PRINCIPIOS

DE
MICROSCOPIA

Biología
MSC Ing. Luis Fernando
Veásquez Tiney
 MICROSCOPIA
Microscopio, del griego: "mikro" = pequeño y
"scopeõ" = mirar (para mirar pequeñas cosas)

Microscopía
Se clasifica en
1930

Primer Microscopio: Z. Jansenn y H. Jansenn 1590

PRINCIPIOS
DE ÓPTICA
Elementos necesarios para formar una imagen:
Fuente de iluminación
Muestras
Sistema de lentes
ÓPTICO ELECTRÓNICO
Fuentes de Fuentes de
iluminación: iluminación:
Luz Visible Haz de
Sistema de Electrones
Lentes: Lentes Sistema de
de vidrio o Lentes:
plástico Electroimanes
Puede ser descrita mediante dos modelos:
Por su forma de propagación, naturaleza ondulatoria (James Clerk Maxwell)
Por su forma de interactuar con la materia, naturaleza corpuscular ó fotónica
(Albert Einstein)
Forma parte del espectro electromagnético
Forma parte de una estrecha franja que va desde longitudes e onda
de 400 nm (violeta) hasta los 700 nm (rojo). (0.4 – 0.7 mm)
 Lentes Convergentes

Objetos que concentran o hacen

divergir los rayos de luz
Lentes Divergentes
(apertura Angular 70°)
Existen dos tipos principales de
Lentes:
Convergentes: forman imágenes
reales
Divergentes: forman imágenes
virtuales
Formación de imagen real

El objeto está fuera del plano focal, y la imagen se forma

detrás de la lente, se observa aumentada e invertida.
El Microscopio de Luz
Instrumento óptico que se usa para
aumentar o amplificar las imágenes de
objetos y organismos no visibles a simple
vista.
Se utiliza para examinar objetos
transparentes o cortados en láminas tan
finas que se transparentan.
Están conformado por tres sistemas:
1. Iluminación
2. Óptico
3. Mecánico
 Partes del microscopio compuesto

Sistema de iluminación: Sistema de óptico:

dirige la luz hacia el objeto, reproduce y aumenta las
comprende: imágenes, comprende:
Fuente de luz Lentes oculares
Espejo Lentes objetivos
Condensador (formado Prismas
por lentes)
Diafragma
Sistema de Iluminación

Fuentes de luz:
Lámpara halógena de intensidad
graduable.
Situada en el pie del microscopio.
El microscopio utiliza la
refracción de la luz para la
formación de imágenes.
 Sistema de Iluminación
Condensador:
Sistema de lentes situadas bajo la platina.

Concentra la luz generada por la fuente de iluminación

hacia la preparación.
Sistema de Iluminación

Diafragma:
Se encuentra en el interior del
condensador.
Limita el haz de rayos de luz que
atraviesa el sistema de lentes
eliminando los rayos demasiado
desviados.
 Sistema Óptico
Este último se llama de
Objetivos: inmersión ya que para su
utilización se necesita
Insertados en el
utilizar aceite de cedro.
mecanismo del revólver.
Generan una imagen real,
invertida y aumentada.
Los mas frecuentes son
los de 4, 10, 40, y 100
aumentos.
 Sistema Óptico

Oculares:
Su función es la de captar
y ampliar la imagen
formada en los objetivos.
Los mas utilizados son
los de 10X (producen un
aumento de 10 veces).
 Sistema Mecánico: posee los elementos que sostienen a
las partes del sistema óptico y de iluminación; comprende:

Base Pinzas de sujeción Tornillos macro y

micrometro
Brazo Tubo ocular
Tornillos del
Platina Mecanismo del revólver carro
Sistema Mecánico

Base:
Sostiene al microscopio y en
ella se integra la fuente
luminosa.
 Sistema Mecánico

Brazo:
Columna perpendicular a la
base.
Puede ser arqueado o vertical y
une a la base con el tubo.
Sistema Mecánico

Platina:
Plataforma donde se coloca la
preparación, posee pinzas de
sujeción y tornillos del carro.
Sistema Mecánico
Tubo:
Es una cámara oscura unida al
brazo mediante una cremallera.
Sostiene al mecanismo del
revolver con los objetivos en su
parte inferior y los oculares en el
extremo superior.
Sistema Mecánico
Tornillo Macrométrico y Micrométrico:
Permiten enfocar al mover la platina
hacia arriba y hacia abajo.
El macrométrico lo hace de forma
rápida y el micrométrico de forma
lenta.
Llevan incorporado un mando de
bloqueo que fija la platina a una
determinada altura.
 Formación
imagen
Microscópica
Formación de la imagen
en el Microscopio
 Conceptos en Microscopía
Amplificación: Amento del tamaño de la imagen.
Amplificación total: Dado por el producto de la lente ocular por el objetivo.
Amplificación vacía: incremento de la imagen sin que pueda percibirse mayores
detalles.

Amplificación de imagen Amplificación vacía de imagen

Poder de Resolución
Distancia mínima entre dos objetos para que sean percibidos como objetos
separados.
La mayoría de células eucarióticas miden entre 3 y 10 veces menos el poder de
resolución del ojo.
La Resolución

Depende de:
Calidad de la lente objetivo.
Longitud de onda de la luz empleada.
Índice de refracción del medio.
 Índice de Medida de la variación
de la velocidad de la
Refracción
luz al atravesar de un
medio a otro.
Aire: 1.0
Aceite: 1.5
 Medidas en Microscopia

Milímetro: milésima parte del metro (mm)

Micrómetro: milésima parte del milímetro (mm)
Nanómetro: milésima parte del micrómetro (nm)
Angstrom: décima parte del nanómetro (Aº)
 Preparaciones
Muestra + Colorante +
Temporales
Medio de Montaje

Muestra + Fijadores + Tinción +

Fijas
Medio de Montaje

Porta objeto

Cubre objeto
Tipos de Microscopios
de Luz
De campo claro (brillante):
el contraste lo provee la
tinción de las muestras
Imágenes con
microscopio de
campo claro
Tipos de Microscopios
de Luz
Contraste de fases: permite
observar muestras vivas, o
carentes de color.
Grosor e IDR.
Placa de fase. Imágenes con
microscopio de
contraste de fases
Contraste de interferencia diferencial
Tipos de Microscopios
de Luz Fibroblastos
teñidos con el
fluorocromo FITC
Fluorescente:
utiliza luz de
longitud de onda,
corta para excitar
Bacillus subtilis
los electrones de esporulando teñidos con
la muestra. FITC, DAPI
y βgalactosidasa.
Cuanto.
Ca++, H+, Na+, Zn2+ y Mg
Tipos de Microscopios
de Luz

Luz Polarizada:
utiliza filtros
polarizantes para Cristales de ácido
observar estructuras úrico observados con
con birrefringencia microscopio de luz

(emite brillantez). polarizada

 Tipos de Microscopios
De campo oscuro: para de Luz
muestras no teñidas,
objeto se observa brillante
sobre un fondo oscuro.

Treponema pallidum observado con

microscopio de campo oscuro
Tipos de Microscopios de
Luz
Tridimensional
Confocal: utiliza
muestras de cortes
seriados teñidas con Secuencias de microscopia confocal
fluorescencia, para
reconstruir una
imagen tridimensional.
Microscopia Confocal
Videomicroscopia
digital

Permite el registro y
almacenamiento electrónico de
imágenes microscópicas
poniendo una cámara de vídeo
en el plano de la imagen
producida por la lente ocular.
 Campo Claro Requiere tinciones

Contraste de Permite diferenciar

Fases densidades no tenciones

Utiliza luz UV, usa

Fluorescencia
fluorocromos
Microscopia
Óptica De Luz Produce
Polarizada birrefringencia

Campo Permite ver muestras

Oscuro vivas, no tinciones

Confocal Forma imágenes 3D

Microscopio Electrónico

Utiliza electrones en lugar

de fotones para formar
imágenes de objetos muy
pequeños.
Funciona con un haz de
electrones de alto voltaje.
Utiliza lentes magnéticas
para formar la imagen
sobre una pantalla.
 Aumenta la imagen desde 1000 hasta
250000 veces.
Posee mayor poder de resolución que el
microscopio óptico, cerca de 2 000 veces.
Microscopía Existen dos tipos de microscopio

Electrónica electrónico:
MTE (microscopio de transmisión
electrónica) electrones transmitidos a través
de una muestra.
MET (microscopio electrónico tridimensional
o de barrido) los electrones rebotan de la
superficie de la muestra.
 Microscopía
Electrónica de
Transmisión

Microscopia
de un alga roja antes
de formar su pared
 Microscopía
Electrónica de Barrido
Óvulo de hámster sin
zona pelúcida con
espermatozoides

Criofactura de epitelio
gástrico visto por
microscopio de barrido
Criofractura
Limites de resolución y magnificación
Resolución Magnificación
Ojo
0.1 mm No produce
Humano

Microscopio 1000 - 2000

200 nm
Óptico veces

Microscopio
3 - 5 A° 250,000 veces
Electrónico
 De Permite ver el
interior de las
Transmisión
estructura

Microscopia
Electrónica
Permite ver la
superficie de
De Barrido
las estructura