Introducción

El microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son

demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el
primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento
óptico que contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen
aumentada del objeto y que funciona por refracción.

La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se

llama microscopia.

Los microscopios empleados en microscopia común son de tipo óptico o

compuesto y el estereoscopico o de disección; se disponen de una gran
variedad de modelos en su construcción; básicamente, los microscopios
ópticos se caracterizan por tener un tubo que lleva dos sistemas de lentes: el
ocular en el extremo superior y el objetivo en el extremo inferior; la imagen se
forma por el objetivo y se magnifica por el ocular.

Los microscopios equipados con un solo ocular se llaman monoculares;

aquellos con dos oculares, binoculares; dependiendo de su tipo, un
microscopio puede estar equipado con varios objetivos intercambiables, los
mas comunes son 2.5x (lupa), 10x, 40x y 100x.

(Esquemas de los dos tipos de microscopio usados: Microscopio optico y

Microscopio estereoscopico)
OBJETIVO:

Conocer el funcionamiento, componentes, cuidados y limpieza del

microscopio óptico y el microscopio estereoscópico.

Historia:

-El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo, según los
italianos, o por Zacharias Janssen, en opinión de los holandeses. La de
William Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los
capilares sanguíneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia.

-En 1665 Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y

notó que el material era poroso. y con poros, en su conjunto, formaban
cavidades poco profundas a modo de cajas a las que llamó células. Se trataba
de la primera observación de células muertas.

-Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos

acromáticos por asociación de vidrios flint y crown obtenidos en 1740 por
H.M.hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios
efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler . En el siglo XIX, al
descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con
combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado
objetivos acromáticos excelentes.

-Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que

aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron
por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica
surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y, por
encargo de Carl Zeiss , mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el
agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A
principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los
microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a 500X o
1000X
Debido a nuestra evolución intelectual, se ha perfeccionado el microscopio y a
la vez descubrir las cosas mas diminutas del planeta y salvar vidas.

MANEJO DE MICROSCOPIOS:

A. Transporte:

-El microscopio debe ser transportado utilizando LAS DOS MANOS A LA

VEZ, con la mano izquierda se sujeta por el brazo y con la mano derecha se
sujeta por la parte inferior.

-Antes de trasladarlo asegúrese de que todas las piezas que lo componen están
aseguradas a él; asegúrese sobre todo objetivos, platina, espejo, lámpara y
cable de luz enrollado.

B. Sitio de utilización:

-La superficie de uso debe ser firme, plana, estar LIMPIA, sin ningún objeto

-El contacto tomacorriente debe estar a una distancia para que el cable no
quede ni muy tenso ni muy holgado, el cable debe estar ubicado de tal manera
que durante su uso no estorbe ni puedan atorarse los usuarios.

Uso del microscopio:

-Durante su uso, POR NINGÚN MOTIVO debe ser movido de su lugar, como
el uso del microscopio es común, los usuarios son los que deben moverse para
hacer las observaciones.

-La intensidad de la luz debe ser regulada de tal manera que NO

SOBREPASE la mitad de graduación máxima, lo ideal es un tercio, esto con
varias finalidades: no calentar demasiado los microscopios, no dañar los
reguladores, no sobre calentar los focos y con ello fundirlos y sobre todo no
perjudicar la retina del usuario.

-Por ningún motivo deben ponerse al microscopio material de cristalería que

este húmedo o que contenga alguna substancia (colorante, solvente, reactivo,
agua); únicamente debe hacer contacto con el microscopio material de
cristalería: portaobjetos, cajas petri, vidrios de reloj, portaobjetos escavados.
NO poner material directamente sobre la platina o la placa de observación.
LIMPIEZA OPTICA:

A. Para evitar la contaminación de las superficies ópticas

-Mantener el microscopio cubierto con su funda cuando no está en uso.

-No toque los lentes con ningún objeto, sobre todo ponga atención en
párpados, pestañas, dedos, aceite de inmersión o jalea de glicerol, etc. Los
ojos del usuario no deben contener ninguna pintura, polvo, etc.

-No frote los lentes con objetos que pudiera tener abrasivos o partículas que
pudieran dañarlos (batas, pañuelos, papel absorbente, camisas, etc.).

-No ponga en el microscopio portaobjetos que contengan en la superficie

inferior: agua, aceite, resina, jalea, o cualquier medio de montaje, etc.

B. Para remover contaminación de las lentes

-Es mejor examinar la lente con lupa o estereomicroscopio que a simple vista,
la luz reflejada es preferible.

-Se pueden remover partículas sueltas por medio de soplar con una perilla de
aire.

-Otros contaminantes se quitan con disolventes como agua o xileno; antes de

usar un disolvente, cerciórese de que lo que va hacer no es perjudicial al
microscopio; estos se aplican con frotación con papel de lentes, papel seda o
con algodón limpio. Estos materiales no se vuelven a usar, porque podrían
acarrear abrasivos, huellas digitales u otras películas delgadas de grasa pueden
quitarse con disolventes según el paso (en caso de que estén los lentes sucios,
el técnico responsable del laboratorio es quien deberá realizar esta operación).

-Después de usar disolventes, los últimos restos del contaminante se remueven

con papel de lentes, algodón seco o espuma de poliestireno (unicel). El
poliestireno es soluble en xileno y etanol, así que es importante que no esté en
contacto con éstos, sobre todo, sobre los lentes. La espuma de poliestireno se
corta en barras de 10 a 15 mm de diámetro, con una navaja se recortan puntas
sucesivas para crear superficies limpias, las cuales se usan para frotar los
lentes.
-Consulte con los técnicos del laboratorio en caso de cualquier duda de la
limpeza del microscopio.

PARTES DEL MICROSCOPIO:

AJUSTE DEL MICROSCOPIO ÓPTICO O DE LUZ TRANSMITIDA:

La microscopia de luz transmitida, conocida también como campo claro es el

método de microscopia óptica más usual, ya que con su ayuda se puede
observar sin complicaciones y mayores esfuerzos las preparaciones biológicas
ya sea con o sin tinción.

Para obtener la resolución óptima cuando se ilumina por completo el campo

visual, es indispensable ajustar el condensador, el diafragma de campo
luminoso y el diafragma de apertura según el principio de KÖHLER para
ajustar correctamente la iluminación. Para lograr esto el cono luminoso de la
iluminación se adapta al cono de abertura del objetivo, de esta manera se
aprovecha la apertura numérica de la óptica y se evita esa luz “inecesaria” que
se manifiesta como luz difusa perturbante.

Para realizar esos ajustes se sigue el siguiente procedimiento:

1. Colocar en la platina una preparación fija bien contrastada.

2. Graduar la luminosidad de la imagen con el regulador de intensidad de

iluminación en el estativo del microscopio.

3. Desplazar hasta el tope superior con el botón de mando y colocar en

posición central la palanca para regular el diafragma de apertura.

4. Intercalar el objetivo 10x en la trayectoria de rayos de luz con el anillo

moleteado (hexagonal) del revolver portaobjetivos.

5. Mirar en el tubo binocular por el ocular fijo (es importante que solo por este
ocular) y enfocar nítidamente la preparación con el mando de enfoque, usando
tanto el macrometrico como el micrométrico.

6. Graduar la nitidez de la imagen para el otro ojo con el ocular enfocable

hasta que la imagen se vea perfectamente nítida.

7. Cerrar el diafragma del campo luminoso hasta el punto en que se pueda ver
el campo visual sin importar la nitidez

8. Graduar el condensador con el botón de mando del condensador hasta

enfocar nítidamente el borde del diafragma del campo luminoso

9. Centrar perfectamente este diafragma con ambos tornillos de centraje del

condensador

10.Abrir el diafragma hasta el punto en el que el borde desaparezca

suficientemente del campo visual (que desaparezca del campo el hexágono)

11.Regular el diafragma de apertura (contraste) para el efecto de sacar un

ocular del portaoculares y mirar (preferentemente sacar el ocular fijo).
Graduar el diafragma de apertura de 2/3 a 4/5 del diámetro de la pupila de
salida del objetivo con la palanca

12.Colocar de nuevo el ocular en el portaoculares.

AJUSTE DE LA DISTANCIA INTERPUPILAR:

Otro aspecto importante a considerar es que cada persona tiene una distancia
interpupilar especifica, para ello deberá realizarse el ajuste alejando o
juntando los oculares de tal manera que al estar oservando atraves de ellos se
vean los dos círculos superpuestos de tal manera que solo se distinga uno solo.

AJUSTE DEL MICROSCOPIO ESTEREOSCOPICO:

1. Conecte y encienda el microscopio

2. Coloque un objeto en la parte central de la placa de observación.

3. Con el tornillo de enfoque baje lo más posible el microscopio sin tocar su

material de observación.

4. Observando por los oculares suba lentamente el microscopio hasta observar

su material.

5. Ajuste la abertura interpupilar de tal manera que vea un solo cirlculo de

observación.

6. Ajuste la nitidez de su material observándolo a través del ocular fijo.

7. Ajuste la nitidez del ocular móvil.

Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza

de los sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imágenes.

tipos de microscopios que existen actualmente:

1) Microscopio óptico

El óptico fue el primer microscopio de la historia. Marcó un antes y un

después en la biología y la medicina pues, a pesar de su relativa sencillez
tecnológica, permitió observar por primera vez estructuras unicelulares.

La principal característica del microscopio óptico es que la luz visible es el

elemento que permite visualizar la muestra. Un haz de luz ilumina el objeto a
observar, lo atraviesa y es conducido hasta el ojo del observador, que percibe
una imagen ampliada gracias a un sistema de lentes.

Resulta útil para la mayoría de tareas de microscopía, pues permite una

correcta visualización de tejidos y células. Sin embargo, su límite de
resolución viene marcado por la difracción de la luz, un fenómeno por el cual
el haz de luz inevitablemente se desvía en el espacio. Es por ello que lo
máximo que se puede obtener con un microscopio óptico son 1.500 aumentos.

2) Microscopio electrónico de transmisión

El microscopio electrónico de transmisión se inventó durante los años

30 y supuso, igual que el óptico en su día, toda una revolución. Este tipo de
microscopio permitía llegar a un número de aumentos mucho mayor ya que no
utilizaba la luz visible como elemento de visualización, sino que usaba
electrones.

El mecanismo de un microscopio electrónico de transmisión se basa en hacer

incidir electrones sobre una muestra ultrafina, mucho más de las que se
preparaban para su visualización en el microscopio óptico. La imagen se
obtiene a partir de los electrones que han atravesado la muestra y que
posteriormente han impactado sobre una placa fotográfica.
Tecnológicamente son mucho más complejos que los ópticos ya que para
conseguir el correcto flujo de electrones por su interior, este debe estar al
vacío. Los electrones son acelerados hacia la muestra mediante un campo
magnético

Cuando inciden sobre esta, algunos electrones la atravesarán y otros

“rebotarán” y serán dispersados. Esto da lugar a imágenes con zonas oscuras
(donde los electrones han rebotado) y zonas claras (donde los electrones han
atravesado la muestra), que en su totalidad conforman una imagen en blanco y
negro de la muestra.

Gracias a no estar limitado a la longitud de onda de la luz visible, los

microscopios electrónicos pueden ampliar un objeto hasta 1.000.000 de
veces. Esto permite la visualización no solo de bacterias, sino también de
virus; algo imposible con un microscopio óptico.

3) Microscopio electrónico de barrido

El microscopio electrónico de barrido también se basa en la colisión de

electrones sobre la muestra para lograr la visualización, pero en este caso
las partículas no impactan sobre toda la muestra simultáneamente, sino que lo
hacen recorriendo distintos puntos. Como si se tratara de un escaneado.

En el microscopio electrónico de barrido la imagen no se obtiene de los

electrones que impactan sobre una placa fotográfica después de atravesar la
muestra. En este caso su funcionamiento se basa en las propiedades de los
electrones, que después de impactar sobre la muestra sufren cambios: una
parte de su energía inicial se transforma en rayos X o en emisión de calor.

Midiendo estos cambios se puede obtener toda la información necesaria para,

como si de un mapa se tratara, hacer una reconstrucción ampliada de la
muestra.

4) Microscopio de fluorescencia

Los microscopios de fluorescencia generan una imagen gracias a las

propiedades fluorescentes de la muestra observada. La preparación es
iluminada mediante una lámpara xenón o de vapor de mercurio, es decir, no se
usa un haz de luz tradicional, sino que se trabaja con gases.

Estos gases iluminan la muestra con una longitud de onda muy concreta que
permite que las sustancias de la muestra empiecen a emitir luz propia. Es
decir, es la propia muestra la que genera luz. No la iluminamos, incitamos a
que ella produzca luz.

Es muy utilizado en microscopía biológica y analítica, pues es una técnica que

otorga gran sensibilidad y especificidad.

5) Microscopio confocal

En la línea de lo que hacía un microscopio electrónico de barrido, el

microscopio confocal es un tipo de microscopio de fluorescencia en el que no
se ilumina la muestra en su totalidad, sino que se hace un escaneado.

La ventaja respecto al de fluorescencia tradicional es que el microscopio

confocal permite hacer una reconstrucción de la muestra obteniendo imágenes
tridimensionales.

6) Microscopio de efecto túnel

El microscopio de efecto túnel permite visualizar la estructura atómica de las

partículas. Utilizando principios de la mecánica cuántica, estos microscopios
capturan los electrones y se logra una imagen de alta resolución en la que cada
átomo se puede distinguir del otro.

Es un instrumento imprescindible en el campo de la nanotecnología. Pueden

ser utilizados para producir cambios en la composición molecular de las
sustancias y permite obtener imágenes tridimensionales.

7) Microscopio de rayos X

El microscopio de rayos X no utiliza la luz ni los electrones, sino que para

lograr la visualización de la muestra, esta es excitada con rayos X. Esta
radiación de muy baja longitud de onda es absorbida por los electrones de la
muestra, lo que permite conocer la estructura electrónica de esta.

8) Microscopio de fuerza atómica

El microscopio de fuerza atómica no detecta ni luz ni electrones, pues su
funcionamiento se basa en hacer un escaneado de la superficie de la muestra
para detectar las fuerzas que se establecen entre los átomos de la sonda del
microscopio y los átomos de la superficie.

Detecta fuerzas de atracción y de repulsión muy leves y esto permite hacer un

mapeado de la superficie obteniendo así imágenes tridimensionales como si de
una técnica de topografía se tratara. Tiene infinidad de aplicaciones en
nanotecnología.

9) Microscopio estereoscópico

Los microscopios estereoscópicos son una variación de los ópticos

tradicionales que permiten una visualización tridimensional de la muestra.

Equipados con dos oculares (los ópticos generalmente solo tenían uno), la
imagen que llega a cada uno de los oculares es ligeramente distinta entre ellos,
pero al combinarse se consigue ese efecto tridimensional deseado.

Pese a no llegar a aumentos tan altos como con el óptico, el microscopio

estereoscópico es muy utilizado en tareas en las que se requiere hacer una
manipulación simultánea de la muestra.

Proporciona una imagen estereoscópica, en tres dimensiones (3D) del

espécimen. Se fundamenta en la visión binocular convencional, en la que los
dos ojos observan el espécimen con ángulos levemente distintos. El
microscopio estereoscópico debe ser binocular. Se utiliza para observar
especímenes de gran tamaño, sin corte o preparación previa puesto que emplea
luz incidente y no funciona por trans-iluminación. Es ideal para realizar
microdiseccion.
 (Microscopio estereoscópico)

10) Microscopio petrográfico

También conocido como microscopio de luz polarizada, el microscopio

petrográfico se basa en los principios del óptico pero con una
particularidad añadida: tiene dos polarizadores (uno en el condensador y
otro en el ocular) que reducen la refracción de la luz y la cantidad de brillo.

Se utiliza cuando se observan minerales y objetos cristalinos, ya que si se

iluminaran de forma tradicional, la imagen obtenida sería borrosa y difícil de
apreciar. También es útil cuando se analizan tejidos que pueden provocar la
refracción de la luz, generalmente tejido muscular.

11) Microscopio de iones en campo

El microscopio de iones en campo es usado en ciencias de materiales ya

que permite visualizar la ordenación de los átomos de la muestra.

Con un funcionamiento similar al microscopio de fuerza atómica, con esta

técnica se miden los átomos de gas absorbidos por una punta de metal para
hacer una reconstrucción de la superficie de la muestra a nivel atómico.
12) Microscopio digital

El microscopio digital es aquel instrumento capaz de capturar una

imagen de la muestra y proyectarla. Su principal característica es que en
lugar de disponer de un ocular, está dotado de una cámara.

Pese a que su límite de resolución es menor que el de un microscopio óptico

convencional, los microscopios digitales son muy útiles para observar objetos
cotidianos y el hecho de poder almacenar las imágenes obtenidas es un
reclamo comercial muy potente.

13) Microscopio compuesto

El microscopio compuesto es todo aquel microscopio óptico dotado de al

menos dos lentes. Mientras que los tradicionales solían ser simples, la
inmensa mayoría de los microscopios modernos son compuestos ya que
disponen de varias lentes tanto en el objetivo como en el ocular.

14) Microscopio de luz transmitida

En el microscopio de luz transmitida, la luz atraviesa la muestra y es el

sistema de iluminación más utilizado en los microscopios ópticos. La
muestra debe ser cortada muy fina para hacerla semitransparente y que parte
de la luz pueda atravesarla.

15) Microscopio de luz reflejada

En los microscopios de luz reflejada, la luz no atraviesa la muestra, sino que

es reflejada al incidir sobre esta y conducida hacia el objetivo. Este tipo de
microscopio es utilizado cuando se trabaja con materiales opacos que, por
muy finos que sean los cortes obtenidos, no dejan pasar la luz.

16) Microscopio de luz ultravioleta

Como su propio nombre indica, los microscopios de luz ultravioleta no

iluminan la muestra con luz visible, sino que lo hacen con luz ultravioleta.
Al ser su longitud de onda más corta, puede conseguirse una resolución
mayor.
Además, es capaz de detectar un mayor número de contrastes, por lo que es
útil cuando las muestras son demasiado transparentes y no podrían
visualizarse con un microscopio óptico tradicional.

17) Microscopio de campo oscuro

En los microscopios de campo oscuro la muestra es iluminada de forma

oblicua. De este modo, los rayos de luz que llegan al objetivo no vienen
directamente del foco lumínico, sino que han sido dispersados por la muestra.

No requiere teñir la muestra para su visualización y permite trabajar con

células y tejidos demasiado transparentes como para ser observados con
técnicas convencionales de iluminación.

18) Microscopio de contraste de fases

El microscopio de contraste de fases basa su funcionamiento en el

principio físico por el cual la luz viaja a distintas velocidades en función del
medio por el que viaja.

Utilizando esta propiedad, el microscopio recoge las velocidades a las que ha

circulado la luz mientras atravesaba la muestra para hacer una reconstrucción
y obtener una imagen. Permite trabajar con células vivas ya que no requiere
teñir la muestra.

 El microscopio óptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para

microfotografía). En los microscopios binoculares la observación se
hace con los dos ojos y esto permite una observación más cómoda y se
percibe una mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se fabrican en
diferentes tamaños incluyendo microscopios pequeños portátiles o de
viaje. Dentro de los tipos de microscopios se describen:

-Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a

partir de los modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la base,
por debajo de la platina. Es el microscopio de uso más común.
-Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en
comparación al microscopio convencional. La fuente de luz está ubicada por
encima de la platina y el principio de funcionamiento y formación de la
imagen es el mismo que el del microscopio tradicional. Utilizado
principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una preparación
previa y para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento)

(Microscopio invertido con el revólver y objetivos por debajo de la platina. La

fuente de luz se ubica en la parte superior)

Microscopio quirúrgico: Es un microscopio que se emplea en microcirugía.

Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras
anatómicas, facilitándole al cirujano una mayor visibilidad de los tejidos sanos
y patológicos que serán manipulados más cuidadosamente y con menores
posibilidades de lesión. Algunos modelos más sofisticados tienen piezas
automatizadas robóticas. Se utiliza principalmente en intervenciones
quirúrgicas en las que se amerite una minuciosa disección, como por ejemplo
del cráneo y cerebro o del globo ocular.
 (Cirujano empleando microscopio quirúrgico)

Microscopios fotónicos especiales: Ciertos especímenes, principalmente las

células vivas o muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio
común de campo claro, muestran un muy pobre contraste de sus estructuras y
no aportan datos relevantes, a pesar del poder de resolución de los objetivos
empleados. Para ello se han creado microscopios con ciertas particularidades
que permiten la observación de ese tipo de especímenes con un incremento
muy satisfactorio del contraste. Entre ellos:

 Microscopio de campo oscuro.

 Microscopio de luz ultravioleta.
 Microscopio de fluorescencia.
 Microscopio de polarización.
 Microscopio de contraste de fases.
 Microscopios interferenciales.