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TESIS PROFESIONAL
A mis padres, por brindarme como herencia mi educación, enseñándome a ser libre, a tener
confianza en mí y a creer en Dios. Por cada esfuerzo realizado para que ésta meta haya llegado
a ser realidad.
A mi padre, quien me enseño que en la vida existe el bien y el mal y que solo con fe, trabajo
continuo, responsabilidad y esfuerzo diario, podría ser algún día un buen hombre.
A mi madre, quien me dio la más cálida bienvenida a este mundo y quien en mi vida ha sido
fuente de ternura, comprensión y amor.
A mis hermanos, Gerardo, Augusto, Adrián y Sergio, quienes me han motivado a dar siempre
un paso al frente lo mejor posible y servir de ejemplo. Por darme su afecto, cariño y confianza.
A Esmeralda, mi esposa, que es quien le da sentido a mi vida, quien la llena de emoción. Por
quien tengo la certeza de que no volveré a sentir frías mis manos y mucho menos mi corazón,
por ser como es y compartir su vida a mi lado.
A Daniel Hernández Tecpa, mi mejor amigo, por brindarme su amistad, apoyo incondicional y
comprensión. Por ofrecer otras perspectivas a mi vida y darme su franco punto de vista.
A mí estimado director de tesis el Doctor José Abraham Banderas López, quien es mi primer
acercamiento a un hombre de ciencia, quien me dio su amistad sincera y me mostró el camino
para descubrir las respuestas a mis inquietudes.
A los matrimonios Vargas Cerón y Cerón Luna por brindarme un espació en su hogar, por su
apoyo, confianza, por haberme motivado a ser mejor. Por haberme enseñado a tener ilusiones y
la convicción en hacerlas realidad.
A mi amiga M. en C. Mónica Jaime Fonseca, que siempre estuvo, está y seguirá estando
brindándome afecto y soporte. Y quien, por cierto, me brindo un valioso espacio en el
laboratorio del CICATA – Legaría para efectuar mis experimentos.
Investigar es ver lo que todo el mundo ha visto, y pensar lo que nadie más ha pensado. Albert
Szent-Györgi (1893-1986)
CONTENIDO
PÁG.
ÍNDICE DE TABLAS
ÍNDICE DE FIGURAS
1 RESUMEN 1
2 INTRODUCCIÓN 2
3 ANTECEDENTES 3
4 OBJETIVOS 20
5 MATERIALES Y MÉTODOS 21
5.2.5 Medición de pH 25
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 30
7 CONCLUSIONES 52
8 PERSPECTIVAS 53
9 BIBLIOGRAFÍA 54
ANEXO 1 57
ANEXO 2 70
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Título Pág.
7 Características morfológicas. 32
1
2 INTRODUCCIÓN
El tepache es una bebida tradicional fermentada que tiene sus orígenes en México, se
cree que su nombre es de etimología náhuatl, ya que algunos autores consideran que deriva de
“tépiatl” o de su diminutivo “tepiatzin” que significa agua o bebida (del vocablo “atl”) de una
variedad de maíz llamada “tepiatl”, en tanto que otros autores indican que deriva de “tepachoa”
que significa aprensar o moler algo con una piedra (11). En la actualidad el tepache se elabora
principalmente de piña, pero pueden emplearse otras frutas, es de color moreno amarillento,
con sabor dulce y agradable. Es una bebida muy refrescante, de bajo contenido alcohólico, que
se consume principalmente durante las épocas cálidas del año, de amplia aceptación popular
sobre todo entre estratos sociales pobres y de clase media. En épocas precortesianas el
tepache se elaborada en México con granos de maíz disueltos en el jugo de la caña de azúcar y
rara vez con pulque, desde entonces se conocía que cuando la fermentación se prolonga por
más tiempo el tepache presentaba un sabor agrio y avinagrado, convirtiéndose en una bebida
embriagante debido a su considerable contenido alcohólico, en ocasiones el líquido
deliberadamente se dejaba fermentar hasta obtener vinagre. La elaboración del tepache de un
lugar a otro tenía y a la fecha tiene, considerables variantes en los ingredientes empleados y
condiciones de preparación, dependiendo de la región y los gustos de los consumidores, por lo
cual el tipo de flora microbiana y las características del producto son difícilmente similares (2,
14, 55).
2
sensoriales. Esto no es permitido en la industria de los alimentos ya que no se puede depender
de métodos rudimentarios no caracterizados en la elaboración de productos para el consumo
humano, pues involucran un riesgo para la salud aparte de no representar una opción de
procesamiento rentable para su venta y al no existir una estabilización del producto su vida de
anaquel es corta. Es entonces indispensable una amplia investigación para determinar factores
tecnológicos en la preparación de los alimentos tradicionales fermentados, en particular del
tepache, que permitan caracterizar la acción sobre el sustrato, de la diversidad de
microorganismos involucrados y se estudie su interacción de manera que se amplíe el
conocimiento del proceso (4, 33).
3 ANTECEDENTES
3
etanol y ácido acético; como resultado de su trabajo recomienda el uso de melazas y menciona
que el empleo de la aireación y modificación del pH no influyen positivamente en la producción
de biomasa. Monroy T. R. (1991)32, llevó a cabo pruebas de fermentación empleando como
inóculo tibicos del tepache en soluciones de piloncillo al 5%, en condiciones microaerofílicas, en
sus estudios encontró que durante las primeras horas de fermentación las bacterias lácticas
predominan, posteriormente las poblaciones de las levaduras se incrementan y disminuyen las
de bacterias lácticas, alcanzando en 24 h un pH de 3,4. Por último Terrazas R. y col. (2001)54,
llevaron a cabo una evaluación sensorial de cuatro muestras de tepache de diferentes fuentes
obtenidas por distintos procesos de fermentación, encontrando que las bebidas obtenidas por
un proceso de doble fermentación presentaron mejor evolución sensorial.
El inóculo está constituido por la flora que contiene la fruta con la que se prepara el
sustrato, aunque también puede emplearse entre 5 a 15% de tibicos o de fermentado obtenido
en procesos anteriores. El proceso de fermentación puede durar de 5 a 12 días y una vez que
se concluye el producto es diluido y endulzado al gusto para su comercialización. Los
4
parámetros para establecer que se ha completado el proceso de fermentación son de
naturaleza empírica y consisten principalmente en la consistencia del fermentado, su sabor, y
olor. Estos últimos son característicos de la bebida, en el caso de la consistencia se toma una
cuchara de madera y se observa la formación de un hilo fino de fermentado cuando se deja
caer, este debe ser consistente con un diámetro entre 6 a 10 veces menor que para el caso del
pulque. Para mejorar el aspecto del tepache es común el empleo de sustancias colorantes entre
las cuales las más empleadas son el azúcar quemada y colorantes naturales. Los contenedores
empleados en la fermentación pueden ser de plástico o madera con una capacidad de 80 a 200
litros, dependiendo de la producción, los cuales se tapan con tela de manta de cielo o un
material similar para impedir la entrada de insectos y al mismo tiempo permitir el escape del gas
generado durante la fermentación.
5
análisis por medio de un método especial de tinción, durante el proceso de formación de un
grano de tibico, mostró que las dextranas son más abundantes en la capa interna. La
compactación del grano está determinada por la presión interior de CO2 que se presenta
durante la fermentación y cuya presencia en el interior ahueca los granos (18, 31).
Las fermentaciones en cultivo mixto ofrecen algunas ventajas sobre una fermentación que
emplea solo un microorganismo, entre las ventajas se encuentran (4, 33):
6
otros microorganismos, puede también alterar el pH del medio y de ese modo, mejorar la
actividad de una o más enzimas, aun cuando la temperatura sea elevada, promoviendo
el crecimiento.
• Los cultivos mixtos son capaces de llevar a cabo transformaciones en múltiples pasos
que serían imposibles de realizar por medio de un único microorganismo. Por ejemplo
en la fermentación para elaborar miso y shoyu se emplea Aspergillus oryzae para hacer
primero el koji. El koji produce amilasa y proteasas, las cuales rompen el almidón del
arroz y las proteínas de la soya, estos componentes son empleados como sustrato por
bacterias ácido lácticas en la elaboración de miso y shoyu, con el objeto de producir
compuestos aromáticos y alcohol.
• En algunos cultivos mixtos se puede establecer una asociación marcadamente estable
de microorganismos. Aun cuando los cultivos sean preparados por individuos inexpertos
trabajando en condiciones no sanitarias, como ocurre en el ragi, en el cual se emplea
una mezcla de hongos, levaduras y bacterias que coexisten incluso aun después de
años de subcultivo. Probablemente la elaboración del primer cultivo iniciador (starter) se
establece por intento y error, y las condiciones de proceso son tales que la mezcla
puede competir contra otros contaminantes comunes.
• La mezcla de microorganismos puede propiciar la generación de compuestos que los
complemente entre sí a la vez que excluyan a microorganismos indeseables. Por
ejemplo, en algunos alimentos fermentados las levaduras pueden producir alcohol y las
bacterias lácticas, acido láctico y otros ácidos orgánicos cambiando las condiciones en
el sustrato, con lo cual se logra excluir la mayoría de las bacterias y mohos indeseables.
• El cultivo mixto permite una mejor utilización del sustrato. El sustrato para alimentos
fermentados está constituido siempre por una compleja mezcla de carbohidratos, lípidos
y proteínas. Los cultivos mixtos poseen un amplio espectro de enzimas y por esta
situación son capaces de atacar una amplia variedad de sustratos. Con la adecuada
selección de especies se puede mejorar la capacidad de cambiar o destruir
componentes tóxicos o nocivos que pueden estar presentes en el sustrato.
• El cultivo puede ser mantenido indefinidamente por gente no especializada con un
mínimo de entrenamiento, si las condiciones ambientales pueden ser mantenidas (por
ejemplo, la temperatura, cantidad de sustrato, tiempo de fermentación y tipo de
sustrato), por tanto es fácil mantener un inóculo mixto por largos periodos de tiempo y
llevar a cabo fermentaciones sucesivas con éxito.
7
• Ofrecen mayor protección contra la contaminación. En fermentaciones con cultivo mixto
las infecciones fágicas son pocas. En cultivos puros comerciales de fermentación,
incluidas las bacterias y actinomicetos, invariablemente ocurren infecciones fágicas y
pueden detener por completo la producción. Los cultivos mixtos por otro lado poseen
una amplia base genética de resistencia fágica, las fallas no ocurren frecuentemente, ya
que si una especie es infectada habrá otras especies que serán resistentes que puedan
continuar con la fermentación. En tales procesos, especialmente con una alta
concentración de inóculo inicial la contaminación no ocurre aún cuando las
fermentaciones son llevadas a cabo en contenedores y tanques abiertos.
• Mediante el empleo de cultivos mixtos es posible utilizar sustratos impuros y baratos. En
la práctica algunos productos fermentados siempre se obtienen de sustratos baratos y
estos son frecuentemente una mezcla de diversos materiales.
• Pueden proveer nutrientes necesarios para una mejor elaboración. Algunos
microorganismos como las bacterias del queso, son adecuadas para la producción del
producto fermentado, ya que además de participar en la formación del producto proveen
factores de crecimiento para lograr una óptima velocidad de elaboración, por otro lado el
empleo de vitaminas es costoso y dificulta el proceso. Así la adición de especies
simbióticas que provean factores de crecimiento es definitivamente una ventaja.
• La fermentación mediante el cultivo mixto puede mejorar el nivel de vitaminas en el
producto final, por ejemplo: En el pulque, por cada 100 g de producto tras la
fermentación se incrementa de 5 a 29 mg de tiamina, 54 a 515 mg de niacina y 18 a 33
mg de riboflavina; En el idli de la india (que es un producto de la fermentación ácida de
leguminosas, principalmente de los granos de la judía Vigna mungo), se mejora el
contenido de tiamina y riboflavina.
• El estudio científico de los cultivos mixtos es más difícil, debido a que más de un
microorganismo está involucrado, por ello es usual que los estudios bioquímicos se
lleven a cabo en cultivos con una sola especie y una fuente de carbono simple, con lo
que se tienen menos variables.
8
• En el proceso para patentar es más difícil definir el producto y los microorganismos
empleados.
• La contaminación de una fermentación es más difícil de detectar y controlar.
• Cuando dos o tres cultivos puros son mezclados, es posible que se requiere más tiempo
y espacio, en comparación a un cultivo con una sola especie.
• Uno de los grandes problemas en las fermentaciones con cultivo mixto es el control del
balance de la cantidad de los microorganismos involucrados. Sin embargo, esto puede
ser superado si el comportamiento de los microorganismos es entendido y esta
información es aplicada en el control.
• El balance de los microorganismos trae el problema del almacenamiento y el
mantenimiento de los cultivos. La liofilización presenta dificultades, por que en el
proceso las células de las diferentes especies mueren en diferente proporción, por lo
que el inóculo puede sufrir cambios radicales en su población. Hasta ahora se ha
establecido que el mejor camino para preservar un cultivo mixto es almacenar el liquido
completo en nitrógeno a -180 ºC. El cultivo almacenado para su utilización debe ser
puesto a prueba en una cantidad pequeña de medio y garantizar que el producto con las
características deseadas pueda ser obtenido en el tiempo esperado.
• Llevar a cabo el escalamiento de la producción puede ser bastante difícil, ya que las
condiciones fisicoquímicas en pequeña escala pueden variar considerablemente tras el
escalamiento, lo cual provoca que el metabolismo y subsecuentemente la participación
de las diferentes especies en el proceso de fermentación se vea afectada, como
solución en el caso de algunas salsas fermentadas se emplean un gran número de
fermentadores pequeños, aunque esto implica en general un gasto mayor.
9
microorganismos a diferente velocidad conforme estos van creciendo, por tanto es implícito el
consumo del sustrato y el incremento de la concentración de la biomasa como una función del
tiempo; es necesario hacer énfasis en que en tal situación la composición del medio de cultivo y
la fisiología celular cambian durante el experimento. En contraste, en un sistema de
fermentación continuo la concentración del sustrato y la biomasa son independientes del
tiempo, esto se logra agregando sustrato fresco y removiendo parte del fermentado, permitiendo
que el cultivo crezca en las condiciones pre-establecidas, manteniendo su estado fisiológico. Si
se analiza el crecimiento microbiano en el tiempo en un sistema por lote se observa una típica
curva de crecimiento que puede ser dividida en fases distinguibles (ver figura 1). La curva de
crecimiento puede dividirse en las siguientes fases: fase lag, fase exponencial, fase estacionaria
y fase de muerte, las cuales se describen a continuación (6, 19, 20, 46).
Logaritmo de
organismos
viables por
unidad de
volumen.
Tiempo
Figura 1.- Curva típica del crecimiento microbiano: a) fase lag, b)
fase exponencial, c) fase estacionaria, d) fase de muerte.
a. Fase lag o de retraso: esta es una fase donde las células se adaptan al medio y lo
adecuan para su crecimiento, por lo que éste no principia de inmediato sino después de
un cierto tiempo que puede ser breve o largo dependiendo de las condiciones del medio,
como son los parámetros fisicoquímicos y el estado fisiológico de las células vivas. De
esta manera si se toma una alícuota de un cultivo que crece exponencialmente y se
emplea como inóculo en medio fresco la fase lag no se observa y el crecimiento
exponencial continúa a la misma velocidad. Sin embargo, si el inóculo se toma de un
cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en medio fresco generalmente se presenta la
fase lag, aún cuando las células del inóculo estén vivas. Esto se debe a que las células
generalmente agotan diferentes coenzimas esenciales u otros constituyentes celulares y
10
se requiere de cierto tiempo para su síntesis. La fase lag también se presenta cuando el
inóculo está formado por células dañadas (por tratamiento térmico, radiación o sustancias
químicas), en éste caso este tiempo es necesario para que las células puedan reparar el
daño. También se observa cuando una población se transfiere de un medio de cultivo rico
a uno pobre ya que para que continúe el crecimiento en un medio de cultivo en particular,
es indispensable que las células tengan un complemento íntegro de enzimas para la
síntesis de los metabolitos esenciales que no están presentes en dicho medio.
b. Fase exponencial: una vez alcanzadas las condiciones favorables para el crecimiento
cada célula se divide para formar dos células, cada una de las cuales también se divide
para formar dos células más y así sucesivamente, como consecuencia se observa un
crecimiento exponencial. La velocidad de crecimiento exponencial varía mucho de un
organismo a otro, por ejemplo, Salmonella typhi crece muy rápidamente con un tiempo de
generación de 20 – 30 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis, crece muy
lentamente, con sólo una o dos duplicaciones por día. Aspectos que afectan la velocidad
de crecimiento pueden ser diversos, los que se manipulan habitualmente son la
temperatura y la composición del medio de cultivo. En general las bacterias crecen con
mayor rapidez que los organismos eucariotas y entre éstos últimos, los pequeños se
desarrollan más aprisa que los grandes.
c. Fase estacionaría: El crecimiento exponencial se detiene si los nutrientes indispensables
se agotan y/o la concentración de sustancias tóxicas, producto del metabolismo, presenta
niveles no tolerables por el micro-organismo, como resultado no hay incremento o
decremento en el número de células vivas. En esta fase aunque no hay cambios tan
apreciables como en la fase exponencial los microorganismos son fisiológicamente activos
y viables. De aquí se deduce que en un sistema cerrado no se puede llevar a cabo
indefinidamente el crecimiento exponencial.
d. Fase de muerte: Si la incubación continúa después de que una población alcanza la fase
estacionaria, las células pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo más
probable es que mueran, si esto último sucede la población se encuentra en la fase de
muerte. Durante esta fase la viabilidad disminuye lentamente y en algunos casos, la
muerte se acompaña por lisis celular.
11
Monod que es uno de los mas ampliamente conocidos, este término no se debe confundir con
el de “nutriente limitante” usado en microbiología para describir un fenómeno de crecimiento
diferente. El término “nutriente limitante” se usa en el sentido estequiométrico para indicar que
cierta cantidad de biomasa puede ser producida con cierta cantidad de nutriente, es decir que la
disponibilidad de este nutriente en el medio delimita la densidad de biomasa que puede ser
alcanzada; mientras que el término “nutriente de control de crecimiento”, se usa para indicar
que la velocidad de crecimiento actual en cierto momento durante la fermentación es regida por
la concentración de un sustrato particular en ese mismo instante. Ambos términos han sido
frecuentemente comentados en la bibliografía (42, 52, 53), sin embargo el empleo de estos
modelos y sus términos en un basto número de casos no predice los resultados observados,
debido en principio a que los sustratos usualmente son mixtos, existiendo mas de una fuente de
nutriente de la cual depende el crecimiento microbiano, situación a la cual corresponden los
alimentos tradicionales fermentados (7, 35, 37, 47). Así por ejemplo, existe una gran
inconsistencia en los datos reportados para el modelo de Monod, incluso para un mismo
microorganismo en sustratos específicos (por diferencias que son hasta de dos órdenes de
magnitud) estas diferencias no pueden ser explicadas por el tipo de especie o algunas
deficiencias, pero es muy probable que dependan en gran parte del historial del cultivo, es decir
de como éste ha ido variando en el pasado, de ahí que durante un experimento cinético la
fisiología del cultivo cambie y pueda exhibir las propiedades llamadas “intrínsecas” y las
“extrinsecas”. Los parámetros “intrínsecos” dependen únicamente de la naturaleza del sustrato,
del tipo de cultivo de microorganismos y de las condiciones fisicoquímicas del medio, por lo cual
son independientes del historial del cultivo y son reproducibles. En contraste “los parámetros
extrínsecos” son un reflejo del historial de las células, de las características propias del
microorganismo y de las condiciones presentes en el medio, de aquí que son difíciles de
reproducir. Por ejemplo, cuando se inocula de manera recurrente un sistema continuo puede
observarse que, tras un período de tiempo, hay una disminución en la velocidad máxima de
crecimiento, mientras que en el sistema por lote es posible observar un aumento en la velocidad
máxima de crecimiento, estas dos situaciones son debidas a que los microorganismos se
adaptan a las condiciones a las cuales se ven expuestos (8, 15, 50).
12
3.5 Adaptación a cambios de concentración de nutriente
Por ejemplo, para diversas especies de bacterias se ha observado, que tras el cultivo
durante un largo periodo de tiempo en un sistema continuo, la densidad celular permanece sin
cambio y la concentración del sustrato residual decrece. Un estudio sistemático de este
fenómeno se realizó para el crecimiento de Escherichia coli en un cultivo empleando glucosa
como sustrato limitante, a diferentes velocidades de crecimiento, el experimento mostró que el
proceso de adaptación es reproducible y que procede más rápido cuando se emplean bajas
velocidades de crecimiento (29). El aumento de la capacidad de asimilación de la glucosa
muestra que el proceso es muy complejo, lo cual sugiere que existen cambios en las proteínas
de las membranas, inducidos por genes. La observación anterior particularmente sugiere que
durante el crecimiento en un sistema continuo con bajas concentraciones de glucosa, ésta es
13
absorbida por el sistema de transporte proteico maltosa/lactosa, más que por el sistema de
transporte de glucosa fosfotransferasa, el cual anteriormente había sido considerado el único
transporte relevante de glucosa en Escherichia coli en tales condiciones. Además se ha
observado que los sistemas de transporte de otros azúcares aumentan y se expresan en
concentraciones nanomolares de glucosa, con lo cual aumenta la capacidad de asimilación de
otros carbohidratos (13, 16). El proceso de adaptación de altas a bajas concentraciones de
sustrato y viceversa es reversible, este fenómeno ha sido reportado que sucede con bacterias
aisladas del agua de mar, cuando las bacterias son transferidas a sistemas que tienen altas
cantidades de sustrato, se observa que su capacidad de asimilación del sustrato disminuye.
Resulta por tanto evidente que un microorganismo puede competir exitosamente en diferentes
ambientes si modifica sus propiedades de asimilación de nutrientes, esto sugiere que estas
propiedades no pueden ser constantes como se ha descrito en un gran número de
investigaciones (21). De esta manera cuando se desea emplear microorganismos provenientes
de productos de la fermentación no controlada (como lo son los productos tradicionales
fermentados), no se debe perder de vista que tales microorganismos están siendo colocados en
ambientes diferentes y por ello se deberán tener en cuenta las variaciones resultantes para
ajustar al producto final esperado (4, 33).
14
3.6.1 Utilización de fuentes de carbono mixtas
Las cinéticas tradicionales se llevan a cabo bajo condiciones que permiten a un único
componente ser el responsable de controlar el crecimiento celular. Estas condiciones han sido
investigadas, probadas y confirmadas para cultivos bajo condiciones definidas en un laboratorio,
mediante el empleo de un medio sintético el cual cubre cada requerimiento fisiológico mediante
compuestos simples de alta biodisponibilidad. En contraste a las condiciones establecidas en un
laboratorio, el crecimiento en un ecosistema ocurre bajo condiciones más complejas, donde los
microorganismos tienen contacto con una gran variedad de componentes que pueden satisfacer
cada una de sus necesidades nutricionales (24, 52). En tales condiciones se ha observado un
comportamiento de crecimiento particular llamado “comportamiento diauxico”, en el cual un
microorganismo consume primero el nutriente por el que tiene más afinidad y al comenzar a
agotarse regula la expresión de sus genes y la actividad de enzimas con el objeto de poder
asimilar otro nutriente o nutrientes sustituibles, en una gráfica de crecimiento este
comportamiento se observa como dos fases de crecimiento exponencial (23, 28, 30, 36). El
fenómeno de crecimiento diauxico no sólo es causado por la fuente de carbono
(multicomponente), por ejemplo Streptococcus thermophillus muestra este comportamiento
cuando se cultiva en leche, debido a que el requerimiento de aminoácidos esenciales
(metionina 60 mg/l y ác. glutámico 200mg/l) no es cubierto, la leche tiene un contenido de
metionina y ác. glutámico de <1 y 45 mg/l respectivamente, de este modo S. thermophilus se ve
obligado a modificar aspectos de su metabolismo para asimilar los aminoácidos de la caseína y
cubrir su requerimiento nutricional (22). En las ultimas dos décadas, algunos estudios
publicados por diferentes grupos de investigación, han aportado evidencia de que en
condiciones de baja concentración de sustrato los microorganismos heterotróficos no se
restringen a consumir una sola fuente de nutriente, si no diversas simultáneamente, este es el
caso de Pseudomona aeruginosa, la cual se ha reportado, crece cuando se inocula en un medio
que posee una mezcla de 45 fuentes de carbono, cada una en una concentración de 1 μg por
litro, sin embargo ninguna de estas fuentes de carbono soporta sola el crecimiento microbiano a
esa concentración (57, 60).
15
recientemente demuestran que en presencia de altas concentraciones de sustrato mixto, la
asimilación simultánea de más de una fuente de carbono ocurre en bacterias y levaduras,
independientemente de las condiciones, ya sean aerobias, anaerobias, termofílicas o
mesofílicas. Aún las combinaciones incompatibles de sustrato (por ejemplo galactosa y glucosa
en Escherichia coli), permiten el crecimiento con comportamiento diauxico cuando sus
concentraciones son del orden de miligramos por litro, menores concentraciones promoverán el
consumo de las dos fuentes simultáneamente (1, 49, 57).
16
crecimiento de S. cerevisiae es inhibido por el acetaldehído producido por Z. mobilis
(49).
• Mutualismo: se establece una relación obligatoria de los microorganismos para
sobrevivir y todos se benefician de ella. Un caso de mutualismo se observa entre
Lactobacillus arabinosus y Streptococcus faecali, los cuales producen fenilalanina y
acido fólico respectivamente, aminoácidos necesarios para su crecimiento (17).
• Sinergismo: Dos microorganismos se benefician de su relación pero su asociación no
es obligatoria. El sinergismo puede verse reflejado en su crecimiento o en la producción
de algún metabolito. Este es el caso de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus
bulgaricus, que cuando se cultivan juntos en leche aumentan su producción de ácido en
32% (33).
• Competición: se establece una asociación interactiva entre dos o más especies, las
cuales requieren algunos nutrientes limitados para su crecimiento, de manera que
crecen a velocidades inferiores debido a que comparten el sustrato. Y solo aquellos para
los cuales las condiciones sean más favorables y muestren mejor actividad metabólica
harán un mayor uso del sustrato. Los microorganismos que establecen esta interacción
no son eliminados, y pueden establecer una coexistencia estable (5).
17
II. Métodos basados en tinción diferencial: Es posible sacar conclusiones en relación con
la morfología de un microorganismo examinando una lámina con éstos que ha sido
sometida a un proceso de tinción diferencial. Estos criterios morfológicos encabezan las
primeras etapas del proceso de identificación microbiana. Por ejemplo la mayor parte de
las bacterias, teñidas con la tinción de Gram, las podemos clasificar como gram positivas
o gram negativas, de acuerdo al color final del microorganismo (Violeta-gran positivo ó
Rojo-gram negativo). Existen otras tinciones diferenciales que permiten evidenciar otras
características de los microorganismos, tales como la presencia de esporas, componentes
estructurales de la pared celular, o si éste esta vivo ó muerto.
III. Métodos basados en pruebas bioquímicas: Las pruebas bioquímicas han sido
ampliamente utilizadas para diferenciar microorganismos. Estas pruebas se fundamentan
en la capacidad diferencial que tienen los microorganismos para asimilar determinadas
fuente de carbono, degradar compuestos, producir compuestos coloreados, o bien
manifestar la presencia de enzimas, por citar algunas. Aún microorganismos fuertemente
relacionados pueden separarse en diferentes especies con base a pruebas bioquímicas,
para ello una vez efectuados los ensayos respectivos se emplean flujogramas que poseen
los resultados presuntivos para la identificación de un gran número de microorganismos
que ya han sido estudiados. Se denominan resultados presuntivos debido a que cuando
se elaboran los flujogramas de 100 repeticiones para una prueba, es común que las 100
no sean positivas. Los procedimientos a seguir para la identificación de los
microorganismos por éstos método, se resumen en procedimientos de enriquecimiento,
aislamiento y pruebas bioquímicas para su identificación final. Una limitación de éstos
método de identificación es la aparición de cepas mutantes que puedan dar origen a
cepas con características diferentes.
Las pruebas bioquímicas pueden ser en medio líquido, semisólido o sólido, que
tienen una formulación que permite evaluar alguna o algunas características. Existen
varias metodologías para elaborar las pruebas bioquímicas una de ellas, que en la
actualidad sigue siendo empleada, es la propuesta por Van Der Walt, que esta descrita en
el tratado “The Yeast” de Lodder (1970), y que ha sido empleada en trabajos referentes al
aislamiento e identificación de levaduras de diferentes alimentos tradicionales
fermentados de origen mexicano. Desafortunadamente este método es tedioso, ya que
requiere de un tiempo considerable para la preparación de las pruebas, por otro lado para
18
los casos en que se desea efectuar pruebas o estudios pequeños no repetitivos esta
opción es bastante costosa ya que una sola fuente de carbono puede llegar a costar entre
$ 1000 y $ 1500 M.N., sin mencionar el considerable espacio y cantidad de material que
se requiere. Una opción más versátil es hacer uso de sistemas comerciales miniaturizados
de pruebas bioquímicas. Estos sistemas han sido diseñados para realizar varias pruebas
bioquímicas de manera simultánea y permitir la identificación en un tiempo más corto
empleando menos material y espacio. Cada uno de los ensayos consta de tubos
miniaturizados que contienen el medio de cultivo, el cual se hidrata al ser inoculado con la
suspensión bacteriana pura. Las pruebas se clasifican en grupos en los cuales, a cada
uno de resultados positivos de los ensayos se le asigna un determinado valor numérico,
obteniéndose un código que corresponde a un determinado género o especie en la base
de datos. Existen muchas casas comerciales que producen sistemas miniaturizados para
diferentes tipos de microorganismos y cada casa fabricante tiene su propia presentación,
algoritmos de identificación, manuales, etc. Biomerieux S.A. de C.V. es una empresa que
elabora este tipo de sistemas de identificación, para el caso de levaduras ofrece el
sistema API 20 AUX, el paquete de este sistema incluye 25 galerías y cada galería evalúa
la capacidad de asimilación de 19 fuentes de carbono en un lapso de tres días de
incubación.
IV. Métodos basados en tipificación con fagos: La interacción entre un virus bacteriano
(fago) y su microorganismo sensible es sumamente específica, ya que el proceso de
adsorción se encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la
célula. Para ello a una placa con medio de cultivo sólido, inoculado con un cultivo puro de
un determinado microorganismo, se le añade una alícuota de un fago específico; éste
puede ocasionar la lisis de los microorganismos, hecho que se evidencia en el cultivo
como zonas claras definidas, denominadas placas, que indican que hubo infección y lisis
celular. El uso de fagos específicos permite identificar y subclasificar microorganismos
dentro de una misma especie.
19
agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. La solución que contiene los
anticuerpos se denomina antisuero, el anticuerpo puede ir marcado mediante alguna
sustancia fluorescente.
4 OBJETIVOS
• Llevar a cabo una investigación de campo sobre las diversas materias primas utilizadas
y acerca de los métodos de fermentación empleados para la elaboración de tepache.
• Llevar a cabo un aislamiento de levaduras del tepache e identificarlas de manera
presuntiva mediante el sistema API 20 C AUX de Biomeireux.
• Realizar pruebas de fermentación en cultivo puro de las cepas de levadura aisladas y
en cultivo mixto con Saccharomyces cerevisiae.
20
5 MATERIALES Y MÉTODOS
Identificación de levaduras
(Características fisiológicas,
morfológicas y bioquímicas)
21
5.1.1 Muestreo y transporte de la muestra
Se consideraron los lineamientos descritos en la NOM-109-SSA1-1994. Las muestras
fueron compradas en la presentación más grande disponible. Cuando fue posible se solicitó que
el producto fuera néctar de tepache (fermentado no diluido). En todos los casos, el vendedor
hizo la toma de muestra y retiro el hielo, posteriormente el producto se etiquetó y se introdujo en
una hielera, se transportó al laboratorio y se mantuvo en refrigeración a 4ºC hasta realizar las
determinaciones analíticas previstas (no más de 48 horas).
22
Tabla 1.- Metodología empleada en la determinación de las características morfológicas y
fisiológicas consideradas para el estudio de las levaduras.
B) Micromorfología
1. Características de la reproducción Medio: GELPA Inóculo: asada de un cultivo en medio
sexual o vegetativa. sólido
Incubación: Temperatura ambiente, 5 días
Inóculo: dilución de cultivo líquido. Medio: GELPA-Ácido Tartárico (0.5- 1 -0.9% p/v)
Incubación: Temperatura ambiente, 10 días.
23
5.1.6 Aislamiento y conservación de las levaduras
El aislamiento de las levaduras para cada una de las muestras de tepache se llevó a
cabo mediante el uso de la técnica de sembrado por extensión con varilla y estría múltiple en
medio papa dextrosa agar (PDA). De las diferentes siembras realizadas se observaron las
diversas morfologías de levaduras y se seleccionaron de cada morfología 10 colonias las
cuales, para su mantenimiento, se resembraron en medio PDA en tubo inclinado. Las cepas
puras así obtenidas se resembraron en medio PDA por estría simple con el fin de obtener un
cultivo joven para ser observado en fresco y mediante la tinción de Gram, utilizando un
microscopio a 100X. A partir de estas observaciones se seleccionaron cinco cepas con
morfología similar y se sembraron en tubo inclinado para análisis posteriores. Todos los cultivos
se hicieron por duplicado y se conservaron en refrigeración a 4 ºC.
24
5.2.2 Determinación de cenizas
La muestra que resultó de la determinación de peso seco se colocó dentro de una mufla
(Raypa HM-9) a 600 ºC por 3 horas, transcurrido este tiempo se disminuyó la temperatura a 100
ºC para sacar la muestra y colocarla posteriormente en un desecador por 30 minutos,
finalmente se pesó y registró este valor.
5.2.5 Medición de pH
En un vaso de precipitados de 50 ml se vaciaron 25 ml del sobrenadante de una muestra
centrifugada (Internacional Centrifuge 1S) durante 30 minutos a 3500 revoluciones por minuto
(rpm), posteriormente el electrodo del potenciómetro (Corning ion meter 450) se colocó dentro
de la muestra en agitación y una vez alcanzado el equilibrio se registró el valor de pH. El
potenciómetro se calibró utilizando los buffers de referencia de pH 4, 7 y 10.
gr
100ml 0.05N Gastoenlitros 60
molácidoacéico
% deácidoacético=
25ml
25
5.2.7 Determinación de azúcares reductores directos
Se colocaron en un tubo de ensaye 0,5 ml de muestra con una concentración de entre
0,1-1,0 g de glucosa por litro, a cada tubo se le agregaron 0,5 ml de DNS (solución de ácido 3-
5-dinitrosalicílico). Los tubos se colocaron en un baño a ebullición durante cinco minutos,
depuse se enfriaron en un baño con agua a 4ºC, se homogenizaron con la adición 5 ml de agua
destilada y se registraron las lecturas de absorbancia obtenidas mediante un espectrofotómetro
(Globe C5-200PC) a 540 nm. Para realizar la curva tipo se empleó una solución de glucosa de
1,0 g/l, de la cual se hicieron diluciones para obtener diez puntos de referencia de muestras que
tuvieran concentraciones entre 0,1 g y 1,0 g/l (13).
26
5.3.3 Muestreo durante la fermentación
FERMENTADOR
Dilución y
Sembrado en placa
Método
DNS
CARBOHIDRATOS
-1 -2 -3 -4
REDUCTORES
10 10 10 10 1 ml 40 ml
Centrifugación
3500 rpm, 30
min.
SÓLIDOS
DETERMINACIÓN DISUELTOS 1.2 ml/ tubo
DE
ACIDEZ
MEDICIÓN
DE
25 ml de PH Centrifugación 0.6 ml/ tubo
muestra 13000 rpm, 15 min.
1 ml / tubo
27
Las pruebas de fermentación tuvieron una duración de 8 días, para el caso de las
pruebas de fermentación en cultivo mixto entre las levaduras Saccharomyces cerevisiae con
Rhodotorula mucilaginosa y Saccharomyces cerevisiae con Candida guilliermondii, se tomo
una muestra diaria del primero al quito día y una al final de la prueba. En el caso de las pruebas
de fermentación de los cultivos puros, se llevaron a cabo de la misma manera que los cultivos
mixtos sólo que se hizo un muestreo adicional de la biomasa los días 1, 2, 6 y 7.
28
Tabla 3.- Diseño experimental LVB-LVR
Prueba de LVB UFC/ml Proporción
LVR UFC/ml
fermentación UFC/ml Totales LVR LVB
2 5 5
10 1,25x10 2,25x10 2,25x10 18022500 1
11 1,88x101 1,13x105 1,13x105 600750 1
12 7,57x100 9,37x103 9,37x103 1237 1
13 1,14x102 9,37x103 9,48x103 82 1
14 5,70x103 1,50x103 7,20x103 1 4
15 5,70x103 1,00x102 5,80x103 1 57
Para realizar los conteos de UFC de las pruebas en cultivo mixto se emplearon para
cada diseño dos medios de cultivo en cada uno de los cuales creció solo una de las levaduras
de las dos implicadas, esto con el propósito de que no hubiera interferencia en los conteos
individuales de las levaduras. En el diseño experimental LVB – LVC se empleo los medios
SELPA (Sorbitol extracto de carne levadura peptona agar) para el conteo de LVC y GELPA
(Glucosa extracto de carne levadura peptona agar) con NaCl al 5% p/v para el conteo de LVB,
en el caso del diseño experimental LVB – LVR se empleo los medios SELPA para el conteo de
LVC y GELPA con ácido tartárico al 0.9% p/v para el conteo de LVB.
29
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El muestreo de las bebidas de tepache se llevó a cabo en algunos mercados del Distrito
Federal, Estado de México e Hidalgo, las muestras colectadas fueron degustadas con el
objetivo de seleccionar aquellas que fueron producto de la fermentación y no de una
formulación con ácido acético. Se colectaron 13 muestras de las cuales se seleccionaron 5,
estas se etiquetaron como: M1, M2, M3, M4 y M5. El origen de las muestras objeto del presente
estudio se presenta en la tabla 4.
30
densidad de levadura suspendida del orden de 4x105 UFC/ml. Se observa también una gran
variabilidad entre los diferentes parámetros medidos de las diferentes muestras, lo cual era de
esperarse en virtud de la diversidad de materias primas y procedimientos de preparación de
esta bebida. La amplia diferencia en el peso seco de las muestras (entre 9,6% a 16,5%) se
atribuye a la proporción de edulcorante empleado en la bebida, lo cual se ve corroborado por la
determinación de sólidos disueltos (por refractometría). La diferencia en el contenido de cenizas
entre las muestras M1 y M5 (néctares) se debe posiblemente a la diferencia en fuentes de
carbono empleados en cada caso para la elaboración de la bebida.
M1 20 7 0
M2 20 60 20
M3 20 0 300
M4 20 3 2
M5 20 55 0
**Ver anexo 1, figura 4 y 5
Los aislamientos realizados a las cinco muestras dieron por resultado, para el caso de
levaduras, tres morfologías bien diferenciadas, etiquetadas como R1, R2 y R3. Una de ellas
(R1), concordó con la morfología descrita para Saccharomyces cerevisiae, otra correspondió a
colonias mate de color café y elevación plana (R2) y la última a colonias semi-brillantes de color
rosa-coral (R3). Los conteos por extensión con varilla realizados a las muestras mostraron
aspectos interesantes referentes las proporciones de las diversas macromorfologías de
levaduras antes mencionadas (ver tabla 6). Las muestras M2 y M5 presentaron, por ejemplo, 60
y 55 UFC de R2, respectivamente, por cada 20 UFC/ml de R1, en contraste con 7 y 3 UFC/ml
para M1 y M4 y más aun con M3 en la cual no se observó la presencia de R2. Las levaduras
con morfología R3 solo estuvieron presentes en tres de las muestras y su proporción respecto
a R1 fue bastante amplia al igual que para R2. Es pertinente aclarar que estos valores solo son
cualitativos y no cuantitativos en virtud de que las diferentes morfologías no se encontraron en
31
todos los casos dentro del rango recomendado en las Normas Oficiales Mexicanas para ser
cuantificadas y que para tal objetivo sería mejor emplear medios selectivos que evitaran
interferencias en el crecimiento de unas levaduras con otras, o bien determinar la densidad de
las poblaciones individuales mediante el empleo de citometría de flujo y sondas de 16S RNA,
que permiten mediciones precisas y rápidas (36, 44).
Micromorfología
32
6.4 Identificación presuntiva de levaduras del tepache
33
especies han sido frecuentemente confundidas. En este trabajo se tomó como criterio para
reportar a LVC como Candida guilliermondii, con base a que Candida famata tiene 100% en la
asimilación de D-sorbitol, en el cual LVC dio negativo.
34
Los resultados de asimilación esperados del sistema API 20C AUX, para las diferentes
especies estudiadas, no concuerdan en todos los casos con los obtenidos siguiendo los
métodos propuestos por Van Der Walt, los cuales están descritos en el tratado “The Yeast” de
Lodder (1970) y empleados en la bibliografía consultada referente al aislamiento e identificación
de levaduras del tepache. Esto se debe en general a las diferencias entre la formulación de los
medios y las técnicas empleadas, por ejemplo el porcentaje de carbohidratos presente en el
sistema API es de 0.5% y en el de Van Der Walt 5%, por otro lado las fuentes de nitrógeno,
vitaminas, minerales y el sistema de incubación empleado difieren entre ellos. Además de lo
mencionado, la variabilidad en la asimilación de un carbohidrato se ve influenciada por las
condiciones a las que se somete usualmente a los microorganismos, por ejemplo cuando se
cultivan continuamente durante un largo periodo en concentraciones abundantes de una
determinada fuente de carbono aumenta la posibilidad de que el microorganismo disminuya su
capacidad de consumir el sustrato, con lo cual aumenta el tiempo necesario para poder
asimilarlo e incluso pierda su capacidad de asimilación de otra fuente de carbohidrato a la que
usualmente no se ve expuesto (30).
35
todo el intervalo de concentraciones de ácido empleadas, esto de manifiesto su adaptación al
medio ácido, que es una característica del tepache.
Tabla 9.- Crecimiento en medio sólido de alta presión osmótica, características fisiológicas y
bioquímicas de las levaduras estudiadas.
Extensión con varilla -crecimiento en medio GELPA-NaCl
Tabla 10.- Crecimiento en medio sólido de alta acidez, características fisiológicas y bioquímicas
de las levaduras estudiadas.
Crecimiento en medio de cultivo de alta acidez (GELPA - ácido tartárico)
% Ácido tartárico LVR LVC LVB
0.14* + + +
0.21* + + +
0.28* + + +
0.35* +(d) + +
0.42* +(d) + +
0.5 + + +
0.6 + + +
0.7 +(d) + +
0.8 +(dd) + +
0.9 - + +
**Ver anexo 1, figura 13, 14 y 15
d: débil dd: muy débil
36
Tabla 11.- Densidad de biomasa en medio líquido (GELP) de LVR, LVC, LVB.
En la tabla 11 se presentan los resultados del cultivo en medio líquido GELP. Se puede
observar que LVC y LVR alcanzaron una densidad de biomasa 15 y 16 veces menor a la de
LVB (columna 5), lo cual, complementado con las otras determinaciones indirectas para
medición de biomasa, sirvieron de base en el planteamiento de los conjuntos experimentales de
las pruebas de fermentación.
37
1E+08 1,4E+07
1E+08 1,2E+07
1,0E+07
Biomasa (UFC/ml) .
.
8E+07
Biomasa (UFC/ml)
8,0E+06
LVB
6E+07
LVC
6,0E+06 LVC
LVR
LVR
4E+07
4,0E+06
2E+07 2,0E+06
0E+00 0,0E+00
0 50 100 150 0 50 100 150
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 16.- Biomasa vs tiempo; LVB, LVC, LVR. Figura 17.- Biomasa vs tiempo; LVC, LVR.
19
17
15
13
LN(UFC/ml).
11 3
LVB
LVC
9
LVR
2
Primeras tres
7
lecturas
5 1
realizadas
3
0 50 100 150
Tiempo (h)
Figura 18.- LN(Biomasa) vs tiempo; LVB, LVC, LVR
38
LVC tienen una densidad, en UFC/ml, 12 y 8 veces menor, respectivamente, en el conteo
realizado al final de la prueba de fermentación (ver tabla 12 anexo 2). El comportamiento del
crecimiento de LVR presenta un punto de inflexión adicional al esperado (ver figura 17),
indicando un posible comportamiento diauxico, este no se apreció la figura 18, de hecho el
comportamiento de la velocidad de crecimiento de LVB fue parecido al de LVR, con la diferencia
de que LVR no alcanzó la fase estacionaria durante el tiempo de muestreo y la fase de
adaptación tuvo más duración, esto se aprecia con un aumento en la pendiente del segundo al
tercer punto de muestreo. En la figura 17 se observa que LVC tiene un crecimiento lento y a
diferencia de LVB, duplica su densidad de biomasa en las últimas 53 h de la prueba de
fermentación, mientras que LVR tan solo aumenta en este tiempo 16% su densidad de
biomasa. En la figura 18 se puede apreciar que LVC tiene el tiempo de adaptación más grande,
mostrando un aumento en la pendiente del segundo al tercer muestreo, en la misma figura se
puede observar que tras las primeras 50 h de fermentación la velocidad de crecimiento de LVC
se reduce de manera significativa aún con ello se mantiene en el mismo orden de magnitud, la
cual sufre una disminución notoria a partir de las 136 h, en las siguientes horas el cultivo no
alcanzó a la fase estacionaria.
0,250 5,60
5,40
0,200
Acidez (% de ácido acético) .
5,20
5,00
0,150
LVB 4,80
pH
LVC
4,60
0,100 LVR
LVB
4,40 LVC
4,20 LVR
0,050
4,00
0,000 3,80
0 50 100 150 0 50 100 150
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 19.- Acidez vs tiempo; LVB, LVC, LVR. Figura 20.- pH vs tiempo; LVB, LVC, LVR.
39
El aumento de la acidez en la prueba de fermentación de LVB (figura 19), muestra a
manera poco aproximada que durante las primeras 21 h (ver tabla 12, anexo 2), la producción
de acidez es baja (5.4x10-3 g/100 ml) y que en las siguientes 28 h se generó el 42,6% de la
acidez total (70x10-3 g/100ml), después de este tiempo la velocidad de producción de acidez
disminuye en un 78,5%, de manera tal que al finalizar la prueba se han producido 166.2 x10-3
g/100ml, en contraste LVC y LVR tan solo producen 19.8x10-3 y 35.4x10-3 g/100ml de acidez
respectivamente. Estos comportamientos se ven corroborados con los cambios en pH,
mostrados en la figura 20, los cuales presentan similitudes con los de la acidez, con algunas
desviaciones debidas al amortiguamiento de las diferentes sustancias que también se están
metabolizando. El pH para las pruebas de fermentación de LVB, LVR y LVC al final del proceso
de fermentación fue 3,95, 4,849 y 4,904, respectivamente.
16
15
,
Sólidos disueltos (% p/p)
14
LVB
13 LVC
LVR
12
11
10
8
0 50 Tiempo (h) 100 150
40
La figura 22 muestra, por otra parte, la evolución de los “carbohidratos reductores”
(CHR) durante el proceso de fermentación. En el caso de LVB la concentración de CHR
aumentó 2,7 g/l en 21 h de fermentación, llegando a una concentración de 29 g/l, en las
siguientes 75 h el comportamiento de esta variable fue ascendente alcanzando a las 96 h una
concentración de 132,2 g/l. Los valores de las pendientes obtenidas en las tres mediciones
realizadas durante este intervalo de tiempo fueron en orden sucesivo 1,29; 1,36; y 1,50 g/lh,
esta inversión de la sacarosa fue favorecida por el aumento de acidez que también tuvo un gran
aumento en este intervalo de tiempo (ver figura 19). En la medición realizada a las 170,2 h la
concentración de CHR disminuyó a 69,0 g/l, lo cual indica el consumo de los monosacáridos
(los cuales son en este caso reductores). En la prueba de fermentación de LVC (figura 23), los
CHR permanecieron prácticamente sin cambio hasta las 75,8 h, en las posteriores mediciones
efectuadas se observó un incremento, alcanzando al final de la prueba una concentración de
31,48g/l, en comparación con LVB el valor final fue 2,2 veces menor. El comportamiento de la
concentración de los CHR en la prueba de LVR presentó entre las 25 y 90 h un comportamiento
que al parecer está relacionado con el exhibido en la evolución de la biomasa (comportamiento
diauxico) mostrado en la figura 17, al finalizar la prueba la concentración de CHR fue 31.7 g/l
valor cercano al obtenido para LVC.
140 34
LVB
120 LVC 32
LVR
100 30
.
.
Glucosa (g/l)
80 28
Glucosa (g/l )
60 26
LVC
LVR
40 24
20
22
0
20
0 50 100 150
Tiempo (h) 0 50 100 150
Tiempo (h)
Figura 22.- Carbohidratos Reductores vs tiempo;
Figura 23.- Carbohidratos Reductores vs tiempo;
LVB, LVC, LVR.
LVC, LVR.
41
6.5.2 Pruebas de fermentación en cultivo mixto LVB-LVC
Los resultados de las pruebas de fermentación en cultivo mixto de LVB con LVC se
muestran en la tabla 13 anexo 2 y en las figuras 24-31. En la figura 24 se muestra la evolución
de biomasa del cultivo mixto de LVB con LVC, si se compara el comportamiento del crecimiento
de LVB en cultivo puro con el cultivo mixto para la misma proporción de inóculo inicial de LVB
(tabla 12, PF1 vs tabla 13 PF6), se observa que el comportamiento de esta variable y la
densidad final de biomasa son parecidas, en el caso de LVB en cultivo puro la biomasa final es
1,04x108 UFC/ml, mientras que en cultivo mixto es de 1,14x108 UFC/ml. En la figura 25 se
observa que con el aumento del inóculo inicial de LVB se disminuye el tiempo en llegar a la fase
estacionaria, de esta manera a esta levadura, en la prueba PF8, le toma 44 h alcanzar una
densidad de 1.03x108 UFC/ml, y en la prueba PF4 le toma más de 94,3 h (ver tabla 13 anexo
2), en la misma figura se observa que la fase de adaptación tuvo más duración conforme
disminuyó la proporción de inóculo inicial, por ejemplo comparando el aumento en la pendiente
entre el segmento trazado por el segundo y tercer punto de muestreo, se encontró que en la
prueba PF4 la pendiente aumenta 2,86 veces su valor mientras que en la prueba PF7 es 1,54
veces. Estos resultados indican que LVC no tiene influencia significativa sobre LVB.
42
máximo este disminuye a medida que aumenta la concentración de biomasa de LVB. Se puede
entonces inferir que el metabolismo de LVB produce cambios en las condiciones del medio, ya
que el valor más alto de biomasa de LVC se obtuvo en la prueba que empleó la menor cantidad
de inóculo inicial de LVB (prueba PF4). El mismo comportamiento se puede ver, aunque con
menor claridad, en la figura 27 que muestra la misma variable en escala del logaritmo natural.
43
Figura 27.- Evolución de la biomasa de LVC escala Ln – “conjunto experimental LVB vs
LVC”
44
más evidente en las pruebas de fermentación PF4 y PF8. En la figura 29 se observa que el pH
sigue una evolución similar al de la acidez, con algunas desviaciones debidas a otras
sustancias que también se están metabolizando, como ya se ha mencionado anteriormente.
45
carbohidratos. Se observa en general que cuando se tiene una mayor proporción de LVB en el
inóculo inicial la disminución en la CSD es más grande, específicamente durante las primeras
70 h, donde la CSD final es, para las pruebas PF4 y PF8, de 9,80 y 8,95%, respectivamente
(ver tabla 13 anexo 2). La evolución correspondiente para los carbohidratos reductores (CHR) a
través de la prueba de fermentación se muestra en la figura 31. En esta figura se observa que el
comportamiento de esta variable es similar al del cultivo puro correspondiente para todas las
pruebas de fermentación realizadas en este conjunto de experimentos, el máximo en esta
variable se alcanzó en un tiempo menor cuando se empleó mayor inóculo inicial de LVB. Al
igual que para la acidez, el comportamiento en la CSD y de los CHR está relacionado con el
crecimiento de la población de LVB.
Glucosa
(g/litro)
46
6.5.3 Pruebas de fermentación en cultivo mixto LVB-LVR
Los resultados de las pruebas de fermentación en cultivo mixto de LVB con LVR, se
muestran en la tabla 14 anexo 2 y en las figuras 32-38. En los siguientes párrafos se comparan
a la vez los resultados obtenidos de las variables medidas durante el proceso de fermentación
para el conjunto experimental 1 (LVB-LVC) y el conjunto experimental 2 (LVB-LVR).
47
´
48
La evolución del pH se muestra en la figura 35, esta variable en general tuvo una
evolución similar al de la acidez, como ya se ha mencionado anteriormente.
Al igual que en el cultivo mixto de LVC con LVB, LVR creció hasta alcanzar un máximo y
después inició su fase de muerte (ver figura 36). En cultivo mixto con LVB, LVR alcanzó una
mayor población en su máximo que LVC y presentó la mayor proporción de reducción de su
49
población. Comparando para el caso de PF13 y PF6, LVR a las 43,8 h tuvo 5,06x105 UFC/ml y
al finalizar la prueba sus UFC/ml disminuyeron a 4,05x104, esto es una reducción del 92% de la
población, en tanto que LVC a las 70,5 h alcanzó 2,77x105 UFC/ml y al finalizar la prueba
3,38x104, en otras palabras una disminución del 87,8% de la población.
La concentración de los CHR del conjunto de experimentos 2 (ver figura 37) difirió del
conjunto de experimentos 1 (ver figura 31), en que después de alcanzar la máxima
concentración de CHR solo en las pruebas PF14 y PF15 hubo una disminución de los CHR
hacia el final de la prueba, comportamiento que se observó en todos los experimentos del
conjunto 1, al igual que en la prueba de fermentación en cultivo puro de LVB, en el caso del
resto de las pruebas de fermentación del conjunto 2 (PF10, 11, 12 y 13) la concentración de
CHR aumentó posiblemente debido a que en estas pruebas LVR se encuentra en mayor
proporción respecto a LVB en el inóculo inicial, de manera que LVR interfiere de alguna forma,
no sucediendo igual con PF14 y PF15 en las cuales LVR está en una proporción
considerablemente menor a LVB.
50
En el conjunto experimentos de LVB-LVR, el comportamiento de la acidez y la
concentración tanto de CHR y CSD estuvo correlacionado con el crecimiento de la población
de LVB de forma similar al conjunto de experimentos LVB-LVC. En específico en el caso de la
concentración de sólidos disueltos del conjunto de experimentos 2 (ver figura 38), se observó la
disminución de la CSD conforme creció la población de levaduras.
51
7 CONCLUSIONES
52
8 PERSPECTIVAS
En una etapa posterior se recomienda que, una vez llevada a cabo la identificación de
los microorganismos de interés, estos se siembren sucesivamente en el sustrato en el cual se
llevara a cabo el estudio al menos por cinco ocasiones, con el objeto de alcanzar una
estabilidad en sus parámetros cinéticos y de esta manera los resultados obtenidos sean
reproducibles. También se sugiere emplear sustratos mixtos que presenten mejor
biodisponibilidad y de los cuales se posea más información, por ejemplo, una mezcla de
peptona, sacarosa y glucosa en proporciones similares a los sustratos que frecuentemente son
empleados en la elaboración de tepache, en lugar por ejemplo de piloncillo o zumo de fruta
endulzado ya que pueden contener cantidades variables tanto de sustancias nocivas como
nutrimentos para el crecimiento celular lo cual pueden eventualmente llevar a la obtención de
datos no significativos. Finalmente se recomienda el uso de técnicas de cuantificación más
exactas y específicas como la cromatografía de líquidos de alta resolución y de gases, para la
cuantificación de carbohidratos y ácidos orgánicos respectivamente. Por último se sugiere
llevar a cabo pruebas similares en otro conjunto más amplio de microorganismos (bacterias) a
fin de poder abordar la problemática de formular un inóculo con las características deseables
para una bebida tipo tepache, respaldada por las pruebas sensoriales correspondientes.
53
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56
ANEXO 1
57
A) B)
C) D)
E) F)
Figura 4.- Sembrado por extensión con varilla en medio PDA y AMS de
diferentes muestras de tepache; A) Zocalo, PDA; B) Zocalo, AMS; C)Hidalgo,
PDA ; D) Hidalgo, AMS; E) Huehuetoca, PDA; Huehuetoca, AMS.
58
G) H)
I) J)
Figura 5.- Sembrado por extensión con varilla en medio PDA y AMS de
diferentes muestras de tepache; A) Tecamac, PDA; B) Tecamac, AMS;
C)Tulpetlac, PDA ; D) Tulpetlac, AMS.
59
LVB LVC LVR
60
A1) A2)
B1) B2)
C1) C2)
Figura 7.- Aislamiento de unidades viables de levadura por estría
cruzada en medio PDA.
A1:A2) LVB
B1:B2) LVC
C1:C2) LVR
61
LVR
LVB
LVC
62
So_C) So_R) So_B)
63
Ga_C ) Ga_R ) Ga_B )
64
1% NaCl 2% NaCl 3% NaCl
65
3% NaCl 6% NaCl
R R
3% NaCl 6% NaCl
C C
3% NaCl 6% NaCl
B B
66
0.14% ác. tartárico 0.14% ác. tartárico 0.14% ác. tartárico
C R B
67
0.35% ác. tartárico 0.35% ác. tartárico 0.35% ác. tartárico
C R B
68
0.6% ác. tartárico 0.6% ác. tartárico 0.9% ác. tartárico
R C C
69
ANEXO 2
70
Tabla 12.- Datos del seguimiento de la fermentación de cultivos puros de levaduras.
Levadura: % de CHR
Tiempo Sólidos LN
Prueba de Ácido pH Reductor (UFC/ml)
(h) (%p/p) (UFC/ml)
fermentación acético es (g/l)
0,0 0,0282 5,330 16,0 26,35 9,11E+01 4,512
7,1 -- -- -- -- 2,16E+04 9,980
21,0 0,0336 5,220 15,7 29,10 3,54E+06 15,081
32,7 -- -- -- -- 3,22E+07 17,287
49,8 0,1044 4,329 14,5 66,40 6,30E+07 17,959
LVB : PF1
75,8 0,1182 4,153 13,2 101,84 9,42E+07 18,361
96,0 0,1272 4,100 12,6 132,26 1,00E+08 18,423
120,6 -- -- -- -- 1,03E+08 18,446
146,6 -- -- -- -- 1,01E+08 18,431
170,2 0,1944 3,952 10,3 69,04 1,04E+08 18,460
0,0 0,0276 5,330 16,0 26,45 2,08E+03 7,642
7,1 -- -- -- -- 3,15E+03 8,055
21,0 0,0282 5,367 16,0 26,72 2,13E+05 12,267
32,7 -- -- -- -- 8,17E+05 13,613
49,8 0,0288 5,237 16,0 26,72 1,22E+06 14,010
LVC : PF2
75,8 0,0324 5,186 16,0 26,72 2,33E+06 14,661
96,0 0,0354 5,143 16,1 27,78 3,39E+06 15,037
122,1 -- -- -- -- 5,57E+06 15,533
135,6 -- -- -- - 8,61E+06 15,968
172,8 0,0474 4,904 16,3 31,48 1,30E+07 16,381
0,0 0,0252 5,330 16,0 26,19 1,02E+03 6,928
7,1 -- -- -- -- 4,73E+03 8,461
20,9 0,0276 5,267 16,0 28,57 7,66E+05 13,549
32,7 -- -- -- -- 2,89E+06 14,875
49,8 0,0276 5,265 16,0 26,98 3,29E+06 15,007
LVR : PF3
75,7 0,0294 5,232 16,0 23,81 4,00E+06 15,202
96,2 0,033 5,209 16,1 29,89 5,87E+06 15,586
120,9 -- -- -- -- 7,19E+06 15,788
136,4 -- -- -- -- 7,70E+06 15,856
172,7 0,0606 4,849 16,4 31,74 8,56E+06 15,962
CHR: Carbohidratos reductores
UFC: unidades formadoras de colonias
71
Tabla 13.- Datos del seguimiento de la fermentación del conjunto experimental LVB vs LVC.
% de Sólidos CHR
Prueba Tiempo LVB LN LVC LN
ácido pH Disueltos Reductores
ferm. (h) (UFC/ml) (LVB) (UFC/ml) (LVC)
acético (% p/p) (g/l)
72
Tabla 14.- Datos del seguimiento de la fermentación del conjunto experimental LVB vs LVR.
% de Sólidos CHR
Prueba LVB LN LVC LN
Tiempo (h) ácido pH Disueltos Reductores
ferm. (UFC/ml) (LVB) (UFC/ml) (LVC)
acético (% p/p) (g/l)
73