a las REasas que reconocen secuencias simétricas. Estas
MTasa pueden unirse a la secuencia de reconocimiento en ambas orientaciones, ya que es simétrica, por lo que
solo se necesita una enzima para modificar ambas cadenas de ADN. En contraste, dos MTasas generalmente
acompañan a REasas que reconocen secuencias asimétricas, una para modificar cada hebra. Los primeros
sistemas suelen comprender dos genes: R y M. Los últimos suelen comprender tres genes: R, M1 y M2, pero en
algunos casos los dos genes M se fusionan en un gen de doble longitud que codifica una MTasa M1 ~ M2
combinada ( Wilson & Murray, 1991) .Especialmente en sistemas en los que los genes R y M tienen orientaciones
diferentes, a veces está presente un tercer gen que codifica una pequeña 'proteína C' de unión al ADN (Control),
que regula la transcripción de la Gen R (Kaw y Blumenthal, 2010). Otro gen accesorio, denominado V (para
reparación de parche muy corto), a veces acompaña a los sistemas de RM en los que la MTasa produce
5-metilcitosina (m5C). Los genes V codifican una endonucleasa reparadora de desacoplamiento de TG, específica
de secuencia, que contrarresta el daño del ADN derivado de la desaminación de m5C (Bunting et al., 2003);
revisado en (Walsh & Xu, 2006).
31
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Figura 2. Digestión con enzimas de restricción in vitro
Figura 2A. Patrón de fragmentos de electroforesis en gel producido por digestión con enzimas de
restricción. El ADN del plásmido pBC4 se incubó durante 1 hora. a 37 grados
C. con cantidades crecientes de la enzima de restricción de Tipo II EcoO109I. Siguiendo
32
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
En la incubación, las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de
etidio y luego se fotografiaron con iluminación UV. Cada combinación de enzima de restricción-ADN produce un
patrón característico de bandas de fragmentos dependiendo de las ubicaciones de los sitios de reconocimiento de la
enzima dentro de la molécula de ADN.
Figura 2B. Comparaciones de patrones de fragmentos de electroforesis en gel de escisión y corte de

ADN. Panel derecho: ADN plasmídico digerido con PleI, una enzima de restricción que escinde ambas cadenas de
ADN dúplex en la secuencia GAGTC. Panel izquierdo: el mismo ADN digerido con BstNBI, una enzima "melladora"
que escinde solo una hebra de ADN dúplex en la misma secuencia GAGTC. La escisión convierte el ADN
plasmídico superenrollado en pequeños fragmentos lineales (derecha), mientras que el corte lo convierte en una
única forma molecular "circular abierta" que migra lentamente.
Figura 2C. EcoRI, un sistema típico de modificación de restricción de Tipo II. Este sistema comprende dos
proteínas, la endonucleasa de restricción ('R.EcoRI', o simplemente 'EcoRI'), y la correspondiente modificación
metiltransferasa ('M.EcoRI') de idéntica especificidad de secuencia. EcoRI actúa como un homodímero (caricatura en
la esquina superior derecha). Reconoce la secuencia simétrica, GAATTC, y la escinde simétricamente como se
muestra. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas se muestran en la parte superior izquierda y la
organización y secuencias de genes en la parte inferior izquierda. La estructura cristalina revisada de EcoRI se
muestra en la parte inferior derecha, vista hacia el surco principal del ADN (pdb: 1ERI).
3. Reconocimiento de secuencias de ADN
Una característica de las enzimas de restricción que a menudo se observa es la precisión con la que
identifican sus secuencias diana en medio de un gran exceso de secuencias adecuadas que ignoran. Una
enzima específica de 8 pb, como NotI, por ejemplo, se une y escinde sólo una secuencia, GCGGCCGC, entre
las 65.536 posibles secuencias de ADN de esta longitud. Algunas secuencias adicionales, principalmente
aquellas que difieren de esta en solo un pb, a veces se escinden a una velocidad mucho menor (denominada
'actividad de estrella', y típicamente 10 5 o 10 6- pliegue más bajo) pero las 65.530 secuencias restantes
permanecen completamente intactas. ¿Cómo 'saben' estas enzimas a qué secuencias unirse y cómo distinguen
'correcto' de 'incorrecto'? ¿Qué mecanismo molecular es responsable de este notablemente alto grado de
discriminación? Esta pregunta ha intrigado a los biólogos moleculares durante años y continúa
desconcertándonos en la actualidad (Norambuena y Melo, 2010; Rohs et al., 2010).
3.1 La hipótesis del enlace de hidrógeno
En 1976, se propuso una explicación para la especificidad de secuencia basada en enlaces de

hidrógeno (enlaces H) que ha tenido un impacto duradero. Alrededor de los bordes de los pares de bases,
expuestos en los surcos de ADN mayor y menor, hay átomos de nitrógeno y oxígeno que pueden aceptar o
donar enlaces H (Figura 3A). Sus posiciones y polaridades difieren de un par de bases a otro; son ambiguos en
el surco menor, pero distintos en el surco mayor (Figura 3B). Seeman et al. señaló que, en principio, dos o
33
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
tres enlaces H entre estos átomos y aminoácidos podrían servir para identificar cada par de bases de forma única
(Seeman, et al., 1976). Dada la importancia de los enlaces H para el emparejamiento de bases de WatsonCrick y
para el reconocimiento del codón anticodón del ARNt, esta hipótesis tenía sentido de inmediato. Los autores
continuaron prediciendo qué aminoácidos podrían unirse en H con qué bases, y sus propuestas: Asn o Gln con
adenina (A) y Arg con guanina (G) en el surco principal; y Asn o Gln con G en el surco menor, demostraron más
tarde ser completamente correctos (Seeman, et al., 1976). Desde entonces se han observado o propuesto muchas
otras combinaciones de pares de aminoácidos y bases (AC Cheng, Chen, Fuhrmann y Frankel, 2003; Luscombe,
Laskowski y Thornton, 2001).
3.2 La estructura de EcoRI
La hipótesis del enlace H de Seeman et al provino de estudios cristalográficos de moléculas de ARN bicatenario,
y no de complejos proteína-ADN. Pasaron diez años antes de que se resolviera el primer complejo de proteína-ADN
altamente específico —la enzima de restricción EcoRI (McClarin, et al., 1986) - y cuando lo fue, su estructura pareció
verificar completamente la hipótesis del enlace H. Se interpretó que cada uno de los pares de bases en la secuencia de
reconocimiento GAATTC de EcoRI formaba dos enlaces H con aminoácidos de una manera que ningún otro par de bases
podría hacerlo (Figura 3C). Los autores escribieron: “… La estructura de… EcoRI… muestra que la especificidad está
mediada por 12 enlaces de hidrógeno de ADN de proteína. Estas interacciones discriminan el sitio de reconocimiento
EcoRI de todas las demás secuencias porque cualquier sustitución de bases rompería al menos uno de estos enlaces de
hidrógeno ”(Rosenberg et al., 1987). Se habló mucho de la estructura EcoRI en ese momento: Numerosas publicaciones
que describen su supuesto mecanismo de reconocimiento de secuencias apareció a finales de los años ochenta. Como
resultado, se aceptó la hipótesis de que los enlaces H determinan la especificidad, aunque lo que se había inferido de la
estructura cristalina distaba mucho de ser una prueba científica genuina. La estructura de EcoRI fue posteriormente
revisada, cambiando la interpretación del enlace H (Kim, Grable, Love, Greene y Rosenberg, 1990; Rosenberg, Grable,
Love, Greene y Rosenberg, 1990; Rosenberg, Grable, Love, Greene y Rosenberg, 1990; Rosenberg,
1991). En particular, para seguir de acuerdo con la hipótesis del enlace H, era necesario suponer que un enlace H
clave ahora se transportaba a través de una molécula de agua intermedia (Figura 3C). Esta es una proposición
inestable, ya que el agua puede formar enlaces H tanto con donantes como con aceptores, y no necesariamente
puede distinguir entre los dos, algo esencial para el reconocimiento de acuerdo con la hipótesis del enlace H. Estos
enlaces H "mediados por agua" también se habían observado anteriormente, en la estructura cristalina del represor
Trp unido a su secuencia operadora en el ADN (Otwinowski, et al., 1988).
34
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Figura 3. Las bases del ADN y sus capacidades de enlace de hidrógeno.
Figura 3A. Estructuras atómicas de los pares de bases G: C (izquierda) y A: T (derecha). Las flechas indican
grupos funcionales alrededor de los perímetros de los pares de bases que pueden actuar como aceptores de enlaces de
hidrógeno (flechas rojas) o donantes (flechas verdes).
Figura 3B. Bordes expuestos de los pares de bases tal como aparecen en el surco principal del ADN (paneles
izquierdos) y en el surco menor del ADN (panel derecho). La organización espacial de los pares de bases con respecto a
las interacciones con proteínas se muestra esquemáticamente a la derecha de cada modelo molecular. Los círculos rojos
representan aceptores de enlaces de hidrógeno; los círculos verdes representan donantes de enlaces H; un círculo gris
representa el grupo timina 5-metilo; y un círculo con una circunferencia punteada representa la ausencia de un
35
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
grupo funcional. Cada par de bases muestra un patrón único de estos elementos en el surco mayor,
pero un patrón ambiguo en el surco menor.
Figura 3C. Las interacciones entre EcoRI y su secuencia de reconocimiento GAATTC, como se deduce
de las estructuras cristalinas de rayos X originales (panel central) y revisadas (panel derecho) de esta enzima
unida al ADN. El ADN en la estructura cristalina revisada (pdb: 1ERI) se muestra a la izquierda con la proteína
eliminada. Esta es la misma vista hacia el surco principal del ADN que se muestra en la Figura 2C.
3.3 La estructura de EcoRV
Siete años después de EcoRI, se informó sobre la estructura cristalina de rayos X de EcoRV, la segunda
enzima de restricción unida al ADN (Winkler, et al., 1993). EcoRV reconoce la secuencia de 6 pb GAT | ATC. Los
enlaces H estaban presentes en los dos pares de bases externos en cada lado (GA - TC) en esta estructura, pero
ninguno estaba presente en los pares de bases más internos (TA). En cambio, una torcedura severa entre estos
pares de bases doblaba el ADN en 50 grados, abriendo el surco menor y comprimiendo el surco mayor (Figura 4).
Debido a la distorsión extrema, se propuso que la discriminación de los pares de bases centrales se lograba
mediante ' lectura indirecta », mediante enlaces H a los grupos fosfato de la cadena principal gracias a la flexión.
Esta también fue una proposición inestable ya que, de ser cierto, la curva debería ser posible solo con TA en el
centro, y no con ninguna de las otras 15 combinaciones de pares de bases que pueden ocurrir. El concepto de
lectura indirecta proviene de la estructura cristalina del represor Trp. En esta estructura están presentes
numerosos enlaces H a los fosfatos de la cadena principal, pero ninguno a las bases (Otwinowski, et al., 1988).
Se han resuelto las estructuras cristalinas de más de 30 enzimas de restricción unidas a sus
secuencias de ADN. En algunos,
como HindIII (Watanabe, Takasaki, Sato, Ando y Tanaka, 2009),
MvaI (Kaus-Drobek et al., 2007) y Eco29kI (Mak, Lambert y
Stoddard, 2010), hay muy pocos enlaces H presentes para explicar
adecuadamente la especificidad mediante la hipótesis del enlace
H. Pero en la mayoría de los casos, las capacidades de enlace de
H de las bases están "saturadas" en el sentido de que cada átomo
de nitrógeno y oxígeno del surco principal parece participar en un
enlace H, y también lo hace un número sustancial de átomos del
surco menor. Esto generalmente se toma como evidencia de que
los enlaces H determinan la especificidad de la secuencia, pero es
solo una evidencia circunstancial. Para estar seguro, esta idea
debe probarse experimentalmente como cualquier otra hipótesis, y
luego aceptarse o
rechazado en los resultados.
Figura 4. Distorsión de la secuencia de reconocimiento de

EcoRV
36
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
En la estructura cristalina de EcoRV unido a su secuencia de reconocimiento GATATC, el ADN está

muy distorsionado. No hay enlaces H entre la proteína y los dos pares de bases centrales, 3 y 4. La
especificidad de EcoRV solo para T: A en la posición 3 y solo A: T en la posición 4 se explica en términos de
'lectura indirecta' habilitada por esta distorsión.
4. Investigación del mecanismo de reconocimiento de secuencias
Hemos llevado a cabo experimentos con varias enzimas de restricción para probar si los enlaces H son
realmente el medio por el cual las proteínas distinguen las secuencias de ADN entre sí. Los detalles de nuestras
investigaciones se informarán en otra parte, pero todos nuestros resultados nos llevan a la conclusión de que no, no lo
son. Los enlaces H entre los aminoácidos y los pares de bases que son teóricamente esenciales para el
reconocimiento de secuencias se pueden eliminar, hemos encontrado repetidamente, sin ningún efecto sobre la
especificidad. Lo que importa en cambio, creemos, es la organización atómica precisa de los sitios de unión del par de
bases: cada sitio puede acomodar apropiadamente sólo un par de bases afines; los conflictos estéricos y
electrostáticos impiden que los demás encajen.
4.1 La importancia del ajuste del sitio de unión en el reconocimiento de secuencias
Una inspección minuciosa de las estructuras cristalinas de las enzimas de restricción sugiere que la especificidad
de la secuencia está determinada por la forma y la electrostática de la superficie del sitio de unión al ADN. Cada par de
bases tiene una forma única y una distribución única de carga estática que proviene de los átomos donadores (+) y
aceptores (-) del enlace H. Los sitios de unión de pares de bases coinciden muy estrechamente con estas formas, de modo
que cada sitio de unión parece un ajuste personalizado para un par de bases en particular y para ningún otro. La
sustitución de pares de bases "incorrectos" por los correctos en estructuras cristalinas mediante el modelado revela
incompatibilidades, en su mayor parte, en forma de obstrucciones y yuxtaposiciones de cargas similares que darán como
resultado choques y repulsiones.
Tales 'conflictos' atómicos no pueden observarse directamente en las estructuras cristalinas, sino que deben
inferirse mediante el modelado, preguntando qué sucede cuando cada uno de los pares de bases 'incorrectos' se
sustituyen por los 'correctos' in silico. Hemos llevado a cabo estas sustituciones en muchas estructuras cristalinas de
enzimas de restricción, y casi cada vez que lo hacemos, encontramos que los pares de bases 'incorrectos' no pueden
acomodarse adecuadamente (Figura 5). Esto nos lleva a la siguiente proposición: las organizaciones atómicas de
los sitios de unión al ADN de proteínas altamente específicas son tales que en cada posición de unión de los pares de
bases, sólo se pueden acomodar los pares de bases afines ("correctos"). Las obstrucciones estéricas y las repulsiones
electrostáticas excluyen a todas las demás.
Cuando las proteínas de secuencia específica se asocian con el ADN, se adhieren de manera suelta y no
específica al principio, deslizándose hacia adelante y hacia atrás, y saltando dentro, fuera y entre las moléculas de ADN,
hasta que encuentran su secuencia de reconocimiento (Halford, 2001; Halford y Marko, 2004). ). Una vez encontradas,
las proteínas se unen estrechamente a esta secuencia y, si son enzimas, llevan a cabo alguna reacción catalítica:
hidrólisis de la cadena de ADN en el caso de una enzima de restricción. En el curso de esta exploración, la proteína
encuentra miles de secuencias "incorrectas", una tras otra. Muy pocas de estas secuencias
37
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
comparten mucha similitud con la secuencia de reconocimiento, por lo que con la mayoría de las secuencias que
encuentra, la proteína experimenta múltiples conflictos en la mayoría de los sitios de unión de sus pares de bases. Los
efectos de estos conflictos son aditivos, por lo que muchos pequeños conflictos individuales se combinan para producir una
gran incompatibilidad general. Para una enzima específica de seis pb, como EcoRI, más del 99% de las secuencias
encontradas difieren de su secuencia de reconocimiento en al menos dos pares de bases. El 96% difiere en al menos tres
pares de bases y el 83% en al menos cuatro. La mayoría de las secuencias encontradas, de hecho, más del 53%, difieren
en cinco o en las seis posiciones de los pares de bases. Para una enzima específica de ocho pb, como NotI, el 97% de las
secuencias encontradas diferirán de su secuencia de reconocimiento en al menos cuatro pares de bases, en más de la
mitad de los sitios de unión del par de bases, es decir, y más de dos tercios diferirán en al menos seis pares de bases. Los
conflictos múltiples, entonces, tanto estéricos como electrostáticos, son la regla con casi todas las secuencias encontradas.
Figura 5. Estérico y
conflictos electrostáticos que
determinar la especificidad
Figura 5A. La estructura de
la más exterior base
par de sitios de unión de BglII (pdb:
1DFM). Los aminoácidos se muestran
en representación de barra sin
hidrógeno átomos;
el par de bases AT presente en este
sitio se muestra en barra y
transparente esfera
representación.
Figura 5B. Molecular
modelos generados en silico
sustituyendo no afines
pares de bases en este sitio de unión en
lugar del par de bases AT realmente
presente. Cada sustitución da como
resultado superposiciones atómicas o
yuxtaposiciones de enlaces H similares
capaz
de provocar choques estéricos,
repulsiones electrostáticas, o ambas. Estos conflictos se indican mediante relámpagos amarillos (estéricos) y rojos
(electrostáticos).
4.2 Observaciones que confirman la importancia de los conflictos en el reconocimiento de secuencias
Casi todas las REasas ocurren naturalmente en asociación con una o más metiltransferasas de
ADN (MTasas). Las MTasas reconocen la misma secuencia que la REasa y modifican esta secuencia
colocando un grupo metilo en una base de adenina o citosina en cada hebra de la secuencia. La
modificación evita que REase se una a la secuencia de reconocimiento a partir de entonces. Se agregan
los grupos metilo
38
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
al grupo 4-amino de la citosina para formar norte 4-metilcitosina (m4C), el carbono-5 de la citosina para formar
5-metilcitosina (m5C), o el grupo 6-amino de la adenina para formar norte 6-metiladenina (m6A). Desde estas
posiciones, los grupos metilo sobresalen en el surco principal del ADN y cambian su topología (Figura 6). Para
las modificaciones de m5C, la falla de la REase para unirse se debe completamente a choques estéricos. Para
las modificaciones de m4C y m6A, se debe a choques estéricos exacerbados, quizás, por la pérdida de un
enlace H.
Modelado de grupos metilo en estructuras cristalinas en silico muestra que, en general, crean
obstrucciones en posiciones en las que se sabe mediante experimentación que confieren resistencia al REase,
pero no obstruyen en posiciones en las que se sabe que no tienen efecto. Esto demuestra una correlación entre las
obstrucciones inferidas por el modelado molecular y la incapacidad de las proteínas para unirse a secuencias de
ADN debido a choques estéricos. Sin embargo, no podemos estar seguros de que uno siempre lleve al otro. El
ADN y las proteínas son flexibles y, en algunos casos, pueden distorsionarse lo suficiente como para adaptarse a
obstrucciones y yuxtaposiciones de carga desfavorables. Los conflictos revelados por el modelado indican solo el
potencial por incompatibilidad. En ausencia de distorsión, es casi seguro que los conflictos impidan la unión, pero
no tenemos forma de saberlo. a priori, cuál será el resultado de cualquier conflicto en particular. Esto debe decidirse
mediante experimentación, en cambio, caso por caso. El trabajo en esta área está avanzando en nuestro
laboratorio y nuestros resultados provisionales son alentadores.
Figura 6. Conflictos estéricos causados por la metilación del reconocimiento BglII
secuencia.
El sitio de unión de BglII (AGATCT), visto hacia el surco principal, se muestra a la izquierda. La
estructura se toma de pdb: 1DFM (Lukacs, Kucera, Schildkraut y Aggarwal, 2000) pero con la proteína eliminada.
Los seis pares de bases que comprenden el sitio de reconocimiento BglII se muestran como esferas vdW y los
pares de bases flanqueantes se muestran como líneas. Los grupos metilo se modelaron en el grupo 6-amino del
par de bases de adenina 1 (verde; modelo central, arriba), o en el grupo 4-amino (azul; modelo central, medio) o
carbono-5 (amarillo; modelo central, parte inferior ) del par 2 de bases de citosina. La metilación en las tres
posiciones hace que la secuencia sea resistente a la escisión por BglII (Ono & Ueda, 1987). ( norte La 4-metilación
de la citosina 2 es la protección natural.
39
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
proporcionada por la metiltransferasa M. BglII). En cada caso, los aminoácidos que forman los sitios de unión en el surco
principal para los pares de bases 1 y 2 presentan una gran obstrucción a los grupos metilo (paneles más a la derecha).
Especulamos que estas obstrucciones dan como resultado choques estéricos (mostrados como relámpagos) que
excluyen las bases metiladas de los sitios de unión y, por lo tanto, evitan que BglII se adhiera a su secuencia de
reconocimiento cuando se modifica en cualquiera de estas posiciones.
Discusión
En este artículo trazamos la historia de las enzimas de restricción desde sus orígenes en un rincón oscuro de la
microbiología hasta su adopción como herramientas moleculares precisas para cortar y reorganizar moléculas de ADN en
el laboratorio. Transcurrieron 20 años entre las observaciones iniciales de la "restricción y modificación controlada por el
huésped" de los virus bacterianos y el aislamiento de la primera de estas nuevas herramientas a principios de la década de
1970. En los 40 años transcurridos desde entonces, se han descubierto miles de enzimas de restricción más, reconociendo
cientos de secuencias de ADN diferentes. Es la extrema precisión o "fidelidad" de las enzimas de restricción lo que las ha
hecho tan útiles. Cada uno escinde el ADN en una secuencia particular de pares de bases, pero no en ninguna de las (a
menudo miles de) otras secuencias de tamaño similar que existen. A este respecto, El ADN es quizás el sustrato
enzimático más complejo que la naturaleza ha ideado porque se presenta en un número asombroso de formas diferentes.
Cómo las enzimas de restricción pueden elegir entre todas estas formas con tanta precisión es una pregunta que ha
atraído a los biólogos moleculares durante más de un cuarto de siglo, pero aún no se ha encontrado una respuesta
satisfactoria. Según un artículo reciente, “… la comprensión del proceso de reconocimiento molecular que media la
selectividad específica de unión de proteína-ADN es uno de los desafíos más interesantes en biología estructural”
(Norambuena & Melo, 2010). pero aún no se ha encontrado una respuesta satisfactoria. Según un artículo reciente, “… la
comprensión del proceso de reconocimiento molecular que media la selectividad específica de unión de proteína-ADN es
uno de los desafíos más interesantes en biología estructural” (Norambuena & Melo, 2010). pero aún no se ha encontrado
una respuesta satisfactoria. Según un artículo reciente, “… la comprensión del proceso de reconocimiento molecular que media la selectividad espe
Los experimentos que hemos realizado con enzimas de restricción intentan hacer frente a este desafío, y
cada uno de ellos nos lleva a la misma conclusión de que la discriminación de secuencia no depende de enlaces
H que pueden formarse solo con la secuencia reconocida. La idea de que la discriminación podría depender de
los enlaces H de esta manera se propuso en 1976 (Seeman, et al., 1976) o, y se desarrolló aún más una década
después cuando se informó la primera estructura cristalina de una enzima de restricción unida a su secuencia de
ADN. (McClarin y col., 1986). Posteriormente, la idea se amplió para incluir enlaces H a ADN únicamente
distorsionado y enlaces H transportados a través de moléculas de agua (Otwinowski, et al., 1988). Y con
enmiendas incluso más recientes, esta sigue siendo la teoría predominante en la actualidad (Rohs et al., 2009).
El reconocimiento de secuencias de ADN generalmente se considera un proceso único, aunque

matizado que tiene múltiples facetas y variaciones (Rohs, et al., 2010; Rohs, West, Liu y Honig, 2009; Rohs, West,
Sosinsky, et al. ., 2009). En cambio, nos resulta útil pensar en él como dos procesos, uno que permite que la
proteína se una a su secuencia de reconocimiento y otro que evita que se una a todas las demás secuencias.
Para la fidelidad, el proceso más importante es el segundo, porque no importa qué tan bien una proteína se una a
una secuencia, si también se une a otras secuencias, entonces no es específica. Implícito en las ideas
predominantes sobre la especificidad de secuencia está el acuerdo de que los enlaces H gobiernan ambos
procesos: permiten que la proteína se una cuando se pueden formar suficientes enlaces H, y evitan que se una
cuando hay una deficiencia. Nuestro
40
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Los experimentos sugieren que no es así como funciona la discriminación. Los enlaces H, en combinación con otros
factores que mejoran la afinidad, ciertamente permiten que la proteína se una a su secuencia de reconocimiento, pero
lo que impide que se una a todas las demás secuencias, argumentamos, no es la ausencia de enlaces H sino más bien
presencia de obstrucciones y repulsiones que excluyen los pares de bases "incorrectos" de los sitios de unión del par
de bases. Los sitios de unión de proteínas altamente específicas tienen organizaciones atómicas, proponemos, que se
adaptan a una sola secuencia de ADN; todas las demás secuencias se encuentran con obstrucciones y repulsiones, y
son estas obstrucciones y repulsiones, en lugar de la falta de enlaces H, las que impiden que la proteína se una.
Anteriormente describimos cómo la modificación de una sola citosina mediante la adición de un grupo
a5-metilo puede evitar la unión debido al choque estérico. Un grupo 5-metilo está presente en Timina, de forma
permanente, y es fácil ver que esto podría actuar de la misma manera y evitar que una proteína se una a cualquier
secuencia de ADN en la que ese grupo metilo no pueda acomodarse. En el ADN imparcial, el 92% de las
secuencias de una enzima específica de seis pb, como los encuentros con EcoRI, tendrán al menos una timina en
la posición "incorrecta", dejando solo el 8% para ser discriminado por conflictos con otras bases. Los números son
aún más sorprendentes para una enzima específica de ocho pb como NotI: más del 99% de las secuencias que
encontrará tienen al menos una Timina en la posición 'incorrecta', dejando menos del 0.5% para ser discriminada
por otros conflictos. El grupo 5-metilo presenta una gran obstrucción y engendra un choque estérico
correspondientemente grande, que, dado que excluye a la timina, automáticamente también excluye a su pareja
de bases, la adenina. Las obstrucciones individuales debidas a adenina, guanina y citosina son menos
pronunciadas que las causadas por el grupo 5-metilo, pero estas parecen aumentar con frecuencia por
repulsiones electrostáticas.
Un enlace de hidrógeno es una forma particular de atracción electrostática que, para esta
discusión, ocurre entre el hidrógeno unido covalentemente al nitrógeno u oxígeno, y el orbital de
electrones de un solo par de un átomo de nitrógeno u oxígeno adyacente (Arunan et al., 2011a,
2011b). El primero tiene una carga positiva y el segundo una carga negativa. Tampoco lo es una
carga completa de +1 o -1 como la de un protón o un electrón, pero sin embargo son significativas.
Los enlaces H tienen solo dos estados: un enlace H está presente, aumentando la afinidad, o está
ausente, sin hacer nada. En contraste, las interacciones electrostáticas tienen tres estados: atracción
(entre cargas diferentes), nada y repulsión (entre cargas similares). El estado adicional de repulsión
hace que la electrostática sea un concepto mucho más poderoso que los enlaces H,
En las estructuras cristalinas de rayos X de complejos específicos de proteína-ADN, casi nunca se

observa una yuxtaposición cercana entre dos donantes de enlaces H o entre dos aceptores de enlaces H; sólo
yuxtaposiciones entre donantes y aceptores, o átomos no enlazantes. Esto sugiere que la repulsión
electrostática entre grupos similares es inestable y no se puede tolerar. Las estructuras químicas de las bases
son tales que la atracción electrostática entre los aminoácidos y los pares de bases "correctos" da como
resultado automáticamente la repulsión hacia los pares de bases "incorrectos" y, a menudo, también a las
obstrucciones. Los mismos aminoácidos que se adaptan a los pares de bases "correctos" obstruyen y repelen
los "incorrectos". Por ejemplo, un átomo de oxígeno del carbonilo de la proteína generalmente contacta con el
4-aminogrupo de la citosina en estructuras cristalinas de proteína-ADN específicas. El átomo de oxígeno es
electronegativo,
41
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
con la citosina electropositiva norte 4 átomos. Si la timina intenta ocupar un sitio de unión de este par de
bases en lugar de la citosina, además de chocar con el grupo 5-metilo, este oxígeno carbonilo repele
automáticamente la timina igualmente electronegativa. O 4 átomos. La adenina a menudo se puede
acomodar en esta posición en lugar de la citosina, pero si la guanina intenta ocupar el sitio de unión,
también experimenta repulsión, aunque más pequeña, entre el oxígeno del carbonilo y la guanina. O 6
átomos.
Los aminoácidos que forman los sitios de unión de proteínas altamente específicas actúan de las dos
formas que proponemos. Acomodan, y generalmente atraen, el par de bases correcto en cada posición de unión. Y
obstruyen, y a menudo repelen, los pares de bases incorrectos. El primero de ellos permite la unión (es decir, el
"reconocimiento") de la secuencia correcta, y el último evita la unión (es decir, la "discriminación") de todas las demás
secuencias. Como caras opuestas de una moneda, estos dos procesos están indisolublemente ligados porque los
mismos aminoácidos a menudo hacen ambas cosas, pero los principios sobre los que operan son bastante diferentes.
Tabla 1. Secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo II representativas
Enzima Secuencia de reconocimiento Enzima Secuencia de reconocimiento
AccI GT | MKAC HgaI GACGC (5/10)
AciI C | CGC HgiAI GWGCW | C
AflII C | TTAAG Hola GCG | C
AflIII A | CRyGT HindII GTy | RAC
EdadI A | CCGGT HindIII A | AGCTT
AhdI GACNNN | NNGTC HinfI G | ANTC
AluI AG | CT HinP1I G | CGC
ApoI R | AATTy HpaII C | CGG
AscI GG | CGCGCC HphI GGTGA (8/7)
AvaI C | yCGRG KasI G | GCGCC
AvaII G | GWCC MscI TGG | CCA
AvrII C | CTAGG MwoI GCNNNNN | NNGC
BamHI G | GATCC NciI CC | SGG
Bbvi GCAGC (12/8) NcoI C | CATGG
BfaI C | ETIQUETA NotI GC | GGCCGC
BglI GCCNNNN | NGGC PacI TTAAT | TAA
BsrI ACTGG (1 / -1) PstI CTGCA | G
BsrBI GAG | CGG SacII CCGC | GG

42
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
BstNI CC | WGG SalI G | TCGAC
EaeI y | GGCCR Sau96I G | GNCC
EarI CTCTTC (1/4) SfaNI GCATC (5/9)
EcoRI G | AATTC SfiI GGCCNNNN | NGGCC
FokI GGATG (13/9) SmaI CCC | GGG
FspI TGC | GCA TaqI T | CGA
HaeII RGCGC | y XcmI CCANNNNN | NNNNTGG
HaeIII GG | CC XmaI C | CCGGG
Se han descubierto enzimas de restricción que reconocen aproximadamente 300 secuencias de

ADN diferentes. Aquí se muestra un conjunto pequeño, pero representativo, de estos. El nombre de la
enzima (consulte la nota al pie de la convención) se enumera en el lado izquierdo de cada columna, y la
secuencia reconocida, escrita en la orientación 5 'a 3', se muestra en el lado derecho. Sin excepción, estas
enzimas reconocen y se unen al ADN de doble hebra, pero para simplificar, se muestra la secuencia de
una sola hebra ya que esto define automáticamente la secuencia de la hebra complementaria. Las
enzimas de restricción reconocen secuencias que comprenden de 4 a 8 bases específicas. La mayoría de
estas secuencias son continuas, pero algunas son discontinuas y contienen una cadena interna de rom 1
(por ejemplo, HinfI) hasta 9 (por ejemplo, XcmI) bases no específicas ('N'). Por lo general, la secuencia de
ADN reconocida es simétrica, lo que significa que las dos hebras son iguales cuando se leen en la misma
orientación. Las enzimas de este tipo ("Tipo IIP") escinden el ADN simétricamente dentro de la secuencia
de reconocimiento y, en estos casos, la posición de escisión se indica mediante una barra vertical ("|").
Varias enzimas reconocen secuencias de ADN que no son simétricas. Estas enzimas ('Tipo IIS')
generalmente escinden el ADN en un lado, fuera de la secuencia de reconocimiento. Por convención, sus
secuencias de reconocimiento se escriben de manera que la escisión se produce a la derecha de la
secuencia mostrada (la hebra "superior"), y las posiciones de la escisión se indican mediante números. Por
lo tanto, para FokI, por ejemplo, GGATG (9/13) significa que esta enzima escinde la cadena superior 9
bases a la derecha de la última G de GGATG, y 13 bases a la derecha (es decir, 4 bases más abajo) de la
C complementaria en la hebra inferior. 2-), y un grupo hidroxilo en el extremo 3 '(3'-OH). La mayoría de las
enzimas de restricción reconocen secuencias de ADN únicas (por ejemplo, EcoRI: GAATTC), pero algunas
reconocen varias secuencias en virtud de acomodar más de un par de bases en determinadas posiciones
(por ejemplo, HgiAI: GWGCWC). Por convención, estas ambigüedades se indican como sigue: 'R' = A o G;
'y' = C o T; 'W' = A o T; 'S' = C o G; 'M' = A o C; 'K' = G o T; 'B' = C, G o T; 'D' = A, 4
G o T; 'H' = A, C o T; 'V' = A, C o G); y 'N' = A, C, G o T.

43
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Cuadro 2. Historia natural de los sistemas de restricción-modificación
• Microbiano:
Presente en todas las bacterias y arqueas de vida libre (y algunos plásmidos y virus) Entre todos los grupos
y nichos taxonómicos
• Numerosas especificidades de secuencia:
> 3.000 sistemas identificados; ~ 300 especificidades de secuencia de ADN diferentes Algunas
especificidades son comunes (por ejemplo, GG'CC), otras son raras (G'AATTC)
• Especies no específicas:
Las mismas especificidades ocurren en diferentes especies.
Ocurren diferentes especificidades en diferentes aislados de la misma especie
• Multiplicidad:
Por lo general, varios sistemas de RM diferentes de varios tipos en cada célula.
• Variedad:
Numerosas organizaciones enzimáticas
Diferentes enzimas a menudo únicas. Muchos ejemplos de convergencia evolutiva
Referencias
Anderson, ES y Felix, A. (1952). Variación en Vi-Phage II de Salmonella typhi.

Naturaleza, 170, 492-494.
Arber, W. (1965). Modificación de bacteriófagos controlada por el huésped. Ana. Rev. Microbiol.,
19, 365-378.
Arber, W. y Linn, S. (1969). Modificación y restricción del ADN. Ana. Rev. Biochem.,
38, 467-500.
Arunan, E., Desiraju, GR, Klein, RA, Sadlej, J., Scheiner, S., Alkorta, I.,. .
. Nesbitt, DJ (2011a). Definición del enlace de hidrógeno: una cuenta (Informe técnico de la IUPAC). Appl
pura. Chem., 83 ( 8), 1619-1636.
Arunan, E., Desiraju, GR, Klein, RA, Sadlej, J., Scheiner, S., Alkorta, I.,. . .Nesbitt,
DJ (2011b). Definición del enlace de hidrógeno (Recomendaciones de la IUPAC
2011). Appl pura. Chem., 83 ( 8), 1637-1641.
Berg, P. y Mertz, JE (2010). Reflexiones personales sobre los orígenes y aparición de
tecnologia de ADN recombinante. Genética, 184 ( 1), 9-17.
Bertani, G. y Weigle, JJ (1953). Variación controlada por el hospedador en virus bacterianos.
Revista de bacteriología, 65 ( 2), 113-121.
Bourniquel, AA y Bickle, TA (2002). Enzimas de restricción complejas: impulsadas por NTP
motores moleculares. Biochimie, 84, 1047-1059.
Bult, CJ, White, O., Olsen, GJ, Zhou, L., Fleischmann, RD, Sutton, GG,
. . .Methanococcus
Venter, JC (1996). Secuencia
jannaschii. completa
Ciencia, 273, del genoma del arqueón metanogénico,
1058-1073.
Bunting, KA, Roe, SM, Headley, A., Brown, T., Savva, R. y Pearl, LH (2003).
Estructura cristalina de la endonucleasa de reparación de ADN de parche muy corto de Escherichia coli dcm
unida a su sitio de producto de reacción en una superhélice de ADN. Nucleico
Ácidos Res., 31, 1633-1639.
44
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Chan, SH, Stoddard, BL y Xu, S. y. (2011). Mellado natural y de ingeniería

endonucleasas: desde el mecanismo de escisión hasta la ingeniería de especificidad de cadena.
Ácidos nucleicos Res., 39, 1-18.
Chang, AC y Cohen, SN (1974). Construcción del genoma entre bacterias
especies in vitro: replicación y expresión de genes del plásmido de Staphylococcus
en Escherichia coli. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, 71
( 4), 1030-1034.
Cheng, AC, Chen, WW, Fuhrmann, CN y Frankel, AD (2003). Reconocimiento
de bases de ácidos nucleicos y pares de bases mediante enlaces de hidrógeno a cadenas laterales de
aminoácidos. J Mol Biol, 327 ( 4), 781-796.
Cheng, X., Balendiran, K., Schildkraut, I. y Anderson, JE (1994). Estructura de
Endonucleasa PvuII con ADN afín. EMBO J., 13 años, 3927-3935.
Cohen, SN, Chang, AC y., Boyer, HW y Helling, RB (1973). Construcción
de plásmidos bacterianos biológicamente funcionales in vitro. Procedimientos de la Nacional
Academia de Ciencias de los Estados Unidos de América, 70 ( 11), 3240-3244.
Danna, K. y Nathans, D. (1971). Escisión específica del ADN del virus 40 de los simios por
endonucleasa de restricción de Hemophilus influenzae. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 68, 2913-2917.
Etzkorn, C. y Horton, NC (2004). Conocimientos mecanicistas de las estructuras de

HincII unido al ADN afín escindido a partir de la adición de Mg2 + y Mn2 +. J.
Mol. Biol., 343, 833-849.
Fleischmann, RD, Adams, MD, White, O., Clayton, RA, Kirkness, EF,
Kerlavage, AR,. . . Venter, JC (1995). Secuenciación aleatoria de genoma completo y ensamblaje de
Haemophilus influenzae Rd. Ciencia, 269, 496-512. Gottesman, MM (1976). Aislamiento y
caracterización de una lambda especializada
fago transductor para el gen de la ADN ligasa de Escherichia coli. Virología, 72 ( 1), 33-44.
Halford, SE (2001). Saltar, saltar y dar vueltas mediante enzimas de restricción. Bioquímica
Soc Trans, 29 ( 4), 363-374.
Halford, SE (2009). Las consecuencias (mil millones de dólares) de estudiar por qué ciertos
aislamientos del fago .lambda. infectan sólo ciertas cepas de E. coli: enzimas de restricción. Bioquímico,
31, 10-13.
Halford, SE, Baldwin, GS y Vipond, IB (1993). Reconocimiento de ADN por EcoRV.
J. Cell. Biochem., 17C, 152.
Halford, SE y Marko, JF (2004). ¿Cómo funcionan las proteínas de unión al ADN específicas del sitio?
encontrar sus objetivos? Ácidos nucleicos Res., 32, 3040-3052.
Heiter, DF, Lunnen, KD y Wilson, GG (2005). Corte de ADN específico del sitio
mutantes de la endonucleasa de restricción heterodimérica R.BbvCI. J Mol Biol, 348 ( 3), 631-640.
Jackson, DA, Symons, RH y Berg, P. (1972). Método bioquímico para insertar

nueva información genética en el ADN del virus Simian 40: moléculas circulares de ADN SV40 que
contienen genes del fago lambda y el operón galactosa de
Escherichia coli. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, 69
( 10), 2904-2909.
Jurenaite-Urbanaviciene, S., Serksnaite, J., Kriukiene, E., Giedriene, J., Venclovas,
C. y Lubys, A. (2007). Generación de especificidades de tipo de escisión de ADN
45
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
II endonucleasas de restricción por reordenamiento de dominios de reconocimiento de diana.

Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 104, 10358-10363.
Kan, NC, Lautenberger, JA, Edgell, MH y Hutchison, CAI (1979). los
secuencia de nucleótidos reconocida por las enzimas de restricción y modificación de Escherichia coli
K12. J. Mol. Biol., 130, 191-209.
Kaus-Drobek, M., Czapinska, H., Sokolowska, M., Tamulaitis, G., Szczepanowski,
RH, Urbanke, C.,. . . Bochtler, M. (2007). La endonucleasa de restricción MvaI es un monómero que
reconoce asimétricamente su secuencia diana. Ácidos nucleicos Res., 35, 2035-2046.
Kaw, MK y Blumenthal, RM (2010). Independencia traslacional entre

genes superpuestos para una endonucleasa de restricción y su transcripción
regulador. BMC Mol. Biol., 11, 87.
Kelly, TJJ y Smith, HO (1970). Una enzima de restricción de Hemophilus
influenzae II. Secuencia base del sitio de reconocimiento. J. Mol. Biol., 51, 393-409. Kim, y., Grable,
JC, Love, R., Greene, PJ y Rosenberg, JM (1990). Refinamiento
de la estructura cristalina de la endonucleasa EcoRI: un seguimiento de la cadena de proteínas
Ciencia, 249, 1307-1309.
Lin, TC, Rush, J., Spicer, EK y Konigsberg, WH (1987). Clonación y expresión
de la ADN polimerasa de T4. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de
América, 84 ( 20), 7000-7004.
Lukacs, CM, Kucera, R., Schildkraut, I. y Aggarwal, AK (2000). Comprensión
la inmutabilidad de las enzimas de restricción: estructura cristalina de BglII y su sustrato de ADN a una
resolución de 1.5A. Nat. Struct. Biol., 7, 134-140.
Lunnen, KD, Barsomian, JM, Camp, RR, Card, CO, Chen, SZ, Croft, R.,.
. . Wilson, GG (1988). Clonación de genes de restricción y modificación de tipo II.
Gene, 74 años, 25-32.
Luria, SE (1953). Modificaciones de virus inducidas por el huésped. Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol., 18, 237-244.
Luria, SE y Human, ML (1952). Una variación no hereditaria, inducida por el huésped de
virus bacterianos. J. Bacteriol., 64, 557-569.
Luscombe, NM, Laskowski, RA y Thornton, JM (2001). Base de aminoácidos
interacciones: un análisis tridimensional de las interacciones proteína-ADN a nivel atómico. Nucl.
Ácidos Res., 29 ( 13), 2860-2874.
Mak, AN, Lambert, AR y Stoddard, BL (2010). Plegable, Reconocimiento de ADN,
y función de las endonucleasas GIy-yIG: estructuras cristalinas de R.Eco29kI.
Estructura, 18, 1321-1331.
McClarin, JA, Frederick, CA, Wang, BC, Greene, P., Boyer, HW, Grable,
J. y Rosenberg, JM (1986). Estructura del complejo de reconocimiento de endonucleasa
DNA-EcoRI a una resolución de 3 angstrom. Ciencia, 234, 1526-1541. McClelland, SE y Szczelkun,
MD (2004). La restricción de tipo I y III
endonucleasas: elementos estructurales en motores moleculares que procesan el ADN.
Ácidos nucleicos Mol. Biol., 14, 111-135.
Meselson, M. y yuan, R. (1968). Enzima de restricción de ADN de E. coli. Naturaleza,
217 ( 5134), 1110-1114.
Midgley, CA y Murray, NE (1985). Polinucleótido quinasa T4; clonación del
gen (pseT) y amplificación de su producto. EMBO J, 4 ( 10), 2695-2703.
46
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
Morgan, RD y Luyten, y. A. (2009). Ingeniería racional de restricción tipo II

Especificidad de unión y escisión de ADN de endonucleasa. Ácidos nucleicos Res., 37,
5222-5233.
Morrow, JF, Cohen, SN y Chang, AC y. (1974). Replicación y transcripción
de ADN eucariota en Escherichia coli. Actas de la Academia Nacional de
Ciencias de los Estados Unidos de América, 71 ( 5), 1743-1747.
Murray, NE (2000). Sistemas de restricción de tipo I: sofisticadas máquinas moleculares (un
legado de Bertani y Weigle). Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 412-434.
Murray, NE, Bruce, SA y Murray, K. (1979). Clonación molecular del ADN
gen de la ligasa del bacteriófago T4. II. Amplificación y preparación del producto génico. J Mol
Biol, 132 ( 3), 493-505.
Murray, NE y Kelley, WS (1979). Caracterización de la transducción lambda polA
fagos; expresión eficaz del gen polA de E. coli. Mol Gen Genet, 175 ( 1), 77-87.
Nathans, D., Adler, SP, Brockman, WW, Danna, KJ, Lee, TNH y Sack,
GHJ (1974). Uso de endonucleasas de restricción en el análisis del genoma del virus de los simios 40. Alimentado.
Proc., 33, 1135-1138.
Nathans, D. y Smith, HO (1975). Endonucleasas de restricción en el análisis y
reestructuración de moléculas de adn. Revisión anual de bioquímica, 44, 273-293. Nelson, M., Zhang,
y. Y Van Etten, JL (1993). ADNmetiltransferasas y sitio de ADN-
endonucleasas específicas codificadas por los virus de Chlorella. Basilea, Suiza: Birkhauser
Verlag.
Norambuena, T. y Melo, F. (2010). La base de datos de la interfaz proteína-ADN. BMC
Bioinformática, 11, 262.
Old, R., Murray, K. y Roizes, G. (1975). Secuencia de reconocimiento de restricción
endonucleasa III de Hemophilus influenzae. Revista de Biología Molecular, 92 ( 2), 331-339.
Ono, A. y Ueda, T. (1987). Síntesis de decadesoxirribonucleótidos que contienen N6-

metiladenina, N4-metilcitosina y 5-metilcitosina: reconocimiento y escisión por
endonucleasas de restricción (nucleósidos y nucleótidos, parte 74).
Otwinowski, Z., Schevitz, RW, Zhang, RG, Lawson, CL, Joachimiak, A.,
Marmorstein, RQ,. . . Sigler, PB (1988). Estructura cristalina del complejo represor / operador trp a
resolución atómica. Naturaleza, 335 ( 6188), 321-329.
Panasenko, SM, Cameron, JR, Davis, RW y Lehman, IR (1977). Cinco
sobreproducción cien veces mayor de ADN ligasa después de la inducción de un lisógeno lambda híbrido
construido in vitro. Ciencia, 196 ( 4286), 188-189.
Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. y Wende, W. (2005). Restricción de tipo II
endonucleasas: estructura y mecanismo. Celda. Mol. Life Sci., 62 años, 685-707. Roberts, RJ
(1976). Endonucleasas de restricción. CRC Crit. Rev. Biochem., 4, 123-164. Roberts, RJ (1980). Enzimas de
restricción y modificación y su reconocimiento.
secuencias. Investigación de ácidos nucleicos, 8 ( 1), r63-r80.
Roberts, RJ (1990). Enzimas de restricción y sus isosquizómeros. Ácidos nucleicos Res.,
18, 2331-2365.
Roberts, RJ, Belfort, M., Bestor, T., Bhagwat, AS, Bickle, TA, Bitinaite,
J.,. . . Xu, S. y. (2003). Una nomenclatura para enzimas de restricción, ADN
47
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
metiltransferasas, endonucleasas autodirigidas y sus genes. Ácidos nucleicos Res, 31 ( 7), 1805-1812.
Roberts, RJ y Macelis, D. (1998). REBASE - enzimas de restricción y metilasas.

Roberts, RJ, Vincze, T., Posfai, J. y Macelis, D. (2010). REBASE - una base de datos para
Restricción y modificación del ADN: enzimas, genes y genomas. Nucleico
Acids Res., 38, D234-D236.
Rohs, R., Jin, X., West, SM, Joshi, R., Honig, B. y Mann, RS (2010). Orígenes de
especificidad en el reconocimiento de proteína-ADN. Annu Rev Biochem, 79 años, 233-269. Rohs, R.,
West, SM, Liu, P. y Honig, B. (2009). Matiz en la doble hélice y
su papel en el reconocimiento de proteínas y ADN. Curr Opin Struct Biol, 19 ( 2), 171-177.
Rohs, R., West, SM, Sosinsky, A., Liu, P., Mann, RS y Honig, B. (2009). los
papel de la forma del ADN en el reconocimiento proteína-ADN. Naturaleza, 461 ( 7268), 1248-
1253.
Rosenberg, JM (1991). Estructura y función de las endonucleasas de restricción. Curr.
Estructura de opinión. Biol., 1, 104-113.
Rosenberg, JM, McClarin, JA, Frederick, CA, Wang, B.-C., Grable, J., Boyer,
HW y Greene, P. (1987). Estructura y mecanismo de reconocimiento de la endonucleasa EcoRI. TIBS,
12, 395-398.
Roy, PH y Smith, HO (1973a). Metilasas de ADN de Hemophilus influenzae Rd
I. Purificación y propiedades. J. Mol. Biol., 81, 427-444.
Roy, PH y Smith, HO (1973b). ADNmetilasas de Hemophilus influenzae Rd.
II. Secuencias de bases de sitios de reconocimiento parcial. J. Mol. Biol., 81, 445-459.
Seeman, NC, Rosenberg, JM y Rich, A. (1976). Reconocimiento específico de secuencia
de ácidos nucleicos de doble hélice por proteínas. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 73, 804-
808.
Smith, HO y Nathans, D. (1973). Una nomenclatura sugerida para hospedador bacteriano
sistemas de modificación y restricción y sus enzimas. Revista de Biología Molecular, 81 ( 3),
419-423.
Smith, HO y Wilcox, KW (1970). Una enzima de restricción de Hemophilus
influenzae. I. Purificación y propiedades generales. J. Mol. Biol., 51, 379-391. Szybalski, W., Kim,
SC, Hasan, N. y Podhajska, AJ (1991). Restricción de clase IIS
enzimas - una revisión. Gene, 100, 13-26.
Taylor, JD y Halford, SE (1989). Discriminación entre secuencias de ADN por
la endonucleasa de restricción EcoRV. Bioquímica, 28, 6198-6207. Van Etten, JL y Meints, RH
(1999). Virus gigantes que infectan las algas. Annu. Rvdo.
Microbiol., 53, 447-494.
Wah, DA, Hirsch, JA, Dorner, LF, Schildkraut, I. y Aggarwal, AK (1997).
Estructura de la endonucleasa multimodular FokI unida al ADN. Naturaleza,
388, 97-100.
Walder, R. y., Hartley, JL, Donelson, JE y Walder, JA (1981). Clonación y
expresión del sistema de modificación de restricción PstI en Escherichia coli. Proc.
Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 78, 1503-1507.
Walsh, CP y Xu, GL (2006). Metilación de citosina y reparación del ADN. Curr. Parte superior.
Microbiol. Immunol., 301, 283-315.
Watanabe, N., Takasaki, y., Sato, C., Ando, S. y Tanaka, I. (2009). Estructuras
48
Encuentro No. 93, 19-48, 2012
de la endonucleasa de restricción HindIII en complejo con su ADN análogo y

cationes divalentes. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 65 años, 1326-1333.
Wilson, GG y Murray, NE (1979). Clonación molecular del gen de la ADN ligasa
del bacteriófago T4. I. Caracterización de los recombinantes. J Mol Biol, 132 ( 3), 471-491.
Wilson, GG y Murray, NE (1991). Sistemas de restricción y modificación. Annu

Rev Genet, 25 años, 585-627.
Winkler, FK, Banner, DW, Oefner, C., Tsernoglou, D., Brown, RS, Heathman,
SP,. . . Wilson, KS (1993). La estructura cristalina de la endonucleasa EcoRV y de sus
complejos con fragmentos de ADN afines y no afines. EMBO
J., 12 años, 1781-17945.
Xu, S. y., Zhu, Z., Zhang, P., Chan, SH, Samuelson, JC, Xiao, J.,. . . Wilson, G.
G. (2007). Descubrimiento de endonucleasas de mellado naturales Nb.BsrDI y Nb.BtsI e ingeniería de
variantes de mellado de cadena superior de BsrDI y BtsI. Nucleico
Acids Res., 35, 4608-4618.
youell, J. y Firman, K. (2008). EcoR124I: de restricción codificada por plásmido-
sistema de modificación al nanodispositivo. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 72, 365-377.
Viieew
wppuubblliiccaactitud
enn ssttaattss

1 Wilsonetal.2012.en - Es

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

1 Wilsonetal.2012.en - Es

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Vea discusiones, estadísticas y perfiles de autores para esta publicación en: https://www.researchgate.

Enzimas de restricción en microbiología, biotecnología y bioquímica

Artículo · Noviembre 2012

Geoffrey Graham Wilson Daniel Heiter

Biolabs de Nueva Inglaterra Biolabs de Nueva Inglaterra

136 PUBLICACIONES 5.380 CITACIONES dieciséis PUBLICACIONES 243 CITACIONES

VER EL PERFIL VER EL PERFIL

Enzimas de corte de ADN Ver Proyecto

El usuario ha solicitado una mejora del archivo descargado.

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Enzimas de restricción en microbiología,

Geoffrey G. Wilson, * Hua Wang, ** Daniel F. Heiter y *** Keith D.

Recibido: octubre de 2012 / Aceptado: noviembre de 2012

Palabras clave: ADN, especificidad, reconocimiento, discriminación, restricción, modificación,

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Las enzimas de restricción, o más formalmente 'endonucleasas de restricción' (REase), se encuentran

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

1.1 Restricción y modificación de virus

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

países, donde la escasez de equipo y financiación puede frenar fácilmente el entusiasmo.

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Figura 1. Restricción y modificación de bacteriófagos.

enzimas de restricción. Sin embargo, surgen algunas placas en estas bacterias, de

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

1.2 El descubrimiento de las enzimas de restricción

Fue la aplicación de la bioquímica, y en particular la purificación de proteínas, al campo de la

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

La secuencia de reconocimiento de HindII tiene una simetría rotacional doble, también

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

1.3 ADN recombinante

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

de la Universidad de Stanford y Herbert Boyer de la Universidad de California en San Francisco, no

Se han identificado y caracterizado miles de enzimas de restricción de microbios en

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

2.1 Variedad de enzimas de restricción

Las secuencias de reconocimiento de REase de tipo II varían de 4 a 8 pb específicos de longitud, lo que

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

2.2 Genética de enzimas de restricción

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Figura 2. Digestión con enzimas de restricción in vitro

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Figura 2B. Comparaciones de patrones de fragmentos de electroforesis en gel de escisión y corte de

3. Reconocimiento de secuencias de ADN

3.1 La hipótesis del enlace de hidrógeno

En 1976, se propuso una explicación para la especificidad de secuencia basada en enlaces de

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

3.2 La estructura de EcoRI

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Figura 3. Las bases del ADN y sus capacidades de enlace de hidrógeno.

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

3.3 La estructura de EcoRV

rechazado en los resultados.

Figura 4. Distorsión de la secuencia de reconocimiento de

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

En la estructura cristalina de EcoRV unido a su secuencia de reconocimiento GATATC, el ADN está

4. Investigación del mecanismo de reconocimiento de secuencias

4.1 La importancia del ajuste del sitio de unión en el reconocimiento de secuencias

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

4.2 Observaciones que confirman la importancia de los conflictos en el reconocimiento de secuencias

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Figura 6. Conflictos estéricos causados por la metilación del reconocimiento BglII

Encuentro No. 93, 19-48, 2012

Geoffrey G. Wilson, * Hua Wang, Daniel F. Heiter y * Keith D.