INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

MORELIA DEPARTAMENTO DE
INGENIERÍA Y BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA
PRACTICA NO. 8

DILUCIONES SERIALES

ALUMNOS:
ANDREA MARGARITA NAVA GARIBAY
JESUS FERNANDO RUIZ RAMÍREZ
JORGE LUIS CAÑDERÓN GARCÍA

DOCENTE:
JOSÉ MARCO VINICIO MARES

SEXTO SEMESTRE "A"

EQUIPO 2

19/11/21
 INTRODUCCION
Hay muchas situaciones en que las cantidades de sustancia necesarias
para ver un efecto son extremadamente pequeñas (por ejemplo un
fármaco para tratar una enfermedad, una hormona para estudiar su
efecto en un animal de experimentación, etc) y difícilmente se pueden
pesar o medir en esas proporciones tan pequeñas. En esas situaciones es
necesario recurrir a la preparación de una solución de alta concentración
(o solución de stock o solución madre) y hacer diluciones seriadas a partir
de ésta, que no son más que un tipo de diluciones sucesivas manteniendo
constante el factor de dilución en cada paso.

La base de cálculo de la concentración de una disolución determina el

modo en que se trabajará con ella. Así pues, para preparar diluciones en
volumen será necesario partir de una disolución concentrada cuya
composición en volumen sea conocida.

El banco de diluciones seriadas tiene muchas ventajas prácticas, desde los

cálculos previos, pasando por la manipulación de volúmenes y hasta en la
representación gráfica de resultados.

En biología y medicina, además de los usos más convencionales, la

dilución seriada también se puede utilizar para reducir la concentración
de microorganismos o células de una muestra. Como, por ejemplo, el
número de colonias de bacterias que crecen en una placa de Petri en un
momento dado depende de la concentración, y dado que muchas otras
técnicas de diagnóstico implican contar físicamente el número de
microorganismos o células en ciertas áreas impresas dentro de una rejilla
(comparando las concentraciones de dos tipos de células o
microorganismos en la muestra) o en cavidades de un volumen
determinado (para concentraciones absolutas), la dilución puede ser útil
para obtener resultados más manejables o para tener un número definido
de colonias de cultivo en cada placa. La dilución en serie es también un
método más barato y más sencillo para preparar los cultivos de una sola
célula que el empleo de pinzas ópticas y micromanipuladores.
 OBJETIVOS

Identificar de manera correcta los cálculos

para las diluciones seriada
Identificar y analizar para que se utilizan las
diluciones seriadas
Identificar el método de las diluciones
seriadas
 MATERIALES Y
REACTIVOS
Cajas de petri
Tubos de ensaye
1 matraz Erlen Meyer
1 pipeta
tubos eppendorf
bacterias de los brotes de alfalfa
Agar de soja
Medio de cultivo liquido
El Caldo de Lisogenia (caldo Luria)
1 vortex
Puntas para pipeta
Turbidimetro
easySpiral
METODO
Diluciones seriales y
técnica de vaciado en
placa

Pesar brotes de alfalfa y agregar

1 g en un tubo con 9 mL de agua
estéril en condiciones estériles.

Agitar el contenido del tubo utilizando

un vortex o agitando vigorosamente
con la mano.

Del tubo original extraer 1 mL con

una pipeta y añadirlo a un tubo de
ensayo no. 2 con 9 mL de agua
estéril.

Agitar el tubo no. 2 y repetir el

mismo procedimiento 4 veces
haciendo uso del tubo anterior

En caso de usar botella de 99

mL, agitar 20 veces en un arco
de 35 cm.

Transferir las diluciones en

cuatro cajas de Petri y
adicionarles agar.

Incubar las cajas de Petri y

seleccionar aquellas que
tengan entre 30-300 colonias
para su conteo.

Fin de la
sesión.
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-- □
1 ,..1
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-- - - ---
-
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Diluciones seriales y técnica
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de vaciado en placa

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-- Rotular 7 tubos de ensayo con sus --
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factores de dilución
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correspondientes.

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Rotular 7 placas de Petri con agar

--
etiquetándolos con sus factores de
dilución.

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-- -
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-- Utilizar una micropipeta y verter 900
-
microlitros del LB al tubo de ensayo. Luego
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100 microlitros de la muestra.

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--
Homogenizar la muestra y realizar la dilución
serial repitiendo el mismo procedimiento para los

-- demás tubos.

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-- --
-- Colocar 100 microlitros de cada
--
--
tubo a diferentes cajas de Petri.

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--
Por método de dispersión, distribuir

--
uniformemente el inóculo por toda

-- la placa.

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-- -
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--
Incubar las cajas de Petri y
--
--
seleccionar aquellas que tengan
entre 30-300 colonias para su
--
--
conteo.

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-- Fin de la sesión.
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--
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-- □
1 ,..1
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-- - - ---
-
--
Métodos manuales y

--
--
microorganismos
cuantificados

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Crecer el microorganismo en caja

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de Petri con agar

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Calibrar el turbidímetro para inocular el

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tampón de fosfato con los microorganismos

-
para obtener 0.5 McFarland

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Hacer diluciones seriales usando tubos
-- -
con 9 mL de tampón de fosfato.
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Agitar con vortex y repetir la dilución
en otros 5 tubos de ensayo.
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-- Inocular 1 mL de la disolución en
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cajas de Petri.

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-- Incubar las cajas de Petri y
--
--
seleccionar aquellas que tengan

--
entre 10-100 colonias para su
conteo.

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-- -
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Utilizar kit de fluido hidratable y
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agregar un pellet a la dilución.
Agitar e inocular 0.1 mL de la
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suspensión.

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-- Fin de la sesión.
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 DISCUSIÓN Y
RESULTADOS
Las diluciones en serie son ampliamente utilizadas en las ciencias
experimentales, incluyendo bioquímica, química, farmacología y
microbiología.

En el primer video nos habla de que tan importante es la dilución seriada

de una muestra, esta se puede realizar con diluciones salinas al 0.85,
medio de cultivo o agua (en este ultimo duran muy poco viables).

Mostrando que las diluciones seriadas tienen muchas ventajas prácticas,

desde los cálculos previos, pasando por la manipulación de volúmenes y
hasta en la representación gráfica de resultados.

La primera ventaja de las diluciones seriadas es que todo el cálculo es

muy sencillo. Sólo hay que tener en cuenta la concentración inicial, el
volumen que se quiere conseguir de cada concentración y el factor de
dilución.

El volumen necesario se asume que es el mismo para todas las

concentraciones y depende de cada experimento. Es fácil ver que el
volumen final que se consigue de cada concentración es exactamente
igual al volumen fijo de solvente con que se cargan todos los tubos del
banco.

El factor de dilución se calcula o aproxima sabiendo las concentraciones

máxima y mínima que se quieren estudiar y el número de
concentraciones distintas que se quieren hacer.

Se uso la técnica de vaciado en placa, la cual consiste en contar las

colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto
tiempo y temperatura de incubación.
 CUESTIONARIO
1.- ¿Qué propósito se tiene al realizar diluciones seriales?

Las diluciones en serie se utilizan para crear disoluciones muy diluidas

con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se
pretenda estudiar curvas de concentración con una escala logarítmica.

2.- El factor de dilución en una dilución serial, puede ser calculado

para cada tubo o como un factor de dilución para toda la serie de
tubos, ejemplifique lo anterior.

Las diluciones se pude realizar como nosotros queramos, como por

ejemplo diluciones a la mitad, 2 en 8 o 3 en 7, siempre y cuando se
mantenga el factor de dilución

3.- Para el proceso de dilución y cultivo que se muestra en la figura,

determine las UFC/ml, considerando lo que se sugiere para elegir las
placas más adecuadas.
4.- Las diluciones seriales son muy utilizadas en bioquímica,
farmacología y homeopatía, describa un ejemplo de cada uno.

Bioquímica: Para contar las unidades de colonia de una muestra, de la

cual se desconoce el numero bacterias
Farmacología: Un fármaco para tratar una enfermedad.
Homeopatía: La preparación de medicamentos homeopáticos se lleva
a cabo en laboratorios farmacéuticos usando materias primas de
origen vegetal, animal, mineral o productos químicos, mediante
diluciones seriadas hasta obtener un producto final con cantidades
centesimales de dicha materia inicial.

5.- Se pueden cometer varios errores al realizar las diluciones

seriales, indique al menos 5

No hacer las diluciones con cuidado, esto puede causar que se

contamine
Que no se homogenice de la forma correcta
Cuando se hace el vaciado de agar, no tener la temperatura bastante
alta, esto puede causar que mate a las baterías
Que se solidifique el agar antes de verterlo
Que se llenen de vapor las placas por taparlas, después de verter el
agar
6.- Fundamente ¿Por qué se sugiere contar las UFC en placas que
contengan entre 30 y 300?

Contar las colonias de las placas que presentan un número entre 30 y 300,
un número menor de 30 colonias por placa puede suponer la presencia de
errores debido a fluctuaciones estadísticas. Por otro lado, un número
mayor de 300 colonias puede ser excesivo para poder contarlas
exactamente.

7.- El diluyente para las diluciones puede ser solución fisiológica

(solución salina al 0.85%), agua, caldo de cultivo o una solución
amortiguadora de fosfatos (PBS). ¿Qué ventajas o desventajas tiene
utilizar una u otra?

PBS
Tiene la ventaja para mantener a las células en condiciones
fisiológicas estables durante periodos cortos
Es isotónico y no toxico para las células
Solución salina
Es mas barato
Control de factores fisicoquímicos y fisiológicos del medio en el que se
cultivan las células.
Extremas condiciones de asepsia
Posibles pérdidas irreversible de las propiedades funcionales de las
células.

8.- ¿Por qué razón se recomienda no sembrar los microorganismos

de las primeras diluciones de una dilución serial?

No se recomienda por que va tener una gran cantidad de bacterias y no se

podría hacer un conteo
9.- Las diluciones seriales también se pueden realizar en
microplacas de 96 pozos, como la que se ve en la figura, describa dos
ejemplos en las cuales se utiliza esta metodología.

Las diluciones en serie también se utilizan regularmente en

microbiología cuando, por ejemplo, las concentraciones iniciales de
bacterias son varios órdenes de magnitud demasiado elevadas para
realizar un recuento en placa.

También se puede utilizar la dilución en serie para determinar los rangos

de concentración adecuados en el desarrollo de ensayos, para evaluar la
respuesta farmacológica en los cribados secundarios y para determinar
los efectos toxicológicos en los primeros estudios de absorción,
distribución, metabolismo, excreción y toxicidad

10.- Si se inicia con una población de 1 x 10 10 UFC/ml y quieres

inocular 0.1 mL de la última dilución decimal para tener entre 30 y
300 UFC en la placa ¿Qué dilución sería la que utilizarías?

Se escogería la dilución que este a 1 x 10-5 ya que esta tiene un numero de

colonias comprendido entre 30 y 300
11.- Si se inicia con una población de 1 x 10 10 UFC/ml e intentas hacer
lo mismo que en la pregunta anterior, pero realizando una sola
dilución ¿Qué volumen tomarías de la muestra original y en cuanto
volumen de diluyente lo adicionarías?

De la muestra original se tomarían 1000 microlitros y se diluyeran en una

solución salina estéril de un volumen de 10 mililitros

12.- Observe lo realizado con un cultivo de Salmonella (en la figura) y

calcule las unidades formadoras de colonia/ml del tubo original.

13.- Para la transferencia de volumen entre tubos, en el protocolo de la

pregunta anterior, se sugiere que se cambien las puntas de la
micropipeta ¿Cuál es la razón de ello?

Para evitar que se contaminen las muestras

 REFERENCIAS
(sf). Dilución en serie en microplacas de 96 y 384 pocillos.
Recuperado de: https://trends.directindustry.es/ibs-integra-
biosciences/project-39224-137892.html

Llano, I. (2021). Homeopatía: La pseudociencia de las diluciones

centesimales (CH). Recuperado de:
https://comunicaciencia.bsm.upf.edu/homeopatia-la-pseudociencia-de-las-
diluciones-centesimales-ch/