TEOU-MICROFILTRACIÓN

PREPARACIÓN EXPOSICIÓN
Diapositiva 4
Microfiltración
Vamos a hablar de la microfiltración pero no del proceso que usa medios
microporosos (membranas) para separar solidos suspendidos de un
fluido y que es muy importante y crucial en procesos industriales incluido
el area farmaceútica y biotecnológica , pero en los cuales existen un
problema y es la obstrucción de la membrana, lo que limita
fundamentalmente la eficiencia y confiabilidad del proceso de filtración.
No vamos a hablar de esa microfiltración sino la que está relacionada
con la microfluídica.
La microfluídica es el manejo y análisis de fluidos en estructuras de
escala micrométrica. cantidades pequeñas de fluidos, estamos hablando
de volúmenes de 10^-9 a 10^-18 litros que fluyen en canales con
dimensiones entre 10 a 100 micrómetros.
Diapositiva 5

El flujo de fluidos a microescala exhibe fenómenos físicos únicos ya que A

microescala, diferentes fuerzas se vuelven dominantes sobre las
experimentadas en la vida cotidiana. Entonces fenómenos como la tensión
superficial, capilaridad, viscosidad difusión entre otros se vuelven más relevantes y
dominantes en los microfluidos.

Así que en los últimos años la investigación en este tema se centra en

realizar nuevos diseños y fabricación de microdispositivos para
aprovechar las fuerzas que actúan en la microescala.
Diapositiva 6
Existen varios materiales para la fabricación de microdispositivos. Materiales
como vidrio, silicona, policarbonato, polimetilmetacrilato etc. Pero el material más
utilizado en aplicaciones biológicas es el polidimetilsiloxano por que es un
material biocompatible (funciona muy bien con cualquier tipo de células), muy
económico, transparente, con alta permeabilidad al oxigeno y al CO2( importante
porque permite la interacción celular). Y existen varios métodos para la fabricación
de microdispositivos; pero un método que es más rápido, menos costoso y menos
especializado para la fabricación de microdispositivos en aplicaciones biológicas
es la litografía blanda que básicamente consiste en una especie de estampado en
caliente y esto consiste en imprimir un patrón de metal o cuarzo
micromecanizado a una lámina de plástico flexible. El calor y la alta presión
permite que la hoja de plástico se imprima. Y posteriormente se pueden unir estas
láminas de plástico impresas para formar los microcanales.
Diapositiva 7
Artículo seleccionado
Bueno, el artículo seleccionado habla sobre la microfiltración sin membranas
utilizando microfluidos inerciales. Es un artículo de la revista scientific reports y es
un artículo del 2015.
En este artículo lo que se busca es reemplazar las membranas ya que estas tienen
el problema de obstrucción u atascamiento que limita su eficiencia en los
procesos de filtración. Con este soporte se buscó la parametrización de
microfluidos inerciales para alcanzar velocidades de procesamiento de volúmenes
macroscópicos proporcionando así una filtración continua, de bajo costo,
compatible con sinnúmero de aplicaciones con los microfluidos y procesos
industriales.
Diapositiva 8
Estos estudios han proporcionado avances en la química, biología, ingeniería y
medicina.
Uno de sus beneficios es que proporciona una manipulación más precisa que
cualquier otro proceso convencional principalmente en la biología celular.
Inicialmente este es un proceso que se llevó a cabo más que todo en la química
analítica y no en procesos industriales. Pero actualmente los desarrollos y nuevos
diseños de microdispositivos tienen un alto potencial en aplicaciones de procesos
industriales.
Diapositiva 9
Se desarrolló pues un sistema de microfiltración sin membrana mediante la
paralelización de la microfluídica inercial (es decir por fuerzas hidrodinámicas
impulsadas por el flujo bombeado externamente) para lograr el procesamiento de
un volumen macroscópico (aprox 500ml/min).
Estas son dos de las células más usadas en la industria, la CHO (chinese hamster
ovary) Células derivadas del ovario de hámster chino; y la levadura que se usa en
diferentes industrias como la cervecera.
Diapositiva 10 MÉTODOS
Ahora vamos a hablar de los diferentes métodos que se utilizaron en el desarrollo
del artículo. Empezando por el método del diseño y fabricación del dispositivo.
El diseño del dispositivo es un microcanal en espiral de 8 bucles con un radio que
aumenta de 8 a 24 mm y que consta de 1 entrada y dos salidas como se puede
observar en el esquema de la diapositiva.
El Principio de funcionamiento de este dispositivo es el siguiente.
Las partículas (o células) con flotación neutra están suspendidas en un fluido que
fluye a través del microcanal recto y experimentan una fuerza de sustentación
inercial neta que surge del equilibrio entre las fuerzas de sustentación inducidas
por cizallamiento y las inducidas por la pared. Entonces Al agregar curvilinealidad
al diseño del canal, se forman vórtices giratorios en la mitad superior e inferior del
canal que aplican una fuerza de arrastre sobre las partículas. El equilibrio de
fuerzas determina las posiciones de equilibrio de las partículas en los canales
curvilíneos.
Como ambas fuerzas son función del tamaño de partícula, las partículas de
diferentes tamaños ocupan distintas posiciones laterales cerca de la pared del
canal y exhiben diferentes grados de enfoque, lo que permite una separación
basada en el tamaño.
La mayoría de las partículas en suspensión pueden quedar atrapada cerca de la
pared exterior por fuertes vórtices a un cierto caudal, lo que facilita la filtración.
Pero además, al optimizar las dimensiones del canal a la relación de tamaño de
partícula y tasas de flujo, las partículas más pequeñas pueden quedar atrapadas
cerca de la pared exterior mientras que las partículas más grandes se enfocan
cerca de la pared interior, lo que permite fraccionamiento de partículas.
El material de este dispositivo es polidimetilsiloxano.
Para la fabricación se utilizó la técnica de litografía blanda que es una técnica más
rápida, menos costosa y menos especializada para la fabricación de
microdispositivos en aplicaciones biológicas. Y consiste básicamente en imprimir
un patrón de metal o cuarzo micromecanizado a una lámina de plástico flexible. El
calor y la alta presión permite que la hoja de plástico se imprima. Y posteriormente
se pueden unir estas láminas de plástico impresas para formar los microcanales.
Diapositiva 11
ATCC (American Type Culture Collection is a nonprofit organization which collects, stores,
and distributes standard reference microorganisms, cell lines and other materials for research
and development.)

Diapositiva 13
(La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz
láser, empleada en el recuento y clasificación de células según sus características
morfológicas)

Diapositiva 15
Resultado 1: Retención de células sin membrana de biorreactores (células CHO y
de levadura).
1. Retención de células sin membrana de biorreactor.
Este procedimiento es principalmente usado para la síntesis de proteínas
tanto en la industria biotecnológica como en la farmacéutica.
Uno de sus desafíos es la retención de células a gran escala por largo
plazo en un biorreactor. Lo cual se logra dado a la separación continua que
se puede dar con esta plataforma.
Diapositiva 16
Para demostrar la viabilidad del sistema los cultivos se llevaron a cabo
diariamente, donde se llenaba con medios frescos cada matraz junto con células
enriquecidas. En este se tienen en cuenta las densidades celular, viabilidad,
glucosa, anticuerpos, pH,
Las pruebas de microfiltración demuestran que se tiene una eficiencia de
separación del 95% de las células de CHO en función de la concentración, a una
velocidad de flujo de 6 ml / min para un solo dispositivo en espiral.

Diapositiva 17
La eficiencia de separación de las células de CHO en función de la concentración a una
velocidad de flujo de 6 ml / min para un solo dispositivo en espiral.

La productividad celular se evalúa midiendo la actividad de la proteína IgG

secretada utilizando un solo ensayo. En la gráfica de la derecha se puede observar
que hubo un crecimiento constante, esto sugiere que la producción celular se vio
mínimamente afectada por la filtración inercial.
Diapositiva 18
Resultado 2: Filtración de levadura
Para demostrar otra aplicación de nuestro el de filtración de alto rendimiento,se
utilizó levadura. Específicamente Se usó Saccharomyces cerevisiae como modelo de
microorganismo pequeño (~ 3-5μm) para probar las capacidades de clasificación
celular de la microfiltración sin membrana.

Por el pequeño tamaño de la levadura se usa un modelo de un canal trapezoidal

con dimensiones de 30× 70μm para optimizar el aislamiento de las células.
Entonces se empleó un molde que acomodaba ocho espirales pequeñas en una
sola capa como plataforma base para multiplexar nuestro sistema para lograr
mayores rendimientos.
Diapositiva 19
Para hacer la suspensión de levadura, esta se diluyó 0,1 g/l en agua y se usó un
flujo de 2ml/min para una sola espira.
La separación de las células de levadura mostró una eficiencia de separación
superior al 90%. y es importante destacar que, a concentraciones más altas de
suspensión de levadura, el dispositivo demostró un rendimiento razonable con
solo un ciclo de separación. Además, la eficiencia de la separación se puede
mejorar aún más aumentando el número de ciclos de clasificación.
Diapositiva 20
Ahora se evalúa qué tan aplicables es el sistema a fines industriales...Se hizo
comparaciones entre el sistema de filtración sin membrana y dos filtros de
membrana comerciales muy utilizados, Filtros de acetato de celulosa y filtro de
teflón para filtración de levaduras. Como se ve en la gráfica, la filtración por
membrana comienza con una eficiencia alta pero a medida que transcurre el
tiempo esta eficiencia disminuye, principalmente por los efectos antes dichos de
obstrucción de la membrana… mientras que si analizamos lo que pasa en la
filtración sin membrana, se ve que tiene un funcionamiento continuo y a bajo
costo.
(para realizar esta comparación se usó un canal de 180 espirales para un flujo de
320 ml/min)
Diapositiva 21 sincronización celular
La capacidad de aislar eficazmente poblaciones de células altamente
sincronizadas tiene varias utilidades biotecnológicas. Por ejemplo, la
sincronización de células como las de CHO pueden impulsar la producción de
productos ya que las celulas en conjunto trabajan mucho mejor que
individualmente; en grupo aumenta la conversion a productos y mejoran el
rendimiento debido a que se evita la saturación de la celula y estres que altera el
metabolismo de la misma, así, el desarrollo de fármacos contra el cáncer puede
acelerarse con el uso de poblaciones de células sincronizadas

Actualmente existen Métodos para sincronizar poblaciones de células,

como el uso de agentes químicos (por ejemplo, nocodazol) , la inanición
de suero y la inhibición por contacto, estos métodos pueden
comprometer la viabilidad celular, afectar el metabolismo en las
siguientes generaciones de células y se altera las expresiones genicas de las
celuas

Diapositiva 22
Resultado [sincronización celular]
Utilizando un sistema basado en microfluídica, también se demostró la
sincronización celular de cultivos celulares de gran volumen.

las celulas típicamente grandes ≥14μm se aíslan a través de la salida

interna mientras que las celulas más pequeñas, que quedan atrapadas en
los fuertes vórtices cerca de la pared exterior, salen del dispositivo en
espiral a través de la salida exterior.
en el video celulas mas grandes van a la salida interiror [INTERES] celulas mas
pequeñas a la salida exteriror, grandes a la salida interiro por las fuerzas de adhesion con
los microcanales,

Diapositiva 23
las prumera imagen son la sincronizacion celualr con agentes quimicos e inhibicion por
contacto que perjudican la expresion genica de la celular, ademas se ve reflejado en las
graficas de abajo con los picos del contenido de adn

Aprovechando las diferencias de tamaño entre las células en las

diferentes fases de crecimiento ( Fig. 4a, c), un único dispositivo de
microfluidos en espiral es capaz de realizar la sincronización celular con
un rendimiento de 1 a 2 ml / min. (hasta 1 × 106 células / ml), mientras
que el sistema multiplexado que se presenta aquí puede ofrecer un
rendimiento de 150 a 300 ml / min o incluso más.
En las gráficas de abajo se observa una Comparación de la viabilidad
celular por agentes externos y microfluídica. Donde se observa que en los
agentes se comprometio la viabilidad celular.
FUNCIONAMIENTO DE LOS MICROCANALES
Los canales de separación individuales están conectados internamente y
el fluido de muestra biológica ingresa a través de una entrada compartida
y sale a través de dos salidas. Dentro de los microcanales curvilíneos, las
células, sujetas a fuerzas hidrodinámicas, muestran migración
preferencial a cualquier salida. Por lo tanto, la filtración y el
fraccionamiento pueden ocurrir en la misma plataforma, dependiendo de
la magnitud de las fuerzas hidrodinámicas netas. La utilidad de este
sistema se demostró al llevar a cabo la retención de células de
mamíferos a gran escala de biorreactores (es decir, velocidad de flujo de
~ 500 ml / min), separación de células de levadura y sincronización
celular. Como las celdas se separan únicamente debido a fuerzas
hidrodinámicas impulsadas por el flujo impulsado externamente, nuestro
sistema puede funcionar de manera continua, sin la necesidad de
reemplazar el filtro de membrana, que consume la mayor parte del costo
operativo de cualquier sistema de filtración.

Microfiltración sin membrana usando microfluidos

inerciales
Resúmen
La microfiltración es una parte omnipresente y, a menudo, crucial de
muchos procesos industriales, incluida la fabricación biofarmacéutica.
Sin embargo, todos los sistemas de filtración existentes sufren el
problema de la obstrucción de la membrana, lo que limita
fundamentalmente la eficiencia y confiabilidad del proceso de filtración.
En este documento, informamos el desarrollo de un sistema de
microfiltración sin membrana mediante microfluidos inerciales
masivamente paralelizando para lograr una tasa de procesamiento de
volumen macroscópico (~ 500 ml / min). Demostramos los sistemas
diseñados para la filtración de células de CHO (10–20 μm) y levadura (3–
5 μm), que son dos tipos principales de células que se utilizan para
biorreactores a gran escala. Nuestro sistema propuesto puede
reemplazar la membrana de filtración existente y proporcionar una
filtración continua pasiva (sin campos de fuerza externos), eliminando así
la necesidad de reemplazar la membrana. Esta plataforma tiene las
combinaciones deseables de alto rendimiento, bajo costo y escalabilidad,
lo que la hace compatible para una gran variedad de aplicaciones de
microfiltración y propósitos industriales.

La tecnología de microfluidos, introducida hace unas dos décadas, ha

facilitado nuevos avances en química, biología, ingeniería y medicina.
Con las dimensiones del canal que coinciden con los tamaños de celda
típicos, la microfluídica está preparada para contribuir significativamente
a la biología celular, por ejemplo, proporcionando un control y
manipulación más precisos que cualquier técnica convencional. Sin
embargo, la manipulación a microescala significó naturalmente una tasa
de procesamiento de volumen de fluido pequeño, que es aceptable en
química analítica pero no en muchos procesos industriales, donde la
economía de escala es importante. Los desarrollos recientes en
microfluidos inerciales y otros sistemas microfluídicos de alto
rendimiento, por lo tanto, son especialmente interesantes ya que tienen el
potencial de permitir diversas aplicaciones microfluídicas en esos
procesos industriales a gran escala. Para mostrar el potencial de tales
"macrofluídicos", desarrollamos una plataforma de microfiltración sin
membrana para la separación de células de rendimiento ultra alto (hasta
500 ml / min) con un rendimiento extremadamente alto utilizando
microfluidos inerciales. Nuestro sistema es un dispositivo microfluídico
altamente multiplexado que consta de de múltiples capas de
polidimetilsiloxano (PDMS) con microcanales en relieve (es decir, ~ 200
microcanales en espiral individuales) diseñados para una clasificación
continua basada en el tamaño de las células de un gran volumen de
fluido biológico. Los canales de separación individuales están
conectados internamente y el fluido de muestra biológica ingresa a
través de una entrada compartida y sale a través de dos salidas. Dentro
de los microcanales curvilíneos, las células, sujetas a fuerzas
hidrodinámicas, muestran una migración preferencial hacia cualquiera de
las salidas. Por lo tanto, la filtración y el fraccionamiento pueden ocurrir
en la misma plataforma, dependiendo de la magnitud de las fuerzas
hidrodinámicas netas. La utilidad de este sistema se demostró al llevar a
cabo la retención de células de mamíferos a gran escala de biorreactores
(es decir, velocidad de flujo de ~ 500 ml / min), separación de células de
levadura y sincronización celular. Como las celdas se separan
únicamente debido a las fuerzas hidrodinámicas impulsadas por el flujo
impulsado externamente, nuestro sistema puede funcionar de manera
continua, sin la necesidad de reemplazar el filtro de membrana, que
consume la mayor parte del costo operativo de cualquier sistema de
filtración.

MÉTODOS
Diseño y fabricación de dispositivos
El sistema de filtración inercial de alto rendimiento se fabricó en
polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando técnicas de litografía blanda de
microfabricación estándar descritas previamente. El molde maestro con
dimensiones de canal específicas se diseñó utilizando el software
SolidWorks® y luego se fabricó mediante la técnica de micro-fresado
convencional (Whits Technologies, Singapur) en aluminio para la
posterior fundición PDMS. El dispositivo en espiral utilizado en este
estudio para la retención y el fraccionamiento de células de mamíferos
era un microcanal en espiral de 8 bucles con una entrada y dos salidas
con un radio que aumentaba de 8 mm a 24 mm para una migración y
enfoque celular eficiente. Cuatro de estos canales en espiral se
conectaron entre sí de forma sistemática en una capa de PDMS, y el
sistema multiplexado final se creó uniendo varias capas de PDMS
mediante tratamiento con plasma (Harrick Plasma, EE. UU.) Y alineación
manual. Las capas de PDMS se fabricaron colando PDMS desgasificado
(mezclado en una proporción de 10: 1 de base y agente de curado,
Sylgard 184, Dow Corning Inc.) en el molde y posteriormente horneado en
un horno durante 2 horas a 70ºC. Los orificios de acceso fluídico se
perforaron dentro del dispositivo usando Uni-Core ™ Puncher (Sigma-
Aldrich Co. LLC. SG) y el dispositivo final se adhirió irreversiblemente a
una capa gruesa de PDMS simple usando una máquina de plasma de
oxígeno genérico para completar los canales . El dispositivo ensamblado
finalmente se colocó dentro de un horno a 70 ° C durante 2 días para
mejorar aún más la unión. Para un suministro de fluido eficiente, hemos
utilizado la impresión 3D (sistema de estereolitografía SLA, EE. UU.) Para
crear una capa guía con canales fluídicos internos y pines cónicos
precisos, que se pueden insertar en el sistema de filtración y distribuir el
fluido por igual en todos los microcanales. . El ancho y la altura
optimizados para la separación de las células de CHO son de 600 μm y
80 × 130 μm, mientras que para las células de levadura son de 450 μm y
30 × 70 μm.

Cultivo de células:
La línea celular de hibridoma AE-1 se adquirió de la Colección Americana
de Cultivos Tipo (ATCC Cat. No. HB-72). Las células se cultivaron en
Medio de Modificación de Eagle de Dulbecco (DMEM). (Invitrogen, EE.
UU.) Suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Invitrogen, EE.
UU.). Las células del vial congeladas se descongelaron y se colocaron en
un medio precalentado junto con penicilina / estreptomicina al 1%
(Invitrogen, EE.UU). La concentración de células viables se determinó
mediante exclusión con azul de tripán (y yoduro de propidio) y se hicieron
diluciones para sembrar un matraz T75 a una concentración de 1 x 105
células viables / ml. Los cultivos se incubaron a 37 ° C en una atmósfera
humidificada que contenía CO2 al 5% (v / v). Se sembraron células de
matraces de plástico que se empezaron a descongelar (arriba) en
matraces giratorios desechables de 125 y 250 ml a 2 × 105 de medio
Hybridoma-SFM completo precalentado (Gibco®, EE. UU.). Los cultivos
en matraces giratorios se colocaron en una placa de agitación
magnética. ajustado a 100 rpm. Se evaluaron muestras diarias de medios
para determinar la viabilidad celular, el análisis de nutrientes y
metabolitos. También se recogieron muestras de medios de matraces
giratorios para la producción de proteínas (IgG1) que se evaluó siguiendo
el protocolo IgG1 Elisa proporcionado por Abcam (nº de cat. Ab100548).
Las células CHO-K1 adherentes (ATCC Cat. No. CCL-61) y la línea celular
MDA-MB-231 también se cultivaron en DMEM bajo en glucosa
(Invitrogen, EE. UU.) Suplementado con FBS al 10% (Invitrogen, EE. UU.)
Junto con 1 % penicilina / estreptomicina (Invitrogen, EE. UU.). El cultivo
se mantuvo a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía 5% (v /
v) CO2. Las células se subcultivaron cada 4 días con medio reemplazado
cada 48 horas. Las monocapas subconfluentes se disociaron usando
tripsina al 0,01% y solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5,3
mM (Lonza, Suiza). Las concentraciones de glucosa y lactato se
determinaron utilizando kits de ensayo comerciales de Sigma-Aldrich.

Preparación de la muestra.
Para caracterizar el rendimiento de un solo dispositivo en espiral para
construir el sistema multiplexado basado en eso, usamos partículas
fluorescentes de tamaño variable (10 y 15 μm para imitar las células de
mamíferos y 4 μm para imitar las células de levadura) como sustituto
para la optimización del diseño. . Se añadieron microperlas marcadas
con fluorescencia (Microesferas Fluoresbrite®, Polysciences Inc,
Singapur) (fracción de volumen al 0,01%) al tampón de muestra que
consta de 1 × solución salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 2 mM
complementado con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5%
(MiltenyiBiotec, Alemania). Se utilizó BSA para prevenir la adsorción
inespecífica a las paredes de los tubos y microcanales. El dispositivo se
montó (es decir, un dispositivo en espiral simple) en un microscopio de
contraste / epifluorescencia de fase invertida (Olympus IX81, Olympus
Inc., EE. UU.) Equipado con una cámara EMCCD de 12 bits (iXonEM +885,
Andor Technology, EE. UU.). Las muestras se cargaron dentro de una
jeringa y se bombearon a través del microcanal a velocidades de flujo
variables utilizando una bomba de jeringa (Harvard Apparatus PHD 2000,
Harvard Apparatus Inc., EE. UU.). Las imágenes se adquirieron con el
software Metamorph® (Molecular Devices, EE. UU.) Y se analizaron con
el software ImageJ®. Para las pruebas con líneas celulares, se
capturaron videos de alta velocidad en la salida del canal usando el
software Phantom Camera Control (Vision Research Inc., EE. UU.) Y luego
se analizaron usando el software ImageJ®. La Figura S4 presenta
imágenes fluorescentes superpuestas de las microperlas capturadas en
la salida de un microcanal en espiral trapezoidal (130 × 80 μm) a
diferentes velocidades de flujo. Hemos diseñado nuestro sistema de
manera que a velocidades de flujo bajas (~ 1,5–2 ml / min); las partículas
pequeñas en el rango de 10–14 μm se enfocan cerca de la pared exterior,
mientras que las partículas más grandes (> 14 μm) se enfocan cerca de
la pared interior, lo que facilita el fraccionamiento. En el procesamiento
de muestras con velocidades de flujo altas (~ 6 ml / min), todas las
partículas dentro del microcanal pueden enfocarse cerca de la pared
exterior, lo que permite la filtración.

Experimentos de retención y fraccionamiento celular:

Para los experimentos de clasificación, las células cultivadas en
matraces giratorios (línea celular de hibridoma AE-1) se filtraron
diariamente utilizando nuestro sistema de filtración inercial multiplexado
(es decir, normalmente usamos una versión pequeña de nuestro sistema
que consta de 12-20 espirales que trabajan a una velocidad de flujo de
60-100 ml / min) dentro de un ambiente esterilizado mientras se
agregaba medio fresco a cada matraz junto con células enriquecidas
durante cada experimento. Las pruebas de microfiltración se realizaron
utilizando una bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer, EE. UU.) Con
tubos de silicona y una cuidadosa esterilización antes y después de cada
experimento. La relación de flujo (relación de salida de las dos salidas)
de nuestro sistema de filtración se estableció en alrededor del 50%. Para
las células adherentes, las monocapas subconfluentes se disociaron con
tripsina al 0,01% y EDTA 5,3 mM y se resuspendieron en el medio
precalentado adecuado para los experimentos de separación. En las
pruebas de fraccionamiento con células CHO, las células asincrónicas se
diluyeron a 1 x 10 ^ 6 células por ml en tampón que contenía 1x solución
salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 2 mM suplementado con BSA
al 1% (Miltenyi Biotec, Alemania) para evitar la aglomeración y adsorción
a las paredes del microcanal. Aunque se sabe que la levadura rehidratada
no se parece perfectamente a las células frescas cultivadas, hemos
utilizado levadura deshidratada en nuestras pruebas por simplicidad.
Esta elección también está alineada con la preferencia industrial por las
levaduras secas sobre las levaduras cultivadas en la actualidad. La
levadura rehidratada también mostró un tamaño promedio de 3-5 μm que
es similar al tamaño de la levadura cultivada. Las suspensiones de
levadura se obtuvieron a partir de una cepa seca de Saccharomyces
cerevisiae (Sigma-Aldrich, EE. UU.) Rehidratada en agua a 35 ° C durante
10 min con agitación. Después de la rehidratación, la suspensión de
levadura se centrifugó durante 15 min a 2000 g usando una centrífuga y
se lavó dos veces con agua destilada para eliminar los restos celulares y
los componentes solubles. Luego, el sedimento concentrado se
resuspendió en el tampón de funcionamiento (explicado anteriormente) y
se procesó usando el sistema en espiral como microfiltros bien
comerciales. Los experimentos de microfiltración utilizando membranas
comerciales se realizaron en modo de flujo cruzado utilizando un módulo
interno hecho de PMMA (metacrilato de polimetilo) mediante técnica de
corte por láser y unión térmica. El área efectiva de la membrana y la
altura del canal de flujo transversal fueron 6.25 × 10 ^ −4m2 y 0.0015m,
respectivamente (Fig. S5).

Análisis de citometría de flujo:

Para detener las células por inhibición por contacto, las células CHO se
cultivaron en el Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) (Sigma-Aldrich,
EE.UU.) durante 96 h hasta una confluencia del 95%. Para la detención de
M por Nocodazol, las células CHO se cultivaron en RPMI con FBS al 10%
con 0,2 g / ml de Nocodazol durante 18 h. Se obtuvieron imágenes de
todas las células sin fijación. Se realizó un análisis de citometría de flujo
en las muestras clasificadas para analizar el contenido de ADN celular a
través de Hoechst. Las poblaciones de células sincronizadas clasificadas
se enjuagaron en 1x PBS y se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% (p
/ v) durante 15 min a 4ºC. A continuación, las células se centrifugaron a
600 g durante 5 min y se incubaron durante 30 min en la solución de
tinción que contenía 1x PBS, citrato de sodio 3,8 mM (Sigma Aldrich, EE.
UU.), RNasa 10 μg / ml (i-DNA Biotechnology, Singapur) y Hoechst
(NucBlue® LiveReadyProbes ® Reactivo, Invitrogen, EE. UU.). Luego, las
células teñidas se probaron para determinar la eficiencia de
sincronización mediante la realización de citometría de flujo (citómetro
de flujo BDTM LSR II, BD Biosciences, EE. UU.), Y los datos controlados se
analizaron mediante el software FlowJo (FlowJo Ltd, Reino Unido).

Análisis de expresión genética:

Para los estudios de expresión génica, las células CHO se sedimentaron y
se resuspendieron a una concentración de 1 x 10 ^ 6 células / ml en
medio fresco y PBS antes de procesarlas usando un sistema de filtración
inercial. Como control positivo, una fracción de células se trató con
cicloheximida (Sigma-Aldrich) 15μg / mL a 37 ° C dentro de la
incubadora. Después del procesamiento a través de un microcanal en
espiral, el ARN se extrajo inmediatamente usando el RNeasy Mini Kit
(Qiagen) y se transcribió a ADNc usando el SuperScript III First-Strand
Synthesis Kit (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los cebadores de PCR, así como las sondas TaqMan para la
identificación del gen C-FOS (# Hs00170630_m1) se adquirieron de
LifeTech. El gen de mantenimiento GAPDH se utilizó para la
normalización de la expresión génica. La mezcla maestra de PCR
contenía 1x mezcla de cebador / sonda, 1x mezcla maestra universal y
500 ng de reacción de ADNc en un volumen total de 25 μl. La
amplificación por PCR se realizó utilizando el sistema de PCR Bio-Rad a
50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos a 95 ° C
durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Todos los experimentos se
realizaron por triplicado para la determinación por RT-PCR de la
expresión génica.

Discusión:
El rendimiento relativamente bajo de los sistemas de microfluidos
convencionales ha sido el principal impedimento para la adopción
industrial de la tecnología a pesar de las muchas ventajas únicas de los
microfluidos. En este trabajo, mostramos que esta limitación se puede
eliminar claramente, mediante la demostración de una plataforma
microfluídica altamente multiplexada capaz de procesar volúmenes de
muestra a escala macroscópica. La eficiencia de separación del sistema
de microfiltración inercial permanece por encima del 90% para varias
líneas celulares a diferentes concentraciones durante 10 días de
procesamiento. La viabilidad de todas las líneas celulares no se vio
afectada notablemente por los esfuerzos cortantes aplicados atribuidos
al corto tiempo de residencia de las células dentro del sistema de
filtración inercial. Tanto las células de hibridoma clasificadas
posteriormente como las no procesadas proliferaron a una velocidad
similar sin una disminución significativa en su título de producción. Estos
hallazgos apoyan que la clasificación inercial de alto rendimiento no
perturba la homeostasis celular en las vías mediadas por estrés,
probablemente porque la aceleración de las células en este sistema es
modesta (~ unos pocos cientos de g), en comparación con las técnicas
de centrifugación. Dada la flexibilidad y relativa facilidad de
implementación de los microfluidos inerciales para la clasificación
pasiva, creemos que este método de retención celular puede adoptarse
fácilmente en biorreactores de perfusión de escritorio para la fabricación
continua de anticuerpos monoclonales. La demostración de la filtración
continua sin membrana para las células de levadura es especialmente
significativa, ya que la microfiltración se vuelve cada vez más desafiante
a medida que el tamaño de las partículas / células disminuye por debajo
de los 10 μm. Anteriormente, se había demostrado experimentalmente un
enfoque inercial de partículas tan pequeñas como 0,78 μm y esta idea
puede extenderse a partículas a nanoescala reduciendo las dimensiones
de los canales (nanofluídicos). Por lo tanto, la microfiltración continua sin
membrana que utiliza microfluidos inerciales tiene el potencial de
interrumpir la tecnología actual de microfiltración basada en membranas,
que se usa ampliamente no solo en la industria biomédica / farmacéutica
sino también en campos como la desalinización y purificación de agua,
procesamiento de alimentos, minería. y muchos otros procesos de
separación industrial que se basan en la filtración por membrana.