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Desarrollo de Un Proceso para La Extracción de Papaína en Colombia
Desarrollo de Un Proceso para La Extracción de Papaína en Colombia
COLOMBIA
Asesor
IVAN DARÍO GIL
Co-Asesor
OSCAR FERNANDO SÁNCHEZ
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
A todo aquel que ahora si conoce que es la papaína y de alguna forma me ayudó
a realizar este proyecto.
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CONTENIDO
LISTA DE TABL AS
LISTA DE FIGURAS
INTRODUCCION
OBJETIVOS
1. GENERALIDADES
1.1 PAPAÍN A
1.1.1 Propiedades Físicas
1.1.2 Propiedades Químicas
1.1.3 Almacenamiento
1.1.4 Toxicidad
1.2 CULTIVO DE Carica Papaya
1.2.1 Descripción
1.2.2 Cultivo
1.3 APLIC ACIONES INDUSTRIALES DE LA PAPAÍN A
1.3.1 Farmacéutica
1.3.2 Cervecera
1.3.3 Carne
1.3.4 Textil- Cueros
1.3.5 Alimentos
1.3.6 Cosméticos
2. PROCESO DE PRODUCCIÓN
2.1 EXTR ACCIÓN DEL LÁTEX
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3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.1 PAPAÍN A CRUDA
3.1.1 Extracción
3.1.2 Secado
3.1.3 Caracterización de la papaína cruda
3.2 PAPAÍN A PURIFICAD A
3.2.1 Metodología Original
3.2.2 Metodología Empleada
3.2.3 Caracterización de la papaína purificada
4. RESULTADOS Y AN ÁLISIS
4.1 EXTR ACCIÓN Y SEC ADO
4.2 CARACTERIZACIÓN DE L A PAPAÍN A CRUDA
4.3 PURIFICACIÓN Y CAR ACTERIZACIÓN DE LA PAPAÍN A PURIFIC AD A.
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS
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LISTA DE TABLAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 17. Disposición de las muestra en el gel b para una electroforesis SDS-PAGE
INTRODUCCION
La papaína es una enzima proteolítica natural que se extrae del látex de las hojas,
el tallo y los frutos inmaduros de la Papaya (Baeza, Correa & Salas, 1989).
Usualmente se agrupa con la quimopapaína, glicil endopeptidasa y endopeptidasa
III, debido a su similaridad de peso molecular, constituyendo el 40% del látex en
concentraciones cercanas a 1 mM (Azarkan, Moussaoui, Wuytswinkel, Dehon &
Looze, 2004). Su especificidad es baja por lo cual es capaz de hidrolizar diferentes
tipos de moléculas tales como: aminoácidos básicos, Leucina, Glicina, Argininia y
Lisina, entre otros. Según Rodríguez y Umaña (1995), se compone de 212
aminoácidos, tres puentes disulfuro y un grupo funcional libre. Debido a que es
una hidrolasa, que rompe enlaces peptídicos, su número de clasificación bajo la
nomenclatura de la Comisión Enzimática de la Unión Internacional de Bioquímica
y Biología Molecular es 3.4.22.2.
La papaína es una enzima que tiene diversos usos industriales y con el pasar de
los años su campo de aplicación va en aumento. Estos diversos usos hacen que
la comercialización de papaína a nivel mundial maneje aproximadamente 150
millones de dólares anuales con una producción anual aproximada de 900 a 1000
toneladas métricas, de las cuales solo 100 corresponden a papaína altamente
refinada. Aunque no existe un reporte oficial del crecimiento del mercado
(Fernadez, 2005), se cree que irá en aumento debido a la inexistencia de una
enzima sintética capaz de remedar sus propiedades. Los principales productores
de la enzima son países africanos, aunque también existen algunos en Asia, otros
países como Chile, tienen una producción capaz de suplir exclusivamente sus
necesidades nacionales. En Colombia, la papaína se emplea en procesos propios
de la industria cosmética, química y de alimentos con un consumo superior a los
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1
Cantidad esti mada por el autor basado en l a producci ón anual de c erveza en C olombia y un consumo apr oximado de
papaína por cada hec tolitro.
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OBJ ETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. GENERALIDADES
1.1 PAPAINA
• Carica Papaya
• Carica Candamarcensis
• Carica Goudotiana
• Caria Cauliflora
• Carica Pentagona
1.2.2 Cultivo (Salunkhe & Kadam, 1995). El suelo necesario par cultivar papaya
debe ser aireado, regado, permeable y suelto. De acuerdo a la fertilidad del
suelo se obtienen frutos de mayor o menor tamaño. Puede crecer en suelos
de tan solo 45cm de profundidad con una cantidad de lluvia anual de
2000mm, pero si se presenta una inundación, el árbol disminuye su tamaño
y comienza a debilitarse.
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Vegetal Reino
Embriophyta Subrei no
Tracheophyta División
Angioespermae Tipo
Dicotiledonea Clase
Archichlamydae Subclas e
Parietal es Orden
Carinicinae Suborden
Caricácea Familia
Carica Género
El clima ideal para este tipo de cultivos es el tropical dado que este influye en el
sexo de la planta y en las características organolépticas de la fruta. La altura
máxima recomendada es de 1300 metros sobre el nivel del mar.
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2
Color: Blanco o Crema
2
Especificaciones Técnicas de materia prima Bavaria
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2. PROCESO DE PRODUCCIÓN
El líquido obtenido luego del filtrado es secado para darle una mayor estabilidad a
la enzima que se encuentra presente en el látex. Un proceso de secado que
puede ser continuo o semi batch y consiste en retirar la humedad presente en una
muestra dando lugar una transferencia de masa entre la muestra y el gas
circundante. La elección del proceso de secado apropiado para una muestra
depende de la misma y de la fuente que retirara la humedad presente (Treybal,
1981).
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2.2.1 Luz solar. El principio que utiliza este método es la radiación de calor del
los rayos solares (Rodríguez & Umaña, 1995). Comúnmente la muestra se
vierte en bandejas pandas que permitan tener una buena área de contacto
con los rayos permitiendo que se seque uniformemente. Estas bandejas
pueden tener algún tipo de protector contra el polvo y los insectos cuyo
diseño varia según la aplicación, la Figura 3 muestra algunos esquemas de
secadores solares.
2.2.2 Secador. Es una operación de secado directa cuyo equipo consta de una
cámara provista de bandejas removibles en donde se deposita la muestra.
Estas bandejas reciben un flujo de aire proveniente de un ventilador o
compresor a una temperatura mayor a la ambiente para retirar la humedad
presente por convección. Cuando la muestra esta seca, se retira y se carga
con nueva muestra, por lo cual es un proceso batch. Es importante anotar
que como el flujo de aire es turbulento, el contenido de la humedad de una
muestra en diferentes lugares del secador puede variar. (Treybal, 1981). La
Figura 4 muestra un esquema básico de secador de bandejas
2.2.3 Horno. Este método consiste en una cámara cerrada con bandejas, la
diferencia con el secador por bandejas radica en que en esta cámara no
existe un flujo de aire, sino se imparte calor al aire presente dentro de la
cámara, el cual puede tener o no una salida al exterior graduable (Treybal,
1981). La temperatura del aire debe ser controlada y verificada para que
ésta no genere una pérdida de la actividad enzimática (Nitsawang, Hatti-
Kaul & Kanasawuda (2006).
2.2.4 Secado al vacío. Consiste en una cámara hermética con bandejas donde
una bomba se encarga de generar vacío dentro de la misma. No existe un
flujo de aire, sino se produce un cambio en le punto de ebullición del agua y
gracias a que las bandejas pueden tener una temperatura ajustable, el agua
se evapora.
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2.2.5 Secado por liofilización. Se utiliza cuando una muestra no puede ser
calentada para evitar la pérdida de alguna característica no termoestable.
La muestra necesita ser congelada a una temperatura de al menos -20°C
(Treybal, 1981). En una cámara hermética tiene lugar la sublimación de los
cristales de hielo formados y la humedad restante contenida en la muestra
se desplaza por difusión a los espacios vacíos dejados por los cristales
(Nitsawang et al., 2006)
La purificación de papaína puede tener como objetivo alcanzar una papaína libre
de impurezas o alcanzar una papaína apta para formulación de vacunas y
medicamentos. A continuación se muestran algunas de las técnicas empleadas
para alcanzar una papaína libre de impurezas, ya que una papaína utrapurificada
requiere de más operaciones y no tiene una demanda significativa en el país
Colombia.
2.3.2 Purificación.
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
fruto fue lavado con agua y pelado con un cuchillo a una profundidad de no
más de 1.5 milímetros. Esta cáscara fue triturada en un procesador de
alimentos obteniendo una pasta húmeda almacenada en frascos plásticos
color ámbar que contenían NaCl a una temperatura aproximada de -20°C.
Figura 7. Proc eso par a obtener el triturado de c áscara proveniente de frutos inmaduros .
3.1.2 Secado
• Secador de Bandejas
• Secador al Vacío
• Horno
• Liofilizador
Tabla 3. Pr ocesos de sec ado con temperaturas y presiones s eleccionadas para cada uno.
Número Orígen Tipo de Secado Temperatura (°C) Presión (mbar)
1 Látex Horno 40 746.6
2 Cáscara Horno 50 746.6
3 Látex Horno 40 746.6
4 Cáscara Horno 50 746.6
5 Látex Secador de Bandej as 40 746.6
6 Cáscara Secador de Bandej as 50 746.6
7 Látex Secador de Bandej as 40 746.6
8 Cáscara Secador de Bandej as 50 746.6
9 Látex Secado al Vacío 40 137.06
10 Cáscara Secado al Vacío 50 137.06
11 Látex Secado al Vacío 40 137.06
12 Cáscara Secado al Vacío 50 137.06
13 Látex Liofilización -30 0.1
14 Cáscara Liofilización -40 0.1
15 Látex Liofilización -30 0.1
16 Cáscara Liofilización -40 0.1
1
y = 835.71x
2
R = 0. 9981
0.9
0.8
0.7
Replica 1
Absorbanci a (nm )
0.6 Replica 2
Replica 3
0.5 Replica 4
P rom edio
0.4 Lineal (P rom edio)
0.3
0.2
0.1
0
0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0. 001 0. 0012
Concentración (µmoles de Tirosina )
Unidades
Unidades ml enzima
=
mg proteína mg proteína
ml enzima
a.
b.
Figura 18 a. Disposición de las muestr a en el gel c para una electroforesis SDS-PAGE de mues tras de látex
denatur adas . b Disposición de las muestra en el gel c para una el ectroforesis SDS-PAGE de muestras sin
denatur ar.
Figura 22. Montaj e para una cromatografía de i ntercambio iónico en una matriz de Q-Sefaros a.
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4. RESULTADOS Y ANÁLISIS
Se plantean entonces dos diseños de tipo factorial dado que las temperaturas
seleccionadas para todos los procesos no son iguales. El primero se efectúa sobre
los datos recogidos para el horno, secador y secado al vacío, y el segundo sobre
el liofilizador. Los factores para ambos diseños fueron: origen, proceso de secado
y temperatura. La elección de un diseño factorial obedece a que este diseño
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permite analizar el efecto de las posibles combinaciones de los tres factores y los
niveles presentes para cada uno. El efecto del factor se traduce en el efecto que
se genera en la variable de salida ante un cambio de nivel del mismo al no ser
constante para todos tiene lugar el efecto de la interacción entre factores
(Montgomery, 2005).
Tabla 8. ANOVA para acti vidad c on origen y proces o de sec ado como fac tores.
Activi dad (uni dades/ml mues tra) Activi dad (unidades/mg proteína)
Numero Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Replica 1 Replica 2 Replica 3
1 0.00068 0.00110 0.00175 0.00040 0.00081 0.00113
2 0.00143 0.00146 0.00175 0.00097 0.00093 0.00102
5 0.00143 0.00145 0.00197 0.00085 0.00093 0.00127
6 0.00038 0.00042 0.00037 0.00021 0.00025 0.00023
9 0.00159 0.00103 0.00174 0.00088 0.00056 0.00115
10 0.00162 0.00152 0.00165 0.00080 0.00055 0.00089
13 0.00104 0.00143 0.00154 0.00038 0.00079 0.00060
14 0.00140 0.00144 0.00172 0.00073 0.00069 0.00087
El diseño esta vez será unifactorial, siendo el proceso de secado el factor con
cuatro niveles. Empleando el software MINITAB 15, se realizó un análisis de
varianza soportado con un análisis de residuales que verifica la tendencia a la
normalidad y la distribución independiente propios de un diseño adecuado. La
Figura 25 muestra la graficas de probabilidad normal y residuales vs. valores
ajustados. En la primera los valores mas representativos, según Montgomery,
(2005), tienden a la diagonal indicando que una distribución normal es correcta
para la serie de datos introducidos. En la segunda los datos introducidos no
muestran una estructura definida, aunque algunos de los valores tienden a
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agregarse en cuatro grupos, esto puede sugerir existen unos datos que afectan la
aleatoriedad.
papaína a un grupo de enzimas de peso molecular similar, las cuales estas siendo
diferenciadas en una electroforesis con un medio sin denaturar.
a b
c d
Figura. 27 Gel a mues tras de látex y c áscara ser vidas según figura 16. Gel b, mues tras us ando diferentes
buffers ser vidas según la figura 17. Gel c muestr as de látex ser vidas según la figura 18 a. Gel d muestras de
látex sin denaturar ser vidas s egún la figura 18 b.
Para la determinación del peso molecular de las bandas presentes en los geles a,
b y c, se realizó mediante una grafica de calibración entre una medida de la
movilidad relativa las bandas del marcador de peso molecular y el logaritmo del
peso molecular de cada una de ellas. La Figura 28 muestra el orden de los
compuestos del marcador de peso molecular empleado.
Figura. 28 Bandas par a el marc ador de pes o molec ular (161-0309 BIO-RAD).
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Se puede ver que para algunos de los geles no se muestran todas las bandas del
marcador de peso molecular, en especial la banda 4 y la banda 7, que no aparece
claramente en ningún gel. Esto se puede considerar como un error en la
electroforesis que puede obedecer a un almacenamiento inapropiado del
marcador de peso molecular.
5.5000
Log Peso Molecular (Daltons)
5.0000
4.5000
gel a
4.0000 gel b
gel c
3.5000
3.0000
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200
Movilidad Relativa
CONCLUSIONES
Las concentraciones ideales para eluir la enzima en un matriz de sefarosa son 0.3
y 0.4 M de NaCl.
RECOMENDACIONES
Sería de gran interés hacer un proceso de purificación con más tiempo para cada
etapa con el fin de poder tener replicas y hacer conclusiones validas
Un marcador de peso molecular no siempre muestra todas sus bandas, por lo que
se recomienda servir varios pozos para poder detectarlas todas.
REFERENCIAS
Azarkan, M., El Moussaoui, A., van Wu ytswinkel, D., Dehon G. & Looze, Y. (2003).
Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica Papaya.
Journal of Chromatography B, 790, 229-238.
Daliya, S., Mathew, Ruey-Shin, J. (2005). Improved back extraction of papain from
AOT re verse micelles using alcohols and a counter-ionic surfactant. Biochemical
Engineering Journal, 25, 219–225.
Ortiz, A., Madrigal, L., Fernández, R. & Cooke, R. (1980). The storage and drying
characteristics of papaya (Carica papaya L.) Latex. J Sci Food Agric, 31, 510-514.
Roe, S. (2001). Protein purification Techniques (2da Ed.). New York, NY, EEUU:
Oxford University Press Inc.
Salunkhe, D.K. & Kadam, S.S. (1995) Handbook of Fruit Science and Technology:
Production, Composition, Storage and Processing. EE.UU: Taylor & Francis Ltd.
Starley, I.F, Mohammed, P., Shneider, G. & Bickler, S.W. (1999). The treatment
of paediatric burns using topical papaya. Burns, 25, 636-639.
Treybal, R.E. (1915). Mass-transfer operations (3ra Ed.). New York, NY, EE.UU:
McGraw-Hill Book.