Índice

IV Resultados.......................................................................................................................... 44
4.1 Población microbiana de los consorcios microbianos F1AA, TD y AM............................ 44
4.2 Biodegradación del crudo Casablanca por los consorcios microbianos............................. 45
4.2.1 Caracterización cromatográfica del crudo Casablanca.......................................... 45
4.2.2 Eficiencia de extracción......................................................................................... 47
4.2.3 Biodegradación del extracto orgánico total............................................................ 48
4.2.4 Biodegradación de la fracción saturada, monoaromática
y poliaromática...................................................................................................... 48
4.2.5 Biodegradación de compuestos diana.....................................................................50
4.2.5.1 Biodegradación de los n-alcanos e isoprenoides....................................... 50
4.2.5.2 Biodegradación de compuestos aromáticos.............................................. 50
4.2.6 Aromaticidad de la fracción poliaromática (F3)..................................................... 53
4.3 Efecto de los ramnolípidos MAT10 en la biodegradación del crudo
Casablanca por el consorcio AM........................................................................................ 54
4.3.1 Biodegradación de los TPH e isoprenoides........................................................... 55
4.3.2 Biodegradación de los HAPs diana........................................................................ 57
V Discusión.............................................................................................................................59
5.1 Consorcio F1AA..................................................................................................................60
5.2 Consorcio TD.......................................................................................................................61
5.3 Consorcio AM..................................................................................................................... 62
5.4 Efecto de la presencia de los ramnolípidos MAT10 en la biodegradación
del crudo Casablanca por el consorcio AM.........................................................................63
6 Conclusiones.......................................................................................................................65

Capítulo II:

Caracterización de la diversidad microbiana de un consorcio

degradador de HAPs

1 Introducción.......................................................................................................................69
1.1 Los hidrocarburos aromáticos policíclicos......................................................................... 69
1.1.1 Estructura de los HAPs.......................................................................................... 69
1.1.2 Origen y distribución de los HAPs en el medio ambiente..................................... 70
1.1.3 Biodegradación de HAPs........................................................................................72
1.1.4 Microorganismos degradadores de HAPs.............................................................. 74
1.1.5 Utilización de inóculos exógenos en experiencias de biorremediación................ 74

iii
Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica

1.1.6 Estudio de la diversidad de comunidades microbianas.......................................... 77

1.1.6.1 Metodologías dependientes de cultivo.......................................................78
1.1.6.2 Metodologías independientes de cultivo................................................... 79
1.1.6.2.1 PLFA................................................................................ 79
1.1.6.2.2 ARDRA........................................................................... 80
1.1.6.2.3 DGGE y TGGE................................................................ 81
1.1.6.2.4 SSCP................................................................................ 82
1.1.6.2.5 T-RFLP............................................................................ 82
1.1.6.2.6 FISH................................................................................. 83
1.1.6.2.7 Limitaciones de las técnicas independientes de
cultivo...............................................................................84
II Objetivos.............................................................................................................................87
III Materiales y métodos........................................................................................................ 88
3.1 Diseño experimental........................................................................................................... 88
3.2 Medios de cultivo, reactivos y disolventes......................................................................... 88
3.3 Consorcio microbiano AM.................................................................................................. 90
3.4 Seguimiento de la población heterótrofa y degradadora de HAPs...................................... 90
3.5 Análisis por microscopia del consorcio AM....................................................................... 90
3.5.1 Microscopia óptica................................................................................................. 91
3.5.2 Microscopia electrónica de transmisión................................................................. 91
3.5.2.1 Estudio ultraestructural de cortes celulares............................................... 91
3.5.2.2 Tinción negativa........................................................................................ 91
3.5.3 Microscopia electrónica de barrido........................................................................ 92
3.5.4 Microscopia de fuerzas atómicas (AFM)............................................................... 92
3.6 Aislamiento de microorganismos cultivables...................................................................... 93
3.6.1 Aislamiento de heterótrofos................................................................................... 93
3.6.2 Aislamiento de degradadores de HAPs.................................................................. 93
3.6.2.1 Agar mineral esprayado con hidrocarburo.................................................93
3.6.2.2 Agar mineral con hidrocarburo en fase vapor............................................93
3.6.2.3 Agar fenantreno......................................................................................... 94
3.7 Capacidad biodegradadora de HAPs de las cepas aisladas................................................. 94
3.7.1 Ensayos realizados y condiciones de incubación................................................... 94
3.7.2 Análisis químico del proceso de biodegradación................................................... 94
3.8 Aislamiento de ácidos nucleicos......................................................................................... 95
3.8.1 Método por congelación rápìda y choque térmico................................................. 95

iv
 Índice

3.8.2 Método por calor: extractos celulares hervidos...................................................... 97

3.9 Análisis electroforético del DNA....................................................................................... 97
3.10 Amplificación de genes 16S rRNA y 18S rRNA mediante PCR....................................... 98
3.11 Análisis de DGGE............................................................................................................... 100
3.11.1 Preparación de geles desnaturalizantes...................................................................101
3.11.2 Tinción y visualización de geles de DGGE............................................................ 104
3.11.3 Escisión y análisis de bandas de DGGE................................................................. 104
3.12 Obtención de librerías de clones de genes 16S y 18S rRNA.............................................. 105
3.12.1 Ligación de productos de PCR.............................................................................. 105
3.12.2 Obtención de células competentes de Escherichia coli DH5Į.............................. 105
3.12.3 Transformación de células competentes.................................................................106
3.12.4 Detección de clones recombinantes........................................................................106
3.12.4.1 Amplificación del inserto..............................................................106
3.12.4.2 Digestión enzimática de clones recombinantes............................ 107
3.13 Secuenciación...................................................................................................................... 107
3.14 Análisis de las secuencias de DNA..................................................................................... 108
3.14.1 Secuencias estudiadas.............................................................................................109
IV Resultados...........................................................................................................................110
4.1 Estudio de microscopia del consorcio AM..........................................................................110
4.2 Evolución de la población heterótrofa y degradadora de HAPs..........................................113
4.3 Aislamiento y clasificación taxonómica de las cepas aisladas........................................... 115
4.3.1 Aislamiento de cepas heterótrofas.......................................................................... 115
4.3.2 Aislamiento de cepas degradadoras de HAPs........................................................ 115
4.3.3 Secuencias de genes 16S rRNA y 18S rRNA
de las cepas aisladas............................................................................................... 117
4.4 Caracterización de la capacidad degradadora de HAPs
de las cepas aisladas............................................................................................................ 118
4.5 Estudio del consorcio AM por DGGE.................................................................................119
4.5.1 Perfil de DGGE del periodo de incubación del consorcio AM.............................. 120
4.5.2 Caracterización por DGGE del consorcio AM
a los 15 días de incubación....................................................................................121
4.6 Librerías de clones de genes 16SrRNA y 18S rRNA.......................................................... 123
4.6.1 Librería de genes 16S rRNA.................................................................................. 123
4.6.2 Librería de genes 18S rRNA.................................................................................. 125
V Discusión.............................................................................................................................126
5.1 Cepas aisladas del consorcio AM....................................................................................... 126

v
Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica

5.2 Estudio por DGGE del consorcio AM................................................................................ 128

5.3 Estudio del consorcio AM por librerías de clones.............................................................. 129
5.4 Complementariedad de las técnicas dependientes
e independientes de cultivo................................................................................................ 130
VI Conclusiones...................................................................................................................... 137

Capítulo III:

Diseño y evaluación de ensayos de biotratabilidad para la biorremediación

de suelos contaminados por hidrocarburos

I Introducción....................................................................................................................... 141
1.1 El suelo............................................................................................................................... 141
1.1.1 Estructura y componentes del suelo....................................................................... 141
1.1.2 Las poblaciónes microbianas..................................................................................142
1.1.3 Destino ambiental de los contaminantes orgánicos en un suelo............................. 143
1.2 Legislación ambiental de suelos contaminados...................................................................144
1.2.1 Plan Nacional de recuperación de suelos contaminados (1995-2005)................... 144
1.2.2 Ley de Residuos (10/1998).................................................................................... 145
1.2.2.1 Real Decreto de 14 de enero de 2005 (9/2005)......................................... 146
1.3 Ventajas y limitaciones de los procesos de biorremediación
de suelos contaminados......................................................................................................150
1.4 Factores que condicionan la biorremediación de un suelo.................................................. 151
1.5 Fases necesarias para la aplicación de la tecnología de la biorremediación........................156
1.6 Los ensayos de tratabilidad en la biorremediación
de suelos contaminados.......................................................................................................156
II Objetivos.............................................................................................................................159
III Material y métodos............................................................................................................ 160
3.1 Reactivos y disolventes........................................................................................................160
3.2 Muestras de suelo................................................................................................................ 160
3.2.1 Suelo A................................................................................................................... 160
3.2.2 Suelo B....................................................................................................................161
3.3 Protocolo del ensayo de tratabilidad....................................................................................162
3.3.1 Análisis fisicoquímico del suelo........................................................................... 164
3.3.1.1 Textura del suelo........................................................................................164
3.3.1.2 Humedad y la capacidad de campo........................................................... 165
3.3.1.3 Carbono orgánico total (COT) y nitrógeno total....................................... 165

vi
 Índice

3.3.1.4 Concentración de nutrientes inórgánicos................................................... 166

3.3.1.4.1 Nitratos, nitritos y fosfatos............................................. 166
3.3.1.4.2 Amonio............................................................................ 166
3.3.1.5 pH............................................................................................................ 167
3.3.1.6 Conductividad eléctrica............................................................................ 167
3.3.2 Estudio de la población microbiana..................................................................... 167
3.3.2.1 Determinación de la población microbiana
heterótrofa y degradadora de alcanos........................................................167
3.3.2.2 Ensayos de respirometría...........................................................................167
3.3.3 Ensayos de toxicidad.............................................................................................. 169

3.3.4 Ensayos rápidos de biodegradabilidad en suelo

resuspendido en agua (slurries)............................................................................. 170
3.3.4.1 Tratamientos.............................................................................................. 170
3.3.4.2 Análisis químico........................................................................................ 170
3.3.5 Ensayos con microcosmos..................................................................................... 171
3.3.6 Análisis químico de hidrocarburos........................................................................ 173
3.3.6.1 Extracto orgánico total (EOT).................................................................. 173
3.3.6.2 Hidrocarburos totales del petróleo (TPH)................................................. 174
IV Resultados y discusión..................................................................................................... 175
4.1 Fase I del estudio de tratabilidad......................................................................................... 175
4.1.1 Poblaciones microbianas y respirometría.............................................................. 175
4.1.2 Estudio de la toxicidad aguda................................................................................ 177
4.1.3 Ensayos rápidos de biodegradabilidad................................................................... 178
4.2 Fase II del estudio de tratabilidad........................................................................................180
4.2.1 Microcosmos del suelo A....................................................................................... 181
4.2.2 Microcosmos del suelo B....................................................................................... 185
V Conclusiones...................................................................................................................... 188

Capítulo IV:

Biorremediación de un suelo contaminado por creosota: caracterización

microbiológica, química y ecotoxicológica

I Introducción...................................................................................................................... 193
1.1 La creosota...........................................................................................................................193

vii