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EFECTO ANTAGONISTA Y BIOCONTROLADOR DE Pseudomonas protegens

HACIA LA CLOCA DEL DURAZNO (Taphrina deformans) EN EL CULTIVO DE
DURAZNO

Article · March 2020

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Cristhian Andres Ordoñez

University of Cuenca
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 EFECTO ANTAGONISTA Y BIOCONTROLADOR DE Pseudomonas protegens HACIA LA
CLOCA DEL DURAZNO (Taphrina deformans) EN EL CULTIVO DE DURAZNO.

Cristhian Ordóñez, Andrés Vallejo, Valeria Paguay, Álvaro Navas

RESUMEN

En la actual agricultura el uso de pesticidas y fertilizantes es muy común para mejorar la calidad de las
cosechas en épocas de siembra, en los últimos años se ha buscado soluciones para disminuir la cantidad de
emisiones y contaminación que realizan tanto al medioambiente como a la flora y fauna del suelo; es por
eso de la necesidad de usar biocontroladores naturales, amigables con el medio ambiente y que disminuyan
considerablemente la contaminación que estas puedan efectuar. Es así, que se aisló la bacteria Pseudomonas
protegens de la rizósfera como un medio alternativo de control hacia distintas enfermedades de un gran
número de especies vegetales; a su vez, se aisló el hongo que provoca la cloca en el durazno (Taphrina
deformans) en la provincia del Azuay en el cantón Cuenca por plantas con presencia de la misma en su
masa foliar, para luego estudiar los efectos que tiene la bacteria P. protegens sobre el hongo Taphrina
deformans. La zona exterior de las hojas de Prunus persica fueron desinfectadas con enjuagues de alcohol
diluido y agua destilada. Luego de su desinfección se seccionaron las hojas con presencia de la enfermedad;
posteriormente se realizó la inoculación que se llevó a cabo a través de medio agar papa destroza. Mientras
tanto, la bacteria P. protegens se la reactivo en medio agar papa destroza para reactivar su actividad
microbiana. Posteriormente, una vez purificada las muestras, se procedió en la mitad de una misma caja
Petri a repicar el hongo y en la otra mitad la bacteria; en otras cajas Petri se repicó el hongo y la bacteria,
luego estas se las unió mediante biofilm. Los resultados determinaron una disminución en el diámetro del
crecimiento del hongo Taphrina deformans hasta de un 94% mediante metabolitos secundarios exudados
por la bacteria Pseudomonas protegens y hasta en un 65% mediante los compuestos volátiles expulsados
por la misma bacteria. Se denotó que la tasa de crecimiento del hongo en presencia de los compuestos
volátiles fue de 1,38cm/día; mientras que en presencia de metabolitos secundarios fue de 0.34cm/día. Dando
así a conocer los efectos antifúngicos de la bacteria P. protegens frente a hongos fitopatógenos.

Palabras clave: Taphrina deformans, Aislamiento, Pseudomonas protegens, antagonismo

INTRODUCCION tales como el ciclaje de nutrientes, la

El uso de Biopesticidas para la agricultura
ecológica, ha dado grandes resultados desde un
punto de vista amigable con el medioambiente y
sin perjudicar a la flora y fauna del suelo. En la
agricultura actual es necesario el uso tanto de
pesticidas y fertilizantes que ayuden a obtener un
mayor rendimiento en época de cosecha,
intentado en lo posible evitar el mal uso de los
mismos que puedan provocar un gran deterioro en
el ecosistema. La sostenibilidad de los sistemas
agrícolas a largo plazo debe fomentar el uso y
manejo efectivo de los recursos internos de los
agroecosistemas (Terry Elein, Leyva, & Hernández,
2005).
Los microorganismos tienen grandes beneficios
en muchos procesos tanto físicos y químicos,
descomposición de materia orgánica, el
mejoramiento de la textura del suelo, la fijación
de nitrógeno atmosférico, aumenta la
disponibilidad de los nutrientes que se encuentran
en formas no asimilables para las plantas y
principalmente su actividad como organismos
antagónicos contra agentes fitopatógenos
(Aguado, 2012).
En las últimas décadas se ha tomado conciencia
del agotamiento de los recursos naturales debido
a la explotación desmesurada de los mismos
(Londoño, 2006). Por lo tanto, es necesario
encontrar soluciones adecuadas, y estas son
encontradas gracias a nuevas tecnologías
orientadas a mantener la sostenibilidad del
sistema mediante la explotación mesurable de los
recursos del planeta para preservar el ambiente

1
(Grageda-Cabrera, Díaz-Franco, Peña-Cabriales,
& Vera-Nuñez, 2012).
Las bacterias rizosféricas se pueden clasificar
como beneficiosas, perjudiciales o neutras en
función de su impacto en la vitalidad de la planta
(Chaudhry, Blom-Zandstra, Gupta, & Joner,
2005). Dentro de esta heterogeneidad, las
rizobacterias pertenecientes a géneros tales como
Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas o Serratia
incluyen algunas de las especies bacterianas
habitualmente consideradas como promotoras del
crecimiento vegetal (PGPR) (Matilla & Krell,
2017).
Las PGPR (Rizobacterias promotoras del
crecimiento vegetal) pueden promover el
crecimiento vegetal indirectamente a través de su
capacidad para proteger a plantas frente al ataque
de fitopatógenos. Uno de los mecanismos que
emplean es la síntesis de compuestos volátiles y
metabolitos secundarios bioactivos (antibióticos)
(Canchigniam, Hayron; Cruz Rosero, Nicolás;
Barrera, Alexandra; Morante, Jaime; Canchignia,
Gina; Peñafiel, María, 2015). Uno de los
requerimientos más importantes para que una
bacteria sea considerada como PGPR es el tiempo
de permanencia en la rizósfera después de la
inoculación. Una población introducida que
declina rápidamente en el tiempo, tendrá una baja
habilidad de competencia con la flora nativa
(Álvarez & Díaz, 2008).
Otro tipo de beneficios que tienen las PGPR, es la
influencia en el mejoramiento de la estructura del
suelo por su contribución a la formación de
agregados estables y su vez como
bioremediadores, eliminando productos
xenobióticos tales como pesticidas, herbicidas y
fungicidas (Grageda-Cabrera, Díaz-Franco,
Peña-Cabriales, & Vera-Nuñez, 2012).
Entre estas tenemos a Pseudomonas protegens
con actividad biocontroladora, esta bacteria
produce uno o más de un número limitado de
antibióticos tales como: fenacina (Phz), 2,4-
diacetilfluoroglucinol (Phl), pirrolnitrina (Prn) y
pioluteorina (Plt) (Laverde, 2016), siendo estos
considerados la causa principal de su actividad
antagonista.
2
Es por eso que es importante buscar diversos
microorganismos benéficos para una mejor
producción agrícola pues estos pueden llegar a
abaratar costos de producción y de igual manera
proteger la calidad de los suelos y aguas de cada
ecosistema; planteándose así que a partir de la
masa foliar de durazno (Prunus persica) con
presencia de Taphrina deformans este se pudiera
aislar y purificar en medio de cultivo PDA, para
luego enfrentarlo con un biocontrolador natural
(Pseudomonas protegens) obtenido de la
provincia de Azuay.
MATERIALES Y MÉTODOS
El laboratorio de microbiología de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad de
Cuenca, políticamente se encuentra ubicado en la
parroquia Yanuncay del cantón Cuenca dentro de
la Provincia del Azuay.
Figura 1. Mapa de ubicación de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca.
Localización y obtención de la muestra: Las
muestras fueron obtenidas de un cultivo de
durazno (Prunus persica) ubicada en la provincia
del Azuay dentro del cantón Cuenca, se
recolectaron muestras basadas en material vegetal
con síntomas típicos de la enfermedad fúngica,
las cuáles fueron transportadas en bolsas ziploc y
procesadas para el aislamiento de hongo
fitopatógeno.
Obtención del inóculo: El aislamiento del
microorganismo se realizó mediante cortes de
tejido vegetal de 1mm2 tomados de la zona de
infección de las hojas de la planta de Prunus
pérsica y la consecuente desinfección del mismo
mediante inmersión en etanol al 70% por 30 y 60
segundos, efectuando luego enjuagues con agua
destilada. Posterior a eso se tomó el tejido y se
inoculó en medio de cultivo PDA.

Observación e identificación del hongo: Se

procedió a identificar el hongo para lo cual
tomamos una muestra del mismo, se colocó en
una lámina portaobjetos con una gota de azul de
metileno, la muestra se cubrió con un Figura 3. Reactivación de Pseudomonas protegens
cubreobjetos y se procedió a observar en un en medio de cultivo PDA.
microscopio electrónico para la posterior
Enfrentamiento de Taphrina deformans con
identificación de Taphrina deformans.
Pseudomonas protegens:

Para observar el efecto antagonista que tuvo P.

Fig 2. Obtención de hongo fitopatógeno (Taphrina
deformans).
Preparación del medio de cultivo PDA: Para la
preparación del medio de cultivo PDA se utilizó
la 200gr de papa y esta se la puso a hervir durante
30 min en un Erlenmeyer con 600 ml de agua
destilada agitando con una varilla de vidrio
frecuentemente hasta el punto de ebullición, se
añadió 20gr de agar y 20gr de sacarosa para
posteriormente esterelizar en autoclave a 121° C
durante 30min.
protegens frente a T. deformans se hizo 3
repeticiones para cada uno de los ensayos. El
primer consta en una misma caja Petri se
involucrara al hongo fitopatógeno y a la bacteria.
Para el segundo ensayo, se repico en una caja
Petri el hongo y en otra caja se sembró a
Pseudomonas protegens por agotamiento,
posteriormente se unió las cajas petri mediante
biofilm para evitar la pérdida de compuestos
volátiles hacia el exterior. Finalmente, las demás
cajas petri fueron usadas para el control de testigo
del hongo fitopatógeno.
Para este ensayo se evaluó el diámetro de
crecimiento del hongo frente a Pseudomonas
protegens, a partir de la síntesis de compuestos
volátiles y metabolitos secundarios bioactivos de
la bacteria antes mencionada.

Reactivación de la cepa bacteriana

Pseudomonas protegens: Con una aza de platino
se tomó una parte de Pseudomonas protegens del
tubo de ensayo, este se sembró en las cajas Petri
(6 repeticiones) previamente colocadas con
medio de cultivo PDA. La cepa de Pseudomonas
protegens fue obtenida del laboratorio de
investigación de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias. Figura 4. Primer ensayo entre Pseudomonas
protegens y Taphrina deformans

3
Diseño experimental y estadístico: El estudio Día 1
realizado se basó en un componente experimental
el cual incluyó el aislamiento a partir del material
infectado. El diseño experimental fue
completamente en bloques sistemáticos. Los
datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de
varianza para cumplir con los supuestos de
normalidad y homogeneidad de la varianza (Little
& Jackson, 1989). Posteriormente estos datos
fueron sometidos a un análisis de varianza
(ANOVA) y prueba de Tuckey (P < 0.05) (SAS
Institute Inc., 1989).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Crecimiento del hongo

Taphrina deformans Cuadro 2. Tasa de crecimiento del hongo
respecto a los diferentes tratamientos en el día 1
9 (1.-Volatiles, 2.- Metabolitos, 3.- Testigo).
8
Día 2
Crecimiento en cm

7
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4
Días

Compuestos Volátiles
Metabolitos Secundarios
Testigo

Cuadro 3. Tasa de crecimiento del hongo

Cuadro 1. Crecimiento en cm/día del hongo respecto a los diferentes tratamientos en el día 2
Taphrina deformans en presencia de (1.-Volatiles, 2.- Metabolitos, 3.- Testigo).
Pseudomonas protegens, tanto para compuestos
volátiles como para metabolitos secundarios.

4
Día 3
Cuadro 4. Tasa de crecimiento del hongo
respecto a los diferentes tratamientos en el día 3
(1.-Volatiles, 2.- Metabolitos, 3.- Testigo).
Día 4
Cuadro 5. Tasa de crecimiento del hongo
respecto a los diferentes tratamientos en el día 4
(1.-Volatiles, 2.- Metabolitos, 3.- Testigo).
Los resultados obtenidos en los diferentes días
muestran una clara diferencia estadísticamente
significativa, siendo que los compuestos
generados por Pseudomonas protegens inhiben
en gran medida el crecimiento del hongo
fitopatógeno Taphrina deformans. Se toma a
consideración que el crecimiento radial se ve
alterado tanto por la síntesis de compuestos
5
volátiles y metabolitos secundarios bioactivos de
la bacteria (Fernando, Nakkeran, & Zhang,
2006).
Figura 5. Efecto de Pseudomonas protegens
frente al hongo Taphrina deformans al cuarto día.
Siendo los metabolitos secundarios los que
pueden llegar a inhibir el crecimiento del hongo
hasta en un 94%, seguido así de los compuestos
volátiles con un 65%, y sin este un crecimiento
total del mismo. Así mismo Canchigniam,
Hayron; Cruz Rosero, Nicolás; Barrera,
Alexandra; Morante, Jaime; Canchignia, Gina;
Peñafiel, María (2015) demostraron como la
bacteria P. protegens tiene efectos antifúngicos
para diferentes organismos fitopatógenos.
Cabe recalcar que del día 1 al día 4, todos los
valores fueron significativos lo que comprueba
que, desde el inicio de los respectivos
enfrentamientos, tuvo un efecto antifúngico.
Según lo descrito por Matilla & Krell (2017)
Pseudomonas protegens producen metabolitos
llamados “Pyoluteorin” y “Rhizoxin” los cuales
son encargados de la inhibición en el crecimiento
de diversos hongos fitopatógenos.
Según Bernar y Ruiz (2016) han demostrado que
Pseudomonas protegens es encargado de la
formación de ácido fusárico, este compuesto
suprime las enfermedades causadas por hongos.
Sin embargo, hay que tomar en consideración que
dependiendo las propiedades físico-químicas del
suelo y las interacciones que existe en la
rizósfera, estos compuestos pueden verse
alterados.
 Dia Compuestos Metabolitos Testigo Se puede apreciar como el crecimiento se ve
Volátiles Secundarios interrumpido por Pseudomonas protegens hacia
el hongo (figuras 5, 6) contra el testigo (figura 7).
1 1,3 0,2 2,37
Al igual que ha Chávez (2016) al enfrentar P.
2 3,13 0,5 5,8 protegens contra un hongo fitopatógeno mostró
un claro efecto antagónico hacia el mismo,
3 4,73 0,93 7,3 concordando también con Ceballos (2009) se
encontró cepas de P. protegens que podían llegar
4 5,43 1,23 8,4 a un porcentaje de inhibición en campo de hasta
Cuadro 6. Comparación del crecimiento diario un 77% con respecto al hongo fitopatógeno.
del diámetro del hongo con los distintos Así representan un auténtico potencial las PGPR
tratamientos vs testigo. como principal enfoque hacia compuestos
La tasa de crecimiento de Taphrina deformans en antifúngicos contra diversos patógenos (Han,
presencia de Pseudomonas protegens se ve Jiyong, Sung, Kee, & Gung, 2003)
significativamente diferenciada. El hongo creció CONCLUSIONES
un aproximado de 1.38cm/día en presencia de sus
compuestos volátiles, mientras a la notable La bacteria Pseudomonas protegens permitió la
diferencia de 0,34cm/día en presencia de la inhibición de un 65% hasta un 94% del
síntesis de metabolitos secundarios. Danto así un crecimiento del hongo fitopatógeno Taphrina
crecimiento total del control de 8,4cm de deformans, el crecimiento radial del hongo fue
diámetro (Total de la caja Petri), en presencia de reducido tanto por la síntesis de compuestos
los compuestos volátiles de 5,43cm de diámetro volátiles y la antibiosis (metabolitos secundarios
y finalmente en presencia de metabolitos y antibióticos) bioactiva de la bacteria.
secundarios de 1,23cm.
El crecimiento el hongo en presencia de la
metabolitos secundarios (antibiosis) generada por
Pseudomonas protegens fue de 0,34cm/día, a
diferencia del crecimiento del hongo en presencia
de diversos compuestos volátiles fue de
1,38cm/día.

Figura 6. Control de crecimiento mediante
compuestos volátiles liberados por Pseudomonas
protegens al cuarto día.
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Figura 7. Control de crecimiento del hongo
fitopatógeno Taphrina deformans al cuarto día.
acid, mycotoxin produced by Fusarium
spp., negatively affects growth of
Pseudomonas protegensPf-5 by means
of iron sequestration and production of
reactive oxygen species. Argentina:
QuímicaViva.

6
Canchigniam, Hayron; Cruz Rosero, Nicolás;
Barrera, Alexandra; Morante, Jaime;
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ANEXOS.

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