Peroxidación

Lipídica
Introducción

Puede iniciar una cadena

Los radicales libres son Presentan un electrón
de reacciones al remover
moléculas o sustancias desapareado en su
un electrón de otra
altamente reactivas. orbital externo.
molécula.

La transferencia de
Anión superóxido (O2.), El radical hidroxilo (OH.)
electrones hacia el
peróxido de hidrogeno está involucrado en
oxigeno forma los
(H2O2) y radical hidroxilo reacciones tales como la
siguientes
libre (OH.). peroxidación lipídica.
intermediarios:
Introducción
Los radicales libre de
oxigeno, causan daño a la
mayoría de las
macromoléculas (proteínas,
ácidos nucleicos, lípidos).
Estos reaccionan con
proteínas dañando la
integridad de la membrana
células y la integridad de
proteínas transportadoras.
El radical hidroxilo extrae
átomos de hidrogeno de
lípidos de membranas e
inician las reacciones de
peroxidación lipídica.
Colapsan gradientes de
iones y conducen hacia la
muerte celular.
Los peróxidos lipídicos
formados se descomponen
en especies carbonilo
reactivas, como el
malondialdehido y el
hidroxinonenal.
Existen mecanismos de
defensa conocidos: como los
antioxidantes, que permiten
contrarrestar la presencia de
estos agentes dañinos.
Este es un proceso radicalario, en cadena
que se desarrolla en tres etapas:

1.1 Iniciación. Abstracción de un hidrógeno desde un

grupo metileno por ataque de un ROS a un lípido.
Formación de dienos conjugados para estabilizar
el radical.
1.2 Propagación. Los radicales peroxilos pueden
abstraer hidrógenos de otras moléculas.Origina
peróxidos lipídicos.
1.3 Terminación. Reacción entre radicales para
dar especies más estables no iniciadoras y no
propagadoras.Se liberan aldehídos, hidrocarburos
de cadena corta, etc.
Experimento N°1: Determinación de Malondialdehído
como medida de peroxidación lipídica.

La evaluación de la peroxidación lipídica a través de la

determinación de Malondialdehído, se constituye en una
prueba muy útil no sólo para conocer la presencia de
radicales libres, generados por algún agente causal, sino
también para poder evaluar las bondades antioxidantes
de muchos productos naturales.
Objetivos del experimento:
▪ 1. Preparar los sistemas biológicos de estudio, a partir de hígado de
rata para la inducción de peroxidación lipídica.

▪ 2. Determinar la concentración de malondialdehído en los sistemas

de estudio.

▪ 3. Interpretar los resultados y discutir los alcances del uso de esta

técnica en trabajos de investigación.
Fundamento:
El Malondialdehído (MDA) forma
un aducto 1:2 con el ácido
tiobarbitúrico produciendo el
siguiente compuesto (complejo
Acido Tiobarbitúrico-
Malondialdehído): de color rojo-
naranja, el cual puede ser medido
por fluorometría o
espectrofotometría.

Acido Tiobarbitúrico
 Parte Experimental
Peroxidación Lipídica

https://web.microsoftstream.com/video/715f81f9-ddb1-44af-88dc-75dd1ec55af3
Reactivos:

▪ KCl 0.15M
▪ FeSO4 15mM
▪ Acido tiobarbiturico 0.67% en acido acético al 50%
▪ Acido tricloroacético al 5%
Procedimiento:
a) Preparación del homogenizado de hígado de rata al 10%

Pesar 2.5 g de hígado de rata y

mantenerlo siempre en hielo.

Tamizar el tejido utilizando una malla metálica,

presionando el tejido contra la malla y agregando
KCl 0.15 M frío, para lavar la sangre.
Procedimiento:
a) Preparación del homogenizado de hígado de rata al 10%

Colocar las membranas en

un mortero frío (sobre
hielo) y triturar con 25 ml Filtrar el
de KCl 0.15 M frío, hasta homogeniza
obtener un homogenizado do con la
homogéneo. El proceso de ayuda de
triturado no debe demorar una gaza.
más de 10 minutos.
Procedimiento:
a) Preparación del homogenizado de hígado de rata al 10%

Separar y guardar el
filtrado a 0 °C, para
hacer los ensayos de
peroxidación lipídica. Se
recomienda utilizar el
filtrado fresco para cada
ensayo.
Procedimiento:
b) Inducción y determinación de la peroxidación lipídica.
Medir 3.0 ml. de homogenizado de
hígado al 10 % e iniciar la
Homogenizado
peroxidación lipídica añadiendo
de hígado 100 ul de sulfato ferroso (FeSO4)
15 mM. Preparar un sistema sin Con FeSO4 Sin FeSO4
FeSO4, que servirá como control.

Incubar los sistemas por 1 hora

a temperatura ambiente.
Con FeSO4 Sin FeSO4
Procedimiento:
b) Inducción y determinación de la peroxidación lipídica.
Transcurrido el tiempo de
incubación, tomar 200 µl de
cada sistema y mezclar por
agitación con 200 µl de ácido
Tomar 200 ul de tricloroacético al 5 %.
cada sistema

200 ul de ácido
tricloroacético al 5 %

Centrifugar a
15,000 rpm
durante 5 minutos
 Procedimiento:
b) Inducción y determinación de la peroxidación lipídica.

100 ul de
sobrenadante

Acido tiobarbitúrico 0.67 %

en ácido acético 50% Incubar las muestras
en baño de agua
hirviente, durante 1
hora.

Tomar 100 ul de sobrenadante y mezclar con 1.0 ml de

Acido tiobarbitúrico 0.67 % en ácido acético 50%.
Procedimiento:
b) Inducción y determinación de la peroxidación lipídica.

Transcurrido este tiempo, retirar los Realizar las lecturas en un

sistemas del baño hirviente y enfriar espectrofotómetro a 535 nm.
en hielo por 15 minutos.
Determinar la cantidad de Malondialdehído (MDA) formado, a
partir de la curva de calibración.
Conc. de MDA (uM) Absorbancia (DO) Absorbancia Neta F. Calibracion Factor Promedio

Estand. 1 10 0.036
Estand. 2 20 0.061
Estand. 3 30 0.094
Estand. 4 40 0.101
Estand. 5
50 0.153
Estand. 6
100 0.250
Estand. 7
150 0.354
Estand. 8
200 0.429
Blanco
0 0.003
Determinar la cantidad de Malondialdehído (MDA) formado, a
partir de la curva de calibración.
Sistemas de estudio Concentración de
MDA (uMoles / L)
Muestra 1

Abs. Bruta: 0.143

Muestra 2

Abs. Bruta: 0.088