Extracción y Electroforesis de DNA

Código: BQ1L001
EXTRACCION DE DNA PLASMIDIAL Y Vigencia: 2/2019

ELECTROFORESIS DE DNA Rev.: 01
Bioquímica de los Alimentos I Facultad Tecnológica
Depto. de Ciencias y Tecnología de los Alimentos UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
Elaborado por: Bq. Myriam Pizarro, Dr. (c) Waldo Díaz
Laboratorio Nº 5
EXTRACCION DE DNA PLASMIDIAL Y ELECTROFORESIS DE DNA
1. INTRODUCCIÓN
LOS ACIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleídos son macromoléculas biológicas que se encuentran en forma

de polímeros compuestos por monómeros “nucleótidos” unidos mediante enlaces tipo
fosfodiester.
Los nucleótidos son estructuras compuestas de bases nitrogenadas: Adenina,
Guanina, Timina y Citocina en el DNA, y Uracilo en vez de Timina en el RNA; un azucar
desoxiribosa en el DNA y ribosa en el RNA y un grupo fosfato. Tanto DNA como RNA son
posibles encontrarlos en forma de doble hebra (dsDNA o dsRNA), o como una hebra
(ssDNA o ssRNA). (Fig 1).
Los ácidos nucleicos pueden contener la información genética de los organismos
en genomas dsDNA tanto en eucariontes (DNA en el núcleo) y procariontes como
bacterias (DNA en el citoplasma), en el caso de los virus los genomas se encuentran en
de dsDNA, ssDNA, dsRNA y ssRNA. Esta información genética es posteriormente
codificada en mRNA, en donde participan además los tRNA y rRNA de ribosomas.
Recientemente se ha descubierto actividades catalíticas de acidos nucleicos como
ribozimas
A
Código: BQ1L001
B C
Fig 1: A, Bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos. B, estructura del sdDNA. C,

estructura del DNA y RNA y sus bases nitrogenadas.
EL GENOMA DE UNA BACTERIA
El genoma bacteriano es un conjunto de elementos genéticos autoreplicativos como

cromosomas, plasmidios y profagos. El genoma de una bacteria está contenido en una
estructura virtual del citoplasma llamado nucleoide. El cromosoma de una bacteria (fig 2b)
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es circular y contiene una región llamada ori y una región llamada termino que aseguran
la replicación del cromosoma durante la división celular y permiten la repartición equitativa
de uno de ellos a cada célula.
A B
Fig 2: A, Micrografía electrónica de barrido de E. coli. B, Genoma de E. coli. C,

Representación del genoma de una bacteria y sus plasmidios.
LOS PLASMIDIOS
Los plasmidios son moléculas de dsDNA circulares de tamaño menor al

cromosoma, que poseen la información genética necesaria para su autoperpetuación en
la descendencia. Muchas bacterias son capaces de perder o captar nuevos plasmidios
dependiendo de sus necesidades. Los plasmidios contienen genes que en general no
están contenidos en el genoma, como genes para resistir metales pesados resistencia
antibiótica, entre otros. Los plasmidios se pueden encontrar en estado relajado, enrollado
y superenrollado (Fig 3A y B). Durante una purificación de plasmidios bacterianos estos
pueden ser cortados con enzimas de restricción de corte único para visualizarlos de
manera lineal en una electroforesis en geles de agarosa.
En la actualidad existen plasmidios comerciales que pueden ser utilizados para
clonar genes de interés en bacterias para permitir, por ejemplo, expresar genes de
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manera regulada y obtener finalmente proteínas que pueden ser fácilmente purificables,
este es el caso del vector comercial pBAD (Fig 3C) (que purificaremos en este práctico).
A B C
Fig 6: A, Estado relajado, enrollado y superenrollado de un plasmidio, B, Micrografía

electrónica de alta resolución de un plasmidio, C, pBAD TOPO un vector comercial.
EXTRACCION DE PLASMIDIOS
Los plasmidios bacterianos deben ser purificados por diferentes motivos, entre los que
destacan la posibilidad de utilizarlos para introducirlos en otra bacteria o bien porque es
necesario chequear que los genes fueron bien clonados. Éstos pueden ser aislados por
diferentes metodología una de las más sencillas y que utilizaremos en este práctico es la
lisis alcalina que consiste básicamente en la ruptura de la bacteria con NaOH y un
detergente SDS, una neutralización con acetato de sodio que forma un macroprecipitado
que permite separar otras macromoléculas de los plasmidios y finalmente un proceso de
centrifugación (Fig. 7).
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Fig 7: Etapas de la extracción plasmidial de bacterias.
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
Los ácidos nucleicos pueden ser separados y visualizados mediante una técnica
de electroforesis en geles de agarosa (Fig. 8A). La agarosa es un polisacárido formado
por galactosas alfa y beta que se extrae de las algas de los géneros Gellidium y
Gracillaria. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica en
donde los ácidos nucleicos son cargados en bolsillos y sometidos a un campo eléctrico
desde un polo negativo a uno positivo y permite la separación por tamaño. Para llevar a
cabo la electroforesis se utiliza un equipo compuesto por una cámara, una balsa, una
peineta y una fuente de poder (Fig 8B). Las muestras de DNA deben ser cargadas en
combinación con “buffer de carga” que aporta sales y densidad necesarias para la
migración, además un colorante que permite la visualización de la migración, como lo son
el xilene cianol, azul de bromofenol, rojo cresol, orange G. La preparación de un gel de
agarosa y electroforesis se muestra detalladamente en la Figura 8C y D.
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A B
C 3.- Enfriar la solución

hasta 65°C y depositar en 5.- Dejar solidificar
la balsa
4.- Colocar peineta 6.- remover

peineta
2.- Funda agarosa
1.- Preparar agarosa

1% en buffer TAE 1X
Gel terminado
D
E
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Fig 8: A, Gel de agarosa en balsa, B, equipos de electroforesis, C, Etapas de preparación

de un gel de agarosa, D, Migración de las muestras en gel de agarosa, E, colorantes
utilizados comúnmente en buffer de carga
TINCION DE GELES DE AGAROSA
Al cargar las muestras en un gel de agarosa se debe cargar un estándar de pso

molecular que permite determinar el peso molecular de la muestra problema, en el caso
de los plasmidios esto no se puede determinar correctamente al menos de que
previamente el plasmidio sea linealizado. Los estándares más utilizados son el DNA del
fago lambda digerido con la enzima HinD III y el DNA del fago Phi X-174 digerido con Hae
III (Fig 9A). Para teñir los geles se utilizan moléculas fluorescentes que intercalan el DNA
y pueden ser observados en un transiluminador que excita las moléculas fluorescentes y
estas emiten luz visible. Los colorantes más utilizados son el bromuro de etidio y el SYBR
green (Fig. 9B, C y D)
A B
Relajado
Lineal
Superenrollado
C D
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Fig 9: A, Lambda HinD III, B, gel de Agarosa que muestra las formas de visualización de
los plasmidios, C, Bromuro de etidio, D, SYBR Green.
OBJETIVOS:
 Extracción de plasmidios bacterianos a partir de un cultivo de E. coli

 Preparación, carga y visualización de una electroforesis en gel de agarosa.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
1.- Extracción de DNA plasmidial de E. coli
 Trabajar con guantes

 A partir de un cultivo de E. coli y de E. coli pBAD (10 ml c/u) previamente crecido
en medio de cultivo LB hasta saturación, centrifugue la muestra a 6000 RPM por 5
min en tubos de plástico de 15 ml y descarte el sobrenadante.
 El pellet bacteriano debe ser resuspendido en 250 ul de “Buffer de resuspención”
que contiene enzima RNAsa que permite la destrucción del RNA, una vez lisada la
bacteria, la resuspención debe realizarse pipeteando suavemente o con la ayuda
de un vórtex.
 Transferir las muestras a 2 tubos de 1,5 ml debidamente etiquetadas.
 Agregar a la suspensión 250 ul de “Buffer de lisis”, el cual contiene reactivos que
destruyen la pared celular y la membrana bacteriana, la muestra debe ser
incubada 10 minutos en un baño de agua a 75 °C o hasta decoloración.
 Agregar 350 ul de “Buffer de neutralización”, que formará un precipitado complejo
de macromoléculas incluyendo el DNA cromosomal de la bacteria, la muestra
debe agitarse suavemente 5 veces.
 Centrifugar la muestra a máxima velocidad (13000 RPM) durante 10 min.
 Rescatar cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo, evitando arrastrar
precipitado.
 Agregar isopropanol o etanol frio hasta completar el volumen del tubo e incubar
durante 10 minutos a -20 °C.
 Centrifugar la muestra a máxima velocidad (13000 RPM) durante 10 min.
 Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 ul de “Buffer TE” o agua
ultrapura.
2.- Electroforesis de ácidos nucleicos
 Trabajar con guantes

 Preparar una solución de Agarosa 1% en una botella con tapa tipo Schott o similar
en buffer TAE 1X.
Código: BQ1L001
 Fundir la solución hasta que quede transparente, si la solución quedó muy caliente
se puede enfriar brevemente en baño de agua fría o esperar.
 Depositar aproximadamente 40 ml de Agarosa fundida en la balsa de
electroforesis cuidando no provocar derrames e inmediantamente coloque la
peineta.
 Esperar la solidificación de la agarosa.
 Llenar la cámara de electroforesis con buffer TAE 1X y colocar la balsa que
contiene el gel dentro de la cámara, con la precaución de ubicarlo según la
polaridad correcta.
 Tomar 20 ul de la solución plasmidial y agregarle 5 ul de “buffer de carga”, cargar
los 25 ul totales en cada uno de los bolsillos del gel.
 Someter a electroforesis a 100 volts durante 30 minutos.
 Posteriormente el gel debe ser teñido en una solución de bromuro de etidio y
revelada en un transiluminador.
Referencias
Cox, M. y Nelson, D. Lehninger Principios En Bioquímica, Parte 1: componentes de las

moleculares de las células.4ta edición 2005.
Green M. y Sambrook J,. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cuarta edición. 2012.
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Purificación de DNA a partir de un alimento
Elegir un alimento
Lisis mecánica
Disolver en H2O
Uso detergente y sal
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Precipitación alcohólica
Visualización de hebras de DNA macroscópica.

Observación.

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LOS ACIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleídos son macromoléculas biológicas que se encuentran en forma

Fig 1: A, Bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos. B, estructura del sdDNA. C,

EL GENOMA DE UNA BACTERIA

El genoma bacteriano es un conjunto de elementos genéticos autoreplicativos como

Fig 2: A, Micrografía electrónica de barrido de E. coli. B, Genoma de E. coli. C,

Los plasmidios son moléculas de dsDNA circulares de tamaño menor al

Fig 6: A, Estado relajado, enrollado y superenrollado de un plasmidio, B, Micrografía

Fig 7: Etapas de la extracción plasmidial de bacterias.

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

C 3.- Enfriar la solución

4.- Colocar peineta 6.- remover

2.- Funda agarosa

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TINCION DE GELES DE AGAROSA

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