CARACTERIZACION DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE Trichoderma sp ,

Penicillium sp , Geotrichum sp y Moniliophthora sp, MEDIANTE LA UTILIZACIÓN

DEL MARCADOR MOLECULAR RADPs

INTRODUCCIÓN

PROCEDIMIENTO PARA RAPDs

Polimorfismo de ADN amplificado al azar, consiste

en una amplificación mediante PCR, para ello se Cuenta con cientos pasos
utilizan un único indicador con secuencia arbitraria, involucrados en este proceso
este usa cebadores cortos normalmente de 10 pares como lo son
de bases, amplificando regiones anónimas del ADN,
para esta preparación se debe tener en cuenta
ciertos componentes
Extracción de ADN
COMPONENTES OLIGO OPA
4µL 10µL
AGUA 103,2 103,2

BUFFER 16 16 Reacción de la PCR con un cebador

escogido al azar
MgCl2 9,6 9,6
cebador 16 16

DNTP 4 4
Separación de fragmentos de ADN
Taq Polimerasa 1,6 1,6 mediante electroforesis con geles de
agarosa o acrilamida
TOTAL 150,4 150,4

Para cada tubo 18,8 18,8

Adn 1,2 1,2
Detección de Bandas en Bromuro
Final del tubo 20µl 20µl de Etidio
Condiciones para #ciclos/T°C/ tiempo
termociclador

Temperatura de hibridación
para OPA 10 y OLIGO 4
Desnaturalización 1 ciclo/ 94°c/5min

Desnaturalización 35 ciclos/94°c/30 seg

Hibridación o anillamiento 32°c/|min

Elongación o extensión 72°c/2min

Ciclo Final 1 ciclo 72°c / 7 min

Indefinido 1 ciclo de 4°c

RESULTADOS
 Electroforesis No. 3 Fecha 20/11/18

Buffer de carga:
Azul de bromofenol
% de agarosa: Buffer de corrida:
Xilencianol BrEt -----
1,5 TBE 1X
Glicerol
Gel RED
Voltaje/Corriente inicial: 80 voltios Tiempo: 1 hora

Voltaje/Corriente final: 100 voltios Tiempo de corrida: 15 minutos

Fotografía
Carril Muestra

1 𝑀𝑎𝑟𝑐𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟

2 𝐷2Trichoderma

3 𝐷2 𝑃𝑒𝑛𝑖𝑐𝑖𝑙𝑙𝑖𝑢𝑚

4 𝐷3 𝑇𝑟𝑖𝑐ℎ𝑜𝑑𝑒𝑟𝑚𝑎

5 𝐴2 𝑃𝑒𝑛𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑢𝑚

6 𝐷3𝑇𝑟𝑖𝑐ℎ𝑜𝑑𝑒𝑟𝑚𝑎

7 𝐶1 𝐺𝑒𝑜𝑡𝑟𝑖𝑐ℎ𝑢𝑚

8 𝐶2 𝐺𝑒𝑜𝑡𝑟𝑖𝑐ℎ𝑢𝑚

9 (+) 𝑀𝑜𝑛𝑖𝑙𝑙𝑖𝑎

Cuadro 1. Electroforesis representada en un transiluminador en gel agarosa

Tabla1. Matriz de las bandas del gel de agarosa en la electroforesis

Discusiones
Para la realización de extracción de hongos se tendrá que tener cuidado en el orden en que
se utilizan los reactivos debido a que cada uno cumple una función específica en el
procedimiento; también se debe tener cuidado en los pasos a seguir debido a que si omitimos
un paso se puede perder la muestra.

El protocolo utiliza cebadores cortos (10 pares de bases) que se utilizan de forma individual
en reacciones de PCR con un nivel de especificación muy bajos. De esta manera se genera
un patrón de bandas sencillos que dependerá de la capacidad de los cebadores para encontrar
zonas en el ADN, parcial o totalmente complementario (Rocha. M; J. Gasca 2007). Sin
embargo, el análisis de RAPDs permite en principio una mayor resolución, dado que el
número de loci que se pueden muestrear es prácticamente ilimitado, frente al reducido
número de sistemas enzimáticos disponibles. Por otra parte, la dificultad operativa de ambos
métodos es muy similar (Ferriol, M.; Pico, B.; et al ; 2008)

La reproducibilidad de las bandas de ADN obtenidas no es perfecta. Algunas bandas

débilmente teñidas aparecen de forma errática, debido a variables no controlables de la
reacción, y por tanto han de despreciarse. Por tanto, las bandas teñidas con más intensidad
son las que han de considerarse de forma preferente. En cualquier caso, es imperativo realizar
varias repeticiones de la misma reacción para verificar cuáles son las bandas reproducibles
(Renteria. M ; 2009).

En cada caso suele partirse de un protocolo estándar, que va siendo modificado para
optimizar los resultados obtenidos. Durante la puesta a punto de la reacción con algunas
combinaciones cebador/ADN pueden aparecer patrones poco discretos, smear, que pueden
convertirse en patrones discretos disminuyendo la concentración de Taq polimerasa o de
ADN genómico, variando la concentración de magnesio o cambiando las condiciones de los
ciclos de amplificación. Después de la amplificación el patrón de bandas se visualiza
mediante electroforesis en gel. La principal limitación del empleo de estos geles es su baja
resolución, que puede llevar a considerar dos bandas que difieren ligeramente en su longitud
como bandas del mismo tamaño. Este problema se minimiza con el empleo de geles de
acrilamida, pero incluso con este polímero de mayor resolución la identidad de migración no
supone identidad de secuencia y podemos estar considerando dos bandas que migran a la
misma distancia como procedentes de la amplificación del mismo locus cuando proceden de
distintos loci (Moretzsohn, M.C; Nunes, C D ; 2008).

CONCLUSIONES

En la práctica de laboratorio se llevó a cabo la metodología de los marcadores RAPDs

(Random amplified polymorphic DNA), conocidos como rapids, uno de los métodos más
sencillos y rápidos en la identificación de polimorfismos de ADN mediante PCR, en cual se
utilizó un único cebador de secuencia corta OPA10, utilizando ciclos de hibridación a baja
temperatura del cebador, con el objetivo de obtener la amplificación de fragmentos
genómicos, la observación se realizó mediante la separación de los fragmentos amplificados
por medio de electroforesis en gel de agarosa, la cual dio como resultado la formación de un
patrón multibanda para cada uno de los microorganismos analizados. En la Tabla se observa
la separación mediante electroforesis en gel de agarosa (realizada por ingeniería
biotecnológica) de los fragmentos amplificados de Penicillium sp, Trichoderma sp , Monilia
sp, y Geotrichum sp. En la muestra, en la cual en la imagen no se puede observar los patrones
multibandas, esto en ocasiones es debido a la calidad del ADN, la cual si no es muy buena
nos da como resultado la obtención de patrones RAPDs imprecisos. Para mejorar la
aplicabilidad de los rapids es necesario la utilización de ADN de calidad, limpio y de peso
molecular elevado, y para la mejora de la reproductibilidad de este método debemos
considerar que la obtención de un ADN puro y poco degradado se debe a las buenas prácticas
de extracción de ADN, con el objetivo también de evitar contaminaciones lo cual nos puede
generar la aparición de un patrón de bandas diferencial y la obtención de un resultado erróneo
(Sirvent, M. B. P, 2012).

La utilización de RAPDs en el sector agronómico es de vital importancia en la caracterización

molecular de fitopatogenos causales de daños a cultivos de interés como en el caso del hongo
Moniliophthora roreri agente causal de la moniliasis del cacao, el análisis y conocimiento de
un microorganismo nos ayuda a conocer su historia evolutiva y su potencial para evolucionar,
como también su caracterización nos permite buscar alternativas para combatir problemas
como en este caso fitosanitarios (Quintero, L. E., Suárez, L. Y., & Chaves, G. 2017). Los
polimorfismos RAPDs se utilizan para construir mapas genéticos, como también para la
detección de variabilidad genética, y son considerados una alternativa económica y rápida en
diferentes aplicaciones como el descubrimiento de mutaciones en plantas, animales y
humanos, la cual se ha convertido en una técnica de interés en el sector agronómico,
ambiental, para la producción animal
En la muestra que se observo no hubo ninguna banda en la separacion de ADN por lo que en
el momento de su estudio fue nulo, sin embargo por su color oscuro se puede determinar que
no fue consecuencia de alguna contaminacion durante el procedimiento sino de una posible
sobre reaccion del cebador con el ADN que produjo la disminucion de la taq polimerasa
perjudicando la reaccion de esta al entrar en contacto con el ADN

REFERENCIAS

- Ferriol, M.; Pico, B.; Nuez, F. (2008). Genetic diversity of some accessions of
Cucurbita maxima from Spain using RAPD and SBAP markers. Genetic resources
and crop evolution, 50,3: 227-238

- Moretzsohn, M.C.; Nunes, C.D.M.; Ferreira, M.E.;Grattapaglia, D. (2008). RAPD

linkage mapping of the shell thickness locus in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)
Theor. Appl. Genet. 100:57-62

- Rocha M. y J. Gasca. 2007. Ecología molecular de la conservación. En: L. E.

Eguiarte, V. Souza y X. Aguirre (comps.). Ecología Molecular. 251-278. Semarnat,
INE, UNAM, Conabio. México tomada de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/adn.pdf

- Rentería M. 2009. Breve revisión de los marcadores moleculares. En L.E. Eguiarte,

V. Souza y X. Aguirre (comps.). Ecología Molecular. 251-278. Semarnat, INE,
UNAM, Conabio. México.

- Sirvent, M. B. P. (2012). Marcadores moleculares basados en PCR: Marcadores

RAPD.
- Quintero-Nuñez, L. E., Suárez-Contreras, L. Y., & Chaves-Bedoya, G. (2017).
Ensayos para la extracción de ADN y estandarización de RAPDs en Moniliophthora
roreri. Respuestas, 22(2), 48-58.