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1
ESTUDIO FITOQUIMICO DE HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL Piper catripense
(PIPERACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE.
Proyecto de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Licenciado en Química.
Director:
WILLIAM FERNANDO CASTRILLÓN CARDONA.
Químico, Especialista En Edumatica, Magister en Ciencias Ambientales.
Codirector:
JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ.
Licenciado En Química, Especialista En Análisis Químico Instrumental, Magister En
Ciencias Biológicas Con Énfasis en Fitoquímica.
2
AGRADECIMIENTOS
Le agradezco a Dios por haberme acompañado y guiado a lo largo de mi carrera, por ser
mi fortaleza, mi luz y apoyo en los momento de debilidad.
Le doy gracias a mis padres Elizabeth y Jaime por apoyarme en todo momento y por los
valores que me han inculcado.
A mis hermanos por ser parte importante de mi vida, por llenar mi vida de alegría y
apoyarme en los momentos de necesidad
A Dany por ser una parte muy importante de mi vida, por haberme apoyado en las buenas
y en las malas
A los integrantes del Grupo de Investigación Productos naturales vegetales por su apoyo
incondicional
3
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ......................................................................................................................13
1. INTRODUCCION ....................................................................................................15
2. JUSTIFICACION........................................................................................................16
2.1. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN .............................................................................. 17
3. OBJETIVOS ...............................................................................................................18
3.1. OBJETIVO GENERAL................................................................................................... 18
3.2. OBJETIVOS ESPEIFICOS .......................................................................................... 18
4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA ..............................................................................19
4.1. FAMILIA PIPERÁCEAE ............................................................................................... 19
4.1.1. Características morfológicas de la familia Piperáceae ........................................ 19
4.1.2. Distribución de la familia Piperácea ...................................................................... 20
4.1.3. Uso de la familia Piperácea ................................................................................... 20
4.1.4. Actividades biológicas de la familia Piperácea .................................................... 21
4.1.5. Estudios químicos de la familia Piperácea ........................................................... 22
4.2 GENERO PIPER ............................................................................................................. 24
4.2.1. Características morfológicas del género Piper .................................................... 24
4.2.2. Distribución del género Piper................................................................................. 25
4.2.3. Uso del género Piper .............................................................................................. 26
4.2.4. Actividades biológicas del género Piper ............................................................... 26
4.2.5. Estudios Quimicos del género Piper ..................................................................... 28
4.3. ESPECIE Piper catripense........................................................................................... 31
4.3.1. Características morfológicas de la especie Piper catripense ............................. 31
4.3.2. Distribución de la especie Piper Catripense ......................................................... 32
4.3.3. Uso de la especie Piper Catripense ...................................................................... 32
4.3.4. Actividades biológicas y estudios químicos de la especie Piper Catripense..... 32
4.4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .................................................................................... 33
4.4.1. Antioxidantes ........................................................................................................... 33
4.4.2. Modelos de evaluación de la capacidad antioxidante ......................................... 33
4.4.3. Método 1,1-difenil-pricrilhidrazil (DPPH).............................................................. 35
5. METODOLOGIA ........................................................................................................36
4
5.1. GENERALIDADES ........................................................................................................ 36
5.2. METODOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRAFICA .............................................. 36
5.2.1 Técnicas de elucidación estructural y caracterización de los metabolitos
secundarios aislados ......................................................................................................... 37
5.3. RECOLECCION DE LA MUESTRA ............................................................................. 37
5.4. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR ..................................................................... 38
5.5. EXTRACCIÓN CON ETANOL, FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE es
METABOLITOS SECUNDARIOS PRESENTES EN HOJAS ............................................ 39
5.6 OBTENCION DE FRACCIONES ................................................................................... 40
5.5.2. Fracción hexano de hojas de Piper catripense (Fx.Hex.Pc.H) ........................... 40
5.5.3. Fracción diclorometano de hojas de Piper catripense (Fx.DCM.PcH) ............... 40
5.5.4. Fracción acetato de etilo de hojas de Piper catripense (Fx.AcOEt.Pc.H) ......... 41
5.6. EXTRACCION Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS ACEITES ESENCIALES
................................................................................................................................................ 42
5.6.1 Obtención de aceites esenciales (AE) de hojas de Piper catripense .................. 42
5.6.2 Identificación de los compuestos de AE de Piper catripense .............................. 42
5.8. EVALUACION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .............................................. 43
5.8.1 Preparación de la solución DPPH .......................................................................... 43
5.8.2 Preparación de la curva de referencia .................................................................. 43
5.8.3. Cuantificación de la capacidad antioxidante ........................................................ 43
6. RESULTADOS Y ANALISIS ....................................................................................45
6.1. MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR ...................................................................... 45
6.2 METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS ............................................................. 47
6.2.1. Elucidación estructural del compuesto PcH.1 ...................................................... 47
6.2.2. Composición de la mezcla PcH.2 .......................................................................... 49
6.2.3. Composición de la mezcla PcH.3 .......................................................................... 53
6.2.4. Composición de la mezcla PcH.4 .......................................................................... 56
6.3 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE HOJAS DE Piper
Catripense .............................................................................................................................. 59
6.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS HOJAS DE Piper
Catripense .............................................................................................................................. 63
6.4.1 Curva de calibración para el ensayo DPPH .......................................................... 63
7. CONCLUSIONES ......................................................................................................68
5
8. RECOMENDACIONES .............................................................................................69
9. BIBLIOGRAFIA .........................................................................................................70
6
INDICE DE FIGURAS
Figura 4-1 Características morfológicas de la familia Piperácea. (Naturalista, 2009) ....... 19
Figura 4-3 Características morfológicas de especies del género Piper. (Naturalista, 2009)
........................................................................................................................................ 25
Figura 5-2 Diagrama Marcha Fitoquímica Preliminar para las Hojas de la especie Piper
catripense ........................................................................................................................ 39
Figura 6-2 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto Pc.H1.
........................................................................................................................................ 48
Figura 6-5 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el β- Eudesmol ...... 50
Figura 6-9 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Veridiflorol ......... 52
Figura 6-12 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Piperonal ........ 54
7
Figura 6-13 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Piperonal ....................... 55
Figura 6-19 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Cubebinolide .... 58
Figura 6-21 Perfil cromatografico de los AE de las hojas de Piper catripense .................. 60
8
LISTA DE TABLAS
Tabla 4-2 Actividad biológica de algunas especies del género Piper. .............................. 27
Tabla 4-4 Clasificación de los modelos de ensayo in vitro (Tovar del Rio & Mosquera,
2013) ............................................................................................................................... 34
Tabla 6-1 Marcha fitoquímica preliminar del extracto etanólico de las hojas de la especie
Piper catripense ............................................................................................................... 45
Tabla 6-2 Composición química relativa del aceite esencial de las hojas de la especie
Piper catripense ............................................................................................................... 60
Tabla 6-3 Promedio de absorbancias, % inhibición, IC50 del Ácido Gálico ..................... 64
Tabla 6-4 % inhibición, IC50 del extracto y fracciones de las hojas de la Piper catripense
........................................................................................................................................ 67
9
TABLA DE GRAFICAS
10
LISTA DE ABREVIATURAS
AE Aceites esenciales
CC Cromatografía en columna
CF Cromatografía flash
DCM Diclorometano
DPPH 1,1-difenil-2-2picril-hidrazilo
EM Espectrometría de masas
EtOH Etanol
Hex Hexano
IE Ionización electrónica
IR Índice de retención
11
Mezcla PcH3 Mezcla 3 hojas Piper catripense
SD Desviación edtandar
12
RESUMEN
Se realizó la colecta del material vegetal en el departamento del Choco municipio Bajo
Baudó, y se extrajo mediante la técnica de maceración en frio con etanol al 96%
obteniéndose 60g de extracto total (E.EtOH.PcH), donde mediante el estudio fitoquímico
preliminar se determinó cualitativamente la presencia de diferentes metabolitos
secundarios, tales como flavonoides, taninos, cardiotonicos, carotenoides, alcaloides,
esteroides y triterpenos.
Se obtuvieron los aceites esenciales por la técnica de arrastre de vapor de hojas frescas,
la identificación de los componentes se hizo mediante CG-EM, comparando los índices de
retención y los espectros de masas de las respectivas señales con los de la librería
13
NIST08, permitiendo identificar 29 componentes, en su mayoría sesquiterpenos siendo el
Isolongifolan-8-ol (30,98) el compuesto mayoritario dentro del aceite.
14
1. INTRODUCCION
15
2. JUSTIFICACION
16
importante de especies vegetales con actividades biológicas, razón por la cual, resulta
meritorio contribuir al estudio químico y biológico de las hojas de la especie Piper
catripense ya que esta cuenta con escasos reportes científicos a nivel nacional.
17
3. OBJETIVOS
18
4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA
19
4.1.2. Distribución de la familia Piperácea
La familia Piperaceae comprende unas 1.300 especies de los trópicos húmedos y cálidos
de todo el mundo, pero con centros de radiación en Sudamérica y Malasia como se
muestra en la figura 4-2. Constituida por 10 a 12 géneros entre los que se incluyen: Piper,
Peperomia, Trianaeopiper, Ottonia, Arctottonia, Macropiper, Manekia, Pothomorphea,
Sarcorhachis, Verhuellia y Zippeli.
En América del sur se encuentra Ecuador donde este se distribuyen aproximadamente 4
géneros y 400 especies, en Argentina se cuenta con 2 géneros y 30 especies
aproximadamente, en Perú se encuentran 3 géneros y alrededor de 830 especies, en
Brasil hay 5 géneros y cerca de 500 especies y en Colombia existen cerca de cuatro
géneros y 2500 especies. (Jara Beltrán, 2013)
20
con: las vías respiratorias (asma, bronquitis, y tos), el tracto digestivo (diarrea y dolor
abdominal), también se han diagnosticado que la composición de estas plantas cuenta
con ciertas actividades como: antiinflamatoria (reumatismo), antimicrobiana
(antibacteriana, antifúngica y la cicatrización de heridas) y antileucémica. (Aricapa, 2011)
Una de las especies más representativas de la familia Piperácea es la Piper nigrum más
conocida comúnmente como la Pimienta Negra donde es utilizada como condimento por
sus frutos aromáticos y picantes gracias a la presencia de piperina (Ciccio, 1996).Otras
especies de esta familia han sido motivo de estudio fitoquímico tanto en Colombia como
en otras partes del mundo por contener gran variedad usos entre estas estudios podemos
hablar de la raíz de Piper methysticum la cual es usada como bebida ya que esta posee
una acción sedante, pero hay que tener en cuenta que en altas cantidades es anestésica
e hipnótica esta bebida es utilizada en Asia (Novara, 1998)
En las islas del Pacífico a las raíces de Piper methysticum se les conoce comúnmente
como kava, allí preparan una bebida refrescante, que es consumida habitualmente como
tranquilizante para combatir la ansiedad.
Otra de las especies más conocidas es la Piper auritum kunth de esta especie vegetal sus
hojas son de gran utilidad por ejemplo para las afecciones de la piel; también se emplea
para padecimientos como inflamación vaginal, infección de la matriz y para acelerar el
parto, para este último lo preparan utilizando las hojas remojadas en alcohol. Así mismo
se usa para enfermedades asociadas con el aparato digestivo, como dolor de estómago
falta de apetito, diarrea e inflamación de estómago, se dice además que es un buen
agente para la bronquitis, tos y para bajar fiebre. (Plantas Colombianas, 2010)
21
Tabla 4-1 Actividad biológica de algunas especies de la familia Piperáceae.
22
CH2
O
N H3C
O
O OH
(1) (2)
O
O O
CH3
H3C N
O CH3
(3) (4)
O HO
H
HO H3C CH3
O
H3C
(5) (6)
OH
H3C O
O O
H3C CH3
O O
H3C
O
CH3 CH3
O H3C
(7) (8)
CH3 CH3
O O O O
(9) (10)
23
O
N
O
(11)
OH
O O
NH O
H3C N
O O H3C
HO CH3 O
O O
CH3 CH3
(12) (13)
24
Figura 4-3 Características morfológicas de especies del género Piper. (Naturalista, 2009)
25
Figura 4-4 Distribución geográfica del género Piper
Los puntos verdes hacen referencia a la distribución de la genero Piper (Trópicos, 2014)
las especies del género Piper son utilizadas para el tratamiento de las enfermedades
parasitarias, específicamente en la malaria y la leishmaniasis en la medicina tradicional
bolivariana, también son usadas estas plantas como bebida refrescante y relajante, Las
raíces y frutos son útiles para tratar el asma, la bronquitis, el dolor de abdomen, como
estimulante y para curar afecciones hemorroidales, En América Latina, la especie Piper
amalago es usada para aliviar ciertos dolores de pecho y se usa como agente
antiinflamatorio.
Estudios han demostrado que las raíces y frutos de Piper chaba son útiles para tratar el
asma, la bronquitis, el dolor de abdomen, como estimulante y para curar afecciones
hemorroidales; en China utilizan varias de las especies de este género como la especie
vegetal Piper brachystachyum presenta propiedades insecticidas y los tallos de la Piper
futukadsura, son ampliamente usados para el tratamiento del asma. (Flores Quisbert,
2007)
26
En el chocó y en toda Colombia son muchas las especies del género Piper que son
utilizadas como medicinales con actividad antiinflamatoria o antibiótica y antimicrobiana.
(Pino, 2008). Algunos usos explorados y reportados en la literatura para diversas especies
de Piper son: antimutagenico, antioxidante, antibacteriano, antifúngico, antiparasitario,
anticancerígeno, analgésico, antiinflamatorio, anti-asma, hipotensor, insecticida como se
observa en la Tabla 4-2. Adicionalmente, varias especies del género Piper han presentado
actividad contra protozoos del género Leishmania los cuales son biológicamente activos
contra agentes patógenos que afectan el bienestar del hombre, (Cardona Galeano, y
otros, 2013)
Órgano de la planta
Especie y/o extracto Actividad biológica Referencias
metabolito evaluado
Piper hispidum extracto etanolico de Anti-fúngico contra (Navickiene HM,
las inflorescencias ciadosporium 2000)
sphaerospernum
Piper Extractos acuoso, Anti-fúngico contra (Navickiene HM,
tuberculaturn DCM:MeOH, y EtOH de ciadosporium 2000)
hojas, tallos y espigas sphaerospernum
maduras (con frutos y
semillas)
Piper Extracto acuoso de Analgésico, (Zakaira,
sarmentosum hojas antiinflamatorio Patahuddin,
anticarcinogeno Mohamad, Israf,
& Sulaiman,
2009)
27
Órgano de la planta
Especie y/o extracto Actividad biológica Referencias
metabolito evaluado
sphaerospernum Hostettmann,
1998)
Piper longum Frutos secos Insecticida-acaricida (Soo, Eun , Sik ,
Yoon , Song, &
Yun, 2002)
Piper Holtonii Extracto etanolico de Antiplasmodica (Rojas , Garavito
hojas , & Rincón, 2013)
CH3
CH3
NH
NH CH3
H3C
H3C O
O O
(15) (17)
28
O
CH3
NH
O CH3
O
(16)
O O
O CH3 O
NH N
CH3
O O
(18) (19)
CH3 CH3
O O
O O O O
(20) (21)
CH3 CH3
O O
O O O O
H3C
O
(22) (23)
29
CH3 CH3
O O
O O
O O O O
O O
(24) (25)
La mayoría de las especies del género Piper pueden presentar algunos terpenos en sus
aceites esenciales, principalmente del tipo monoterpenos y sesquiterpenos que varía en
sus núcleos. Se pueden encontrar en estos aceites los siguientes metabolitos como el
dilapiol (26), Miristicina (27), Peperitona (28), Apiol (29), germacreno D (30), fenaldreno
(31), linalol (32). (Parmar, y otros, 1997)
CH3
CH3 CH3
O O
O O O
CH3 O
CH2 CH2
O O H3C CH3
CH3 CH2
O
CH3 CH3
O CH2
CH3
O
H3C OH
H3C
CH3
CH2
(32)
30
4.3. ESPECIE Piper catripense
Esta especie se encuentra comúnmente como hierba o arbusto, sus hojas son
compuestas, opuestas (dos hojas por nudo); presenta un tallo leñoso, con protuberancias
de donde salen las ramas o las hojas (nudos), tiene haces vasculares, Las flores se
organizan en inflorescencias espiciformes (aspecto de espiga), caracterizadas por el
crecimiento indefinido o indeterminado, no presenta frutos como se observa en la figura 4-
5.
REINO PLANTAE
División Angiospermae
Clase Magnoliopsida
Orden Piperales
Familia Piperáceae
Género Piper
Especie Piper catripense
31
4.3.2. Distribución de la especie Piper Catripense
Esta especie no cuenta con estudios químicos ni biológicos excepto por los usos descritos
anteriormente; razón por la cual se hace meritoria para realizar este estudio fitoquímico y
biológico.
32
4.4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
4.4.1. Antioxidantes
Las moléculas oxidadas y fragmentos moleculares más corrientes son los radicales libres.
Todos los radicales libres llevan una innumerable cantidad de electrones que les hacen
inestables y altamente reactivos. Para estabilizarse, les quitan electrones a otras
moléculas. Esto hace que haya más moléculas inestables, provocando una reacción
dañina en cadena de radicales libres, oxidando muchas estructuras biológicas,
dañándolas. Es lo que llamamos el daño oxidativo, importante causa del envejecimiento,
el cáncer, la ateroesclerosis, los procesos inflamatorios crónicos y las cataratas, que son
las más características. (Casa Piá, 2016).
33
En la práctica se realizan muchos modelos de test in vitro, para evaluar la actividad
antioxidante de la muestra de interés; sin embargo, es necesario considerar que los
modelos presenten diferentes variaciones que puede dificultar un poco la comparación de
los resultados entre un método y otro.
Con base a las reacciones químicas, la gran mayoría de los ensayos para determinar de
capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías:
Ensayos basados en la reacción por transferencia de átomos de hidrógeno
Ensayos basados en la reacción por transferencia de electrones
Tabla 4-4 Clasificación de los modelos de ensayo in vitro (Tovar del Rio & Mosquera,
2013)
ENSAYO CATEGORIA
Acido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-
sulfonico ( ABTS)
1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH)
34
4.4.3. Método 1,1-difenil-pricrilhidrazil (DPPH)
El ensayo DPPH permite evaluar la capacidad de sustancias frente al radical libre estable
2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH) en una solución metanólica que tiene un color violeta
intenso que se pierde progresivamente cuando se añade la muestra que contiene
antioxidantes. Así, el grado de decoloración de la solución indica la eficiencia de la
capacidad secuestrante de la sustancia agregada. La decoloración del radical se
determina a 517 nm y la cuantificación se realiza empleando soluciones patrón de ácido
gálico o ácido ascórbico. En la Figura 4-7 se observa la reacción del DPPH con un agente
antioxidante.
35
5. METODOLOGIA
5.1. GENERALIDADES
36
La determinación de la composición química relativa del aceite esencial se realizó por
cromatografía de gases acoplada a masas (CG-EM), el aceite fue diluido en cloroformo,
empleando una columna capilar SHRXi-5MS de 30 metros de longitud x 0,25 mm x 0,25
μm con una inyección en modo Split (10:1), el gas de arrastre utilizado fue helio (grado
5.0) con flujo constante de 1,2mL/min. La temperatura inicial de la columna fue de 40 ºC
manteniéndose por 5 minutos, luego incremento 4 ºC por minuto, hasta llegar a 160 ºC,
aumentado 2,50 ºC por minuto, hasta llegar a 220 ºC aumentando 8 ºC por minuto, hasta
llegar finalmente a 280 ºC manteniéndose por 4 minutos para un tiempo total de análisis
de 70.5 minutos. Los espectros de masas se obtuvieron por ionización electrónica (IE) de
energía de 70 eV. Las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de
transferencia fueron de 230 y 275 ºC, respectivamente. El gas de arrastre utilizado fue
helio (grado 5.0), con flujo constante de 1,2 mL/min.
37
Figura 5-1 Mapa de localización del área de recolección de la especie. Colombia,
Departamento Choco
Tomado de. https://prezi.com/7kexec7s7zvm/copy-of-el-choco/
38
Figura 5-2 Diagrama Marcha Fitoquímica Preliminar para las Hojas de la especie Piper
catripense
Para extraer los diferentes metabolitos secundarios presentes en las hojas de la Piper
Catripense, se realizó la preparación del extracto con 400 g de hojas secas y trituradas en
molino empleando 700 ml de EtOH al 96% durante varios días y agitación en tiempos
parciales utilizando la técnica de maceración en frio. En la preparación de este extracto se
obtuvieron 0.0167 g de un sólido color blanco el cual se denominó compuesto PcH.1.
El extracto etanolico obtenido (E.EtOH.Pc.H) fue floculado con H2O en una relación 1:1
(H2O: E.EtOH.Pc.H) por un tiempo de 24 horas con el fin de eliminar interferencias e
impurezas, se filtró y concentro a presión reducida a 40°C, posteriormente se realizó el
fraccionamiento continuo liquido-liquido. El porcentaje de rendimiento neto que presento
la extracción por maceración en frio con EtOH fue del 12 % a partir del material vegetal
seco.
39
5.6 OBTENCION DE FRACCIONES
0,7 g de la Fx.DCM.Pc.H fueron separados empleando el método de CC, como fase móvil
se utilizó DCM:AcOEt 8:2 obteniendo 9 fracciones. De la fracción numero 1
40
(Fx1.DCM.Pc.H) se obtuvieron 0,566 g de un sólido el cual fue denominado Mezcla PcH.3
y de la fracción 3 (Fx3.DCM.Pc.H), se obtuvieron 0,289 g de un sólido el cual se
denominó Mezcla PcH.4. El procedimiento se ilustra en la figura 5-4
41
AcOEt:DCM 7:3 y empleando como revelador Luz ultravioleta, debido a su complejidad no
se continuo con el estudio de esta fracción.
El aceite esencial fue obtenido a partir de hojas frescas de la especie vegetal Piper
catripense (232 g) por extracción por arrastre de vapor, obteniéndose finalmente 7 mL de
aceite con un porcentaje de rendimiento total del 3,0%. La composición química de los AE
se determinó a partir de CG-EM y la identificación se hizo mediante el cálculo de los
índices de retención (IR) y comparación con los espectros de masas de la base de datos
de la librería NIST 08.
Ecuación 1. Cálculo de IR
(Goodner, 2008)
Dónde:
IR: Índice de retención del compuesto de interés X.
n: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés
X.
N: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye después del compuesto de
interés X.
tRX: Tiempo de retención del compuesto de interés X.
tRN: Tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto de interés X.
42
tRn: Tiempo de retención del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés X.
43
de química de la Fundación Universitaria Juan N. Corpas (Sharma et al, 2010; Martínez,
2014). El porcentaje de inhibición del radical DPPH, se calculó utilizando la siguiente
ecuación:
A Blanco A Muestra
% de inhibición del DPPH *100
A Blanco
Dónde:
A: corresponde a la absorbancia.
44
6. RESULTADOS Y ANALISIS
Tabla 6-1 Marcha fitoquímica preliminar del extracto etanólico de las hojas de la especie
Piper catripense
METABOLITOS PATRÓN DE
ANÁLISIS RESULTADO
SECUNDARIOS CONTROL
Shinoda +
FLAVONIODES Rosenhein Quercetina +
Leucoantocianidinas -
Cloruro férrico +
Digitalis
TANINOS Acetato de plomo
purpurea -
Gelatina – sal +
Borträger-Kraus -
Comportamiento ante
ácido y donador de -
QUINONAS electrones Antrona
Rodamina y amoniaco -
Hidrosulfito de sodio +
Hidroxamato férrico -
Erlich 7- -
CUMARINAS
Hidroxicumarina
Fluoresencia +
45
METABOLITOS PATRÓN DE
ANÁLISIS RESULTADO
SECUNDARIOS CONTROL
SESQUITERPENLACTON
AS
Hidroxamato férrico Manzanilla -
Espuma -
SAPONINAS Quinua
Rosenthaler -
Balijet +
Tollens -
CARDIOTONICOS Diente de león
Antrona +
Molish +
CAROTENOIDES Salkowski Zanahoria +
Valser +
Mayer -
ALCALOIDES Dragendorrf Cinconina +
Schleiber +
Wagner +
Liebermann – Burchard +
ESTERIODES Y
Colesterol
TRITERPENOS
Dienos homoanulares +
*(-) resultado negativo (+) resultado positivo
Como se observan en la tabla 6-1, el extracto etanolico de las hojas de la especie Piper
catripense, presento prueba positiva para los metabolitos secuandarios de tipo
flavonoides, taninos, cardiotonicos, carotenoides, alcaloides, esteroides y triterpenos. Por
el contrario y presento prueba negativa a los siguientes metabolitos secundarios:
quinonas, cumarinas, sesquiterpenlactonas y saponinas.
Los resultados obtenidos están de acuerdo con reportes para las especies que ha
mostrado que la P.crassinervium, P. pesaresanum (Aricapa, 2011), P. tenuistylum, P.
lagenaebaccum (Orbe Saavedra & Tuesta Pinedo, 2013), P. aequaleii ( Garcia Paz ,
2011) P. bogotensis, P.tuberculatum jacq, P. rediculata, P. mariquitense L. y P. aduncum
L (Calle, 2017) presentan los resultados obtenidos en la identificacion de los metabolitos
secuandarios de las hojas de la especie Piper catripense
46
El genero piper se caracteriza por la presencia de diferentes tipos de metabolitos
secundarios, entre los que se destacan las amidas, flavonoides, kavapirona, lignanos,
neolignanos, piperolidos, propenilfenoles y terpenos. Algunos metabolitos aislados como
isobutilamidas pelitorina y guineensina fueron aisladas de la especie Piper nigrum que
presento actividad insecticida contra Culex pipiens, Aedes aegypti y A. togoi (Samuel,
Oliver, coetzee, & Brooke, 2016). De la especie P. hostmannianum var. Berbicense, se
han aislado flavonas como Metillinderina que presentaron actividad antimalarica (Portet et
al., 2007).
47
Figura 6-1 Corriente iónica total (TIC) de la Compuesto PcH.1.
(x10,000)
1.00 109
HO NH
0.75 O
0.50 151
0.25
43 80
53
37 51 65 68 79 91 94 107 120 122 135
0.00
35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 100.0 105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 140.0 145.0 150.0
Figura 6-2 Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto Pc.H1.
48
Figura 6-3 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el acetaminofén
El pico base m/z 109 del espectro del acetaminofén es generado por la pérdida del grupo
carbonilo que en este caso es una cetona, de igual manera se genera la pérdida del grupo
amino y agua característico en los alcoholes
49
4, la cual muestra tres señales con tiempos de retención de 17.377, 19.178 y 19.542
minutos respectivamente.
H3C CH3
H3C
(x10,000)
1.00 59
HO
0.75
0.50 149
0.25 108
41 79 81 93 122 164
67
119 135
39 189 204
0.00
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
50
Figura 6-6 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el β- Eudesmol
Inicialmente este metabolito presenta una ruptura heterolitica del obteniendo dos
productos el primero que es el pico base m/z 59 y el segundo con una m/z 164, posterior
se realiza una pérdida de un metil por medio de una ruptura homolitica, quedando un
compuesto con un m/z 149
(x10,000)
1.00 43
0.75 OH
189
OH
0.50
93
55 81 107 149
79 119
0.25 67 207
133
161
177
0.00
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
51
Figura 6-8 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Cedrane-8,13-diol
el ion molecular del espectro del Cedrane-8,13-diol sufre la pérdida de un CH2O, que
conduce a la formación del ion con m/z 207, el cual pierde de H2O característico de los
alcoholes, sucesivamente se conduce a la eliminación de radicales metilo, CH y el
reordenamiento de hidrógeno.
El compuesto Cedrane-8,13-diol fue identificado en las hojas de la especie Ipomea pes-
caprae como aceite esencial, no se encontró reporte en la familia Piperaceae (Dejanb,
Marie, & Quetin Leclercq, 2007)
El espectro de masas de Veridiflorol (35), se ilustran en la figura 6-9 y 6-10 con un ion
molecular m/z 222, un pico base en 43 m/z con una intensidad relativa del 100% y formula
molecular C15H26O.
(x10,000)
1.00 43
OH
0.75
41
69
0.50 109
55 81 161
0.25 93
121
189 204
135 147
164
0.00
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250
52
Figura 6-10 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Veridiflorol
El ion molecular del espectro del Veridiflorol sufre la pérdida de H2O característico de los
alcoholes que conduce a la formación del ion con m/z 207, sufre ruptura, obteniendo
C12H17 con un m/z 161 y C3H7 con m/z 43 correspondiente al pico base.
Este compuesto fue identificado en la familia piperaceae en las hojas de la especie Piper
aduncum (Rodríguez, y otros, 2013) Piper retrofactum, Piper maclueri leaf (Hieu, Thang,
Hoi, & Ogunwande, 2014) y en las hojas, frutos y raíces de la especie Ottonia
martiana Miq como aceites esenciales (Cunico, y otros, 2007)
Sin embargo el Veridiflorol está presente en Las hojas de Allophylus edulis, mostro
actividad anti-micobacteriana, anti-inflamatoria y antioxidante. (Trevizan , y otros, 2016)
53
compuestos presentes en la mezcla PcH.3: Piperonal, (36) y tetratetracontano (37) con
porcentajes de coincidencia de 93 y 96% respectivamente, la corriente iónica total (TIC)
de la mezcla muestra un dos señales con tiempos de retención de 13.883 y 23.659
minutos, como se observa en la Figura 6-11
(x1,000,000)
TIC
23.659
3.25
3.00
2.75
2.50
2.25
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
13.883
0.25
13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0
O
O
(36)
CH3
H3C
(37)
El espectro de masas y las posibles rutas de fragmentación del Piperonal (36), se ilustran
en la figura 6-12 y 6-13 respectivamente, con un ion molecular a m/z 150 y una
intensidad relativa de 10%, un pico base en 149 m/z con una intensidad relativa del 100%
y formula molecular C8H6O3
(x10,000)
1.00 149
O O
0.75
O
0.50
63 121
0.25
62 91
39
0.00 105
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0
54
Figura 6-13 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Piperonal
Partiendo del ion molecular del Piperonal presenta la perdida y trasposición de hidrogeno,
formado el ion pico base m/z 149, sucesivamente se realizó la pérdida del CO
característico de los alcoholes.
55
(x10,000)
1.00 57
0.75 71
43
0.50 85
0.25 97
113 127
155 169 183 197 211 225 239 267
0.00
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0
Se obtuvo 0,4672 g de un sólido verde, el cual presentó manchas de color violeta en CCD
al ser revelado con Vainillina /H2SO4. La correspondiente comparación de los espectros
de masas con la librería NITS08, permitió la identificación de dos compuesto presentes en
la mezcla PcH.4: 3-butilindolizidina (38) Cubebinolido (39) β- Eudesmol (33) con un
porcentaje de coincidencia de 71, 74 y 91% respectivamente, la corriente iónica total
56
(TIC) del compuesto muestra dos señales con tiempos de retención de 19.029, 19.624 y
23,666 minutos, como se observa en la figura 6-16
(x100,000)
5.5 TIC
5.0
23.686
4.5
4.0
3.5
19.029
3.0
2.5
19.624
2.0
1.5
1.0
0.5
18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5
N
O
O
O O
(38) (39)
(x10,000)
1.00 124
0.75 N
0.50
0.25
44
55 68 81 122
0.00 51 65 94 96 108 110 136 138 150 152
40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 100.0 105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 140.0 145.0 150.0 155.0 160.0 165.0 170.0
57
Figura 6-18 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el 3 – butilindolizidina
(x10,000)
1.00 135 O O
O O
0.75
O O
0.50
0.25 77
50 354
43 105 162
91 131 173 192 219
206
0.00
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0
58
Figura 6-20 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Cubebinolide
A partir del ion molecular del Cubebinolide se observa una ruptura homolitica obteniendo
dos moléculas la primera con un m/z 219 y la segunda un m/z 135 correspondiente al
pico base.
Este compuesto fue aislado por primera vez por Yoshiki e Ishiguro en 1933 a partir del
extracto etéreo de madera de hinoki (Chamecyparis obtusa Sieb. Y Zucc.) Como un
compuesto cristalino incoloro, (Marcotullio , Pelosi , & Curini, 2014) fue identificado en las
especie Piper cubeba y Piper trichostachyon (Usia, Watabe, Kadota, & Tezuka, 2005)
El aceite esencial de las hojas de Piper catripense se obtuvo con un rendimiento del 3,0%.
La identificación de la composición química del aceite esencial se realizó mediante CG-
EM y comparando los índices de retención y los espectros de la librería NITS08. El perfil
59
cromatógrafo se observa en la figura 6-21. Se determinó la presencia de 29
compuestos
Tabla 6-2 Composición química relativa del aceite esencial de las hojas de la especie
Piper catripense
% tR % IR IR
Señal Nombre ***
coincidencia (min) área Teorico Cal
1 α –pineno M 98 14,487 0,8 939 941
2 β-pineno M 97 16,333 0,44 980 991
3 δ-Elemene S 95 30,073 0,28 1339 1340
4 β-elemene S 96 31,987 13,79 1391 1401
5 Hexadecanal AL 95 32,26 0,12 1800 1806
6 Cariofileno S 94 32,9 3,97 1404 1406
60
% tR % IR IR
Señal Nombre ***
coincidencia (min) área Teorico Cal
7 α-Cubebeno S 90 33,153 0,47 1351 1360
8 β-farneseno S 89 33,833 0,12 1443 1442
9 α-cariofileno S 95 33,947 1,2 1454 1453
10 β-Chamigrene S 90 34,613 0,33 1475 1484
11 Germacreno D S 95 34,82 2,35 1480 1488
12 β-Selineno S 93 35,007 1,23 1485 1491
13 Isolongifolan-8-ol S 82 35,593 30,98 1618 1611
14 Epiglobulol S 84 35,833 1,23 1530 1534
15 δ-Cadineno S 88 36,02 0,33 1524 1527
16 L-perillyl alcohol M 82 36,613 2,38 1261 1267
17 Elemol S 95 36,847 1,54 1549 1551
18 Nerolidol S 95 37,167 1,01 1564 1566
19 Germacreno D-4-ol S 90 37,753 0,7 1574 1575
20 1,11- HA 86 38,107 1,76 1627 1631
Hexadecadieno
21 α-copaeno-11-ol S 92 38,447 0,3 1584 1586
22 Guai-1 (10) -en-11- S 91 39,533 0,74 1614 1623
ol
23 δ–Cadinol SO 94 40,087 1,42 1580 1582
24 β-eudesmol SO 95 40,34 10,72 1593 1596
25 α-panasinseno S 87 40,54 1,12 1416 1429
26 ϒ- S 89 41,173 0,31 1558 1559
Gurjunenepoxide-
(2)
27 (Z,E) Farnesol S 82 41,64 2,05 1697 1697
28 β- Cariofileno S 88 42,1 0,63 1494 1504
29 Farnesal S 95 43,073 0,34 1656 1658
MONOTERPENOS(M) 3,62%
SESQUITERPENO (S) 65,02%
SESQUITERPENOIDE (SO) 12,14%
HIDROCARBURO ALIFATICO (HA) 1,76%
ALDEHIDO (AL) 0,12%
61
Los monoterperos encontrados representan un 3,62% de la composición del aceite
esencial de los cuales el componente mayoritario fue L-perillyl alcohol (2,38%), en los
sesquiterpenos se encuentra el primer y segundo compuesto mayoritario que
corresponde al Isolongifolan-8-ol (30,98%) y el β-elemeno (13,79%), en los
sesquiterpenoide se encuentra el tercer compuesto mayoritario β-eudesmol (10,72%), el
hidrocarburo 1,11-hexadecadieno (1,76%) y el aldehído hexadecanal (0,12%).
Teniendo en cuenta que el rendimiento fue alto de 3,0%, se puede considerar que las
hojas de la especie Piper catripense, es un espeice vegetal rica en aceites esenciales, ya
que se caracterizan por producir gran cantidad de monoterpenos y fenilpropanoides, lo
cual está de acuerdo con los componentes volátiles determinados, como se puede
observar en la gráfica anterior.
62
Reportes en la literatura demuestran que los compuestos volátiles determinados en los
aceites esenciales analizados ya habían sido previamente reportados para varias
especies del género Piper ( Parmar, y otros, 1997). Como las especies P. auritum, donde
se identificaron como constituyentes principales monoterpénos, sesquiterpénos y
compuestos oxigenados (Sánchez, Pino, Correa, Naranjo, & Iglesia, 2009), en la especie
P. marginatum fueron identificados β-cubebeno, β-elemeno, Germacreno D y Germacren-
D-4-ol. (Jaramillo-Colorado, Julio-Torres, Duarte-Restrepo, Gonzalez-Coloma, & Julio-
Torres, 2015) en la especie Piper aduncum, donde fueron identificados sesquiterpenos
como el β-cariofileno, α –pineno, β-elemene, δ-Elemene, α-Cubebeno, β- Cariofileno,
Germacreno D y Germacren-D-4-ol (Scalvenzi, Yaguache-Camacho, Cabrera- Martínez, &
Guerrini, 2016)
También se tiene reporte que el compuesto L-perillyl alcohol se estudio con fines de
quimioprevencion dentificado como agente potencial quimiopreventivo (Division of Cancer
Prevention, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2002)
.
6.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS HOJAS DE Piper
Catripense
Para la interpretación de los valores obtenidos durante el ensayo DPPH como estándar de
comparación de la capacidad antioxidante del extracto etanólico y las fracciones de las
hojas de la especie Piper catripense. Como se observa en la grafica 6-2 curva de
calibración del Ácido Gálico, se estimó que los datos de la regresión lineal establecen
que la función matemática que relaciona las variables del porcentaje de inhibición y
concentración (ppm) con un coeficiente de correlación de 0,99134454, el cual nos indica
que existe una buena relación lineal, en el grado de asociación entre las dos variables
cuantitativas, generando una relación directamente proporcional.
63
Como se observa en la tabla 6-3, se muestran el promedio de las absorbancias, el % de
inhibición y el IC50 del control positivo (Ácido Gálico + MeOH), se realizo un stock de 500
ppm de ácido gálico y ocho (8) diluciones en serie (3, 6, 11, 17, 23, 28, 34, 40 ppm),
finalmente se midieron a una absorbancias a 520 nm, en tiempos de 0 y finalizando a los
30 minutos.
64
inhibicion y un IC50 de 3,661 µg/mL presentando un buen grado en la respuesta biologíca
y química de la capacidad antioxidante, para disminuir en un 50% la concentración inicial
del radical DPPH
IC 5 0 A G
100
80
60
AG
40
20
0
0 .5 1 .0 1 .5
L o g C o n c e n tr a c ió n
En la figura 6-4 se evidencia que en el extracto etanolico (E. EtOH. Pc.H) las
concentraciones de 28, 34 y 40 ppm, presentan un % de capacidad antioxidante mayor a
50%, de la fracción de hexano (Fx. Hex. Pc.H) la concentración 40 ppm, presentan un %
de capacidad antioxidante mayor a 50%, la fracción de diclorometano (Fx.DCM.Pc.H) no
registra un % de capacidad antioxidante significativo ya que están por debajo del 40 % y
la fracción de acetato de etilo (Fx. AcOEt.Pc.H), presento un % de capacidad antioxidante
mayor a 50% en las concentraciones de 17,23, 28, 34 y 40 ppm, esto debido a que esta
fracción debe presentar compuestos fenólicos ya que estos compuestos son susceptibles
a la oxidación, por lo tanto, actúan como antioxidantes
65
C a p a c id a d
100
% C a p a c id a d a n tio x id a n te
90
E tO H
80 H ex
70
DCM
60
50 A cO Et
40
30
20
10
0
E tO H Hex DCM Ac O E t
M u e s tr a s
En la tabla 6-4 se observa los porcentaje de inhibición y el IC50 del extracto etanolico (E.
EtOH. Pc.H), la fracción de hexano (Fx. Hex. Pc.H), la fracción de diclorometano
(Fx.DCM.Pc.H) y la fracción de acetato de etilo (Fx. AcOEt.Pc.H), se consideraron como
extractos activos, aquellos que presentaron un porcentaje de actividad antioxidante
superior al 50%; valor que se usó como referencia considerando que equivale a la mitad
de la actividad antioxidante presentada por el Ácido Gálico, utilizado como control
positivo.
Tambien se muestra que el E. EtOH. Pc.H presento un IC50 de 22,57 µg/mL y la Fx.
AcOEt.Pc.H presento un IC50 21,03 µg/mL lo cual indica que tiene un alto potencial de
eliminadores de radicales libres, ya que es capaz de neutralizar el 50% de radicales libres.
La fracción de Fx. Hex. Pc.H presento un IC50 36,92 µg/mL y la Fx. DCM. Pc.H presento
un IC50 92,79 µg/mL, lo cual indica que tiene potencial moderado para neutralizar los
radicales libres.
66
Los valores de la deviacion estandar (sd), ns indican que los datos menos dispersos son
los de la fraccion de diclorometano Fx.DCM.Pc.H y los datos más dispersos son los de la
fracción de hexano Fx. Hex. Pc.H
Tabla 6-4 % inhibición, SD, IC50 del extracto y fracciones de las hojas de la Piper
catripense
67
7. CONCLUSIONES
Se permitió identificar por primera vez la composición química de los aceites esenciales
de las hojas de la especie Piper catripense. Un total de 29 compuestos fueron
identificados, los cuales representan un 83% de la muestra total, constituidos
principalmente por sesquiterpenos, encontrando que el compuesto mayoritario es un
sesquiterpeno identificado como Isolongifolan-8-ol, también se encontraron compuestos
como el β-elemene y sesquiterpenoides como β-eudesmol
68
8. RECOMENDACIONES
Dentro de este proyecto se desea que haya una mejora continua, se recomienda
continuar con el estudio fitoquímico de la especie Piper catripense
69
9. BIBLIOGRAFIA
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