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Biotecnologiay Mejoramientovegetal II
Biotecnologiay Mejoramientovegetal II
Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarán en este libro una
excelente fuente de información.
Consejo Argentino para la Información
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Ediciones
Instituto Nacional de
INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA
ARGENBIO - Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología Tecnología Agropecuaria
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
Editores:
Dra. Gabriela Levitus,
Dra. Viviana Echenique,
Dra. Clara Rubinstein,
Dr. Esteban Hopp
Ing. Agr. Luis Mroginski.
Prefacio ............................................................................................................................... 6
Agradecimientos ................................................................................................................ 7
Lista de Autores .................................................................................................................. 7
Prólogo a la Primera Edición. Dr. Francisco García Olmedo ............................................. 11
Prólogo a la Segunda Edición. Dr. Francisco García Olmedo ........................................... 11
Capítulo 1: Polinización y fertilización in vitro. Susana Cardone, Gladys Pérez Camargo y Aurora
Picca. .................................................................................................................................................. 185
Capítulo 2: Hibridación somática. Pablo Polci y Pablo Friedrich. .................................................... 197
Parte III: Métodos para acelerar programas de mejoramiento e identificación varietal 295
Capítulo 1: Obtención de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Verónica Conti y Rubén Miranda
y Nicolás Gear. .................................................................................................................................... 297
Capítulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, An-
tonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. 311
Capítulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento genético de cultivos. Carlos Sala, Maria-
no Bulos, Analía Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... 325
Capítulo 4: Identificación y registro de variedades. Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y María
Alicia Loray ......................................................................................................................................... 339
Capítulo 1: Micropropagación. Sofía Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... 353
Capítulo 2: Semilla sintética. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. 363
Capítulo 3: Conservación de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. ....................... 369
Capítulo 1: La transformación tecnológica y los nuevos desafíos. Carmen Vicién. .......................... 633
Los Editores
A todos y cada uno de los 141 autores, en su mayoría investigadores y profesionales de institu-
ciones argentinas, que han contribuido con sus aportes.
Al Dr. Francisco García Olmedo, reconocido investigador y catedrático español, por regalarnos
también el prólogo de esta segunda edición.
Al Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología (ArgenBio), por aus-
piciar la publicación del libro.
A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar este
proyecto.
Los Editores
El uso de fuentes y nombres comerciales en este documento es sólo para fines de identificación
y no implica ningún aval ni recomendación. Además, los contenidos u opiniones expresadas en
esta publicación son de exclusiva responsabilidad de los autores.
PRÓLOGOS
La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedan
encadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segunda
edición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, un texto que, hace seis años, supuso una es-
pléndida y afortunada aportación a la recensión de un área tecno-científica en vigorosa ebullición y
de gran relevancia práctica. La necesidad de esta edición surge de múltiples circunstancias, entre
las que cabe resaltar el enorme avance del conocimiento que ha tenido lugar, la redefinición de
los retos entonces planteados y la aparición de otros nuevos que han diversificado los objetivos
prácticos de la disciplina. Además, entre la aparición de la primera edición y la de esta segunda, ha
ocurrido una crisis alimentaria significativa que no es separable de otras, tales como la económica,
la climática o la energética.
Según todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores múltiples: la
subida del precio del petróleo, el bajo nivel de reservas, la especulación, el incremento de la pobla-
ción y del consumo per capita, el desvío de una parte sustancial de la producción agraria hacia la
fabricación de biocombustibles, la disminución de los rendimientos por el estrés debido al cambio
climático y la falta de inversión en innovación agropecuaria. Parece como si el éxito relativo de las
últimas décadas hubiera hecho bajar la guardia.
En particular, la tasa de crecimiento de la producción de alimentos ha ido por detrás de la del
crecimiento de la población durante la última década, justo el tipo de comportamiento relativo que
propuso Malthus hace más de dos siglos. En el último medio siglo, ha sido la mejora genética la
que ha tenido el protagonismo técnico en la derrota de la amenaza maltusiana, ya que la superfi-
cie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto conciencia
de que no se sabe bien cómo se va a conseguir el aumento de la producción de alimentos en un
70-100 % para el año 2050, necesidad que se considera mínima para alimentar una población pro-
yectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, además, tendrán una demanda per cápita
significativamente superior a la actual. Si se quiere lograr dicho objetivo, habremos de ser aún más
eficaces en las próximas décadas de lo que lo hemos sido en las precedentes.
Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni serán exclusivamente técni-
cas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrán un importante componente técnico y
es sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita.
El cambio climático está alterando los estreses bióticos y abióticos a que deben hacer frente las
cosechas, lo que hace prioritaria la investigación básica y aplicada tanto en el esclarecimiento de
los mecanismos involucrados como en la adaptación de las cosechas tradicionales a las nuevas
condiciones, así como el desarrollo de nuevas cosechas que sean más apropiadas para condicio-
nes extremas.
La crisis energética ha impulsado un nuevo interés por los biocombustibles, en los que se han
centrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulación de objetivos políticos
que pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentación mundial. Así por ejemplo, los
objetivos declarados para fechas próximas, tanto por lo EEUU como por la UE, están determinando
una competencia por el suelo agrícola de la generación de biocombustibles con la producción de
alimentos que no puede sino encarecer significativamente los alimentos y aumentar el número de
hambrientos en el mundo, así como contribuir a la destrucción de bosque tropical. Por otra parte,
La búsqueda de especies y variedades aptas para la producción de biocombustibles plantea retos
formidables a la investigación de su agronomía y a su mejora convencional y biotecnológica.
Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edición de
“Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II” manifiesta su pleno potencial y debe alcanzar su máxi-
ma funcionalidad.
Dr. Francisco García Olmedo, 2010
como una formulación de sales inorgánicas y MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97.
1962)
compuestos orgánicos requeridos para la nu- N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,
trición y manipulación de los cultivos. Existen y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975)
B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell
numerosas formulaciones, cada una de las Res. 50: 151 - 158. 1968)
cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.
Para dar una idea de la cantidad de formu-
laciones disponibles, George y col., luego de
• Otros compuestos.
revisar más de 3.000 trabajos científicos des-
criben en dos tomos (casi 1.000 páginas en to-
Fuente de carbono: Prácticamente todos los
tal) más de 2.000 medios de cultivo. También
cultivos son heterótrofos (comparativamente
dos empresas multinacionales ofrecen para la
unos pocos son autótrofos) y por ende necesi-
venta más de 60 medios cada una, listos para
tan del suministro de una fuente de carbono.
su utilización especialmente en la micropropa-
La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,
gación comercial de plantas. En la Tabla 1 se
es el azúcar más utilizado. En algunos medios
presentan tres medios que son muy usados en
se la reemplaza por glucosa. En casos particu-
la actualidad.
lares se cita el empleo de maltosa o galacto-
Básicamente, los medios de cultivo se com-
sa. También myo-inositol (100 mg/L) suele ser
ponen de compuestos que suministran:
incorporado a los medios resultando un mejor
• Una fuente de carbono
crecimiento de los cultivos.
• Nutrientes minerales
Nutrientes minerales: Los medios de cultivo
• ·Sustancias vitamínicas
deben suministrar los mismos macro y micro-
• Sustancias reguladoras del crecimiento
nutrientes que son esenciales para el creci-
• Agente gelificante (en el caso de medios
miento de las plantas enteras. En general se
semisólidos)
destacan las concentraciones relativamente
8. Lecturas Recomendadas
a partir de una célula epidérmica o del mesófilo renciación de los nuevos órganos. Este tipo de
foliar, como ocurre en las coníferas, se suce- meristema puede iniciarse en forma directa, a
den una serie de divisiones mitóticas. Así se partir de células diferenciadas pertenecientes a
pueden observar, a través del estudio histológi- un explante cultivado in vitro, o indirectamente,
co, pequeñas masas de células que contienen a partir de una célula o grupo de células dife-
citoplasma denso y grandes nucleolos. Este renciadas que promueven la proliferación celu-
conjunto de células, agrupadas a modo de es- lar (Fig 4 A). Su evolución determinará el cre-
feras, fueron denominadas meristemoides por cimiento de un órgano, por ejemplo una yema
Torrey en 1966, y son responsables de la dife- adventicia (Fig 4 B).
FIGURA 1. A-D: Metafases mitóticas teñidas con coloración de Feulgen. A: Lathyrus macropus, 2n = 2x =
14, las flechas señalan los satélites de los cromosomas SAT. B: Oziroe argentinensis [citada en Fernández
y Daviña (1991) como Fortunatia biflora], 2n = 2x = 30, con un cariotipo asimétrico. C y D: Turnera sidoides
subsp. pinnatifida, C: citotipo diploide, 2n = 2x = 14 y D: citotipo tetraploide, 2n = 4x = 28. E-F: Idiogramas
de los citotipos diploide y tetraploide de Turnera sidoides subsp. pinnatifia ilustrados en C y D, respectiva-
mente. En gris se representan los satélites de los cromosomas SAT. La barra representa 10 micras en A y
B, 5 micras en C y D y 2,5 micras en E y F.
FIGURA 2. A: Bandeo Ag-NOR en una metafase de Arachis hypogaea donde se identifican las regiones
organizadoras del nucleolo en marrón oscuro (flechas). B: bandeo con quinacrina que distingue las regio-
nes heterocromáticas ricas en AT (en amarillo intenso) de las regiones eucromaticas (amarillo pálido) en
los cromosomas prometafásicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoi
en donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratinción realizada con
DAPI diferencia bandas heterocromáticas centroméricas ricas en AT (en blanco) de las porciones cromo-
sómicas eucromáticas (en azul). D: FISH que revela las regiones teloméricas (verde) de A. hypogaea. E:
FISH que revela la distribución preferencial de un retroelemento en el genoma A de A. hypogaea. F: GISH
doble sobre una metafase de A. hypogaea utilizando como sondas ADN genómico de A. ipaensis (rojo) y
de A. duranensis (verde) que demuestra la constitución alopoliploide del cultígeno y las especies diploides
progenitoras más probables. G y H: ARN-FISH en antera y ovario de Paspalum notatum utilizando como
sonda un ARN marcado de expresión diferencial y tejido-específica en plantas apomícticas pero no sexua-
les. La intensidad del color violeta indica cantidades relativas del ARN analizado presente en los diferentes
tejidos de plantas apomícticas. La barra representa 5 micras en A, C-F, 10 micras en B, 200 micras en G
y 100 micras en H.
mayores de 10 kb, el plásmido se hace gene- tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHI
ralmente inestable. y se liga a un ADN, y luego se aíslan los clones
Aunque en el ambiente natural los plásmidos transformados, aquellos transformantes que
conjugativos generalmente se transfieren por posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina
contacto célula a célula, los plásmidos vecto- no portan ningún ADN clonado. Aquellas célu-
res de clonación generalmente han sido modi- las que continúan siendo resistentes a la ampi-
ficados a fin de evitar su transferencia por con- cilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen
jugación y así lograr su contención biológica. el plásmido con el fragmento del ADN clonado.
Sin embargo, en el laboratorio es posible rea- Como la resistencia a la ampicilina y a la te-
lizar la transferencia a la célula hospedadora traciclina puede determinarse independiente-
por transformación, utilizando choque térmico mente en placas con agar, resulta fácil aislar
en presencia de cloruro de calcio o mediante bacterias que contengan los clones deseados
electroporación. y eliminar las células que no los contengan.
Aunque los primeros plásmidos utilizados
existían en forma natural, los vectores de clo-
B) Bacteriófagos o fagos:
nación actuales constituyen una generación
posterior de vectores construidos in vitro, como
Fago λ: se caracteriza por ser un fago es-
el plásmido pBR322 (Fig. 2). En este plásmi-
pecializado en la transducción (transducción
do, el sitio de restricción de BamHI está dentro
especializada) por lo tanto este fago puede uti-
del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio
lizarse también como vector de clonación para
para PstI está dentro del gen de resistencia a
la ampicilina. Si se inserta un fragmento de un la recombinación in vitro. Es un vector de clo-
ADN en uno de estos sitios, la resistencia al an- nación particularmente útil porque:
tibiótico conferida por el gen que contiene este 1. Se conoce bien su estructura, genética
sitio se pierde (inactivación por inserción). Por molecular y funcionamiento
habitual. El marcador seleccionable suele ser junto con la falta de familiaridad en el manejo
un gen de tipo silvestre que le confiere la ca- de levaduras entre biólogos moleculares, limi-
pacidad prototrófica a la célula hospedadora. taron el uso de los YACs. Para superar estas
El mas comúnmente utilizado es URA3+, que dificultades fueron desarrollados los cromo-
confiere a las auxótrofos URA3- la capacidad somas artificiales de bacterias (BACs) consti-
de desarrollarse en un medio de cultivo sin ura- tuyen un sistema de clonación que mantiene
cilo. Durante la meiosis los YACs se aparean un bajo número de copias en cada bacteria,
con cualquier YAC homólogo presente, resul- garantizando una recombinación mínima entre
tando en una alta frecuencia de recombina- diferentes fragmentos de ADN y son de sencilla
ción entre los fragmentos clonados. Esta alta manipulación. Los BACs se basan en el plás-
frecuencia de quimerismo lleva a predicciones mido F de 7kb de E. coli y pueden llevar inser-
inexactas en los mapas físicos moleculares y, tos de 300 kb aunque el promedio es de 100
aislada en el género Escherichia, especie Las escisiones realizadas por las endo-
coli, cepa RV 13. Se utiliza el término isoqui- nucleasas de tipo II, pueden resultar en
zómeros para las enzimas que reconocen la extremos romos o cohesivos. En el primer
misma secuencia de ADN pero han sido ob- caso, se producen cortes escalonados
tenidas de diferentes especies de bacterias. que crean colas cortas de cuatro bases de
Pueden diferenciarse tres tipos de enzi- cadena simple en cada extremo del frag-
mas de restricción. Las de tipo I y III escin- mento. Estas colas tienden a asociarse
den en sitios alejados de la secuencia de re- con una cadena complementaria por apa-
conocimiento, requiriendo de ATP para reali- reamiento de bases (Fig. 4a), a secuen-
zar el traslado del sitio de reconocimiento al cias complementarias de otro fragmento
de acción y tienen actividad de restricción y con colas generadas por la misma enzima.
metilación simultáneamente. En cambio, las Cuando se generan extremos romos, el
de tipo II cortan en el sitio de reconocimien- ADN es clivado en el centro de la secuen-
to, tienen actividad de restricción exclusiva- cia de reconocimiento, en el mismo punto
mente y reconocen secuencias palindrómi- en ambas cadenas, no quedando bases
cas (secuencias que se leen igual en ambas desapareadas en los extremos por lo que
direcciones). Estas últimas son las utiliza- no presentan tendencia a unirse con otros
das para el clonado de ADN, aunque tienen fragmentos por complementariedad (Fig.
otras aplicaciones como las construcción de 4b).
mapas de restricción de un plásmido o bac- Aunque por su especificad y versatilidad
teriófago, fragmentación del ADN genómico las endonucleasas de restricción son las
para su separación por electroforesis con enzimas las mas renombradas, la tecno-
aplicación en técnicas como “Southern Blot” logía del ADN recombinante no sería fac-
o fingerprinting o la generación de fragmen- tible sin la participación en el proceso de
tos para ser usados como sondas. otras enzimas de roles diversos (Tabla 1).
Este ciclo es repetido por algunas decenas de Después de apenas 20 ciclos se logra más
veces y, como el producto de cada polimeri- de un millón de veces la cantidad inicial de la
zación sirve como molde para el siguiente, en secuencia de interés. Esta escala de amplifi-
cada ciclo se duplica la cantidad de producto cación permite, por lo tanto, iniciar el proceso
sintetizado. Es necesario tener en cuenta que, con cantidades mínimas de ADN (del orden de
además de la enzima, los cebadores y el ADN pico o nanogramos) y terminar la reacción con
de interés, para que se produzca la amplifica- grandes cantidades de una secuencia de inte-
ción es necesaria la presencia de un medio rés. La versatilidad de esta reacción es enorme
tamponado y desoxinucleótidos (dNTPs) y clo- y la combinación de la PCR y la secuenciación
ruro de magnesio que actúa como cofactor de constituye una poderosa herramienta para el
la enzima. El resultado de la reacción es un análisis de genes.
fragmento de ADN de doble cadena cuyos ex- Como hemos mencionado, la técnica de
tremos corresponden a los extremos 5´ de los PCR es de suma utilidad para amplificar ADN
cebadores y su tamaño a la distancia entre los a partir de fragmentos clonados en distintos
mismos. A pesar de que se forman moléculas vectores, donde los cebadores son comple-
más largas a partir del molde original en cada mentarios a los sitios del vector que flanquean
ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no el fragmento inserto. La versatilidad de la PCR
contribuyen significativamente a la masa final incluye la amplificación a partir de ADN de ma-
de secuencia blanco. terial embebido en parafina por varios años,
Figura 7. Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. El ADN del fago contiene dos sitios de restricción
EcoRI. El ADN de la región central no esencial del fago se reemplaza por ADN foráneo, uniendo los frag-
mentos del fago con el ADN a clonar a través de la enzima ADN ligasa. Es necesario previamente adicionar
al ADNc adaptadores que llevan sitios EcoRI, para generar extremos cohesivos para acoplarse con el ADN
del fago. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem, flanquedas por sitios
cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, que se utilizarán
para infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de una
molécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. Para la localización del gen de
interés en la genoteca, es necesario hacer una copia de la placa en membrana de nylon, que luego será
hibridada con una sonda para el gen marcada apropiadamente. Si la marcación es radiactiva, por ejemplo,
será revelada por autoradiografía y el clon se identifica por comparación entre la marca de la membrana
de nylon y la placa de bacterias.
ciado: la detección de las bandas de ADN y la completada los productos de las 4 reacciones
traducción de un patrón de bandas en uno de se mezclan y se corren en una sola calle de un
secuencia. Estos equipos utilizan nucleótidos gel, en un secuenciador automático. A medida
marcados con fluorocromos. Se utilizan 4 co- que los fragmentos pasan a través del láser,
lorantes diferentes, que al ser exitados por lá- sus marcas fluorescentes se excitan y emiten
ser emiten luz de diferente longitud de onda. luz que se detecta mediante un fotomultiplica-
Los colorantes pueden utilizarse para marcar dor. Después de ser procesada por una com-
el primer universal de secuenciación de M13 putadora, la secuencia es mostrada como una
o cada uno de los 4 terminadores de cadena serie de picos o cromatograma, donde cada
didesoxi. En este caso, cada mezcla de reac- uno de los 4 colores representa a un nucleótido
ción con un terminador diferente se marca con diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro:
un colorante diferente. Cuando la reacción es guanina y azul: citosina) (Fig. 9).
5.3.1 Isoenzimas
Las isoenzimas se definen como diferentes
formas moleculares de una enzima, que po-
seen una actividad catalítica común, es decir
actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cam-
bios en el ADN que codifica estas enzimas
(mutaciones) pueden resultar en cambios en la
composición de aminoácidos, originando pro-
teínas con la misma actividad biológica pero
con diferente carga neta y por lo tanto con dife- Figura 1.
rentes velocidades de migración en un campo
eléctrico. Estas diferencias determinan patro-
nes característicos de migración electroforética Las isoenzimas se extraen por homogenei-
de las formas iso-enzimáticas. Varios factores zación del tejido (semilla, raíz, hoja) en condi-
definen el patrón de bandas o zimograma: i) ciones no desnaturalizantes (que preservan la
Número de genes que las codifican: la pre- actividad catalítica de la enzima) y se analizan
sencia de varios genes codificando para una mediante electroforesis en un soporte sólido,
misma enzima ha sido atribuida a procesos de generalmente almidón. El gel puede ser corta-
duplicación génica y subsecuente divergen- do en capas horizontales y cada una se desti-
cia a través de mutaciones diferentes en cada na a una solución de revelado específica que
caso; ii) Estados alélicos: el proceso más sim- consta de un sustrato, un colorante y cofacto-
ple de generación de nuevas formas enzimá- res, disueltos en un buffer apropiado. La reac-
ticas es la mutación de un gen estructural, las ción que ocurre entre las enzimas presentes
variantes alélicas se denominan aloenzimas. en el gel y el correspondiente sustrato generan
Estos marcadores muestran codominancia productos coloreados que conforman el patrón
(en un individuo diploide ambos alelos de un de bandas. Las metodologías empleadas en
locus son expresados y visualizados). A modo la extracción y electroforesis son relativamen-
de ejemplo, la enzima alcohol dehidrogenasa te sencillas y rápidas y el equipamiento es de
(ADH), puede comprender varios loci y alelos bajo costo.
con denominación Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Las isoenzimas han tenido un rol prominente
Adh-2b, Adh-2c, etc.; iii) Estructura cuaterna- en estudios de poblaciones vegetales para de-
ria de los productos proteicos: la enzima fun- terminar variabilidad y estructura genética, sis-
cional puede estar compuesta por un número temática y biología evolutiva así como en des-
variable de sub-unidades. En las formas más cripción de germoplasma e identificación de
simples o monoméricas los individuos homoci- variedades. Su aplicación en la construcción
gotas presentan una banda y los heterocigotas de mapas se ha visto limitada por el número
simplemente la suma de ambas. Cuando la es- de marcadores isoenzimáticos disponibles (en
tructura cuaternaria se vuelve más compleja, general menor a 50), y por su reducido poli-
encontramos enzimas activas compuestas por morfismo (2-4 alelos). Por otro lado, las formas
dímeros, tetrámeros, etc. En este caso el indivi- enzimáticas extraídas de hoja o raíz (no así las
duo heterocigota presenta bandas adicionales de semilla) presentan variaciones en relación a
Figura 2.
Figura 4.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 2.
Existe una relación entre la distancia física considerando un nivel de significancia prede-
a la que se encuentran 2 loci y la probabilidad terminado (p ≥ 0,05 o 0,01), aunque también
de que se produzca un CO entre ellos. Cuanto es posible utilizar el LOD score (ver punto 2.4).
más alejados estén uno del otro mayor será Si la probabilidad asociada al Χ2 obtenido para
la probabilidad de que ocurra un entrecruza- cada locus en forma individual es superior a la
miento y se generen gametas recombinantes. predeterminada, se considera que ambos mar-
Consecuentemente, si dos loci están lo sufi- cadores segregan de acuerdo a lo esperado.
cientemente separados en el cromosoma como En el segundo paso, el número de progenies
BC1: población de retrocruzamiento; F2: población tipo F2 (iii) Prueba de segregació n de factores simples A/a y B/b
derivada del cruzamiento entre 2 progenitores heteroci-
gotas; RIL: población de líneas endocriadas recombinan- Número de individuos con fenotipo A = 60 + 4 = 64
tes (RILs por Recombinant Inbred Lines) y DH: población Número de individuos con fenotipo a = 59 + 3 = 62
de haploides duplicados. X2 1 g.l .= 0.03 n.s
Número de individuos con fenotipo B = 60 + 3 = 63
Número de individuos con fenotipo b = 59 + 4 = 63
X2 1 g.l = 0.00
La hipótesis nula (Ho) es que ambos loci se-
gregan independientemente y la hipótesis al- (iv) Prueba de segregació n independiente de locus A y B
ternativa (HA) es que ambos loci están ligados. Fenotipos Frecuencia No. No.
d Valores genotípicos
-a a
M1 M1 M2 M2 1 0 0 1 0
M1 M1 M2m 2 1-p p 0 1-p p
M1 M1 m2m2 (1-p)2 2p(1-p) p
2
1-2p 2p(1-p)
M1m1 M2 M2 p 1-p 0 p 1-p
M1m1 M2m 2 cp(1-p) 1-2cp(1-p) Cp(1-p) 0 1-2cp(1-p)
M1m1 m2m2 0 1-p p -p 1-p
M1m1 M2 M2 p2 2p(1-p) (1-p)2 -(1-2p) 2p(1-p)
m1 m1M2m 2 0 p 1-p -(1-p) p
m1 m1m2m2 0 0 1 -1 0
ligado contribuye a la variación fenotípica; blación F2 pueden ser estimados los efectos
2) interfiere en la estimación del efecto del QTL aditivo y de dominancia, en un RC el efecto g1
y 3) removiendo el efecto de la segregación o g2 y sólo el efecto aditivo en poblaciones de
del otro QTL se reduce la varianza residual RILs y DH. Para determinar si el valor de cada
del intervalo en consideración, aumentando el efecto estimado es diferente de cero se usan
poder de detección y precisión. El mapeo por las estadísticas LR o LOD. En muchos trabajos
intervalo compuesto (Jansen 1993, 1994; Zeng de mapeo un valor de LOD superior a 2 – 3
1993, 1994), combina el mapeo por intervalo es utilizado como criterio para declarar la pre-
con la regresión múltiple. Esta última, permite sencia de un QTL. Esta forma de determinar el
incluir en el mapeo marcadores ubicados por valor umbral o crítico es arbitrario y la mayoría
fuera del intervalo como cofactores, incremen- de los autores no lo consideran el más adecua-
tando el poder de detección y precisión en la do, pues la probabilidad e detectar al menos un
estimativa de la posición del QTL. La pregunta falso positivo (declarar la real la presencia de
de cuántos cofactores deben utilizarse no es un QTL inexistente) en alguna región del ge-
de fácil respuesta. En principio los dos marca- noma es prácticamente 1 (100 %). Se propuso
dores que flanqueen el intervalo deben ser in- disminuir este sesgo determinando un nivel de
cluidos, al igual que aquellos que resulten sig- significancia para cada cromosoma. En este
nificativos en una regresión múltiple. Definidos caso, el nivel de corte para cada cromosoma
los marcadores que se utilizarán como cofac- correspondería al del genoma completo dividi-
tores, la metodología de mapeo por intervalo do el número de cromosoma o grupos de liga-
compuesto se aplica exactamente igual a la de mientos obtenidos. También es posible definir
mapeo por intervalo simple. un nivel de significancia para cada intervalo, di-
vidiendo la significancia del cromosoma por el
3.4. Test de hipótesis y nivel de número de intervalos en el grupo de ligamiento
significancia (número de marcadores menos uno).
La formulación de hipótesis adecuadas y Finalmente, el valor crítico de corte puede
utilización de estadísticos apropiados, para la establecerse empíricamente mediante el test
evaluación de las mismas, es esencial para de permutaciones que es actualmente el más
declarar la presencia de un QTL. En una po- usado. Para realizar este test deben numerar-
Figura 2: Sintenia entre los genomas de varias gramíneas. El genoma de arroz contiene grupos de mar-
cadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas pueden
sintetizarse básicamente como compuestos por «bloques de ligamiento de arroz». En la figura se muestra
el alineamiento de los cromosomas y segmentos de cromosomas (identificados con letras mayúsculas)
de varias gramíneas con los del arroz (centro). El genoma del maíz tiene dos copias semejantes de cada
bloque de genes por lo que está representado por dos anillos del círculo. Las líneas externas punteadas
conectan sectores adyacentes de los cromosomas de trigo. Modificado de Gale y Devos (1998).
2) -Mapeo Cromosómico
marcador 2
marcador 1 gen marcador 3
3) -Mapeo de Restricción
gen marcador 2
3) -Mapeo Físico
gen fragmentos
clonados
2) -Mapeo Cromosómico
marcador 2
marcador 1 gen marcador 3
3) -Mapeo de Restricción
gen marcador 2
3) -Mapeo Físico
gen fragmentos
clonados
Genoteca de BACS
Clones organizados
en Contigs
Secuenciado
Ensamblado
vida del organismo. Para ello se obtienen po- genoma completo. Para ello, el ADN genómi-
blaciones de ADNc (que reflejan sólo secuen- co total se digiere con enzimas de restricción
cias expresadas) que se secuencian de forma apropiadas o se fragmenta mecánicamente en
masiva para generar miles de secuencias par- fragmentos de gran tamaño (100-300 kb.), que
ciales conocidas como ESTs (Parte I, Cap. 8). se clonan en vectores apropiados, para cons-
Estas secuencias de entre 300-500 pb. suelen truir genotecas que contienen, al menos, una
ser suficientes para la identificación de los ge- representación completa del genoma, que pue-
nes mediante comparación con las secuencias de estudiarse en detalle y secuenciarse (Parte
existentes en las bases de datos públicas (ej. I, Cap. 4). A fin de distinguir las regiones codi-
Genbank, EMBL), utilizando para ello progra- ficantes de las no codificantes, las secuencias
mas de análisis informático (Parte I, Cap.12). se comparan con las de ESTs y ADNc previa-
Si la información contenida en la secuencia mente estudiados.
parcial no es suficiente, habría que determinar
la estructura del ADNc completo para estudiar Para reconstruir la secuencia del genoma
su función por otros métodos. original a partir de los fragmentos clonados se
utilizan las siguientes estrategias:
- Secuenciación genómica
La aproximación anterior no permite iden- a) Secuenciación de los clones y
tificar genes que se expresan a bajo nivel o ensamblado de los fragmentos
en situaciones fisiológicas no consideradas o El clonado comienza obteniendo un número
regiones no representadas en el ARNm. Para elevado de fragmentos al azar que se clonan
obtener esta información debe secuenciarse el en un vector apropiado. En la preparación de
Figura 5: Montaje de un genoma complejo mediante la secuenciación completa del genoma por tiros de
escopeta («whole genome shotgun sequencing»). En primer lugar, se construyen los contiguos con las
secuencias que se superponen. Finalmente se utilizan los extremos apareados para cubrir los intervalos
sin secuencia y así orientar y ordenar los contiguos en unidades llamadas andamios (scaffolds) Modificado
de Griffths et al. (2004).
genéticos comparativos que demuestran las muy diferente entre estas especies, ¿cuál es la
relaciones interespecíficas (Fig. 7). En térmi- base de la mayor complejidad en los humanos?
nos genéticos, las gramíneas representan una La explicación estaría en el proteoma, más
familia muy diversa. Se estima que el genoma que en el genoma. Las proteínas codificadas
de las mismas divergió hace alrededor de 65 por los genes pueden agruparse en familias en
millones de años desde un antecesor común. base a su similitud y muchas de estas familias
El nivel de ploidía y el número básico de cro- proteicas son compartidas por todos los grupos
mosomas son muy variables, así como el ta- mencionados, aunque el número de miembros
maño del genoma. por familia es mayor en humanos.
Esto es particularmente evidente en aque-
6 Algunas generalizaciones acerca de los llos genes involucrados en el desarrollo. Los
genomas humanos tenemos 30 genes para factores
Los estudios en especies modelo han per- de crecimiento del fribroblasto, mientras que
mitido arribar a varias generalizaciones. Una Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2.
de ellas es que el número de genes no es Las nuevas proteínas surgen a través de cor-
la base de la complejidad. La mosca de la tes y empalmes alternativos de un mismo ARN
fruta tiene unos 13.000 genes, Caenorhabitis mensajero (alternative splicing), lo que permi-
elegans 18.000, Arabidopsis 26.000 y los hu- te aumentar considerablemente la diversidad
manos 30.000. Si el número de genes no es proteica a partir de los mismos mensajes. Las
predicciones indican que el 60% de los genes los exones (secuencias del mensajero que se
humanos tiene dos o más alternativas de em- encuentran representadas en la proteína, las
palme. En Caenorhabitis el 22%. secuencias correspondientes a los intrones no
Un elevado número de factores de trans- lo están) comprenden un porcentaje bajo del
cripción y modificaciones postraduccionales genoma, mientras que los intrones compren-
también conducen a una mayor complejidad. den el 24%. Los genes no están distribuidos en
En el caso de Arabidopsis, cerca del 9% de forma pareja. Algunos se encuentran agrupa-
los genes son factores de transcripción (FT). dos en ciertas regiones del genoma mientras
Si se compara la proporción con los genomas que otros se encuentran aislados. En la mosca,
de otras especies, se observa que Arabidopsis el nematodo y Arabidopsis la disposición de los
no sólo tiene más genes que algunos anima- genes es mucho más regular.
les pequeños, sino que la proporción de FT es Aproximadamente la mitad del genoma hu-
más alta que en cualquier clase de organismo mano consiste de secuencias repetitivas,
estudiado. Esto parece reflejar el hecho de siendo la mayoría elementos transponibles
que las plantas deben adaptarse a una amplia que se propagan replicándose e insertando
variedad de condiciones medioambientales, a una copia de sí mismos en otras regiones del
diferencia de los animales, que pueden movili- genoma. En la actualidad solo dos tipos de ele-
zarse y cambiar de lugar si este no les resulta mentos son activos, Alu y LINE1. La mayoría
propicio. de los mismos se encuentran en regiones ricas
En humanos, los genes ocupan una cuarta en A y T, mientras que los genes se encuen-
parte del genoma, y sólo el 1,5% codifica para tran en áreas con elevado contenido de G y
proteínas. Las secuencias correspondientes a C. Fragmentos de estos elementos también
Figura 8: a) Elementos repetitivos en un fragmento cromosómico de maíz. b) Diagrama que muestra como
los elementos transponibles en gramíneas son responsables del incremento en el tamaño del genoma.
El arroz, sorgo, cebada y maíz derivaron de un ancestro común hace aproximadamente 70 millones de
años. Desde entonces, los transposones y retrotransposones se han ido acumulando a diferentes niveles
en las especies. Los cromosomas son más largos en maíz y cebada, cuyos genomas contienen grandes
cantidades de retros con LTR (long terminal repeats). En verde se señalan los elementos transponibles y
en naranja los genes. Modificada de Griffths et al. (2000).
Primera hibridización
a , d no hay amplificación
b´ b b´ no hay amplificación
c amplificación lineal
e amplificación exponencial
Figura 1.
los geles. La visualización de los productos de la otra, o aquellos que están presentes con di-
PCR se logra luego de la electroforesis en ge- ferentes intensidades relativas en los distintos
les de poliacrilamida seguida de la apropiada tratamientos experimentales, representan po-
generación y detección de imágenes, que son tenciales transcriptos de ARNm de expresión
evaluadas comparando la intensidad relativa diferencial. Típicamente, las bandas son eva-
de las bandas producidas a partir de diferentes luadas sólo si amplifican en forma consistente
muestras experimentales. Los fragmentos que en reacciones de PCR duplicadas para cada
están presentes en una muestra y ausentes en muestra (ver la Figura 2).
)A n (A)A
)A
(A
A)A A) A)
n
(n A A(n A A)A
A ( AA
AA
AA AA A( (n A
A
n AA AA
A
n A
AA
A)A(n AA
A)A( nAA
A A
AAA(A)nA
AAA(A)nA
A)A( AA AAA A
n A
AA
(A) A A)A( nAA
( nAA AAA
n
A)AA(AA AAA(A AA
(A) A
A n) )n A
( nA
n
AA A)A
AA
AA
A(A
(A
(A
)n A
AA
)A
)A
n
n
A
A
A(A
An )
Transcripción reversa usando
cebador ancla del tipo 5’T(T)nTXY3’
Muestra 1 Muestra 2
Figura 2.
La fase final del display diferencial consiste casos debe realizarse un alineamiento de las
en la identificación de la secuencia del trans- imágenes de los fragmentos de amplificación
cripto representado por el producto de PCR y con el gel de poliacrilamida seco. En los casos
la confirmación de que éste realmente se ex- en que se utiliza tinción con nitrato de plata no
presa en forma contrastante. Estas etapas se es necesario realizar este paso, por lo cual la
logran localizando físicamente y escindiendo la recuperación de la banda es mucho más efi-
sección del gel de poliacrilamida que contiene ciente. Los productos de PCR son purificados
al producto de interés. En la mayoría de los del gel y reamplificados. Para ello el fragmento
mRNA AAAAAAAAAAAAAn(A)A
TTTTTTTTTTTTTT
Cebador Oligo dT
AAAAAAAAAAAAAn(A)A
TTTTTTTTTTTTTT
Síntesis de cDNA
cDNA
Amplificación selectiva
de fragmentos XY
YX
XY
YX
Figura 3.
División a la mitad y
añadido de los adaptadores A y B
CATG AAA(A)nA CATG AAA(A)nA
A GTAC TTT(T)n T B GTAC TTT(T)n T
CATG AAA(A)nA CATG AAA(A)nA
A GTAC TTT(T)n T B GTAC TTT(T)n T
CATG AAA(A)nA CATG AAA(A)nA
A GTAC TTT(T)n T B GTAC TTT(T)n T
Cebador A GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC
CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGG Cebador B
Etiqueta doble (ditag)
Corte con la “enzima ancla” (ET),
purificación de las “ditags”,
concatenado y clonado
CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG
GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC
AE Tag 1 Tag 2 AE Tag 3 Tag 4 AE
Ditag Ditag
Figura 4.
Transcripción reversa
y marcaje con fluoróforos
Clones de DNA
Impresión robótica
Hibridización
al microarreglo
Laser 2
Excitación
Laser 1
Emisión
Análisis computacional
Figura 5.
a que hay un único punto de unión y una mayor Originalmente, las sondas de ADN eran di-
retención de la sonda al sustrato. También se sueltas en soluciones con alto contenido de
han desarrollado otros sustratos para producir sales. Luego se introdujo la utilización de de-
señales más intensas y que demanden me- tergentes para mejorar la morfología de las
nores cantidades de sondas. Para lograrlo se descargas. Sin embargo, algunos investigado-
aumentó la cantidad de grupos reactivos sobre res informaron que la presencia de detergen-
la superficie. Esto se puede lograr cubriendo tes resulta en un mayor arrastre de la sonda
los portaobjetos con dendrímeros, mezclas de y una mayor variabilidad entre una deposición
epoxisilano y aminosilano o con polímeros que y la siguiente. La utilización de soluciones de
se auto-absorben. descarga conteniendo agentes higroscópicos
Estados de desarrollo
Germinación
Plantas maduras
Plantas jóvenes
6. Perspectivas
Los resultados obtenidos mediante estudios
de proteómica en sus distintas aplicaciones
han indicado que los estudios de genómica
y transcriptoma no son suficientes, dado que
la proteómica generalmente evidencia pro-
cesos no detectados por los otros estudios
mencionados.
Esto se debe fundamentalmente a que las
proteínas son física y químicamente más diver-
sas que los ácidos nucleicos. Además, debido
al procesamiento del ARN y a las modificacio-
nes postraduccionales, las proteínas de un
dado organismo exceden en número la can-
tidad de genes. Otro nivel de complejidad se
presenta si se tienen en cuenta la interacción
de proteína-proteína, lo cual modifica las pro-
piedades de las proteínas individuales.
De esta manera, el estudio del proteoma,
en paralelo con el del transcriptoma, llevado a
cabo sobre el mismo sistema, podrá dilucidar
los mecanismos de control de expresión de
proteínas y evidenciará los procesos biológicos
llevados a cabo en una determinada situación.
7. Bibliografía
Figura 2. Espectro de masas del aminoácido fenilalanina. Sobre las abscisas se observan las relaciones
masa/carga (m/z) de los diferentes fragmentos obtenidos luego de la ionización de la molécula. Sobre las
ordenadas se grafican las intensidades relativas de cada fragmento obtenido. Bajo condiciones experi-
mentales definidas estas intensidades son proporcionales a la cantidad de la molécula en análisis presente
en una muestra dada. Fuente: adaptado de “The Golm Metabolome databases”.
Figura 3. Esquema en donde se muestra los niveles de energía de los núcleos en presencia o ausencia de
un campo magnético externo (B0) y las transiciones de los núcleos entre un nivel de energía y otro superior
al absorber una frecuencia (υ0) correspondiente a la diferencia de energía (∆E).
modo de analizar cualitativamente el gradiente dos para las condiciones evaluadas, producto
diferencial por tratamiento y por gen mediante final de un análisis de microarreglos.
un gráfico de perfiles de expresión individua-
les. De estos resultados surgieron genes can- Búsqueda de marcadores funcionales en
didatos de interés para su análisis de expresión bases de datos genómicos
diferencial, de los cuales 15 fueron selecciona- Como mencionamos anteriormente, la se-
dos para validar mediante la técnica de PCR cuenciación completa de los genomas de es-
cuantitativa (qPCR). pecies modelo o parcial de especies de interés
Este último paso de validación es de una ha generado una rápida acumulación de infor-
herramienta indispensable en el análisis de mación biológica que es depositada en bases
microarreglos ya que por todo lo expuesto de datos genómicas y es fácilmente accesible
anteriormente podemos inferir que los genes a través de Internet. Esta información, que de-
obtenidos son producto de transformaciones riva en muchos casos de la caracterización de
numéricas y una evaluación subjetiva al crite- líneas elite de una misma especie, de especies
rio estadístico aplicado. Es así que podemos de un mismo género o de distintas fuentes re-
concluir que la validación experimental confie- lacionadas, constituye el recurso que permite
re rigurosidad biológica a un conjunto de su- sistematizar el desarrollo de marcadores mo-
puestos genes candidatos obtenidos a partir de leculares potencialmente asociados a la varia-
una lista de genes diferencialmente expresa- ción fenotípica para caracteres de interés. El
Tabla 1. Resumen de los avances metodológicos posibilitados por las técnicas de fertilización in vitro
para el estudio del proceso de la doble fecundación de las Angiospermas (Modificado de Wang y col.,
2006).
Investigar los aspectos Hibridar especies distantes Investigar las diferencias entre
moleculares de la las células del saco
embriogénesis embrionario
Aislamiento de protoplastos
Fusión de protoplastos
Selección de
células híbridas
Protoplastos híbridos
Híbrido Carácter
Híbridos simétricos
Solanum tuberosum x S. brevidens Resistencia al virus del enrollamiento de la hoja de
papa (PLRV), al hongo Phytophtora infenstans y a
la bacteria Erwinia cartovora.
S. tuberosum x S. circaeifolium Resistencia a P. infenstans y al nemátodo
Globodera pallida.
S. tuberosum x S. phureja Mayor productividad de tubérculo.
S. melongena x S. integrifolium/S. saintwongseis Resistencia a la bacteria Pseudomonas
solanacearum .
Híbridos asimétricos
Brassica oleracea x B. campestris Resistencia al hongo Phoma lingam.
B. napus x B. carinata/B. juncea Resistencia a P. lingam
.
Nicotiana tabacum x N. Repanda/N. glutinosa Hipersensibilidad al virus del mosaico del tabaco
(TMV).
Cíbridos
B.campestris (silvestre) x B.napus/B. campestris Resistencia al herbicida atrazina y esterilidad
(cultivar) masculina
citoplasmática (CMS).
caciones para este fenómeno, como por ejem- cundación de plantas regeneradas. Se lograron
plo que la resistencia o tolerancia observada avances en el mejoramiento de esta especie
se deba a cambios epigenéticos, a la naturale- en caracteres cuali y cuantitativos. Ejemplos
za quimérica del material, al uso de toxinas no en éste y otros cultivos importantes, con varie-
específicas (en el caso de resistencia a enfer- dades comerciales obtenidas por esta técnica,
medades), a la complejidad del carácter a ser se detallan en la Tabla 1.
seleccionado (como por ejemplo la resistencia
a salinidad o sequía) o a la imposibilidad de Además, se pueden mencionar logros en
las células para expresar el carácter cuando otros cultivos, por ejemplo:
se diferencian. Para las dos estrategias que se En papa, se logró resistencia a Phytophthora
citaron previamente, a y b, la obtención de re- infestans, a Alternaria solani y a la colonización
sistencia sólo será posible si ésta existe en la por áfidos que transmitían el virus Y (PVY), y
población original (entonces el cultivo in vitro el virus del enrollamiento de la hoja (PLRV). En
sólo serviría para recuperar los genotipos úti- este caso la resistencia surgió a través del cul-
les) o bien si surge por variación somaclonal tivo de protoplastos provenientes de suspen-
durante el proceso de cultivo. siones celulares cromosómicamente variables
del cultivar “Russet Burbank”.
6 Variantes somaclonales liberadas co-
mercialmente En banana se obtuvo resistencia a Fusarium
en cultivares que no habían podido ser mejo-
Dentro de los primeros registros de variación rados por métodos tradicionales. No obstante,
somaclonal en cultivos de importacia econó- para lograr una variedad con rendimiento equi-
mica se encuentra la variación registrada en parable a las variedades no resistentes, se ne-
arroz, donde se informó en detalle la variación cesitó un trabajo posterior que permitió combi-
obtenida en la progenie derivada de la autofe- nar ambas características en un somaclón.
En tabaco, se obtuvieron cultivares toleran- yecto para obtener somaclones de pasto llorón.
tes a aluminio y resistentes a herbicidas. Se trabajó con varios cultivares de esta gramí-
nea apomíctica y luego de la evaluación de un
También, mediante la aplicación de esta es- gran número de plantas se seleccionaron los
trategia se obtuvieron cambios interesantes siguientes materiales:
para su explotación comercial en especies orna- - Una planta diploide sexual, obtenida a par-
mentales. Variaciones en el color de las flores, tir de un cultivar tetraploide apomíctico. Este
la arquitectura de la planta y el número de flores material fue registrado en el Instituto Nacional
por planta se citaron en gerbera, clavel, cri- de Semillas.
santemo, tulipán, violeta africana y begonia. - Utilizando un tratamiento de duplicación
Dentro de las especies forrajeras, se han cromosómica, se trató semilla, de una planta
observado variaciones en plantas de alfalfa re- R1 derivada de la planta anterior obteniendo
generadas por cultivo in vitro, para caracteres un genotipo tetraploide, altamente sexual, tam-
como altura y resistencia a Fusarium oxyspo- bién registrado.
rum. En gramíneas forrajeras como Lolium y
Festuca arundinacea se han citado cambios, Estos dos materiales se utilizan actualmente
en varios caracteres como por ejemplo: mor- para realizar estudios básicos acerca del modo
fología de planta, forma y tamaño de hoja y de reproducción (apomixis) y en la generación
espiga, desarrollo floral, vigor y supervivencia, de poblaciones de mapeo para el análisis del
y en pasto bermuda (Cynodon dactylon), resis- modo reproductivo y de caracteres agronómi-
tencia al moteado de la hoja cos de importancia.
En el laboratorio de Genética del Dpto. de - Dos plantas heptaploides apomícticas a
Agronomía de la UNS se llevó a cabo un pro- partir de un cultivar tetraploide apomíctico. Una
y cuando hay más de una copia, éstas suelen un mismo sitio del genoma con distinto grado
distribuirse en loci independientes, lo que fa- de reordenamiento de la secuencia del trans-
cilita la posterior eliminación de las copias no gen. Este último aspecto es considerado como
deseadas por segregación. Por otra parte, el una desventaja ya que tanto desde el punto de
mecanismo involucrado hace que se transfie- vista de la percepción pública como el de la op-
ra un segmento de ADN definido: el T-ADN, timización de la expresión de los transgenes,
acompañado de proteínas que lo protejen de es deseable disponer de inserciones simples
la acción de nucleasas. Por el contrario, en el y bien definidas molecularmente. Esto es par-
método biolístico el ADN transferido no está ticularmente relevante cuando se tiene por ob-
asociado a proteínas, por lo que al ser parcial- jetivo el desarrollo de productos comerciales.
mente degradado solo parte del mismo llega al Así, el fenómeno de silenciamiento de transge-
núcleo donde se produce, con baja eficiencia, nes (pérdida de su expresión), observado en
la integración al azar en el ADN cromosómico. algunos casos, puede resultar de la presencia
En este método es común que se produzcan de varias copias del transgen. Por otra parte,
inserciones de varias copias del transgen en cuando se utiliza el método biolístico, el seg-
Marcadores
b) 1 2 3 4 5 c) 1 2 3 4 5 d) 1 2 3 4 5
Sitio de Ausente dentro del T- Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre el
corte: ADN marcador y el transgen
Sonda: T-ADN (frag. Hind III) T-ADN (frag. Hind III) Gen marcador
Frag: tamaño > 5 kb > 2 kb > 2 kb
cantidad Variable El doble que en b) Igual en en b)
e) 1 2 3 4 5 f) 1 2 3 4 5
Sitio de Un sitio (Eco RI) entre el Dos sitios (Sal I) dentro del
corte: marcador y el transgen transgen
Sonda: Transgen Fragmento (Sal I) del
transgen
Frag: tamaño > 3 kb 1 kb
cantidad Igual que en d) Uno
para cada sitio de inserción independiente del pérdida del sitio de corte. La aparición de una
T-ADN (4-c). La aparición de un número impar banda del tamaño del T-ADN puede indicar la
de bandas indica que en un mismo sitio se in- presencia de repeticiones en tandem. Para es-
sertaron múltiples copias, ocurrieron rearreglos timar el número de copias del transgen en un
o se produjo el truncado del T-ADN. Si se di- locus transgénico, se deben utilizar enzimas de
giere la muestra con una enzima de restricción restricción con sitios flanqueantes del transgen
que posee un sitio único de corte entre el gen y como sonda el transgen. Se observará una
marcador y el gen de interés y utilizando como sola banda del tamaño del transgen, sin em-
sonda el gen marcador, se obtendrá una sola bargo la intensidad de la señal variará entre las
banda por cada inserción independiente (4-d). distintas plantas analizadas de acuerdo al nú-
Si la membrana se hibrida con el gen de in- mero de copias del mismo (4-f). Para realizar
terés (4-e) aparecerá un patrón que tendrá el esta comparación es necesario utilizar simultá-
mismo número de bandas que el anterior. La neamente estándares conteniendo un número
ausencia de una banda indica la inserción de conocido de copias del transgen. Esta deter-
una copia truncada de uno de los genes y la minación no es del todo precisa ya que puede
Figura 1. Foto mostrando el blanqueo del tejido de plantas en las cuales se silenció el gen PDS en las
especies Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum res-
pectivamente de izquierda a derecha
Tabla 1. Clases de sRNAs y su función.* se han mantenidos las siglas en inglés. RdRP: sigla en Inglés
para RNA polimerasa – RNA dependiente. Tabla adaptada de Carrington y col., 2007.
ejemplo produciendo la metilación de los re- y col., 2000). Vaucheret y sus colaboradores
siduos de citosina de DNA y la consecuente propusieron al silenciamiento transcripcional
modificación de la cromatina. Sin embargo la como un sistema de control de la expresión
metilación per-sé no es suficiente en todos los génica de transposones y accidentalmente de
casos para el establecimiento del silenciamien- transgenes con características similares a ellos
to. A modo de ejemplo puede citarse la exis- (2001).
tencia de mutantes de los genes sil1 y mom1,
para los cuales se ha reportado la pérdida del 1.2 Silenciamiento post-transcripcional
TGS a pesar de que las secuencias se encuen- El silenciamiento génico post-transcripcional
tran metiladas (Furner y col., 1998 y Amedeo (PTGS) es un mecanismo inducible y especí-
espaciadora)
1.3 Regulación génica por mi-
croRNAs hpRNA (brazos de gen
candidato, intrón en 96 23
Como hemos mencionado, el sentido como secuencia
silenciamiento es un mecanismo espaciadora)
Tabla 2: Métodos basados en el mecanismo de silenciamiento génico, para disminuir la expresión de un gen.
miRNAs
Construcción
artificiales
empleada Antisentido HpRNAi VIGS
Requerimiento
de transgénesis
para obtener
un
silenciamiento
sistémico Si Si Si No
Formación de
Origen de Explota a los Los dsRNAs se forman
dsRNA por
dsRNAs que Formación de dsRNA por precursores de durante la replicación
apareamiento del
luego son apareamiento del transcripto miRNAs viral o bien por
transcripto
procesados sentido y del antisentido. endógenos para estructuras secundarias
sentido y del
por DCL. generar sRNAs. que adquiere el virus.
antisentido.
Figura 4. (A) y (B) Hoja de N. benthamiana agroinfiltrada con distintas combinaciones de GFP o dsGFP,
Hc-Pro, P19 y miR-GFP (micro artificial) observada bajo luz UV. (C) “Northern blot” de RNA total extraído
de las zonas infiltradas utilizando una sonda que reconoce al mRNA de GFP. (D) Detección del miR-GFP
en gel de poliacrilamida de material extraído de las zonas infiltradas. P= vector vacío.
las proteínas no esenciales e incorporar un si- dos etapas, una de iniciación y otra de mante-
tio múltiple de clonado en donde se puede in- nimiento. La primera sería absolutamente de-
troducir el fragmento del gen candidato que se pendiente de la presencia del virus, siendo los
desea silenciar, dejando las regiones no tradu- genes blancos silenciados sólo si la planta es
cibles y la región codificante de la proteína de infectada por el virus. Mientras que la segunda
la cápside intactas. Posteriormente este vec- etapa sería independiente del mismo. (Ruiz y
tor fue mejorado por el grupo del Dr. Dinesh col., 1998, Jones y col., 1999).
Kumar mediante la incorporación del promotor
35S duplicado el cual incrementa la transcrip- Consideraciones finales
ción, del terminador de la nopalina sintetasa y A lo largo de este capítulo se describieron
de la secuencia de una ribozima que permite algunas de las metodologías empleadas fre-
simular el final 3´ del genoma viral de forma cuentemente para estudios de genética rever-
más adecuada (Liu y col., 2002). sa basados en el silenciamiento génico. Como
Así, la base del silenciamiento inducido por se mencionó al inicio del capítulo el empleo de
virus puede explicarse fundamentalmente me- estas metodologías presenta ciertas ventajas
diante el mecanismo de PTGS. Estudios reali- respecto a otras, sin embargo una de las con-
zados en N. benthamiana empleando un trans- sideraciones que hay que tener en cuenta al
gén de la proteína reportera GFP muestran que usar los métodos basado en silenciamiento gé-
el mecanismo de VIGS puede ser separado en nico es la especificidad del mismo con el fin de
1. Regresión Estudiar la relación funcional entre una Una buena predicción no habilita por si sola
múltiple variable dependiente (Y) y varias variables a hacer inferencias sobre causalidad.
(RM) independientes (X1, X2 ... Xn). La predicción debe ser realizada sólo en
Predecir una variable dependiente a partir de situaciones similares a aquellas de donde el
variables independientes. modelo fue derivado (dentro del dominio de
Si los modelos están basados en los valores experimentados).
experimentación, investigar causalidad y El procedimiento sólo considera funciones
efectos. lineales de las variables analizadas.
La RM es apropiada para variables Y
continuas e independientes; en el caso que
se busque realizar inferencias estadísticas, los
errores deben ser normales, las varianzas
homogéneas el muestreo debe ser aleatorio.
2. Análisis Explorar la relación entre distintas variables El MANOVA debe cumplir con los
multivariado de independientes cualitativas (tratamientos) y supuestos de independencia de las
varianza varias variables dependientes cuantitativas. observaciones, homogeneidad de matrices de
(MANOVA) Es un método básicamente inferencial. varianza y covarianza para todos los grupos
de tratamientos y distribución normal
multivariada para todas las variables
dependientes. En algunos casos con un gran
número de vari ables dependientes el poder
estadístico del ANOVA excede al obtenido
con un simple MANOVA.
3. Análisis Describir las situaciones multigrupales, El procedimiento está indicado para
discriminante encontrar las combinaciones lineales óptimas vari ables independientes continuas, siendo
(AD) entre variables que permitan discriminar inef iciente para variables que no están
grupos de objetos. La ecuación de la función corregidos por varianzas o covarianzas. Con
discriminante lineal puede ser usada para AD sólo se encontrarán las combinaciones
clasificar observaciones o para predecir a de variables que sean lineales. Los grupos
que grupo pertenece una nueva observación. deben ser definidos a priori.
4. Análisis de Describir una matriz de datos de objetos y El procedimiento es propuesto
componentes variables en una dimensión más reducida, principalmente para variables continuas, es
principales usualmente mediante una representación ineficiente para datos que no están
(ACP) gráfica (biplot); fijar combinaciones lineales corregidos por varianzas o covarianzas. Con
no correlacionadas de las variables ACP sólo se encontrarán las combinaciones
originales maximizando sus varianzas. de variables que sean lineales.
Sugerir nuevas combinaciones de variables
para estudios posteri ores.
5. Análisis de Describir los datos mediante la reducción de Los resultados dependen del índice de
coordenadas las dimensiones entre objetos y mostrarlas di stancia elegido. El análisis produce un
principales mediante una representación gráfica. Se nuevo sistema coordenado que, a diferencia
(ACOOP) puede hacer con variables cuantitativas, de otros métodos, no puede indicar
cualitativas o con la mezcla de ambas. combin aciones de variables porque sólo
emplea la matriz de distancia entre objetos.
6. Análisis Factorial Reproducir una matriz de correlación entre Los métodos exploratorios de análisis de
(AF) variables originales suponiendo la existencia factores son tan estructurados que las
de uno o más factores no evidentes interpretaciones son subjetivas. El
(latentes). Descubrir est ructuras subyacentes procedimiento es ineficiente para datos que
en grupos de datos mediante la no están corregidos mediante correlaciones,
interpretación de estos factores. por lo que no resulta ideal para relaciones no
lineales o datos binarios.
7. Análisis de Analizar la correlación existente entre dos El análisis es ineficiente para datos que no
correlaciones grupos de variables del mismo grupo de están corregidos mediante correlaciones o
canónicas objetos. Esto se hace en forma simultánea en combinaciones lineales, por lo que no resulta
(CC) lugar de calcular correlaciones de a pares. ideal para relaciones no lineales o datos
binarios. No se pueden hacer rotaciones
como en el caso del AF lo cual dificulta la
interpretación de las combinaciones lineales
encontradas. Brinda una estimación de la
varianza entre combinaciones lineales y no
de la varianza extraída de las variables.
8. Regresión Modelar la relación entre una variable Una buena predicción por sí sola no permite
Biotecnología Xy cuantitativas
logíst ica
276 (RL) Mejoramiento Vegetal II
respuesta binaria (Y) y una o más variables
y/o categóricas.
hacer inferencias de causalidad. Las
predicciones sólo deberían ser llevadas a
La RL también sirve para investigar la cabo en situaciones similares a aquellas
asociación entre una variable X con otra utilizadas por el modelo propuesto (dentro
variable en la presencia de otras variables X. del dominio de los valores experimentados).
Si los modelos de causalidad están basados
en experimentación se podría estudiar causas
canónicas objetos. Esto se hace en forma simultánea en combinaciones lineales, por lo que no resulta
(CC) lugar de calcular correlaciones de a pares. ideal para relaciones no lineales o datos
binarios. No se pueden hacer rotaciones
como en el caso del AF lo cual dificulta la
interpretación de las combinaciones lineales
encontradas. Brinda una estimación de la
varianza entre combinaciones lineales y no
de la varianza extraída de las variables.
8. Regresión Modelar la relación entre una variable Una buena predicción por sí sola no permite
logíst ica respuesta binaria (Y) y una o más variables hacer inferencias de causalidad. Las
(RL) X cuantitativas y/o categóricas. predicciones sólo deberían ser llevadas a
La RL también sirve para investigar la cabo en situaciones similares a aquellas
asociación entre una variable X con otra utilizadas por el modelo propuesto (dentro
variable en la presencia de otras variables X. del dominio de los valores experimentados).
Si los modelos de causalidad están basados
en experimentación se podría estudiar causas
y efectos. La RL brinda una alternativa para
el AD entre dos grupos cuando las variables
son categóricas.
9. Modelos Investigar las relaciones conjuntas entre Las variables deben ser categóricas o bien se
logarítmicos variables categóricas. requiere una transformación a categóricas.
lineales
LOGL
10. Análisis de Explorar gráficamente las relaciones Es una técnica descriptiva aconsejable para
correspondencia contenidas en las tablas de contingencia. El análisis exploratorios. Es muy sensible a la
AC A C permite sugerir nuevas combinaciones presencia de “outliers”.
de variables para estudios posteriores.
11. Escalamiento Describir los datos me diante la redu cción de El análisis solamente utiliza información
multidimensional las dimensiones a través de una que está ordenada en rangos.
EMD representación gráfica, con el objetivo de
encontrar relaciones no lineales entre
objetos.
12. Análisis de Clasificar objetos o variables por su Si bien este método puede ser usado para las
agrupamientos o semejanza o diferencias en base a vari ables cuantitativas y/o cualitativas, los
conglomerados mediciones de similitud o distancia. Los resultados dependen de las medidas de
agrupamientos se representan en un di stancias y de los algoritmos elegidos para
dendrograma. formar los agrupamientos.
en que los datos fueron tomados y en que el ex- aplicación del análisis multivariado, puede brin-
perimento fue realizado, más que en la técnica dar conclusiones más fuertes que las logradas a
de análisis en sí misma. través de un grupo de comparaciones simples.
Las inferencias sólo están justificadas cuan- Si se tiene cuidado durante el proceso de inter-
do los datos son tomados de una muestra gran- pretación de resultados, las combinaciones de
de y bien definida. Cuando esto no ocurre los variables (componentes, factores, etc.) podrían
valores de probabilidad tal vez directamente no ser de significativa importancia para estudiar un
se deberían informar y las conclusiones a las proceso. El uso racional de la estadística mul-
que se arriba sólo deberían limitarse a los da- tivariada, el ajuste de un modelo y el conoci-
tos utilizados y a las condiciones en las que se miento biológico pueden ayudar al investigador
desarrolló el experimento. De la misma manera a diseñar con criterio un experimento crucial y a
resulta poco aconsejable elaborar generaliza- llegar a conclusiones consistentes.
ciones demasiado amplias cuando los estudios Como dijimos anteriormente, el análisis mul-
se realizan sobre casos particulares o específi- tivariado aprovecha las relaciones entre las va-
cos que no son representativos. riables para buscar patrones o estructuras en
A menudo sucede que el investigador prefie- los datos. En este sentido, podría encontrarse
re o necesita interpretar las variables en forma un origen de patrones cuando se realizan medi-
separada cuando maneja un grupo de varia- ciones sobre grupos de objetos similares. Pue-
bles correlacionadas. En estos casos sería más den existir casos donde no se conoce a priori
apropiado utilizar métodos univariados, con el si los grupos están ya formados, cuantos son,
complemento de pruebas de Bonferroni ajusta- o cuales objetos pertenecen a cada grupo, es
das. Sin embargo, cuando sea posible, la consi- allí donde habría que ver que tipo de análisis es
deración conjunta de las variables, mediante la más apropiado.
A B C D E F A B C D E F
A 1 0.5 0 0.333 1 0.5 A 1 0.667 0 0.5 1 0.667
B 0.5 1 0.167 0.4 0.5 0.571 B 0.667 1 0.286 0.571 0.667 0.727
C 0 0.167 1 0.2 0 0.429 C 0 0.286 1 0.333 0 0.6
D 0.333 0.4 0.2 1 0.333 0.25 D 0.5 0.571 0.333 1 0.5 0.4
E 1 0.5 0 0.333 1 0.5 E 1 0.667 0 0.5 1 0.667
F 0.5 0.571 0.429 0.25 0.5 1 F 0.667 0.727 0.6 0.4 0.667 1
Además, ambas matrices son simétricas: la muestra comparten 3. Así Jaccard vale 0.5. El
asociación entre A y E es la misma que la que total de bandas de B es 4 y el total de bandas
se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la detectadas en E es 5. El promedio de estos to-
mitad de la matriz de asociación. Esta obser- tales da 4.5 por lo que la asociación de Dice da
vación será válida para todas las medidas que (3/4.5) = 2/3 = 0.667.
se presenten en este capítulo. Se observa también que, salvo los 0 y los 1,
Si los datos son binarios pero de estados todos los valores de Jaccard son menores que
equivalentes, dos muestras deberán conside- los de Dice.
rarse más asociadas tanto cuando comparten Además, ambas matrices son simétricas: la
"unos" como "ceros", ya que la codificación que asociación entre A y E es la misma que la que
se les asigna es indistinta. se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la
Este es un proceso típico en el análisis de la mitad de la matriz de asociación.
información a partir de bandas. Primero se co- Esta observación será válida para todas las
difica la información, se construye la matriz de medidas que se presenten en este capítulo.
datos y, en este caso, se calcularon las matri- Si los datos son binarios pero de estados
ces de asociación de Jaccard y Dice a efectos equivalentes, dos muestras deberán conside-
de observar las características mencionadas rarse más asociadas tanto cuando comparten
más arriba. "unos" como "ceros", ya que la codificación que
Entre las muestras A y C no se observaron se les asigna es indistinta.
bandas en común, por lo tanto a = 0 y tanto
Jaccard como Dice dan 0. Un índice recomendable por su simplicidad
Por otro lado, A y E comparten la presencia es el de Simple Matching o de Concordancia
de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Simple:
Jaccard como Dice dan 1.
Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tan- SIMPLE MATCHING a+d
SM12 =
to, de las 6 bandas presentes en una u otra a+b+c+d
∑p ∑q 2
i
2
i
blación está en equilibrio entre la variabilidad
i =1 i =1 producida por mutaciones y por deriva genéti-
ca, siendo el tamaño efectivo de la población,
y luego la Distancia Estándar: D12 = - ln I. en cada una, constante. Basándose en estos
supuestos, y en que todos los loci sean equiva-
Si se usan varios loci se trabaja con el pro- lentes entre sí, se espera que la Distancia de
medio aritmético de las probabilidades defini- Nei se incremente linealmente con el tiempo. Si
das anteriormente resultando: las frecuencias alélicas en cada población han
sido estimadas con pocas muestras se pueden
r mi utilizar, en cambio, algunas modificaciones a la
∑∑ p q
i =1 j=1
ij ij Distancia Estándar de Nei como las propuestas
D12 = − ln por Nei (1978) y Hillis (1984). La distancia de
r mi r mi
Cavalli-Sforza y Edwards, por el contrario, asu-
∑∑ p ∑∑ q
i =1 j=1
2
ij
i =1 j=1
2
ij me que las diferencias entre las poblaciones
no provienen de mutaciones sino que son sólo
consecuencia de la deriva genética. Además,
Ejemplo: Para la información de la Tabla 2, no asume que el tamaño poblacional ha per-
en el caso de las frecuencias de cinco alelos manecido constante en todas las poblaciones.
provenientes de dos loci, se tiene: I = 0.857986 Considera que el tamaño de la población cam-
y, por lo tanto, D = 0.15317. bia en forma lineal pero no con el tiempo sino
con 1/N, donde N es el tamaño efectivo de la
población. Así, en estos casos, los conocimien-
tos básicos de genética poblacional brindarán
las herramientas necesarias en el momento de
la elección del método más apropiado para el
análisis de nuestros datos.
0.6
P1------------------------------------P2
0.4
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
P1---------------P3? P3?---------P2
0.6
38-39
40-43
0.4
denominado dendrograma. 38
39
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
1
1
En esta sección se tratarán solamente los 40 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
41 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1
métodos jerárquicos aglomerativos. 42 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1
vez realizado el primer agrupamiento, cómo se Tabla 4. Matriz de datos de análisis isoenzimático
define la distancia entre ese grupo y los restan- de 8 cultivares de Amaranthus.
tes elementos?.
Supongamos que en un primer paso se han
agrupado los elementos A y B porque son los V1 V2 CP1 CP2
que presentan la menor distancia entre sí. La 1 -0.127 0.031 -0.279 0.055
distancia entre el nuevo grupo AB y otro ele- 2 -0.107 0.137 -0.235 0.246 Autovalo-
mento C se puede definir según distintos cri- 3 -0.123 0.091 -0.270 0.163
res:
4 -0.005 0.074 -0.010 0.134
terios:
5 -0.220 0.070 -0.483 0.126
6 -0.232 0.162 -0.509 0.291 4.81258
Ligamiento simple: d(AB,C) = mín {d(A, C), d(B, C)}, 7 -0.125 -0.112 -0.273 -0.202 3.22431
Ligamiento completo: d(AB,C) = máx {d(A, C), d(B, C)}, 8 -0.125 -0.097 -0.274 -0.174
9 -0.232 0.162 -0.509 0.291 α1 = 46.85
10 -0.232 0.162 -0.509 0.291 α2 = 78.2
d(A, C) + d(B, C) ... ... ... ...
Ligamiento promedio: d({A,B},C) =
2
En el caso del ligamiento simple, la nueva Tabla 5. Resultados de autovectores y coordena-
das principales del análisis isoenzimático de 8 culti-
distancia se define es la mínima distancia entre
vares de Amaranthus.
AE BF C D
AE 0 1.1 1.41 1.15
BF 1.1 0 1.29 1.22
C 1.41 1.29 0 1.26
D 1.15 1.22 1.26 0
AEBF C D
AEBF 0 1.41 1.22
C 1.41 0 1.26
D 1.22 1.26 0
AEBFD C
AEBFD 0 1.41
C 1.41 0
AE BF C D
AE 0 1.05 1.41 1.15
BF 1.05 0 1.18 1.16
C 1.41 1.18 0 1.26
D 1.15 1.16 1.26 0
AEBF C D
AEBF 0 1.295 1.155
C 1.295 0 1.26
D 1.155 1.26 0
AEBFD C
AEBFD 0 1.277
C 1.277 0
mos algoritmos en el caso del ligamiento sim- Este ligamiento promedio se conoce tam-
ple o completo. Para el ligamiento promedio bién por las siglas UPGMA (Unweighted Pair
hay que promediar todas las distancias entre Groups Method with Arithmetic Averages).
elementos de AB y de C: donde dij es la distan- Consideremos el ejemplo de la Tabla 6. Pri-
mero se realizará un agrupamiento aplicando
ligamiento simple.
∑d ij En primer lugar se agrupan los elementos A
d(AB, C) =
i, j
y E porque están a menor distancia (son igua-
n AB n C les). Formado ese primer grupo habría que
calcular las nuevas distancias del grupo AE a
cia entre el elemento i del grupo AB y el j de C; los restantes elementos pero como d(A, U) =
nAB y nC son los números de elementos en el d(E, U) para todos los restantes elementos U
grupo AB y C, respectivamente. se mantienen esas distancias.
X Y
Plantas haploides Cultivo de anteras
X Y
Gametos X Y Formación de
gametos
XY
Híbrido
Esquema 1.
Figura 6. Producción de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maíz (Zea mayz).
(A) Espigas de trigo cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. (B) Plantas de maíz (donantes
de polen) crecidas en invernáculo. (C) Desgrane de espigas para realizar la desinfección de los granos y
posterior rescate de embriones. (D) Grano con dos embriones haploides (poliembrionía). (E) Embriones
inmaduros rescatados y creciendo in-vitro. (F) Planta rusticada. (G) y (H) Plantas con 3-5 macollos con
sus raíces sumergidas en solución de colchicina para la duplicación cromosómica. I. Plantas tratadas con
colchicina y llevadas a macetas con tierra en cámara de crecimiento
GTT CGG GAG AAG TGC TGC AAG CAG CTG AGC CAG ATA GCA CCA CAA TGT CGC
TGT GAT TCT ATC CGG CGA GTG ATC CAA GGC AGG CTC GGT GGC TTC TTG GGC
ATT TGG CGA GGT GAG GTA TTC AAA CAA CTT CAG AGG GCC CAG AGC CTC CCC
TCA AAG TGC AAC ATG GGC GCC GAC TGC AAG TTC CCT AGT GGC TAT TAC TGG
TGA TGATATAGCCTC
TATTCGTGCCAATAAAATGTCACATATCATAGCAAGTGGCAAATAAGAGTGCTGAGTGATGATCTATGAA
TAAAATCACCCTTGTATATTGATCTGTGTTCGAGAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3’
B
1 2 3 4 5 6 M
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
Figura 1. (A) Secuencia nucleotídica del gen pinb-D1, mostrando el cambio de aminoácido Glicina → Seri-
na (Gly → Ser) resultante de la mutación de la base guanina (G) a adenosina (A) que diferencia a los alelos
asociados a texturas blandas y duras, respectivamente. Con un recuadro se indican las zonas donde hibri-
dan los primers, y en negritas y subrayado las bases que forman el sitio de restricción de BsrBI (GAGCGG/
CCGCTC) presente en el alelo asociado a textura dura en grano de trigo. (B) Fotografía de electroforesis
en gel de agarosa 2% de productos de PCR amplificados con primers señalados en figura anterior dige-
ridos con la enzima de restricción BsrBI. En calles 1, 4 y 6 patrón del alelo de pinb-D1 asociado a textura
blanda; en calles 2, 3 y 5, patrón del alelo de pinb-D1 asociado a textura dura.
Del análisis se concluye que la diferenciación cuáles poblaciones formarán parte del progra-
molecular entre las poblaciones representa un ma de conservación podría basarse en consi-
33 % de la varianza total, y que esa diferencia deraciones exclusivamente prácticas ya que
es significativa (p= 0,02). las poblaciones son genéticamente equivalen-
La diversidad genética cuantificada por tes. Por el contrario, una especie compuesta
marcadores moleculares puede mostrar, por de poblaciones con niveles bajos de variabi-
ejemplo, que en una especie nativa de interés lidad en cada unidad pero con alto grado de
forestal todas las poblaciones presentan altos diferenciación entre poblaciones, requerirá que
niveles de variabilidad genética y son bastante los esfuerzos de protección sean dirigidos ha-
similares entre si. En este caso, la decisión de cia tantas poblaciones como sea posible, ya
jidos más juveniles dentro de un árbol o, 2) in- duo está determinado por la posición que ocu-
duciendo el rejuvenecimiento del árbol donante paba en la planta adulta. Esto es ocasionado
antes de aislar los explantos. por efecto del envejecimiento fisiológico e im-
plica que los explantos más reactivos in vitro se
Para seleccionar el material más juvenil en encuentran en las yemas de las áreas basales
una planta adulta hay que considerar el fenó- del tronco y raíces.
meno de topófisis. Este es un proceso por el A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso
cual el tipo de crecimiento de un nuevo indivi- de reversión temporaria de las características
Semilla Sintética
Concepto:
Resulta difícil tratar de determinar el origen
de la idea de la producción de semillas sintéti-
cas o artificiales. Es uno de los resultados de
la aplicación en la Agricultura de los embriones
somáticos descriptos por primera vez en 1958,
por Jakob Reinert y por F.C. Steward y co-
laboradores. Sin embargo, un gran propulsor
de su utilización para la propagación en gran
escala de plantas fue Toshio Murashige quien
en un Simposio realizado en 1977 en Ghent
(Bélgica) presentó formalmente la idea de la
producción de las semillas sintéticas, enten-
diendo como tal a un simple embrión somático
encapsulado. Esta semilla se diferencia de la
semilla verdadera en que el embrión es somáti-
co (producido por el fenómeno conocido como
embriogénesis somática) y no cigótico y que si Fig. 1.- a) Partes de una semilla sintética .b,c y d)
tiene endosperma y cubierta, éstos son artifi- Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30)
ciales (Fig.1a y b). Esta semilla, puesta en con- mediante semillas sintéticas (las barras verticales
indican 3 mm)
diciones adecuadas, germina (Fig.1c) y se con-
vierte en una planta (Fig.1d). Muchos grupos
de investigación han contribuido al desarrollo tipo de “semillas sintéticas” - de una utilización
de las semillas sintéticas. Entre ellos se deben muy restringida- no será tratado en este capí-
destacar el grupo liderado por Keith Walker de tulo.
la Compañía Monsanto que a partir de media-
dos de la década del 70 trabajaron especial- Tipos de semillas sintéticas
mente con alfalfa. También hay que mencionar Las semillas sintéticas pueden fabricarse de
la labor de Robert Lawrence de la Union Car- diferentes maneras (Fig.2). Básicamente se
bide quienes comenzaron los trabajos con es- pueden usar embriones hidratados (tal como
pecies forestales, lechuga y apio. Otros inves- resultan de la embriogénesis somática) o bien
tigadores como Drew, Kitto y Janick realizaron pueden ser desecados. En algunos casos es-
sus trabajos con zanahoria. El aporte del grupo tos embriones están protegidos por cubiertas
liderado por Keith Redenbaugh de la Plant Ge- protectoras. De esta manera se pueden distin-
netic Inc. fue muy importante, especialmente guir 5 tipos básicos de semillas sintéticas.
por su descubrimiento de que hidrogeles como 1) Semillas sintéticas con embriones de-
el alginato de sodio podían ser utilizados para secados (Tipo 1 de la Fig. 2) sin cubierta:
producir semillas artificiales que podían germi- Es un sistema muy simple, los embriones son
nar en condiciones de invernadero. desecados hasta alcanzar porcentajes de hu-
Hay que aclarar que además del concepto medad de 8- 20%. En este caso los embriones
de semilla sintética definido más arriba, tam- no están provistos de ningún tipo de cubierta
bién es factible que en lugar de encapsular em- protectora. Embriones de alfalfa sometidos al
briones somáticos, se encapsulen yemas. Este desecamiento mostraron porcentajes de con-
Cuadro 2. Necesidad de contar con semillas sintéticas en algunas plantas leñosas subtropicales de inte-
rés para Argentina y Estado actual de su desarrollo.v
3 Genómica
El mejoramiento de la plantas forrajeras ha
entrado en la era genómica, lo cual significa
que se cuenta con gran cantidad de nuevas
herramientas y tecnologías para el descubri-
Figura 3. A) Esquema de la liberación a campo, a miento de genes y para el análisis global de
pequeña escala, de plantas transgénicas de trébol los genomas. Todo esto aportará información
blanco inmunes a AMV. acerca de todos los aspectos del crecimiento
vegetal, desarrollo, diferenciación y respuestas
a estreses bióticos y abióticos, revolucionando
el mejoramiento vegetal y la producción. Miles
de etiquetas de secuencias expresadas (ESTs,
Expressed Sequence Tag) han sido el punto
de partida para dilucidar la función de miles
de genes vegetales, permitiendo la creación
de bases de datos de los principales cultivos;
posibilitando la identificación, caracterización
funcional y uso de genes valiosos para los sis-
temas de producción de forraje.
5 Lecturas Recomendadas
Sin embargo, en las especies apospóricas de Otros aspectos sustanciales del carácter
Paspalum, un género también perteneciente apomixis
a la tribu Paníceas igual que Panicum, existe Hay varias características particulares de
una característica en la constitución de los sa- este modo de reproducción que merecen ser
cos apospóricos que los diferencia netamente remarcadas. Por una parte la apomixis usual-
del tipo Panicum: en Paspalum los sacos ge- mente no altera la formación del microgame-
neralmente tienen una célula central con dos tófito y la meiosis ocurre en las anteras gene-
núcleos polares y a veces tres (Figura 3). Esta rando polen reducido, aunque a veces se ob-
característica es importante porque debido a servan tasas inferiores de viabilidad. Además,
la pseudogamia, la relación genómica mater- apomixis y sexualidad no son procesos mutua-
na/paterna del endospermo es distinta en las mente excluyentes ya que pueden aparecer
plantas sexuales y en las apospóricas. En las simultáneamente sacos reducidos (meióticos)
sexuales, hay una relación 2/1 materno/pater- y no reducidos (provenientes de apomixis) en
no (madre n + n; padre n), mientras que en las una misma planta, en una misma inflorescen-
apospóricas esa relación es generalmente 4/1 cia y aún en un mismo óvulo. Una planta apo-
(madre 2n + 2n; padre n). En Panicum la rela- míctica que es capaz de generar al menos una
ción es 2/1 tanto en las sexuales como en las parte de su progenie por medios sexuales se
apospóricas (n + n/n en las sexuales y 2n/n en conoce como “facultativa”. Por lo tanto, en los
las apospóricas). genotipos apomícticos facultativos las proge-
nies segregan como clases maternas (2n + 0) cundación de una ovocélula reducida y 3) ha-
y no-maternas o aberrantes. Hay tres tipos di- ploides (n + 0) generados por partenogénesis
ferentes de individuos aberrantes que pueden a partir de una ovocélula reducida.
encontrarse en la progenie de una planta apo- Por otra parte, la apomixis gametofítica se
míctica: 1) híbridos BIII (2n + n) que resultan de relaciona fuertemente con la poliploidía. En
la fecundación de una ovocélula no reducida, general las especies apomícticas presentan
2) híbridos BII (n + n) que resultan de la fe- razas de bajos niveles de ploidía (usualmente
diploides) que se reproducen por sexualidad ducción apomíctica. Existen varias teorías que
y otras de mayor nivel de ploidía (por ejemplo explican la baja frecuencia de apomixis a ni-
tri, tetra o pentaploides) que se reproducen vel diploide. Una fue propuesta por Nogler y
por apomixis. Estos complejos integrados por sostiene que un alelo dominante A, responsa-
individuos sexuales y apomícticos de distinto ble de la aposporía, no puede ser transmitido
nivel de ploidía se conocen como “complejos a través de gametas haploides, con lo cual la
agámicos” y se consideran estructuras repro- apomixis no puede ser encontrada en diploides
ductivas complejas y evolucionadas donde la naturales. Otra fue planteada por Mogie y sos-
sexualidad permite la generación de nuevos tiene la existencia de un fenómeno de dosaje
genotipos y la apomixis la propagación clonal génico para un alelo mutante a-, en presencia
muy eficiente de las combinaciones genéticas del alelo salvaje a+, para que el carácter se
superiores. Al menos para algunas especies exprese. De acuerdo a esta teoría la ausencia
(por ejemplo P. notatum y P. rufum) existen evi- de apomixis en los diploides naturales se debe
dencias que sugieren que la diversidad gene- más bien a una falta de expresión, en lugar de
rada a niveles menores de ploidía puede ser la no-transmisión propuesta por Nogler. Mogie
impulsada hacia los niveles poliploides por me- sugiere que se necesitan dos copias del alelo
dio de eventos sucesivos de hibridización 2n + a- (frecuencia mayor a 0,5) para la expresión
n. La relación de la apomixis con la poliploidía de la apomixis. En contraste con esta teoría,
es estrecha ya que existen muy pocos casos Noirot propone que el alelo a+ no debería es-
reportados de diploides que muestran repro- tar presente en una frecuencia mayor de 0,25.
bancos de datos. Más adelante otros autores aposporía. También se comparó la expresión
informaron la expresión de asg1 (gen especí- de genes en flores de genotipos sexuales y
fico de la apomixis 1) en primordios florales de apomícticos de P. notatum y se identificó al gen
una accesión apomíctica de guineagrass (Pa- arp1, que es homólogo a la cinesina katD de A.
nicum maximum) asociada temporalmente con thaliana. Se identificaron 6 genes de expresión
la aparición de las células iniciales de la apos- diferencial en ovarios de plantas apomícticas
poría. La secuencia de asg1 es similar a varios y sexuales de Brachiaria brizantha, entre ellos
genes específicos de la semilla o el embrión de un gen homólogo a una proteína quinasa (fami-
diferentes especies vegetales, entre ellos rd22 lia MAP quinasas, del inglés mitogen-activated
(un gen expresado en semillas e inducido por protein).
sequía en A. thaliana), grp (un gen que codifica Recientemente una caracterización más ex-
una proteína rica en glicina de la pared celu- tensa del transcriptoma fue completada para
lar de ovarios de Phaseolus vulgaris), usp (un las especies apospóricas Poa pratensis y Pas-
gen que codifica a una proteína de semilla de palum notatum. La misma permitió el aisla-
Vicia fava), plyg1 (un gen que codifica a un pre- miento de centenares de genes de expresión
cursor de la cadena beta de poligalacturonasa diferencial en flores de genotipos sexuales y
de Lycopersicum esculentum) y adr6p (un gen apospóricos (Figura 5). Varios genes comunes
regulado negativamente por auxina de Glycine fueron identificados en ambas especies, y mu-
max). La homología de secuencia con todos chos de los restantes pertenecen a las mismas
estos genes es altamente significativa por lo vías funcionales. Los genes identificados se
que los autores interpretaron que asg1 podría inscriben dentro de unas pocas clases onto-
cumplir una función nueva dentro del comple- lógicas: transducción de señales, proteólisis,
jo de formación del embrión y la semilla, rela- control del ciclo celular, control de la transcrip-
cionada con la aparición de las iniciales de la ción, estructura de la cromatina y actividad de
transposones. Muchos de los genes aislados liploidización. Asimismo, los genes afectados
son idénticos a otros cuya expresión es afecta- durante los cambios de ploidía pertenecen cla-
da en inflorescencias por un cambio en el nivel ramente a las mismas clases funcionales que
de ploidía, lo que evidencia a nivel molecular el los controlados durante la apomixis.
alto grado de relación entre la apomixis y la po- Entre los genes activados o silenciados du-
Automatización de la pro-
pagación in vitro
El proceso de escalado
para la optimización de la pro-
ductividad de un proceso de
Figura 1. El diagrama indica el origen de las tTCLs y las diferentes micropropagación, indepen-
condiciones de cultivo aplicadas para la obtención de plantines de dientemente de la estrategia
crisantemo. (Gentileza de Jaime Teixeira da Silva, traducido) que se utilice, requiere de la
7 8
b) Las flechas indican los eventos 7 y 8 (izquierda y derecha, respectivamente) y su comparación respec-
to de la planta silvestre. Se puede apreciar diferencias, entre otras, en el tamaño de las flores y la forma
y tamaño de las hojas.
Figura 7. Desarrollo de los productos obtenidos en los ensayos de transformación de Calibrachoa exce-
llens con Agrobacterium rhizogenes.
narse con técnicas de transformación genética las relaciones genéticas como la diversidad
que permitan introducir variaciones en el pa- entre distintas especies. Por ejemplo, en cala-
trón de floración y explotarlos comercialmente. tea (Calathea Mey.), el uso de AFLPs permitió
El conocimiento de la diversidad genética es diferenciar distintas especies, generando perfi-
de gran ayuda para un correcto manejo del ger- les y clusters que podrán ser utilizados para la
moplasma por parte de los mejoradores. Con comparación con otras especies.
este fin se crearon BEGOBIO y BEGOMOL, Por otro lado, estudios basados en RAPDs,
dos bancos de germoplasma ex situ e in situ de ISSRs y microsatélites de cloroplasto (ADNcp)
Begonia. El proyecto cuenta con un programa han permitido estudiar la diversidad genética
de preservación de la biodiversidad por medio de dos especies de prímula, Primula sikkimen-
de criopreservación y de almacenamiento de sis y P. farinosa. En el último caso, el releva-
ADN en chips y en librerías de ADNc. miento de plantas de distintas altitudes permitió
Distintos trabajos con marcadores molecula- establecer la diferenciación de las poblaciones
res clásicos que han permitido analizar tanto a través del gradiente de altitudes. En came-
Aplicación de la biotecnología en
la mejora y conservación de
especies forestales
Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo,
Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry
mente la superficie boscosa a una tasa anual forestales. La mayoría ya han sido presenta-
de deforestación mundial de unos 13 millones dos y descriptos en este volumen y pueden ser
de has, a la cual nuestro país, contribuye con encontrados en diferentes publicaciones (eg.
un promedio de 300.000 has de bosque nativo *Ziegenhagen and Fladung 2008).
por año (FAO 2007) urge por lo tanto actuar Una de las formas de agrupar a los diferen-
rápidamente en la conservación del bien co- tes tipos de marcadores genéticos utilizados
mún genético forestal ya que de él depende la en estudios de genética ecológica forestal es
conservación de la diversidad genética y el uso en función de su utilidad para reflejar el ver-
adecuado de la misma en procesos producti- dadero nivel de variación genética a diferentes
vos de importancia socio-económica. escalas espacio-temporales.
Numerosos son los marcadores que se utili- En base a ello podemos definir tres grupos
zan en estudios de genética ecológica con fines de marcadores genéticos que se han utilizado
de conservación y domesticación de especies y se utilizan actualmente:
Los acrónimos utilizados (en orden alfabético) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: Arabis mosaic virus;
CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV:
Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maize dwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum
pox virus; PRV: Papaya ringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV:
Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato chlorotic spot virus; TEV:
Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus;
TSV: Tobacco streak virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV:
White clover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus.
rística de cada virus, una menor cantidad de Las plantas transgénicas que expresaban el
sitios de infección y un menor título viral. Se gen de cápside del virus TMV resultaron resis-
demostró que hay una correlación entre la re- tentes a la inoculación con partículas virales
sistencia y el nivel de expresión de la proteína de TMV pero la resistencia era sobrepasada
de la cápside, que la protección actúa a nivel si se las inoculaba con ARN viral infectivo. Se
celular y es superada por altas dosis de inó- postuló entonces que la protección se debía a
culo (viriones). En algunos casos es superada la inhibición del desnudamiento viral en las cé-
por inoculación con ARN viral. La protección lulas infectadas inicialmente. Varias líneas de
es más efectiva para el virus homólogo al que evidencia apoyan esta hipótesis. Por ejemplo
dio origen al transgén. Sin embargo, abarca si se inoculan protoplastos derivados de plan-
también a virus y cepas relacionadas aunque tas transgénicas que expresan la CP de TMV
la eficiencia se va reduciendo a medida que la o plantas no transformadas con pseudovirio-
relación filogenética se hace más lejana y dis- nes de TMV que contienen ARNm que codifica
minuye la identidad entre la secuencia expre- para la proteína indicadora beta-glucuronidasa
sada en la planta transgénica y la secuencia (GUS), se observa que hay una marcada dis-
del virus desafiante. minución de la actividad GUS en los proto-
Tabla 2: Plantas transgénicas con resistencia a virus autorizadas para su comercialización. (fuente AG-
Bios: http://www.agbios.com/dbase.php)
Los acrónimos utilizados fueron: CMV: Cucumber mosaic cucumoviru s; PRSV: Papaya
ringspot potyvirus ; PLRV: Potato leafroll luteovirus ; PPV: Plum pox virus ; PVY: Potato
virus Y; WMV-2: Watermelon mosaic virus 2; ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus.
Figura 2. Quórum sensing. Modelo simplificado de la transducción de señales en quórum sensing, QS.
Los microorganismos censan sus poblaciones a través de un sofisticado mecanismo de comunicación ce-
lular. Cuando la densidad celular alcanza un determinado umbral se dispara la expresión de determinados
genes. Este tipo de regulación que controla diversas funciones biológicas, entre ellas las de virulencia, es
conocido como autoinducción o quorum sensing. Las moleculas señallizadoras esenciales de este sistema
son la acil-homoserin lactonas (acil-HSL).
Figura 3. Quorum quenching. Diferentes estrategias pueden utilizarse para interferir la comunicación
entre células bacterianas. Existen diferentes mecanismos que afectan la regulación por acil-HSL. Existen
mecanismos bioquímicos que interfieren en la comunicación entre bacterias a nivel de la generación de
la señal: por ejemplo la inhibición de la síntesis o de la transferencia de estas moléculas señal o de sus
precursores. Existen además posibles interferencias en el transporte y en la recepción de la señal. Otras
estrategias de interferencia a la comunicación entre células bacterianas se relacionan con la degradación
de las acil-HSL. Algunos microorganismos son capaces de sintetizar compuestos que imitan a las acil-HSL
con el objeto de interferir la comunicación entre otras especies y competir con ellas por nichos ecológicos.
Síntesis de fitoalexinas:
Entre las estrategias tendientes a incre-
mentar el sistema defensivo de las plantas
se incluye la síntesis de fitolexinas, lo que ge-
neralmente involucra la modificación de vías
biosintéticas complejas. Las fitoalexinas son
compuestos químicos sintetizados por la plan-
ta en respuesta a una invasión microbiana. La
5
IS frente a Colletotrichum
4
LFC1-05
F7
3
LFC3-05
TPS1-05
2
SS71
L9
1
M11
MP3
0
1 2 3 4 5
Cultivares de frutilla
Figura 2: Susceptibilidad de cinco cultivares de frutilla a ocho aislados diferentes de Colletotrichum sp. La
susceptibilidad es evaluada por el Indice de Severidad (IS) utilizando una escala de 1 a 5, siendo 1 muy
resistente y 5 muy susceptible.
4
Figura 3 9 dpi
3
30 dpi
2 50 dpi
0
EC
EC 3 SN 2 C1 Cruz. Ctr.(+)
Ctr. Prot. C2 C.acut.
Tratamientos
Figura 3: Evolución de la enfermedad evaluada como IS (índice de severidad) a los 9, 30 y 50 dpi (días
posteriores a la infección con un aislado virulento de C. acutatum) de plantas de frutilla del cultivar Pájaro
pretratadas con: EC, extracto estéril de conidios del aislado avirulento M23 de Colletotrichum sp.; SN, so-
brenadante estéril de un cultivo del aislado avirulento M23 de Colletotrichum sp.; C1, conidios activos del
aislado avirulento M23 de Colletotrichum sp.; C2, agua destilada estéril. La susceptibilidad es evaluada
por el Indice de Severidad (IS) utilizando una escala de 1 a 5, siendo 1 muy resistente y 5 muy susceptible.
a 30 kDa
b IS
kDa
30
c 14
Figura 4: Aumento de la resistencia inducida por la expresión heteróloga de un gen de quitinasa (ch5B)
proveniente de Phaseolus vulgaris. A) pHCHI, constructo utilizado para la expresión del gen de quitinasa
en plantas de frutillaFigura
(cultivar 4
Pájaro). CMv35s, promotor constitutivo proveniente del virus de mosaico del
coliflor; tnos, terminador proveniente del gen de nopalino sintasa (nos) del plásmico Ti de Agrobacterium
tumefanciens; Pnos, promotor proveniente del gen de la nopalino sintasa del plásmico Ti de A. tumefan-
ciens; toct, terminador proveniente del gen de octopina sintasa (oct) del plásmico Ti de A. tumefanciens;
nptII, gen de la neomicina fosfotransferasa que otorga resistencia a neomicina a los tejidos transformados
de plantas. B) Resultados de ensayos de susceptibilidad al hongo patógeno Botrytis cinerea de hojas de
plantas de frutilla (cv. Pájaro). C1, control de planta no transformada y no inoculada; pBI, control de planta
transformada con el vector de expresión sin el inserto de la quitinasa y no inoculado; ChiA y ChiB, hojas
de dos líneas plantas transformadas obtenidas en forma independiente e inoculadas con el patógeno; C2,
control de planta no transformada e inoculada con el patógeno. La inoculación se realizó con 10 µl de una
suspención de 106 conidios/ml. Las hojas fueron colocadas bajo condiciones controladas de temperatura,
luz y humedad, evaluándose el desarrollo de la enfermedad a los 5 dpi. C) Evaluación de la expresión
(a), indice de susceptibilidad (b) y actividad de la quitinasa en hojas de frutilla (c) no transformada (NT),
transformada con el vector sin inserto (pBI), de lineas transgénicas que expresan (ChiA y ChiB) y que no
expresan (39A, 39B, 35, ChiC) el gen de la quitinasa ch5B; Lizo, proteína utilizada como marcador de peso
molecular correspondiente a Lysozima (figura extraída de Vellicce et al., 2006)v
Figura 2. Obtención de plantas cítricas libres de enfermedades. A: planta obtenida por microinjerto de
ápices caulinares in vitro. B: injerto sobre un plantín vigoroso. C: membrana de inmunoinmpresión-ELISA
con huellas de tallos de plantas infectadas con tristeza. D: moteado causado por psorosis. E: epinastia
causada por exocortis. F: acanaladuras causadas por cachexia-xiloporosis. G: invernáculo con plantas
madres libres de enfermedades.
muchos insectos producen proteinasas, como pecies. Se ha observado que no siempre estos
la tripsina, o enzimas semejantes a la quimo- genes actúan como antimetabolitos efectivos,
tripsina. Las proteínas antimetabólicas, como sino que hay un gradiente de efectividad frente
las IP, interfieren en el proceso digestivo de los a diferentes insectos y que, además, muchas
insectos susceptibles y, de esta manera, afec- veces no son tan efectivos como los genes Bt.
tan su crecimiento y desarrollo. Tomando este En base a estas observaciones se debe opti-
concepto, se han transformado plantas con mizar la interacción entre el IP introducida y la
secuencias de genes IP que, escoltados por proteasa blanco del insecto para incrementar
promotores adecuados, pueden expresar altos la acción del gen expresado en la planta trans-
niveles de estas proteínas. Los IP se encuen- génica.
tran comúnmente en los alimentos derivados Otra estrategia para mejorar los niveles de
de vegetales y son fácilmente inactivados con control puede ser utilizar más de un gen IP
la cocción. Teniendo en cuenta esta precau- para interferir en diferentes proteasas del in-
ción, la expresión de genes que codifican para secto. En este sentido, la combinación exito-
IP en plantas se puede considerar como una sa de diferentes secuencias de IPs formando
estrategia segura. multidominios para el control de trips (Thysa-
El primer ejemplo exitoso de resistencia a noptera: Thripidae) abre un abanico de nuevas
insectos expresando IPs fue la expresión de posibilidades.
genes inhibidores de tripsina de caupí (CpTi) También se ha propuesto el uso de IPs en
en 1987. A partir de ese momento, se han intro- combinación con los genes Bt, debido a que
ducido numerosos genes IP en diferentes es- las entomotoxinas Bt activadas pueden estar
pampeana por esta plaga alcanzan los de las pérdidas causadas por ataques de
170 millones de dólares y que además, lepidópteros.
la adopción de híbridos Bt incrementó en
un 10% el rendimiento del cultivo (es de- Lecturas recomendadas
cir, que evitó pérdidads de producción de
esa magnitud). Baum J A, Bogaert T, Clinton W, Heck G R,
• Algodón Bt: el algodón Bt provee resis- Feldmann P, Ilagan O, Johnson S, Plaetinck G,
tencia al complejo principal de pestes Munyikwa T, Pleau M, Vaughn T & Roberts J.
(Helicoverpa gelotopoeon y H. Zea co- 2007. Control of coleopteran insect pests through
RNA interference. Nature Biotechnology 25,
múnmente asociadas con Heliotis vires-
1322-1326.
cens) y también al gusano de la hoja Brookes G. 2007. The benefits of adopting
(Alabama argillacea), la lagarta rosada genetically modified insect resistant (Bt) maize in
(Pectinophora gossipiella) y otros le- the European Union (EU): first results from 1998-
pidópteros (Spodoptera spp). Pero no 2006; PG Economics Ltd www.pgeconomics.
provee resistencia contra insectos co- co.uk.
leópteros o succionadores (chinches y Christeller J T, Malone L A, Todd J H, Marshall R
homópteros). Se ha determinado que la M, Burgess E P J, Philip B A. 2005. Distribution
reducción en la cantidad de insecticidas and residual activity of two insecticidal proteins,
pulverizados durante el período de culti- avidinand aprotinin, expressed in transgenic
tobacco plants, in the bodies and frass of
vo Bt oscila entre 43% y 55%. La mayo-
Spodoptera litura larvae following feeding.
ría de las reducciones son en insectici- Journal of Insect Physiology 51, 1117–1126.
das muy tóxicos (de clases I y II), como Farias L R, Costa F T, Souza L A, Pelegrini P B,
organofosforados, carbamatos y piretroi- Grossi-de-Sá MF, Neto S M, Bloch C Jr, Laumann
des sintéticos, que causan problemas de R A, Noronha E F, Franco O L. 2007. Isolation
residuos y son tóxicos para los insectos of a novel Carica papaya α-amylase inhibitor
benéficos. Se ha estimado el impacto de with deleterious activity toward Callosobruchus
la adopción de algodón Bt como el equi- maculates. Pesticide Biochemistry and
valente a un 30% de aumento neta de Physiology, 87, 255–260.
producción por hectárea. El aumento de Integration of Insect-Resistant Genetically Modified
Crops within IPM Programs Series: Progress
producción corresponde a la reducción
in Biological Control, Vol. 5 Ed: Romeis, Jörg;
Australia, Brasil,
cry1Ac de Bacillus Canadá, China,
Monsanto thuringiensis subsp. SAGPyA UE, India, Japón,
MON 531 16/07/1998
Argentina kurstaki HD-73 N°428 Corea, Méjico,
(B.t.k) Filipinas,
Sudáfrica, EEUU
Australia, Brasil,
Canadá, China,
UE, India, Japón,
cry1Ab de Bacillus
Monsanto SAGPyA N° Corea, Méjico,
MON 810 16/07/1998 thuringiensis subsp.
Argentina 429 Filipinas,
kurstaki HD-1.
Sudáfrica, Suiza,
Taiwán, Uruguay,
EEUU
Australia, Brasil,
Canadá, China,
cry1A(b) de Bacillus UE, Japón, Corea,
Novartis thuringiensis subsp. SAGPyA N° Méjico, Filipinas,
Bt 11 27/07/2001
Agrosem kurstaki cepa HD-1; 392 Rusia, Sudáfrica,
pat Suiza, Taiwán,
Reino Unido,
Uruguay, EEUU
Australia Canadá
cry1F de Bacillus
Dow China UE
thuringiensis var.
AgroSciences y SAGPyA N° Japón Corea
TC 1507 15/03/2005 aizawai ; gen pat de
Pioneer 143 Méjico Filipinas
Streptomyces
Argentina Sudáfrica Suiza
viridochromogenes
Taiwán EEUU
Evento apilado
derivado del
Dow cruzamiento de las
UE, Japón,
AgroSciences y líneas 1507 y NK603 SAGPyA Nº
1507 x NK603 28/05/2008 Corea, Méjico,
Pioneer con tolerancia a 434
Filipinas
Argentina herbicida y
resistencia a
lepidópteros.
Figura 1. Esquema de la inhibición por el ácido n-fosfonometil glicina (glifosato) sobre la enzima EPSPS
susceptible y la incompatibilidad del sitio de acción al mismo herbicida en la enzima EPSPS* mutante.
Fuente: Mentaberry, A. 2007
Figura 4. Sub-unidad de AHAS mostrando sus tres sectores junto con la Tiamina piro fosfato (TPP) en
color rojo y los cofactores Mg2+, y flavin dinucleotido (FAD). En amarillo puede verse el sitio de acción ocu-
pado por el herbicida imazaquin. Fuente: Dr. Ronald G. Duggleby
la proteína y se encontró una mutación puntual obtenida de Klebsiella pneumoniae sub. sp.
de Ser a Gly en la posición 228. Se observaron ozanae. Estas plantas son resistentes a campo
mutaciones similares de la Ser 264 a Gly en la a los herbicidas ioxynil y bromoxynil y han sido
proteína de 32 kDa de Chlamydomonas rein- liberadas comercialmente en algunos países.
hardtii, Chenopodium album y Solanum nigrum. Al ser el glifosato menos costoso y de mayor
La búsqueda de resistencia por ingeniería espectro de control que los hidroxibenzonitri-
genética se ha orientado a la introducción de los, en 2004 fue el último año de comercializa-
proteínas de 32 kDa mutadas en plantas trans- ción de algodón BXN1 y colza BXN.
génicas y a la detoxificación de atrazinas me-
diante la introducción de un gen que codifica Resistencia a Dicamba
Es un herbicida auxínico que se utiliza como
glutation-S-transferasa (GTS). El segundo en-
pre y post emergente en el control de malezas
foque ha dado mejores resultados.
latifoliadas anuales y perennes. Recientemen-
te se logró aislar el gen de la dicamba mono-
Resistencia a hidroxibenzonitrilos
oxigenasa (DMO) de Pseudomona maltophi-
Los hidroxibenzonitrilos son también inhibi- lia, la cual confiere tolerancia a dicamba. Esta
dores del fotosistema II en especies dicotiledó- enzima está involucrada en la conversión del
neas. Por esta razón, cuando se aplican sobre dicamba en un compuesto no tóxico como el
dicotiledóneas resistentes a los mismos, se ácido 3,6 dicloro-salicílico. La inserción de este
suele incluir un herbicida de acción graminici- gen provee a las plantas latifoliadas resisten-
da, de modo de ampliar el espectro de control cia al herbicida. Actualmente se encuentra en
de malezas. Se obtuvieron plantas transgéni- desarrollo y proceso de inscripción en USA la
cas de algodón, colza y tabaco que expresan soja y el algodón resistentes a dicamba por la
una secuencia codificante para una nitrilasa, inserción de este gen.
Tabla 2. Obtención de plantas tolerantes a déficit hídrico utilizando factores de transcripción de origen
vegetal (Adaptada de Umezawa y col., 2007)
Planta de la
Planta Sistema de
Clasificación Nombre del gen cual proviene Experimentos realizados Parámetros medidos Año
transformada expresión
el gen
Familia AP2/ERF
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 1998
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Arabidopsis Ara bidopsis Arabidopsis Retención de agua Supervivencia 1999
RD29AP
DREB1/CBF DREB1B/CBF1 Tomat e Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Crecimiento y desarrollo 2002
DREB1/CBF CBF4 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2002
DREB1/CBF ZmDREB1A Arabidopsis Maíz CaMV35SP Disecación Electrolitos 2004
DREB1/CBF DREB1C/CBF2 Arabidopsis Arabidopsis Knock out Disecación Supervivencia 2004
AP2/ERF SHN1/WIN1 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Desarrollo 2004
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Trigo Arabidopsis Arabidopsis Retención de agua Supervivencia 2004
RD29AP
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Tabaco Arabidopsis Arabidopsis Retenció n de agua Superviven cia y 2004
RD29AP fototsíntesis
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Arroz Arabidopsis MaízUbi -1P Retención de agua 2005
AP2/ERF WXP1 Alfalfa M. truncatula CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2005
DREB2 DREB2A (forma Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP, Retención de agua Supervivencia 2005
active con Arabidopsis Supervivencia
deleción interna) RD29AP
Proteínas con
dominio básico
asociado a
cierre de
leucinas (bZIP) ABF3, AREB2/ABF4 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua 2002
AREB1/ABF2 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Crecimiento y supervivencia 2004
bZIP
ABF3 Arroz Arabidopsis Maíz Ubi -1P Retención de agua Supervivencia 2005
bZIP
AREB1/ABF2 (forma Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua, Fotosíntesis y supervivencia 2005
bZIP
active con una deshidratación Supervivencia
bZIP
deleción interna)
AREB1/ABF2 (forma Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP deshidratación 2005
active fosforilada) Supervivencia
bZIP)
Proteínas con
ZPT2-3 Petunia CaMV35SP Deshidratac ión 2003
dedos de zinc
CAZFP1 Arabidopsis Petunia CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2004
Cys2His2-type STZ Arabidopsis Pimie nto CaMV35SP Retención de agua Supervivencia, contenido 2004
Cys2His2-type Arabidopsis de clorofila
Cys2His2-type HAHB4 Arabidopsis y CaMV35SP y Deshidratación, ataque Supervivencia,
maíz girasol promotor con insectos, retención de conductancia
HD- Zip HAHB4 agua Supervivencia, área foliar,
(homeodominio turgencia, desarrollo
asociado a
cierre de ANAC019/055/ 072 Arabidopsis 2004
leucinas) Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua
Supervivencia
Otros
NAC
Metabolismo de
osmoprotectores
Fructan o s SacB Tabaco B. subtilis b CaMV35SP 5–10% PEG (tierra ) Desarrollo 1995
Trehalos a TPS1 Tabaco S. cerevisiae b CaMV35SP Disecación Supervivencia 1996
myo -Inositol IMT1 Tabaco Iceplant CaMV35SP Retención de agua Fotosíntesis 1997
Prolina P5CS Arroz Mothbean AIPC-ABA- Retención de agua Crecimiento del tallo 1998
inducible
Trehalos a OtsA, OtsB Tabaco E. coli b CaMV35SP Regado limitado Peso seco de hojas 1998
Fructan o s SacB Remolacha B. subtilis b CaMV35SP Regado limitado (productividad) 1999
Glicina -betaína COX Arabidopsis/ canola/ A. pascens b CaMV35SP Regado limitado Producci ón de biomasa 2000
Tabaco Crecimiento del tallo
ser sencilla, ya que diferentes miembros de la ambientales hostiles (Figura 1). Se trata de
red antioxidante en plantas responden de ma- amino ácidos (como prolina), aminas (glicina-
nera diferente a distintos tratamientos hostiles. betaína, poliaminas), azúcares y azúcares al-
Se han obtenido en consecuencia niveles va- coholes (trehalosa, manitol), y antioxidantes
riables de tolerancia mediante la expresión de (glutatión, ascorbato, tocoferoles). Otros solu-
enzimas antioxidantes. Por ejemplo, la sobre- tos compatibles son los fructanos, polímeros
expresión de superóxido dismutasas fue capaz de fructosa, cuyo incremento está relacionado
de incrementar la supervivencia y tolerancia a al proceso de aclimatación a las bajas tempe-
estrés en arveja y tabaco, pero no en alfalfa. raturas en especies tolerantes de gramíneas.
Así por ejemplo, plantas transgénicas de arroz
Síntesis de metabolitos protectores y tabaco que producen fructanos mostraron un
Se ha identificado una amplia gama de me- incremento en la tolerancia a las bajas tem-
tabolitos capaces de mitigar los efectos de- peraturas. No obstante, la modulación de una
letéreos del estrés osmótico y del estrés oxi- única reacción enzimática, aún cuando se trate
dativo que acompañan a muchas situaciones de la etapa limitante, está generalmente regu-
Proteinas-
quinasas
CDPK OsCDPK7 Arroz Arroz CaMV35SP Retención de agua Crecimiento del tallo, expresión génica, 2000
marchitez,
GSK3/Shaggy AtGSK1 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2001
MAPKKK NPK1 Maíz Tabaco CaMV35SP Estrés hídrico Número de hojas, tamaño de fruto 2004
SnRK2 SRK2C Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia, expression génica 2004
Otros
Medidor de calcio CBL1 Arabidopsis Arabidopsis Agrobacterium Retención de agua Supervivencia, expression génica 2003
MAS
14-3-3 Proteina GF14l Algodón Algodón CaMV35SP Retención de agua Senescencia, contenido de clorofila, 2004
fotosíntesis
CC-NBS-LRR ADR1 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia, expression génica 2004
Farnesyl- ERA1 Arabidopsis, Arabidopsis CaMV35SP/ Retención de agua, Supervivencia, pérdida de agua, 2005
transferasa canola RD29AP ensayos a campot productividad de semilla, contenido de aceite
(antisentido)
permitieron explorar los mecanismos molecu- cadamente procesos esenciales para la planta.
lares que regulan la producción de metabolitos Sin embargo, para lograr esto de una manera
secundarios. De esta forma, a partir de la déca- relativamente controlada, no basta con cono-
da de los 80, se logró un progreso significativo cer los componentes (enzimas y metabolitos)
en la disección de muchas vías biosintéticas y que participan de una determinada vía meta-
en la sobreexpresión de genes heterólogos, lo bólica. También se debe conocer la regulación
que permitió los primeros avances. Desde en- de esta vía (pasos limitantes, mecanismos de
tonces se han logrado numerosos resultados retroalimentación) y su relación con otras vías
exitosos y un número aún mayor de resultados biosintéticas (vías competitivas). También es
no esperados. El conocimiento ganado ha con- importante conocer la compartimentalización
ducido a concebir el funcionamiento del meta- celular de la ruta en estudio y la participación
bolismo como el de una gran red de reacciones de tejidos o de órganos especializados en la
químicas interrelacionadas, en que la modifica- producción de determinados metabolitos.
ción de un sólo componente puede producir
un impacto considerable en el metabolismo Manipulación genética del metabolismo
de todo el organismo. Aún así, el metabolis- secundario por sobreexpresión o
mo secundario es un blanco particularmente inhibición de la producción de enzimas
atractivo para mejorar el rendimiento de un La manipulación genética del metabolismo
producto determinado sin que ello afecte mar- secundario tiene como objetivo el aumento o
la simbiosis vegetal (por inducción de la nodu- rales convencionales. En Petunia hybrida, una
lación de bacterias fijadoras del nitrógeno). de las plantas en que la vía de síntesis de an-
Este tipo de polifenoles son importantes eco- tocianinas ha sido más extensamente estudia-
nómicamente porque contribuyen al sabor, aro- da, se producen derivados de delfinidinas y de
ma y color de los alimentos y bebidas. Además cianidinas pero no derivados de pelargonidina.
en los últimos años han adquirido una gran im- Esto se debe a la especificidad de la enzima
portancia en la salud humana debido a estudios dihidroflavonol 4-reductasa de petunia, la cual
que sugieren que estos compuestos presentan no puede reducir al precursor de pelargonidina,
un efecto protector frente a ciertas enferme- el dihidrokemferol, en kemferol. Sin embargo,
dades y pueden actuar como antialergénicos. hace casi dos décadas se obtuvo una variedad
Debido a las propiedades benéficas para la sa- de petunias anaranjadas que representa el pri-
lud humana y a su importancia económica, las mer producto exitoso de modificación del color
vías biosintéticas de los flavonoides han sido de las flores por ingeniería genética. Esto se
extensamente estudiadas. Esto ha permitido el logró transformando una variedad de petunia
desarrollo de la ingeniería metabólica aplicada blanca con el gen de la dihidroflavonol 4-re-
al mejoramiento nutricional de ciertos cultivos ductasa (dfr) de maíz. La variedad de petunia
como también a la producción de flores de cor- blanca (mutante RLo1) acumula dihidrokemfe-
te. Una de las primeras aplicaciones de la in- rol debido a que los genes f3’h (3´flavonoide
geniería metabólica fue la manipulación de la hidroxilasa) y f3’5’ (3´-5´flavonoide hidroxilasa)
vía de síntesis de flavonoides y antocianinas se hallan afectados por mutaciones; en conse-
para cambiar el color de las flores. Esto se de- cuencia, produce flores que no muestran pig-
bió principalmente a que era una de las vías mentación. La transformación de esta variedad
más conocidas y los resultados eran fácilmen- con el gen de maíz condujo a la producción
te observables. Es inusual encontrar la gama y acumulación de pelargonidina, obteniéndo-
completa de colores dentro de las especies flo- se flores de petunia color anaranjado (Figura
ArgenBio www.argenbio.org
Batista J et al, 2007. Evaluación de inocuidad
alimentaria de organismos genéticamente
modificados, Criterios y recursos para su
implementación. UNU-Biolac-RNBio-ILSI
(disponible en www.ilsi.org.ar. Biotecnología)
Bouis H. 2007. The potential of genetically modified
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Butelli E et al., Enrichment of tomato fruit with health-
promoting anthocyanins by expression of select
transcription factors, Nat Biotechnol, 26:1301–8,
2008.
Figura 3: Tomates violeta con alto contenido de Chu Y, Faustinelli P,R amos ML, Hajduch M,
antocianinas y tomates rojos sin modificar. Foto del Stevenson S, Thelen JJ, Maleki SJ, Cheng
Centro John Innes Centre H y Ozias-Akins P. Reduction of IgE Binding
Costo estimado
Costo de
Contaminante usando otras
Fitorremediación
tecnologías
Plantas
Hiperacumuladoras Metal Contaminantes y entorno
comunes
zinc(Zn), Metales pesados, selenio y
Thlaspi caerulescens Mostaza parda
cadmio (Cd) radionucleótidos en el suelo
Solventes clorados y nitratos
Berkheya coddii níquel (Ni) álamo en aguas subterráneas,
metales pesados en el suelo
Solventes clorados en agua
Astragalus racemosus selenio (Se) Álamo carolino
subterráneas; metales, nitratos
arsénico Desechos explosivos en
Pteris vittata Lenteja de agua
(As) aguas subterráneas
Hidrocarburos aromáticos
Ipomoea alpina cobre (Cu) mora
policíclicos (PAHs) en el suelo
Radionucleótidos en aguas
Haumaniastrum robertii cobalto (Co) girasol
subterráneas
Metales pesados e
Iberis intermedia talio (Tl) pastos
hidrocarburos en el suelo
Gysophila Hidrocarburos en suelos y
boro (B) alfalfa, enebro
spaerocephala aguas subterráneas
Figura 6. EdenfernTM
Figura 1. Rizosecreción en plantas transgénicas. Plantas transgénicas de tabaco que expresan hEGF,
creciendo en medio MS sobre un disco de nitrocelulosa (izquierda), ensayo de root blot realizado sobre
estas membranas y revelado con un anticuerpo anti-hEGF (derecha).
a b
Cultivo GM / fracción Modelo Animal Parámetros analizados
Maiz/grano Pollos parrilleros Ganancia de peso, observaciones
Soja/alimento tostado. Gallinas ponedoras clínicas, ingesta, cal idad de carne,
producción y calidad de huevos,
digestibilidad
Maíz/ silaje/ forraje/ grano Ganancia de peso, ingesta,
Soja/alimento tostado. Vacas (ganado de carne) observaciones clínicas, producción
Soja cruda y calidad de carne, grasa
abdominal.
M aiz/grano Cerdos Ganancia de peso, ingesta,
Soja/alimento tostado. observaciones clínicas, calidad de
carne, contenido graso.
Algodón/ semilla Ganancia de peso, ingesta,
Maiz/grano Vacas lecheras observaciones clínicas, pH
Soja/alimento tostado. rumi nal, producción, calidad y
composición de la leche,
características para producción de
queso.
Maiz/grano Ovejas Digestibilidad
el impacto que el cultivo podría tener en espe- Todos estos puntos son analizados, del mis-
cies propias del agroecosistema. Por ejemplo, mo modo que la inocuidad alimentaria, caso
efectos sobre especies que no son el blanco de por caso. También se estima el cambio que
su actividad en el caso de cultivos GM protegi- podría provocar en el manejo agronómico, la
dos de insectos . introducción de un dado cultivo GM .
Mayor capacidad de cruzarse con plantas El objetivo de las evaluaciones de riesgo am-
de su entorno que la contraparte convencio- biental, es identificar impactos en el ambiente
nal. Incluso en caso de ser idéntica, se eva- (negativos o positivos), cuantificarlos y propor-
lúa cuáles serían las consecuencias de dichos cionar elementos para aquellos que deben ma-
cruzamientos (debido al llamado flujo génico nejar y minimizar estos riesgos, siempre en el
mediado por polen). contexto de la práctica agronómica corriente y
El flujo genético entre poblaciones es un de las tecnologías alternativas disponibles (por
fenómeno natural, responsable de una gran ejemplo, cultivos “Bt”, evaluados en relación
diversidad genética. Para estimar qué peso con las aplicaciones tradicionales de insectici-
puede tener un rasgo nuevo introducido por das químicos, y en el contexto del Manejo In-
ingeniería genética en el flujo génico gene- tegrado de Plagas, como una herramienta más
ral, es importante tener en cuenta qué efec- de control biológico).
to en particular producirá ese gen si se es-
tablece en otra población. Todo esto se exa- 4. Nuevas tecnologías potencialmente
mina en función de la existencia de parientes aplicables a la evaluación de la
silvestres de ese cultivo en la zona donde se lo bioseguridad
quiere introducir. Por ejemplo, en el caso de la Los avances en la tecnología científica de los
soja o el maíz, no existen parientes silvestres últimos años han transformado profundamente
en Argentina, pero sí en México (en el caso de la forma en la que se hace ciencia y se obtie-
maíz) y en China (en el caso de la soja). ne información de los sistemas biológicos. La
Objetivo del Detección de características Detección de proteínas. Detección de secuencias de ADN Detección de secuencias de ADN
ensayo biológicas o de una Determinación de la reacción proteína GM-anticuerpo
respuesta fisiológica
Tipo de resultado Cualitativo Cualitativo Cuantitativo
Cualitativo Semi-cuantitativo (utilizando la estrategia de sub-muestreo) Semi-cuantitativo (utilizando la
ELISA en placa puede ser cuantitativo estrategia de sub-muestreo)
Matriz sobre la que Semillas, granos, plántulas Semillas, granos, material verde joven, raíces, alimentos sin procesamiento Semillas, granos, tejidos, Semillas, granos, tejidos, alimentos con y
se puede realizar alimentos con y sin sin procesamiento
procesamiento
Ventajas Para tolerancia a herbicidas Método sencillo y fácil de llevar a cabo. Permite la detección “in situ”. No Método sensible, exacto y Método sensible, exacto y específico.
(TH): Método sencillo, necesita material ni instalaciones sofisticadas. específico. Permite la identificación y cuantificación
preciso y económico Preciso, exacto y rápido. Permite la identificación especifica de eventos.
específica de eventos. Utilización sobre cualquier tipo de matriz
Utilización sobre cualquier tipo de sin importar grado de procesamiento.
matriz sin importar grado de Método rápido
procesamiento
Desventajas Demora para la lectura de los Necesita una buena expresión de la proteína en la matriz de análisis. Debe Detección compleja si no se Cuantificación compleja si no se definen
resultados (al menos una conservarse intacta la estructura proteica a detectar. No permite la definen adecuadamente el adecuadamente el muestreo, la
semana para TH) identificación entre eventos GM distintos que expresen la misma proteína. muestreo, la estrategia de estrategia de detección y los materiales
Para resistencia a insectos: Problemas para la cuantificación directa (ELISA en placa). No permite la detección y los materiales de de referencia. Mayor costo en equipos y
Método costoso y de identificación de proteínas similares entre la proteína GM y la convencional referencia. reactivos
dificultosa realización Mayor posibilidad de
contaminación.
Mayor costo en equipos y
Nivel de Requiere manejo mínimo de Requiere manejo mínimo de la técnica. Capacitación en técnicas de Capacitación en técnicas de biología
preparación del la técnica. Requiere mayor capacitación en el caso de ELISA en placa. biología molecular molecular
personal
Exigencia para Instalaciones básicas Laboratorio con instalaciones básicas. Puede realizarse in situ (tiras Laboratorio de Biología Molecular Laboratorio de Biología Molecular
instalaciones reactivas) y laboratorios básicos de inmunologia (ELISA en placa)
Aplicación del En general para Determinación de pureza del carácter y presencia adventicia por parte de Determinación de pureza del Por tratarse de determinaciones
método determinación de pureza del organismos de control y/o la industria semillera. carácter y presencia adventicia cuantitativas, es el método de elección
carácter por organismos de por parte de organismos de para transacciones comerciales.
control o la industria control y/o la industria semillera.
semillera. Transacciones comerciales.
Uso habitual En semillas (para TH) Método de screening rápido en semillas, tejidos varios y alimentos sin Transacciones comerciales en Transacciones comerciales en todo tipo
No se aplica hasta el procesamiento todo tipo de matriz de matriz donde exigen resultados
momento para la cuantitativos
característica de resistencia a
insectos
Material de Semillas o granos Material GM y no GM(Granos, semillas y/o tejidos). Harinas GM, ADN y plásmidos. Disponibles Harinas GM, ADN y plásmidos. Disponibles
referencia a utilizar GM y no GM Disponibles comercialmente para algunas especies y eventos. comercialmente para algunas especies comercialmente para algunas especies y eventos.
y eventos.
durante el análisis. Entre estos controles, se presente en la muestra, que puede ser detec-
encuentran las muestras positivas para la ca- tado. Este límite varía de acuerdo al método de
racterística a detectar y controles específicos elección y dentro de cada método, de acuerdo
para la detección de sustancias inhibidoras del al tipo de muestra analizada.
análisis. El límite de cuantificación es la menor con-
centración del analito de interés presente en la
Falsos positivos muestra de estudio que puede ser cuantificado
Se define como “falsos positivos” a aquellas con un aceptable nivel de exactitud y precisión.
reacciones para las que se detecta proteína o En ambos casos, dependerá de la matriz so-
secuencia de ADN, cuando en realidad NO la bre la que se realiza el análisis y del método
contienen. Gran parte de este tipo de resulta- en sí mismo. Es de suma importancia conocer
dos no provienen de la muestra original, sino
estos límites de manera de aplicar adecuada-
que se deben a la contaminación de la misma
mente los métodos. El laboratorio deberá en-
por errores de manipuleo. La contaminación
tonces validar sus metodologías mediante en-
puede darse a lo largo de todo el proceso de
sayos de validación y en lo posible mediante
análisis. Esta puede ser previa al envío de la
misma al laboratorio así como dentro del la- pruebas de interlaboratorio.
boratorio, ya sea durante la preparación de la
misma para el análisis como en el momento Los materiales de referencia
de su detección específica. La técnica de PCR Los materiales de referencia son una herra-
es muy sensible, por lo tanto niveles ínfimos mienta fundamental para cualquier análisis.
de contaminación con ADN en una muestra Por un lado, permiten conocer como se com-
pueden generar un resultado positivo falso. La porta el método con una muestra positiva y con
amplificación repetida del mismo fragmento de una negativa para la característica a detectar,
ADN (amplicón) va generando cientos de miles y por otro son fundamentales para la validación
de millones de copias dentro del mismo labo- del mismo y su comparación con otros labora-
ratorio y estas copias pueden contaminar las torios. Comercialmente se encuentran materia-
nuevas muestras y los reactivos si no se tienen les de referencia disponibles y confiables para
cuidados especiales. Además, restos de mo- distintos eventos y concentraciones. Los más
lienda de semillas o granos u otros tejidos ve- utilizados y difundidos son las harinas o granos
getales de muestras previas, pueden llevar la GM, las secuencias de ADN y los plásmidos.
contaminación a nuevas muestras. Asimismo, En la actualidad no existe un único material
en el caso de la PCR pueden informarse fal- de referencia que pueda aplicarse para la de-
sos positivos por elección de una estrategia de tección y/o cuantificación de todos los produc-
detección inadecuada. Los casos más comu- tos a ser analizados. Ello conduce a que, cuan-
nes se dan cuando se realiza la detección del do estén disponibles, éstos deben ser elegidos
Promotor 35S en crucíferas o en alimentos que y utilizados de acuerdo al tipo de matriz que se
las contengan (por infección con el virus del quiere analizar. No siempre es sencillo estable-
Mosaico del Coliflor) y en el caso de Agrobac-
cer cuál es el mejor material de referencia a ser
terium con la detección del Terminador NOS.
utilizado como control positivo, sobre todo para
Para la detección de los falsos positivos se
efectos de cuantificación, ya que el número de
utilizan de manera rutinaria controles nega-
copias por genoma haploide varía para cada
tivos. Estos controles consisten en muestras
que no contienen la característica especial que evento, además de la existencia de variables
cada método permite detectar (secuencia de propias para las matrices de cada muestra.
ADN, proteína o directamente la matriz a ana- En relación a los controles negativos, se debe
lizar). asegurar la ausencia de la característica GM
por debajo de cierto umbral y con un rango de
Límite de Detección y Límite de tolerancia.
Cuantificación La temática de los materiales de referencia
Se considera como límite de detección a la presenta una serie de consideraciones, com-
mínima concentración del analito de interés plejidades, problemáticas y usos que exceden
Lecturas recomendadas
t Gametas R S
Frecuencia de las
p q
gametas
t+1 Genotipos RR SR SS
Frecuencia de los
p2 2pq q
2
genotipos (zigotos)
Fitness (viabilidad) W RR W SR W SS
Contribución ponderada
p2 W RR 2pq W SR 2
q W SS
(adultos)
Frecuencia relativa de
cada genotipo luego de
p2 W RR / W M 2pq W SR / W M Q2 W SS / W M
una generación de
selección
Desarrollo de resistencia en
poblaciones de malezas
El primer registro de resistencia a herbicidas
se reportó en 1970 en Estados Unidos, en una
población de Senecio vulgaris (senecio) que
mostró resistencia a simazina y atrazina lue-
go de un período de diez años en el que estos
principios activos se aplicaban una o dos veces
por año. A nivel mundial, la tasa de aparición
de biotipos resistentes se ha incrementado
notablemente. En 1983 se habían detectado
60 casos de resistencia y en la actualidad se
registran 321 biotipos resistentes que corres-
ponden a 185 especies, de las cuales 111 son
dicotiledóneas y 74 son gramíneas. Si bien se
ha documentado resistencia a la mayoría de
Figura 2. Evolución de la resistencia. (A) una po-
los grupos químicos, un alto porcentaje de los blación de malezas que presenta mayoría de plan-
casos corresponden a inhibidores de la enzima tas susceptibles es pulverizada con un herbicida.
acetolactato sintasa (ALS), de los fotosistemas Como el biotipo resistente al herbicida se encuentra
I y II, de la síntesis de ácidos grasos y de las en una frecuencia muy baja, la población en general
auxinas sintéticas (figura 1). es eficientemente controlada. (B) Con la aplicación
En las poblaciones de malezas, el desarro- recurrente del mismo herbicida (u otros herbicidas
llo de resistencia es un proceso evolutivo en que actúan en el mismo sitio de acción) las plantas
respuesta a la presión de selección ejercida susceptibles son eliminadas antes de formar se-
millas que garantizan su supervivencia. Contraria-
por el uso repetido de herbicidas con el mismo
mente, la frecuencia del biotipo resistente se incre-
sitio de acción. Los biotipos susceptibles mue- menta ya que dispersan sus semillas normalmente.
ren, mientras que los resistentes sobreviven y (C) Al persistir la aplicación de estos herbicidas, la
producen semillas. Si continúa la aplicación de densidad del biotipo resistente se incrementa signi-
herbicidas que actúan sobre el mismo sitio de ficativamente. (D) Luego de algunos años la mayo-
acción, la proporción del biotipo resistente se ría de los individuos de la población es resistente y
incrementa en relación al biotipo susceptible el herbicida ya no resulta una herramienta eficiente
(figura 2). para el control de la maleza.
País Cultivos GM
Soja, algodón, maíz, canola, alfalfa, papaya,
EEUU
zapallo, remolacha azucarera
Argentina Soja, algodón, maíz
Brasil Soja, algodón, maíz
Canadá Maíz, soja, canola, remolacha azucarera
India Algodón (Bt)
China Algodón, tomate, papaya, álamo, petunia, pimiento
Paraguay Soja
Sudáfrica Algodón, maíz, soja
Uruguay Maíz, soja
Bolivia Soja
Filipinas Maiz
Australia Algodón, canola, clavel
España Maíz
México Algodón, soja
Colombia Algodón, clavel
Chile* Maíz, soja, canola
Honduras Maíz
Rep. Checa Maíz
Portugal Maíz
Alemania Maíz
Eslovaquia Maíz
Rumania Maíz
Polonia Maíz
Burkina
Algodón
Faso
Egipto Maíz
los cultivos. Muchos herbicidas sirven para un En las plantas, la enzima 3-enolpiruvil-shi-
determinado tipo de malezas y suelen dejar re- quimato-5-fosfato sintasa (EPSPS) es clave
siduos que permanecen en el suelo por años. en las rutas metabólicas que llevan a la pro-
El empleo de cultivos tolerantes a herbicidas ducción de los aminoácidos aromáticos (fenila-
resuelve estos problemas, ya que estos culti- lanina, tirosina y triptófano). Esta enzima sólo
vos son tolerantes a los herbicidas glifosato o está presente en plantas y microorganismos,
glufosinato, ambos de amplio espectro (es de- tales como bacterias y hongos, y ausente en
cir, eliminan a casi todas las plantas, excepto animales y humanos. En la década de 1970 se
aquellas tolerantes a dichos herbicidas) y de descubrió que el glifosato inhibía a la enzima
menor efecto residual que los herbicidas tradi- EPSPS, impidiendo la producción de aminoáci-
cionales. Además, el productor se beneficia en dos aromáticos. Los aminoácidos son esencia-
gran medida porque con puede usar métodos les para la síntesis proteica y las proteínas son
de labranza más conservacionistas, como la necesarias para el crecimiento y las funciones
siembra directa, que ayuda a conservar el sue- vitales, por lo tanto, la aplicación del glifosa-
lo y la humedad, simplifica el manejo y reduce to lleva a la muerte de la planta. Las plantas
los costos de producción. tolerantes a glifosato tienen el gen epsps de
la cepa CP4 de la bacteria del suelo Agrobac- El maíz tolerante a glifosato se aprobó para
terium tumefaciens. Como la enzima EPSPS su siembra comercial en 2004, y desde ese en-
producida en esta cepa bacteriana no es afec- tonces su adopción creció en forma sostenida,
tada por el glifosato, su introducción en el ge- alcanzando en la campaña 2008/09 las 320 mil
noma de las plantas las vuelve tolerantes al hectáreas (el 10% del maíz transgénico total).
herbicida. Uno de los nombres comerciales del También se han cultivado híbridos de maíz que
glifosato es “Roundup”, por eso, quienes de- contienen dos características acumuladas: la
sarrollaron esta tecnología denominaron a los resistencia a insectos y la tolerancia a glifosato
cultivos tolerantes al glifosato con el nombre de (800 mil hectáreas). La adopción del algodón
“Roundup Ready”, o RR. tolerante a glifosato también se incrementó en
Como método alternativo, también se obtuvo gran medida en los últimos años, alcanzando
maíz tolerante a glifosato por introducción del en la campaña 2008/09 las 210 mil hectáreas
gen de la EPSPS del maíz, pero con modifi- (el 70% del algodón sembrado en Argentina).
caciones en su secuencia para que la enzima
resulte resistente al herbicida. Cultivos resistentes a insectos
En Argentina se cultivan soja, maíz y algo- El barrenador del tallo (Diatraea sacchara-
dón tolerantes a glifosato. La soja fue el primer lis) es un insecto lepidóptero que constituye
cultivo en el mercado argentino en incorporar la principal plaga de los cultivos de maíz en
una característica a través de transgénesis. En nuestro país. Sus larvas se alimentan de los
1996 fueron inscriptas en el Registro Nacional tallos y las hojas, dejando galerías que dañan
de Propiedad de Cultivares las primeras varie- la planta, la quiebran, impiden el transporte de
dades de soja tolerante a glifosato de la empre- nutrientes y sustancias y son vía de entrada
sa Nidera y ya en la campaña 97/98 se sem- para hongos, cuyas toxinas (micotoxinas) son
braron 1.750.000 de hectáreas. Hoy hay varias muy peligrosas para nuestra salud.
empresas semilleras que ofrecen al mercado La denominación Bt deriva de Bacillus
un gran número de variedades de soja con thuringiensis, una bacteria que normalmen-
esta característica, encontrándose variedades te habita el suelo y cuyas esporas contienen
de los grupos III a VIII, adaptadas a una amplia proteínas tóxicas para ciertos insectos. Estas
gama de regiones y necesidades. En 2008/09, proteínas, denominadas Cry, se activan en el
la superficie de soja transgénica ascendió a 17 sistema digestivo del insecto y se adhieren a
millones de hectáreas. su epitelio intestinal, alterando el equilibrio os-
Conclusiones
La aceptación o rechazo de una tecnología
por parte de la sociedad puede determinar su
éxito o su fracaso, la introducción de algo nue-
vo siempre genera debate y las campañas de
información son fundamentales. La divulgación
científica objetiva, seria y sin tinte emocional,
es una herramienta muy útil para desenterrar
mitos e interrogantes. La sociedad necesita in-
formación veraz y de base científica: la infor-
mación y la educación son la clave.
Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarán en este libro una
excelente fuente de información.
Consejo Argentino para la Información
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INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA
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