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Gestión e investigación de residuos http://wmr.sagepub.com/

Dinámica de las comunidades bacterianas indígenas asociadas a la degradación del petróleo crudo en el suelo
microcosmos durante la biorremediación mejorada con nutrientes
Chioma B Chikere, Karen Surridge, Gideon C Okpokwasili y Thomas E Cloete
Residuos de gestión 2012 30: 225 publicado originalmente en línea el 8 de agosto de 2011
DOI: 10.1177 / 0734242X11410114

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Artículo de revisión

Gestión e investigación de residuos30

(3) 225–236

Dinámica de las comunidades bacterianas indígenas - Autor (es) 2012 Reimpresiones y

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asociadas con la degradación del petróleo crudo en 0734242X11410114 wmr.sagepub.com

los microcosmos del suelo durante la

biorremediación mejorada con nutrientes

Chioma B Chikere1, Karen Surridge2, Gideon C Okpokwasili1 y

Thomas E Cloete3

Abstracto
Se examinó la dinámica de la población bacteriana durante la biorremediación de un suelo africano contaminado con petróleo crudo ligero árabe y
enriquecimiento de nutrientes (bioestimulación). Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa seguida de electroforesis en gel en gradiente
desnaturalizante (DGGE) para generar huellas dactilares de la comunidad bacteriana de los diferentes tratamientos empleando el gen del ácido
ribonucleico ribosómico (rRNA) 16S como marcador molecular. Los patrones de DGGE de los suelos modificados con nutrientes indicaron la presencia de
bandas distinguibles correspondientes a los suelos enriquecidos con nutrientes y contaminados con aceite, que no estaban presentes en los suelos de
control prístinos y contaminados con aceite. La caracterización adicional de las bandas DGGE dominantes después de la escisión, reamplificación y
secuenciación reveló queCorynebacterium spp., Dietzia spp., Rhodococcus erythropolis sp., Nocardioidessp., Baja GþC (guanina más citosina) Los clones
bacterianos grampositivos y varios clones bacterianos no cultivados fueron los grupos bacterianos dominantes después de la bioestimulación.
ProminenteCorynebacterium sp. La secuencia de IC10 se detectó en todos los suelos modificados con nutrientes, pero no en el suelo de control
contaminado con aceite. Los recuentos bacterianos heterótrofos totales y que utilizan hidrocarburos aumentaron significativamente en los suelos
modificados con nutrientes 2 semanas después de la contaminación, mientras que los suelos de control prístinos y contaminados con aceite se
mantuvieron bastante estables durante todo el período experimental. El análisis cromatográfico de gases de los hidrocarburos residuales en suelos
bioestimulados mostró una marcada atenuación de los contaminantes a partir de la segunda a la sexta semana después de la contaminación, mientras
que no se observó una reducción significativa en los picos de hidrocarburos en el suelo de control contaminado con petróleo durante el período
experimental de 6 semanas. Los resultados obtenidos indicaron que la enmienda de nutrientes del suelo contaminado con aceite seleccionó y enriqueció
las comunidades bacterianas principalmente del grupo filogenético Actinobacteria capaces de sobrevivir en la contaminación tóxica con la
biodegradación concomitante de los hidrocarburos. Por lo tanto, el presente estudio demostró que el suelo investigado alberga poblaciones de bacterias
que degradan los hidrocarburos y que pueden bioestimularse para lograr una biorremediación eficaz de suelos contaminados con petróleo.

Palabras clave
Biorremediación, bioestimulación, degradación de hidrocarburos, ARNr 16S, reacción en cadena de la polimerasa, electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante

Fecha de recepción: 10 de julio de 2010; aceptado: 15 de abril de 2011

Introducción 1Departamento de Microbiología, Universidad de Port-Harcourt, PMB 5323,

Port Harcourt, Estado de Rivers, Nigeria
La contaminación por petróleo crudo se considera uno de los principales 2Departamento de Producción Vegetal y Ciencias del Suelo, Universidad de
Pretoria, Pretoria, República de Sudáfrica
problemas ambientales que enfrentan los países productores de petróleo
3Departamento de Microbiología, Universidad de Stellenbosch, Stellenbosch,
del mundo, incluida Nigeria (Ayotamuno et al., 2006; Chikere, 2010; Chikere República de Sudáfrica
y Chijioke-Osuji, 2006; Chikere et al., 2008, 2009a, b). Los detalles de la
Autor correspondiente:
contaminación real del ecosistema terrestre por petróleo en Nigeria son
Chioma B Chikere, Departamento de Microbiología, Universidad de Port-
difíciles de cuantificar porque la mayoría de los derrames de petróleo se Harcourt, PMB 5323, Port Harcourt, Estado de Rivers, Nigeria
deben a causas antropogénicas como Correo electrónico: ujuazed@yahoo.com

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226
vandalismo en oleoductos (Nweke y Okpokwasili, 2004). Las tierras
contaminadas con petróleo crudo son costosas de reparar mediante
métodos fisicoquímicos; por ejemplo, en los EE. UU. se espera que el costo
supere el billón de dólares estadounidenses por año (Stroud et al., 2007).
La biorremediación se ha establecido como una estrategia
rentable para la remediación de contaminantes de hidrocarburos
de petróleo en el suelo. El proceso está mediado principalmente
por microorganismos ubicuos en el suelo. Existe una gran
cantidad de literatura sobre el tema de la degradación del aceite
por bacterias y ahora se acepta generalmente que ninguna
especie de bacteria degradará por completo ningún aceite en
particular (Cappello et al., 2007; Hamamura et al., 2006;
Higashioka et al. ., 2009; Macnaughton et al., 1999; Mahmoud et
al., 2009; Maila et al., 2006; Montiel et al., 2009; Quatrini et al.,
2008; Rodrigues et al., 2009; Ruberto et al. , 2009; Wolicka et al.,
2009). La degradación del petróleo crudo en el suelo involucra a
un consorcio de bacterias, por esta razón, La evaluación de la
estructura de la comunidad microbiana del suelo (la abundancia
relativa de poblaciones dentro de la comunidad) y la función (los
procesos clave impulsados por dichas poblaciones en el suelo
contaminado) a través del análisis de las moléculas de ADN
extraídas de las matrices del suelo son de suma importancia para
comprender mejor los cambios bioquímicos que ocurren durante
la degradación del petróleo crudo (Malik et al., 2008; Morales y
Holben, 2011; Rajendhran y Gunasekaran, 2011; Simon y Daniel,
2011; Van Elsas et al., 2007). Los cambios en el contenido de
hidrocarburos en los suelos durante la biorremediación dieron
como resultado cambios característicos en las poblaciones
microbianas y la abundancia de bacterias que utilizan
hidrocarburos (Hamamura et al., 2006; Kaplan y Kitts, 2004; Lal et
al., 2010; Maila et al., 2006). ; Ruberto et al., 2009).
Los objetivos de este estudio fueron determinar si la contaminación
por aceite por sí sola enriquece poblaciones bacterianas específicas y
monitorear la comunidad microbiana después de la bioestimulación
mediante enmienda de nutrientes al suelo contaminado con aceite. Se
investigó la dinámica poblacional de las comunidades bacterianas
indígenas que responden a la contaminación por petróleo crudo en un
suelo de textura arcillosa arenosa después de la bioestimulación con
fuentes de nutrientes orgánicos e inorgánicos. Se utilizaron técnicas
independientes y dependientes del cultivo para monitorear los cambios en
la dinámica y estructura bacteriana a lo largo del tiempo.
Materiales y métodos
Sitio de muestreo y propiedades del suelo
El suelo utilizado para el estudio fue recolectado de un sitio sin
antecedentes de contaminación de petróleo previa, ubicado en la
granja experimental de la Universidad de Pretoria, República de
Sudáfrica. La porción de tierra tomada para el experimento nunca
se había cultivado en el momento de la investigación. La textura
del suelo era arcillosa arenosa (85% arena, 10% arcilla y 5% limo).
Las características del suelo fresco utilizado para la
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Gestión de residuos e investigación 30 (3)
Tabla 1. Características fisicoquímicas del suelo fresco utilizado en el
estudio.
Parámetros Valores
pH (H2O) 5.3
Fósforo de 38 mS m-1
conductividad eléctrica 17,1 mg kg-1
Potasio 48,0 mg kg-1
Carbono orgánico total (COT) 0,37%
NH4 nitrógeno 3,19 mg kg-1
NO3 nitrógeno 11,03 mg kg-1
Contenido de humedad 6,91%
Distribución de tamaño de partícula
Arena gruesa 85,0%
Limo 5,0%
Arcilla 10,0%
El estudio se muestra en la Tabla 1. Los valores presentados representan la
media de tres submuestras analizadas para cada parámetro.
Diseño experimental
El suelo se recogió del horizonte superficial (horizonte A) y se dividió en
quince macetas de 5 L que contenían cada una 4 kg de suelo. La altura de
la maceta era de 24 cm con cinco aberturas en la base para evitar el
encharcamiento. La muestra de suelo ocupó aproximadamente la mitad
del volumen de la maceta dejando suficiente espacio para la cabeza. En la
Figura 1 se muestra una imagen de la maceta. Los experimentos se
llevaron a cabo por triplicado para representar cinco regímenes de
tratamiento diferentes, a saber, NPK (nitrógeno, fósforo, potasio) -suelo
modificado (PN), suelo modificado con nitrato de calcio y amonio (PU),
excrementos de aves de corral (estiércol de pollo) - suelo modificado (PP),
control de aceite contaminado (OC) y control prístino (PC). Todos los
tratamientos, excepto el PC, se contaminaron con 160 ml de crudo ligero
árabe.
Las muestras de suelo contaminadas con aceite se mezclaron a fondo
con una paleta de mano desinfectada con etanol al 70%. Para los suelos
modificados con nutrientes, se disolvieron 25 g de NPK, nitrato de calcio y
amonio o excrementos de aves de corral en 200 ml de agua destilada
estéril y se mezclaron con el suelo contaminado para distribuir el petróleo
crudo y los nutrientes a través de las partículas del suelo y también para
mejorar la aireación. Los microcosmos se mantuvieron a temperatura
ambiente en un invernadero; Los suelos tratados con nutrientes se
regaron regularmente semanalmente con 200 ml de agua destilada estéril
para sustituir el agua evaporada y también se mezclaron cada dos días
para la aireación.
Los controles prístinos y contaminados con aceite (OC y PC) se
dejaron intactos durante el período experimental de 6 semanas y,
como se esperaba, perdieron agua rápidamente. La adición de agua
en los tratamientos modificados con nutrientes mantuvo la humedad
del suelo al mismo nivel que el análisis estadístico mediante el análisis
de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba de comparación
múltiple de Tukey mostró que el contenido de humedad en PN,
Chikere y col.
Figura 1. La olla utilizada en el experimento.
PU y PP no fueron significativos en p <0.05 en comparación entre
sí, mientras que fueron significativos en p <0,05 cuando se
compara individualmente con OC y PC, respectivamente. Los
microcosmos se muestrearon los días 0, 7, 14, 21, 28, 35 y 42.
Se recolectaron tres submuestras que representan una del
microcosmos individual de cada tratamiento y se agruparon para obtener
una muestra compuesta de la siguiente manera: (1) suelo PN; (2) suelo de
PU; (3) suelo de PP; (4) suelo OC; y (5) suelo de PC.
Enumeración de bacterias e hidrocarburos heterótrofos
totales utilizando recuentos bacterianos
A partir de una muestra compuesta de cada tratamiento, se
homogeneizó 1 g de suelo en 9 ml de NaCl al 0,85% utilizando una
máquina de vórtex Heindolph (Alemania). Se colocaron en placa
diluciones decimales (10 veces) de las suspensiones en Plate Count
Agar (Merck, Alemania) y se incubaron a 30ºC.8C durante 24 horas
para el recuento total de bacterias heterotróficas (THB). Para los
recuentos de hidrocarburos que utilizan bacterias (HUB), se
sembraron en placas diluciones apropiadas de suspensiones de suelo
en agar Bushnell-Haas (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Los hidrocarburos se
suministraron a través de la fase de vapor a los supuestos usuarios de
hidrocarburos colocando papeles de filtro Whatman N ° 1 estériles
impregnados con 5 ml de aceite crudo ligero árabe sobre las tapas de
las placas invertidas. Las placas se incubaron a 308C durante 7 días.
Análisis cromatográfico de gases
Los hidrocarburos residuales se extrajeron de los suelos de PN, PU,
PP y OC (5 g cada uno) semanalmente comenzando desde el día cero
con 40 metroL de norte-pentano (grado HPLC)) sonicando la muestra
5 min en cada extracción tres veces. El extracto de pentano se
centrifugó a 3000gramo durante 5min. Las tres fases orgánicas se
secaron sobre Na2ASI QUE4, agrupados y ajustados a 150 metroL
después de la adición de 32 metroSe añadió L de cumeno (isopropil
benceno) como patrón interno. El análisis se llevó a cabo
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227
utilizando un Varian 1440 GC-FID (California, EE. UU.). Se
utilizó una columna DB-1 con las siguientes dimensiones:
30m3 0,2 mm; 0,25metrom espesor de película; 0,32 id. El helio era el
gas portador a un caudal de 1 ml / min.-1. Los análisis fueron
se llevó a cabo en modo de inyección dividida usando una relación dividida de 5:
1. El puerto de inyección se estableció en 2508C.La temperatura del horno se
programó desde 408C durante 10 minutos, luego 208Cmin-1 hasta 3308C,
manteniendo esta temperatura durante 10 min.
Extracción de ADN del suelo
El ADN de la comunidad microbiana total de los microcosmos
correspondientes a los cinco tratamientos se extrajo de 0,25 g de
suelo utilizando el kit Zymo Research Soil Microbe DNA (Inqaba
Biotech, Sudáfrica) y el disruptor celular Bio 101 FP-120 FastPrep
(Qbiogene, Inc. Canadá) . La máquina se configuró a una
velocidad de 5.0ms.-1 durante 45 s. Las muestras de ADN
extraídas se cuantificaron utilizando el espectrofotómetro
NanoDrop ND-1000 (EE. UU.) Antes de que los fragmentos del
gen del ARNr 16S se amplificaran mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR). La concentración de ADN utilizada para la
PCR osciló entre 22 y 51 ng.metroL-1.
Reacción en cadena de la polimerasa
La amplificación de la plantilla de ADN se realizó utilizando 2
metroL volumen del ADN extraído con mini termociclador BIO
RAD MJ (México). Los 50metroL mezcla de PCR contenía 5 metro
Mezcla de L desoxi nucleósido trifosfato (dNTP) (2,5 metromol L-1)
(Promega, EE. UU.), 5 metroL de 53 Tampón Green Go Taq Flexi
(Promega), 3,5 metroL de 25 mmol L-1 MgCl2
(Promega), 2 metroL de cada 10 pmol de los cebadores
directo (cebador M) y reverso (cebador K) pA8f-GC (59-
CGC-CCG-CCG-CGC-GCG-GCG-GCG-GGC-GGG-GCG-GGG-
GCA-GGG-GAG-AGT-TTG-ATC-CTG-GCT-CAG-39) y
KPRUN518r (59-ATTACCGCGGCTG CTGG-39) (Maila et al.,
2006), 0,25 metroL de 5UmetroL-1 arranque en caliente
228 Gestión de residuos e investigación 30 (3)

ADN polimerasa Go Taq, 2.5 metroL-1 de 20 mgmL-1 de albúmina de

9 PN
suero bovino y 27,75 metroL de agua esterilizada. Se incluyó un tubo
8 PU
de reacción sin ADN molde como control negativo. El programa de
PÁGINAS

PCR fue el siguiente: paso de desnaturalización a 958C durante 3 min, 7

Tronco10 UFC g–1

jefe
seguido de 33 ciclos a 958C durante 30 s, recocido durante 30 sa 558C
6
ordenador personal

y extensión a 728C durante 1 min, seguido de una extensión final a 72

8C durante 7min y luego se mantiene a 48C.El ADN amplificado se 5
examinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,4% con 2
4
metroL alícuotas de productos de PCR en 13Tampón tris-acetato-
EDTA. 3
0 7 14 21 28 35 42
Periodo (días)
Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante
Figura 2. Recuentos de bacterias heterotróficas cultivables totales durante la
Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel en gradiente
biorremediación. PN, suelo modificado con NPK; PU, suelo modificado con
desnaturalizante (DGGE) según el método descrito por Muyzer et al. (1993)
nitrato de amonio y calcio; PP, aves de corral que caen suelo modificado; OC,
utilizando el sistema de detección de mutaciones múltiples BioRad Dcode. control de contaminación por aceite; PC, control impecable.
Se cargaron diez microlitros que contenían 250 ng de los diversos
fragmentos de genes amplificados con ARNr 16 S por carril en un gel de
gradiente desnaturalizante al 25-55%. El gel se corrió a 70 V durante 17 h a
una temperatura constante de 60ºC.8C. Las bandas seleccionadas se PN
9
recogieron bajo luz azul de gel DGGE usando una punta de micropipeta PU

estéril. A cada banda se le asignó un número para el análisis de secuencia. 8 PÁGINAS

jefe
Los bloques de gel se colocaron en 30metroL agua destilada estéril y se
7
Tronco10 UFC g–1

ordenador personal
deja reposar durante la noche. Los fragmentos de ADN de las bandas se
sometieron luego a PCR como se describió anteriormente. 6

4
Secuenciación
3
0 7 14 21 28 35 42
Los productos de PCR de las bandas extirpadas se secuenciaron con el
Periodo (días)
cebador K utilizando un analizador genético ABI 3130XL (Applied
Biosystems, Foster City, CA) que incorpora el kit de secuenciación del
Figura 3. Hidrocarburo cultivable total que utiliza recuentos bacterianos
ciclo ABI Big Dye Terminator versión 3.1 (Applied
durante la biorremediación. PN, suelo modificado con NPK; PU, suelo
Biosistemas). La secuenciación fue realizada por Inqaba modificado con nitrato de amonio y calcio; PP, excrementos de aves de
Biotechnical Industries Pty. Ltd, Sudáfrica. Los electroferogramas corral (estiércol de pollo) -suelo modificado; OC, contaminado con aceite
de las secuencias generadas se inspeccionaron con el software control; PC, control impecable.
Finch TV (Geospiza). La identificación de la secuencia se realizó
utilizando la instalación BLAST-N del Centro Nacional de Los recuentos HUB de las macetas modificadas con nutrientes alcanzaron su punto

Información Biotecnológica (NCBI). máximo el día 14 para PN (suelo modificado con NPK) y PP (excrementos de aves /

suelo modificado con estiércol de pollo) mientras que PU (suelo modificado con nitrato

de calcio y amonio) alcanzó su punto máximo el día 21.

Resultados El tratamiento con NP mostró la mayor disminución de los

Recuentos bacterianos
Las tendencias en los recuentos de bacterias cultivables para el período de
6 semanas se muestran en las Figuras 2 y 3. Se observó que las macetas
PN, PU, PP modificadas con nutrientes alcanzaron su punto máximo en
los recuentos de THB el día 21. Estos permanecieron bastante estables
hasta el día 35 después de lo cual los recuentos comenzaron a disminuir.
Los recuentos de THB para el OC aumentaron levemente el día 7,
disminuyeron el día 21, aumentaron levemente y permanecieron estables
entre los días 28 y 35. Después de este período, los recuentos comenzaron
a disminuir. El THB para PC se mantuvo bastante estable desde el día cero
hasta el día 42 (Figuras 1 y 2).
contaminantes el día 14 seguido de PU y PP el día 21 respectivamente
(Figura 4). Se observó que casi todos los hidrocarburos en los suelos
modificados se degradaron 3 semanas después de la contaminación
por petróleo. Para el día 42, las alturas de los picos de hidrocarburos
se redujeron todas en los suelos modificados con nutrientes en este
orden, PN> PU> PP, mientras que no se observó una disminución
notable en el control contaminado con aceite (OC). La reducción de la
altura de los hidrocarburos, tal como se muestra en los
cromatogramas, se usa cualitativamente para calificar el progreso de
la degradación de los hidrocarburos (Atlas y Philp, 2005; Challian et
al., 2004; Leahy y Colwell, 1990; Stroud et al., 2007). Las curvas
sigmoideas (Figura 5 (a) a (c)) también se generaron a partir de

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Chikere y col. 229

Figura 4. Cromatogramas de gases (de arriba hacia abajo) del control contaminado con aceite días 0, 42; Suelo modificado con NPK (PN) días 0,
14 y 42; suelo modificado con nitrato de calcio y amonio (PU) días 0, 21 y 42; suelo modificado con excrementos de aves de corral (PP) días 0, 21
y 42.

las tasas de degradación de los hidrocarburos en los tratamientos
bioestimulados. La degradación se determinó como el porcentaje
de hidrocarburo degradado medido en el área bajo los picos de
los cromatogramas en relación con la cantidad de hidrocarburo
del control abiótico correspondiente [control contaminado con
aceite (OC)]. La curva derivada para el tratamiento de NP (Figura 5
(a)) tuvo el mejor ajuste para los puntos trazados seguidos de PP
(Figura 5 (c)) y PU (Figura 5 (b)), respectivamente. Como no hubo
pérdidas significativas de hidrocarburos por el tratamiento de
OC, la desaparición de estos hidrocarburos
en los tratamientos con nutrientes modificados podría atribuirse a la
bioestimulación y al aumento de la actividad bacteriana, lo que
resultó en la biodegradación de los contaminantes. Esta observación
corrobora los hallazgos de Quatrini et al. (2008) en un estudio
relacionado.
A lo largo del período de 42 días, PN (suelo modificado con NPK) mostró la
degradación más efectiva del petróleo crudo. Sin embargo, los recuentos de
bacterias no reflejaron estas tendencias ya que PP (excrementos de aves / suelo
modificado con estiércol de pollo) mostró los recuentos más altos tanto para
THB como para HUB. Excrementos de aves de corral

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230
Figura 4. Continuado.
Se ha demostrado que contienen una gran cantidad de microorganismos
(Williams et al., 1999) que pueden haber sido un inóculo adicional a los que
ya se encuentran en el suelo, como también se registra en este estudio.
Los microorganismos identificados en la cama de aves de corral utilizada
en el estudio fueronPseudomonas spp., Escherichia coli, Mycobacterium
spp y Salmonela spp., pero las secuencias de estas bacterias no se
identificaron en el DGGE, lo que posiblemente signifique que pueden no
haber estado entre la microbiota dominante que degrada los
hidrocarburos a pesar del aumento en los recuentos de THB y HUB que
causaron en el tratamiento con PP. En la misma línea, Van Hamme et al.
(2003) informaron que el medio de sales minerales utilizado en el
aislamiento de HUB puede favorecer incluso a los microbios no
degradantes debido a las trazas de carbono en el agar, sobrestimando así
su número e importancia durante la biorremediación. Hamamura y col.
(2006) en su estudio también informaron el cultivo de numerosos HUB de
suelo contaminado con aceite que no se correlacionó con los resultados
obtenidos usando técnicas moleculares independientes del cultivo y
aconsejaron que se deben usar métodos moleculares para confirmar y
verificar
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Gestión de residuos e investigación 30 (3)
tales resultados obtenidos utilizando métodos de cultivo
tradicionales. También se ha observado que los microorganismos de
crecimiento rápido que se adaptan mejor a las condiciones de cultivo
particulares crecen preferentemente que los que no lo están y, por lo
tanto, no representan con precisión la composición real de la
comunidad microbiana de los ecosistemas contaminados durante la
biorremediación (Malik et al., 2008). Por lo tanto, la caracterización
dependiente del cultivo de degradadores de hidrocarburos de sitios
contaminados con hidrocarburos limita el alcance de la diversidad
microbiana y la importancia ecológica de los organismos no
cultivables en tales ambientes puede pasar desapercibida (Chikere,
2010; Delmont et al., 2011; Van Hamme et al., 2003).
Análisis molecular de la dinámica de la comunidad
bacteriana
El ADN comunitario total extraído de todos los tratamientos produjo
ADN de alto peso molecular. Los productos de PCR se obtuvieron de
todas las muestras de ADN del suelo. De ahí el aceite usado para
Chikere y col.
Figura 4. Continuado.
contaminar las muestras de suelo no afectó la calidad del
ADN extraído del suelo. Las muestras de ADN utilizadas para
PCR y DGGE se tomaron de los días en que se demostró una
reducción apreciable de los picos de hidrocarburos en los
cromatogramas. Los patrones de anillado mostraron que las
bandas DGGE dominantes aparecieron en suelos modificados
con nutrientes PN, PU, PP a lo largo del tiempo (0-42 días) y
no en el control de suelo prístino o contaminado con aceite
[PCB (línea de base de control prístino), OCB (contaminado
con aceite) línea de base de control de suelo), OC0 (control de
suelo contaminado con aceite día cero), OC42 (control de
suelo contaminado con aceite día 42)) (Figura 6). En suelo PN,
no se observaron bandas dominantes el día cero del
experimento, pero apareció una banda prominente pn1 el día
14 y persistió hasta el día 42. Las bandas pn2 y pn3 también
fueron dominantes el día 42 aunque no aparecieron 2
semanas después del tratamiento. comenzó. Una banda
tenue
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231
durante todo el período de estudio. Dos bandas prominentes
adicionales pu2 y pu3 aparecieron el día 14 y persistieron durante
todo el experimento seguido de pu4 que emergió el día 14
aunque no tan prominente como el primero. También se
observaron bandas débiles pu5 y pu6 los días 21 y 42,
respectivamente. Una banda, pp2 apareció en el suelo de PP el
día cero, pero se hizo más prominente a partir del día 14 y
persistió durante todo el período de estudio. Las bandas pp1 y
pp3 se vieron débilmente solo el día cero y nunca volvieron a
aparecer posteriormente, mientras que la banda pp4, que surgió
el día 14, persistió durante todo el experimento. Todos los suelos
modificados con nutrientes mostraron patrones sucesionales
obvios, en los que la mayoría de las bandas de DGGE que
emergieron temprano en el experimento desaparecieron con el
tiempo mientras que otras que aparecieron más tarde
permanecieron relativamente prominentes durante el período de
estudio (Figura 6). En cambio,
durante el período experimental. En consecuencia, el
232
Figura 4. Continuado.
las poblaciones correspondientes a las bandas prominentes de DGGE en suelos
modificados con nutrientes se atribuyeron a la bioestimulación más que a la
contaminación por hidrocarburos únicamente.
Las secuencias de ADN de algunas de las bandas DGGE
prominentes correspondientes a poblaciones bacterianas
seleccionadas durante la degradación del petróleo crudo se informan
junto con sus parientes GenBank más cercanos en la Tabla 2. Todas
las secuencias obtenidas en el estudio se depositaron en GenBank
con los números de acceso GU451069 a GU451108. Poblaciones
filogenéticamente diversas relacionadas con laActinobacterias,
cloroflexi, gramo-Proteobacterias yFirmicutes se identificaron en los
suelos modificados con nutrientes. Sin embargo, las secuencias de
ADN de las bandas pn1, pu2 y pp4 se detectaron en tratamientos con
PN, PU y PP. Las secuencias correspondientes a estas bandas eran 99,
100 y 96%, respectivamente, idénticas a la secuencia parcial del gen
16S rRNA deCorynebacterium sp. IC10. Todas las secuencias de ARNr
16S obtenidas de los suelos enmendados con nutrientes estaban en
su mayoría afiliadas con organismos Gram positivos y se agruparon
com
dentro delCorynebacterium – Dietzia – Nocardioides – Rhodococcus
plex, cuyos miembros degradan los hidrocarburos del petróleo
crudo (Bouchez-Naitali et al., 1999; Chaillan et al., 2003; Daly et
al., 1997; Hamamura et al., 2006; Kloos et al., 2006; Larkin et al.,
2005; Leahy y Colwell, 1990; Margesin et al., 2003; Philp et al.,
2005; Popp et al., 2006; Quatrini et al., 2008).
Discusión
En el presente estudio, se combinó el análisis DGGE de fragmentos de
genes de ARNr 16S amplificados por PCR a partir de ADN bacteriano
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Gestión de residuos e investigación 30 (3)
con técnicas de química analítica y dependientes del cultivo para
estudiar la degradación del petróleo crudo y la dinámica de las
comunidades bacterianas en un suelo contaminado con petróleo
crudo durante un período de 42 días. Varios investigadores han
utilizado métodos dependientes del cultivo para aislar las bacterias
implicadas en la degradación de los hidrocarburos del petróleo (Adoki
y Orugbani, 2007; Ayotamuno et al., 2006; Chaillan et al., 2004;
Chikere y Chijioke-Osuji; 2006; Ebuehi et al., 2005; Maila et al., 2006;
Nweke y Okpokwasili, 2004; Odokuma y Dickson, 2003; Rojas-
Avelizapa et al., 2007), aunque actualmente solo se puede cultivar una
fracción de las bacterias del suelo involucradas en la biodegradación.
en el laboratorio (Heinzel et al., 2009; Malik et al., 2008; Surridge et al.,
2005; Zengler, 2008). Se observó que los recuentos bacterianos
heterotróficos cultivables totales y que utilizan hidrocarburos
aumentaron en los suelos bioestimulados (PN, PU y PP) a partir de la
segunda semana hasta la sexta semana del período de
biorremediación alcanzando los números más altos en los días 35 y
42, respectivamente. Por otro lado, las poblaciones de recuentos de
bacterias heterótrofas cultivables y que utilizan hidrocarburos se
mantuvieron estables durante todo el período experimental en los
suelos de control prístinos y contaminados con aceite (OC y PC).
Varios estudios también han registrado un aumento en los recuentos
de bacterias heterótrofas cultivables y que utilizan hidrocarburos
durante la biodegradación del petróleo crudo después de la
bioestimulación (Ayotamuno et al., 2006; Chaillan et al., 2004; Chikere
y Chijioke-Osuji, 2006; Ebuehi et al., 2005; Margesin et al., 2003;
Nweke y Okpokwasili, 2004; Ruberto et al., 2009; Wolicka et al., 2009).
Se indujeron cambios en los recuentos bacterianos detectados en
todos los suelos bioestimulados.
Chikere y col.
Figura 5. Curvas sigmoides que muestran las tasas de degradación de los
hidrocarburos en los suelos enmendados con nutrientes en relación con el
control contaminado con aceite: (a) PN, suelo enmendado con NPK; (b) PU, suelo
modificado con nitrato de calcio y amonio; (c) PP, excrementos de aves de corral
(estiércol de pollo) -suelo modificado.
por la adición de nutrientes en lugar de la contaminación por aceite
solo. Esta misma observación fue realizada por Evans et al. (2004)
cuando investigaron el impacto de la contaminación por petróleo y la
bioestimulación en la diversidad de comunidades bacterianas
indígenas en microcosmos del suelo.
El patrón más consistente observado en el presente estudio fue la
aparición de Corynebacterium sp. Bacterias similares a IC10 en todos
los suelos modificados con nutrientes (Figura 6; bandas pn1, pu2 y
pp4) tratadas con diferentes nutrientes orgánicos e inorgánicos. La
amplia distribución de estas especies bacterianas en los suelos
bioestimulados posiblemente indica la importancia de
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233
Corynebacterium spp. en la degradación de hidrocarburos. Este hallazgo
es consistente con los resultados de estudios previos que muestran la
prevalencia de sustancias que degradan los hidrocarburos.
Corynebacteriumspp. en varios suelos contaminados con hidrocarburos
utilizando enfoques dependientes del cultivo (Adebusoye et al., 2007;
Bouchez-Naitali et al., 1999; Rahman et al., 2002) e independientes
(Jimenez et al., 2007). La bioestimulación de los suelos contaminados con
aireación y enmiendas de nutrientes mostró que los cambios en la
abundancia y diversidad de poblaciones bacterianas ocurrieron a partir de
la segunda semana después del tratamiento. Tanto los recuentos de
bacterias heterótrofas cultivables como los que utilizan hidrocarburos
totales aumentaron apreciablemente durante este mismo período, en
paralelo con cambios marcados en la estructura de la comunidad
bacteriana, como se demostró mediante la toma de huellas dactilares de la
población. Sin embargo, los suelos de PU y PP mostraron un perfil
bacteriano estable desde el día 14 hasta el día 42, último día del
experimento, a diferencia del suelo de PN donde se observó sucesión
poblacional durante el mismo período. Esto sugiere que los suelos de PU y
PP pueden albergar poblaciones especializadas que poseen vías de
degradación de alcanos con una amplia especificidad de hidrocarburos,
como también lo observaron Hamamura et al. (2006). El suelo de PU tuvo
secuencias principalmente delActinobacterias grupo filogenético y está
bien documentado que los miembros de este grupo son degradadores de
hidrocarburos conocidos (van Beilen et al., 2007; Bell et al., 1998; Chaillan
et al., 2004; Evans et al., 2004; Hamamura et al. , 2006; Quatrini et al., 2008;
Van Hamme et al., 2003). El suelo de PP tenía secuencias de ambos
Actinobacterias y Firmicutes grupos. Otros estudios demostraron que
estos grupos pueden degradar varios hidrocarburos (Evans et al., 2004;
Hamamura et al., 2006; Larkin et al., 2005; Leahy y Colwell, 1990; Popp et
al., 2006). También se detectaron cambios en las intensidades de las
bandas a lo largo del tiempo en los suelos bioestimulados, lo que indica
que los cambios en la estructura de la comunidad bacteriana fueron
inducidos predominantemente por la adición de nutrientes en lugar de la
adición de aceite solo, ya que el petróleo crudo utilizado para la
contaminación se aplicó a la misma concentración del 4% en todos los
microcosmos del suelo. Esta observación también fue realizada por Zucchi
et al. (2003) y Evans et al. (2004). Otros estudios independientes han
subrayado el uso de la bioestimulación para promover la degradación de
los hidrocarburos del petróleo (Ayotamuno et al., 2006; Balba et al., 1998;
Ijah y Antai, 2003; Macnaughton et al., 1999; Nweke y Okpokwasili, 2004;
Odokuma y Dickson, 2003; Okpokwasili, 2006; Ruberto y col., 2009;
Williams y col., 1999; Wolicka et al., 2009) en diferentes contextos
ecológicos. Dadas las condiciones óptimas para la actividad microbiana, los
microorganismos del suelo cuando se enfrentan a fuentes antropogénicas
y naturales de contaminantes de hidrocarburos con el tiempo se adaptan
mediante un enriquecimiento selectivo y esto conduce concomitantemente
a la biodegradación de estos compuestos.
Conclusión
Se concluyó que ocurrieron cambios en la población bacteriana.
como resultado de la bioestimulación. Aporte de nutrientes, aireación y
234 Gestión de residuos e investigación 30 (3)

pcb ocb oc0 oc42 pno pn14 pn42 pu0 pu14 pu21 pu42 pp0 pp14 pp28 pp48

pp1

pn2 pu2

pn1 pp4

pn3 pp2

pn4 pp3
pu3
pu1
Pu6
Pu5
pu4

Figura 6. Perfiles DGGE de fragmentos del gen de ARNr 16S de pcb, control prístino; ocb, línea de base de control contaminada con aceite; oc0, día cero de
control contaminado con aceite; oc42, control contaminado con aceite día 42 y suelos modificados con nutrientes pn0; pn14; pn42 (NPK enmendado los
días cero, 14 y 42 del suelo); pu0; pu14; pu21; pu42 (suelo modificado con nitrato de calcio y amonio días cero, 14, 21 y 42); pp0; pp14; pp28; pp42 (suelo
modificado con excrementos de aves de corral días cero, 14, 28, 42).

Tabla 2. Identificación de la secuencia de algunos fragmentos del gen de ARNr 16 S detectados en las muestras de suelo modificadas con nutrientes

Banda DGGE No. de acceso Grupo filogenético% de similitud relativa de GenBank más cercano

pn1 GU451105 Actinobacterias Corynebacterium sp. IC10 99

pn3 GU451103 Firmicutes Baja GþC Bacteria Gram positiva T135 98
pn4 GU451104 Actinobacterias Corynebacterium sp. CNJ945 PL04 95
pu1 GU451101 Cloroflexi Kouleothrix aurantica 88
pu2 GU451086 Actinobacterias Corynebacterium sp. Clon 100
pu3 GU451089 gramo-Proteobacterias bacteriano no cultivado IC10 100
pu4 GU451096 Actinobacterias Dietzia sp. CNJ898 PL04 99
pu5 GU451093 Actinobacterias Nocardioides sp. RS3-1 94
pu6 GU451092 Actinobacterias Rhodococcus erythropolis 51T7 Clon 85
pp1 GU451085 gramo-Proteobacterias bacteriano de compost sin cultivar OB22 Low 97
pp2 GU451071 Firmicutes GþC Bacteria Gram positiva T135 99
pp3 GU451082 Actinobacterias Corynebacterium sp. IC10Corynebacterium 95
pp4 GU451078 Actinobacterias sp. CNJ954 PL04 93

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Chikere y col. 235

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444245
2012
WMR0010.1177 / 0734242X12444245 Erratum a 410114 Gestión e investigación de residuos

Errata

Gestión e investigación de residuos

30 (5) 558
© The Author (s) 2012 Reimpresiones y
permisos: sagepub.co.uk/
journalsPermissions.nav DOI: 10.1177 /
0734242X12444245 wmr.sagepub.com

El editor desea disculparse por el error que ocurrió en Waste microcosmos durante la biorremediación mejorada con nutrientes 'por
Management and Research, marzo de 2012, vol. 30, número 3, págs. Chioma B Chikere, Karen Surridge, Gideon C Okpokwasili y Thomas E
225-236 del artículo 'Dinámica de las comunidades bacterianas Cloete. El artículo debería haber aparecido como un artículo original en
indígenas asociadas con la degradación del petróleo crudo en el suelo lugar de un artículo de revisión.

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