EVALUACIÓN DE LA REGENERACIÓN NEURAL EN RATAS CON LESIÓN

CRÓNICA DE LA MÉDULA ESPINAL: UTILIZACIÓN DE UNA ESTRATEGIA

DE COMBINACIÓN PARA MEJORAR EL EFECTO REGENERADOR DE LA
INMUNIZACIÓN CON PÉPTIDOS NEURALES MODIFICADOS.

Nombre del participante: Diego Incontri Abraham

I. RESUMEN

La regeneración del Sistema Nervioso Central es considerada extremadamente difícil una vez que la lesión
ocurre, particularmente, la Lesión de la Médula Espinal (LME) es un evento devastador debido a que los
pacientes presentan un deterioro permanente de la función motora y sensorial [74]. La LME desencadena una
serie de trastornos anatómicos y fisiológicos con graves secuelas sobre la función neural [4]. En los estadios
crónicos de la enfermedad, procesos de necrosis, apoptosis, desmielinización y de formación de cicatriz glial
generan alteraciones en la organización de fibras nerviosas [19, 39, 72, 73]. Actualmente, la literatura identifica
6 objetivos terapéuticos para LME: precursores neurales derivados de células madre, estimulación eléctrica
medular, inflamación, estrés oxidativo, barrera hematomedular y la cicatriz glial inhibitoria [70, 71, 74]. Debido
a la compleja conexión entre estos eventos, las estrategias que combinan múltiples terapias sugieren un mejor
pronóstico. En el presente proyecto, se pretende utilizar la estrategia de modulación de la respuesta autorreactiva
mediante el uso de péptidos neurales modificados (A91), en combinación con la remoción de la cicatriz glial.
A91 es un péptido derivado de 87-99 aminoácidos de la secuencia inmunogénica que da estructura a la protéina
básica de la mielina. La activación de Linfocitos T inducida por A91 promueve una respuesta antiinflamatoia
que permite a la microglia diferenciarse hacia un fenotipo M2, generando un microambiente de baja producción
de radicales libres y con mecanismos neuroprotectores [75, 76]. Además, la remoción de la cicatriz glial
permitirá reducir el microambiente que se presenta en la fase crónica de LME, ya que esta es un obstáculo que
impide la regeneración axonal y la intervención terapéutica con el uso del péptido neural modificado A91 [77,
78]. Posteriormente, y mediante inmunohistoquímica, se analizará la proliferación celular y la aparición de
neuronas de temprana formación en el sitio de lesión medular con el uso de Bromodesoxiuridina (BrdU) y de
la Proteína de Migración Neuronal Doblecortina (DCX), respectivamente. Se compararán los resultados
obtenidos entre los diferentes grupos de neuronas mediante un Análisis Estadístico con ANOVA de una vía o
mediante la Prueba de Kruskal-Wallis.

II. MARCO TEÓRICO

Entre los diversos tipos de daño en el sistema nervioso central, la Lesión de la Médula Espinal (LME) es
considerada un problema importante de salud pública por sus repercusiones económicas y emocionales.
Además, posee una alta morbilidad a nivel mundial, se calcula que en el 2007 el número de personas que
sufrieron de alguna lesión medular fue de 28 a 55 millones [28,48]. Tan solo en México, se ha estimado una
incidencia de 18.1 pacientes por cada 1,000,000 de habitantes [50]. Según el Centro de Estadísticas Nacionales
de Lesiones de Médula Espinal (NSCISC por sus siglas en inglés), se calcula una incidencia de
aproximadamente 17,500 casos nuevos cada año en la población de Estados Unidos. Y se estima que la cantidad
de personas vivas con LME en Estados Unidos en 2017 se encuentra en un rango de 245,000 a 353,000 personas.
Cabe mencionar que este padecimeinto se encuentra con mayor frecuencia en la población masculina (81% de
los casos nuevos en Estados Unidos).
 La LME ocasiona una serie de trastornos anatómicos y fisiológicos con graves secuelas sobre la
función neural [4]. Debido a que, el origen de los eventos degenerativos es distinto, para su estudio la LME se
ha dividido en tres fases: la primera fase incluye el daño neuronal inmediato debido al impacto y la necrosis
isquémica, ésta última producto de la hemorragia y disminución del flujo sanguíneo [16,41]. Durante esta
primera fase también se genera edema, que con la acumulación de calcio intracelular y de potasio extracelular
[16,55,56] y con el incremento en las concentraciones de glucosa y la disminución en la síntesis de ATP,
generan una interrupción en el flujo eléctrico causando choque medular [16,47]. La segunda fase es
caracterizada por la aparición de alteraciones bioquímicas como la lipoperoxidación y la acumulación de
aminoácidos excitatorios en la zona de lesión y sus alrededores, provocando una sobreexcitación de las neuronas
hasta que éstas se colapsan [55,64]. Finalmente, durante la tercera fase o fase crónica se observan disturbios en
la organización de las fibras como son la desmielinización, degeneración Walleriana, apoptosis de
oligodendrocitos y la formación de una cicatriz de fibras de colágeno [19,39].

La LME también provoca desde las etapas tempranas y hasta los estadios crónicos [8] la activación del
sistema inmune, por lo que durante las primeras horas o días después de la lesión medular se genera una reacción
celular mediada por macrófagos, neutrófilos, linfocitos T y astroglia reactiva, generando de esta manera un
proceso inflamatorio y autorreactivo exacerbado que provoca un daño importante al tejido neural [9,52]. A
pesar de lo antes mencionado, recientemente nuestro grupo y otros en el mundo han demostrado que el sistema
inmune puede jugar un papel muy importante en los procesos de protección, cicatrización, producción de tejido
conectivo, angiogénesis y regeneración de tejidos vulnerables [26,33,34,46,65]. Estudios previos sugieren que
después de una LME se desencadena una respuesta inflamatoria no modulada y muy intensa que contribuye
particularmente a la degeneración del tejido neural [12,15], sin embargo, también se ha reportado que de ser
modulada, esta respuesta es capaz de proteger e incluso iniciar la restauración del tejido neuronal dañado
[46,57,66,67]. En estudios realizados por nosotros y otros grupos de investigación, se ha demostrado la
existencia de una respuesta inmune autorreactiva dirigida contra constituyentes del sistema nervioso central
[27,32,37,51], misma que es capaz de modular la respuesta inflamatoria y proteger así el tejido neural [25,46].
La modulación de esta respuesta autorreactiva se ha realizado mediante la inmunización con constituyentes del
sistema nervioso central (SNC) o con péptidos neurales modificados como el Cop-1 o el A91. Nuestro grupo
de investigación ha demostrado que esta estrategia activa a linfocitos T que promueven protección del tejido al
inhibir la expresión de la sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS), disminuyendo así la producción de óxido
nítrico [22] y la lipoperoxidación después de una LME [33]. Además, también se ha demostrado que estos
linfocitos son capaces de liberar factores neurotróficos, creando así un ambiente propicio para la regeneración
neural [5,49]. Nuestro grupo recientemente demostró la presencia y el efecto benéfico de estos factores después
de una lesión al SNC. Por otra parte, también hemos demostrado que todos estos efectos benéficos contribuyen
a la preservación del tejido neural, la sobrevida de neuronas y a una mejor recuperación neurológica en modelos
de LME y de isquemia cerebral focal [31,46]. Así mismo, reportamos que el efecto neuroprotector de esta
terapia se puede potenciar al combinarla con otros fármacos neuroprotectores [34,46]. Finalmente, en un estudio
muy reciente demostramos que la estimulación de la respuesta autorreactiva es capaz de promover regeneración
axonal, sin embargo, los axones regenerados no logran atravesar la cicatriz fibroglial y, por lo tanto, no
establecen conexiones funcionales. Lo anterior puede deberse a la presencia de la cicatriz fibroglial misma que
se conforma por células astrocíticas y colágeno y representa una barrera física y química que impide el
desarrollo de nuevas conexiones neuronales. Las células gliales que forman parte de la cicatriz liberan
proteoglicanos y otras moléculas inhibitorias del crecimiento neural [13,39].

La participación de la respuesta autorreactiva en procesos de restauración neural se ha documentado

ya por varios autores. En un trabajo realizado por Aharoni y colaboradores, se demostró que la administración
del péptido neural modificado “acetato de glatiramer” induce un incremento significativo en la neurogénesis de
animales con encefalomielitis autorreactiva experimental (EAE) [2]. En isquemia cerebral focal también se
reportó un incremento significativo de la neurogénesis después de inmunizar a los animales con el péptido
neural modificado Poly-YE [65]. La inmunización con un péptido neural contribuyó también a restablecer e
incrementar la neurogénesis en animales adultos inmunocomprometidos [67] y en animales envejecidos [54].
Finalmente, en LME también se ha reportado que la inmunización con péptidos neurales promueve en forma
significativa la migración de células madre al sitio de lesión y su diferenciación hacia neuronas nuevas [66].
Un estudio reciente demostró que la remoción de la cicatriz glial junto con la inmunización de péptidos neurales,
modifican el microambiente que prevalece en LME Crónica [69].

Con todo lo anterior, podemos concebir que la estimulación de la autorreactividad protectora como
terapia restauradora del tejido neural ofrece grandes expectativas a futuro, sin embargo, de acuerdo a nuestras
últimas observaciones, se requiere potenciar el efecto regenerador con otras terapias que han demostrado
promover regeneración neural. La reconexión funcional y altamente eficiente de los axones regenerados puede
estar inhibida por la cicatriz fibroglial, misma que se tiene que remover mediante procedimientos mecánicos o
químicos para permitir el crecimiento axonal. Algunos estudios han demostrado que la pura remoción de dicha
cicatriz promueve el desarrollo de axones en la porción de la médula espinal lesionada, sugiriendo que es
factible la reconexión axonal [44].

La literatura actual identifica 6 objetivos terapéuticos para LME: precursores neurales derivados de
células madre, estimulación eléctrica medular, inflamación, estrés oxidativo, barrera hematomedular y la
cicatriz glial inhibitoria [70, 71, 74]. Debido a la compleja conexión entre estos eventos, las estrategias que
combinan múltiples terapias sugieren un mejor pronóstico. El presente proyecto intenta emplear como estrategia
base la estimulación de la autorrecatividad protectora, mediante la administración del péptido neural modificado
A91, para promover la regeneración neural; además pretendemos combinar esta estrategia con otra que
favorezca o potencialice su efecto regenerador. Se adicionará la eliminación de la cicatriz fibroglial para
promover el paso de los axones regenerados. En este proyecto se analizará, mediante inmunohistoquímica, la
proliferación celular con el uso de Bromodesoxiuridina (BrdU); y la presencia de neuronas de temprana
formación con el uso de la Proteína de Migración Neuronal Doblecortina (DCX). Cabe mencionar que varios
artículos utilizan el BrdU para evaluar la expresión y proliferación de células progenitoras y de células madre
neurales, al igual que de neuronas, astrocitos y microglia, en la médula espinal lesionada [79, 80, 81, 82]. Por
otro lado, el uso de DCX se ha utilizado para evaluar y confirmar la presencia de células migratorias como
neuroblastos y células madre, en el sitio de lesión medular [83, 84].

La fase crónica de la lesión medular se caracteriza por un periodo de supuesta estabilidad generalizada
en la que están ausentes muchos de los elementos que se activaron como medios protectores o promotores de
restauración durante la fase aguda de la lesión. En esta etapa, más que una recuperación, se ha observado un
periodo de estabilidad hacia los 3 meses [8] y posteriormente un declive progresivo de la función neurológica
en roedores sometidos a una lesión en la médula espinal [10]. A nivel clínico, este fenómeno también ha sido
percibido [14]. Lo anterior nos obliga a buscar estrategias terapéuticas que logren evitar este deterioro y que
contribuyan a una mejor calidad de vida del paciente lesionado medular. Una forma de lograr establecer las
condiciones que se dan en una lesión aguda y tener con ello la presencia nuevamente de factores que contribuyan
a la restauración del tejido (factores neurotróficos, respuesta inmune modulada, etc.) es mediante la eliminación
quirúrgica de la cicatriz fibroglial. En cuanto a este tema, nuestro grupo ha desarrollado un procedimiento
quirúrgico que permite eliminar la cicatriz sin incrementar el deterioro neurológico. En un estudio piloto,
aplicamos la estrategia de combinación de terapias (incluyendo la remoción quirúrgica de la cicatriz fibroglial)
para potenciar el efecto regenerador de la autorreactividad protectora en animales con lesión crónica (3 meses
de evolución), donde logramos observar que, de un total de 7 animales, 5 de ellos incrementaron en forma
significativa su capacidad motora y solo 2 de ellos no presentaron cambio alguno. En el caso de los animales
que presentaron el incremento, todos pasaron de movimientos ligeros de las extremidades inferiores a elevación
incluso del tren posterior. Vale la pena mencionar que en el grupo de animales utilizados como testigos no se
observó ninguna mejoría similar (ver figura 1). En este estudio piloto se documentó solamente la recuperación
neurológica de los animales con una sola prueba clínica.
 Figura 1

15

Locomocion en campo
p< 0.05

*
10

abierto
5

al

al
o

ig
t
ig

t
en

en
st
st

Te
rim
Te

rim
pe

pe
Ex

Ex
Pre-Tx Pos -Tx

Como consecuencia de los resultados anteriores, queremos realizar el presente proyecto para
documentar en forma exacta el importante hallazgo antes mencionado.

Al momento se han diseñado diferentes estudios con la finalidad de promover restauración del tejido
neural. Sin embargo, la gran mayoría de ellos se desarrollan principalmente en animales con lesión aguda (horas
o días después de la lesión) y en menor proporción se han desarrollado en animales con lesión crónica (meses
o años después de la lesión). Actualmente existe una gran cantidad de pacientes con lesión crónica que esperan
la llegada de un tratamiento que les ayude a mejorar su calidad de vida. La aplicación de la presente estrategia
es muy factible a nivel clínico. El diseño se ha estructurado de tal forma que cada uno de los elementos
terapéuticos utilizados sean extrapolables inmediatamente al humano. Finalmente, a la fecha no se ha
documentado el efecto de la autorreactividad protectora combinada con otras terapias que pudieran potenciar
su efecto. El presente proyecto explorará el efecto de la terapia de combinación en la fase crónica de la lesión
medular.

III. OBJETIVOS

• Objetivo general

Determinar el efecto de la estrategia de combinación sobre la restauración neural y la recuperación neurológica

en ratas con lesión crónica de la médula espinal y compararlo con los inducidos por los tratamientos por
separado y en los animales no tratados.

• Objetivos específicos

Determinar el número de neuronas de nueva formación en el sitio de lesión en los grupos estudiados.

IV. HIPÓTESIS

La estrategia de combinación provocará una regeneración funcional del tejido neural y recuperación
neurológica en animales con lesión crónica de la médula espinal que será significativamente mayor a la
presentada por aquellos tratados con los procedimientos por separado o aquellos no tratados.
 V. JUSTIFICACIÓN

Al momento no existe un tratamiento efectivo para los pacientes con LME crónica. Es importante entonces,
realizar estudios que busquen desarrollar estrategias que brinden alguna esperanza. La modulación de la
autorreactividad contra constituyentes neurales y la remoción de la cicatriz fibroglial ha demostrado por
separado promover un efecto significativo sobre la regeneración del tejido medular en fases agudas de la lesión,
sin embargo, a la fecha no existen estudios que hayan evaluado el efecto que pueden tener estas estrategias
combinadas en la fase crónica. Por las condiciones que cada una origina y la sinergia que se podría generar al
ser administradas en conjunto, pensamos que se mejorarán las condiciones de restauración y esto provocará una
mejor regeneración funcional, misma que producirá una mejor recuperación neurológica en los individuos
tratados. Los resultados de este proyecto serán de gran relevancia para el diseño de estudios clínicos donde se
aplique este mismo tratamiento en pacientes con lesión crónica de la médula espinal. Esto último influirá de
manera importante en la calidad de vida de estos pacientes y de aquellos con otro tipo de enfermedad
neurodegenerativa crónica. La aplicación a nivel clínico de los procedimientos que forman parte de esta
estrategia de combinación es muy factible ya que, en manos de un buen especialista, incluso la remoción de la
cicatriz fibroglial no debe dejar más secuelas de las que ya experimenta el paciente. En nuestro laboratorio,
hemos perfeccionado un método quirúrgico que garantiza en roedores, la eliminación de la cicatriz sin
incrementar el déficit neurológico. El diseño se ha estructurado de tal forma que puede ser extrapolable en
forma inmediata al humano.

VI. MÉTODO EXPERIMENTAL

Se utilizaron 3 ratas por cada grupo (9 en total):

- Grupo 1: Ratas con LME crónica sin ningún tratamiento.

- Grupo 2: Ratas con LME crónica + remoción de la cicatriz.
- Grupo 3: Ratas con LME crónica + remoción de la cicatriz + modulación de la respuesta autorreactiva
contra constituyentes neurales (MRACN).

A través de un doble marcaje mediante inmunohistoquímica (DCX y BrdU), se cuantificará el número de

neuronas de temprana formación en el epicentro y sitios adyacentes al epicentro de la lesión medular a los 60
días después de la administración del tratamiento. Posteriormente, se compararán los resultados obtenidos entre
los diferentes grupos de neuronas mediante un Análisis Estadístico con ANOVA de una vía o mediante la
Prueba de Kruskal-Wallis.
 9 ratas Sprague Dawley
Unidad Experimental
divididas en 3 grupos

Grupo 1: Ratas con LME Grupo 2: Ratas con Grupo 3: Ratas con LME crónica
crónica sin ningún LME crónica + + remoción de la cicatriz +
tratamiento. remoción de la cicatriz. modulación de la respuesta
autorreactiva contra
constituyentes neurales

Aplicación del tratamiento al día 60

Lesión al día 0 (2 meses depués de la lesión)

Evaluación de la aparición de neuronas Inmunohistoquímica al Evaluación de la presencia de

de temprana formación en el sitio de día 60 despúes de proliferación celular en el sitio de
lesión medular mediante el uso de DCX. aplicar el tratamiento lesión medular mediante el uso de
BrdU.

Observación de
muestras en el
microscopio
confocal

ANOVA de una vía o

Analisis
Prueba de Kruskal-
estadístico
Wallis
 VII. CRONOGRAMA

1. Actividad 1: Tropicalización de técnicas de Inmunofluorescencia.

2. Actividad 2: Escritura de Artículo de Revisión.
3. Actividad 3: Observación de muestras en el microscopio confocal.
4. Actividad 4: Análisis de resultados.
5. Actividad 5: Escritura de informe COMECYT.

Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre

Actividades** Semana Semana Semana Semana Semana Semana Semana Semana
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Actividad 1 x x x
Actividad 2 x x x x x x x x
Actividad 3 x x x
Actividad 4 x x
Actividad 5 x x x

VIII. REFERENCIAS

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