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Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Editores: Gabriela Levitus, Viviana Echenique, Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginski
Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa

Ediciones

Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Editores:
Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

ndice

Prefacio ............................................................................................................................... Agradecimientos ................................................................................................................ Lista de Autores .................................................................................................................. Prlogo a la Primera Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ............................................. Prlogo a la Segunda Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ........................................... Parte I: Herramientas Bsicas ...........................................................................................
Captulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland . Captulo 2: Morfognesis. Silvia Radice ... Captulo 3: La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas vegetales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germn Robledo, Aveliano Fernndez y Viviana G. Sols Neffa. .................................................................................................................................................. Captulo 4: Herramientas bsicas de ingeniera gentica. Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Viviana Echenique. ................................................................................................................................ Captulo 5: Marcadores moleculares. Mara Carolina Martnez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. Captulo 6: Construccin de mapas de ligamiento gentico, localizacin de genes y regiones cromosmicas asociadas a caracteres de inters en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pablo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... Captulo 7: Genmica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y Gustavo Schrauf. .............................................................................................................................................. Captulo 8: Transcriptmica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... Captulo 9: Protemica. Paula Casati y Mara F. Drincovich ............................................................. Captulo 10: Metabolmica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J. Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... Captulo 11: Metagenmica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... Captulo 12: Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz, Paula Fernndez, Vernica Lia, Corina Fusari. ...................................................................................

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Parte II: Mtodos para generar y analizar diversidad


Captulo 1: Polinizacin y fertilizacin in vitro. Susana Cardone, Gladys Prez Camargo y Aurora Picca. .................................................................................................................................................. Captulo 2: Hibridacin somtica. Pablo Polci y Pablo Friedrich. ....................................................

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Captulo 3: Epigentica y evolucin 5LFDUGR : 0DVXHOOL \ &DUORV ) 0DUO  Captulo 4. Mutagnesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara Gabriela Pacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... Captulo 5: Variacin somaclonal. Susana Cardone, Sofa Olmos y Viviana Echenique. ............... Captulo 6: Aplicacin de la transformacin gentica al mejoramiento vegetal. Marina L. Daz, Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Ral D. Ros ............................................................... Captulo 7: Usos del silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes candidatos. Cecilia Vzquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodrguez, Natalia Almasia y Sebastin Asurmendi .. Captulo 8: Anlisis de experimentos biolgicos. Sofa Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibez, Nlida Winzer .............................................................................................................................. Captulo 9: Mtodos multivariados para estimar variabilidad gentica. Nlida Winzer, Miguel DiRenzo, Sofa Olmos y Mercedes Ibez. .........................................................................................

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3DUWH ,,, 0pWRGRV SDUD DFHOHUDU SURJUDPDV GH PHMRUDPLHQWR H LGHQWLFDFLyQ YDULHWDO


Captulo 1: Obtencin de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Vernica Conti y Rubn Miranda y Nicols Gear. .................................................................................................................................... Captulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, Antonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. Captulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento gentico de cultivos. Carlos Sala, Mariano Bulos, Anala Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... &DStWXOR  ,GHQWLFDFLyQ \ UHJLVWUR GH YDULHGDGHV Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y Mara Alicia Loray .........................................................................................................................................

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Parte IV: Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma


Captulo 1: Micropropagacin. Sofa Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... Captulo 2: Semilla sinttica. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. Captulo 3: Conservacin de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. .......................

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Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnologa vegetal


Captulo 1: Aportes de la citogentica al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Graciela Gonzlez, Mara Rosa Ferrari, Ana Mara Garca, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, Pablo Tomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. Captulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genmica. Germn Spangenberg, Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... Captulo 3: Caracterizacin molecular de la apomixis y su aplicacin en la agricultura. Silvina C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... Captulo 4: Avances de la biotecnologa en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandn, Pablo A. Marinangeli y Mariana Prez de la Torre. ..................................................................................

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Captulo 5: Aplicacin de la biotecnologa en la mejora y conservacin de especies forestales. Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... Captulo 6: Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a virus en plantas. Mariana del Vas, Ana Julia Distfano, Cecilia Vzquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... Captulo 7: Obtencin de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrin Vojnov, Mercedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... Captulo 8: Aproximaciones biotecnolgicas para un manejo sustentable del estrs fngico en la agricultura. Juan Carlos Daz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martnez-Zamora; Sergio Salazar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontivero y Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... Captulo 9: Utilizacin de cultivos de tejidos para la obtencin y conservacin de plantas libres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ Captulo 10: Obtencin de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... Captulo 11: Aplicaciones biotecnolgicas al manejo de malezas. Germn Ferrari y Julio E. Delucchi. .................................................................................................................................................. Captulo 12: Obtencin de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abiticos. Florencia del Viso, Andrea F. Puebla, Nstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. Captulo 13: Manipulacin gentica del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Mara Binaghi ........................................................................................................................................... Captulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. Captulo 15: Fitorremediacin. Mara Eugenia Segretn, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. Captulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, Mara Eugenia Segretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matas Lentz. .........................................................................

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Parte VI: Manejo responsable de la tecnologa

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&DStWXOR  &ULWHULRV FLHQWtFRV SDUD OD HYDOXDFLyQ GH OD ELRVHJXULGDG GH 2UJDQLVPRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV Clara Rubinstein ........................................................................................... &DStWXOR  %LRVHJXULGDG GH 2UJDQLVPRV *HQpWLFDPHQWH 0RGLFDGRV  0DUFRV 5HJXODWRULRV Moiss Burachik .................................................................................................................................. Captulo 3: Flujo gnico y su posible impacto ambiental. Mnica Poverene, Soledad Ureta y Agustina Gutirrez. ............................................................................................................................. Captulo 4: Deteccin de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... Captulo 5: Manejo integrado de plagas Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y Cecilia Roca. ................................................................................................................................................... Captulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolucin y estrategias de manejo. Daniel Tuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. .....................................................

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Parte VII: Biotecnologa y sociedad


Captulo 1: La transformacin tecnolgica y los nuevos desafos. Carmen Vicin. ..........................

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&DStWXOR  $GRSFLyQ GH ORV FXOWLYRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV HQ $UJHQWLQD \ HQ HO PXQdo. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... Captulo 3: Biotecnologa en la mira: el problema de la percepcin. Valeria Durand ...............

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PREFACIO En oportunidad de la Primera Edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, nos habamos propuesto responder a la necesidad de un texto en idioma espaol, dirigido a docentes y estudiantes de los cursos de Agronoma y de otras formaciones relacionadas con las tecnologas aplicadas al mejoramiento vegetal, as como brindar un recurso de informacin general y consulta para no especialistas. Esta Segunda Edicin, intenta actualizar, profundizar y extender estas temticas, atendiendo a la rpida evolucin en este campo del conocimiento. En el contexto de los principios bsicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad gentica y seleccionar caractersticas deseables, las tecnologas evolucionan rpidamente y, del mismo modo, se acelera la transferencia del conocimiento bsico a las aplicaciones. Esta edicin intenta UHHMDU HVWH SURFHVR GLQiPLFR \ DSRUWDU LQIRUPDFLyQ DFWXDOL]DGD FRQ HMHPSORV GH DSOLFDFLRQHV DO mejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentes campos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas bsicas, se ha hecho foco en las tcnicas de cultivo de tejidos y micropropagacin que se utilizan en s mismas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades o como paso obligado en la construccin de plantas transgnicas. En la seccin que se ocupa de las DSOLFDFLRQHV GH HVWDV WpFQLFDV D FDVRV HVSHFtFRV VH EULQGDQ HMHPSORV GH PHMRUDPLHQWR ORJUDGR en diferentes especies. La tecnologas omicas (genmica, transcriptmica, metabolmica) constituyen una de las herramientas ms importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campo GH OD LQYHVWLJDFLyQ EiVLFD HQ HO PDSHR GH JHQHV \ OD LGHQWLFDFLyQ GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV FRPR HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH IXQFLRQHV \ UHGHV UHJXODWRULDV TXH LQX\HQ HQ ODV FDUDFWHUtVWLFDV TXH VH desean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestas a diferentes tipos de estrs ambiental, entre otras. Es claro que dentro de las tecnologas de mejoramiento, la transgnesis o transformacin gentica es una de las herramientas ms verstiles y poderosas, ya que permite resolver problemas que por va del mejoramiento convencional no sera posible enfrentar. En esta edicin se presentan numerosos ejemplos de transgnesis para la obtencin de cultivos tolerantes a estrs bitico y abitico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. 'HVGH  FXDQGR VH FXOWLYDURQ SRU SULPHUD YH] OD VXSHUFLH PXQGLDO GH FXOWLYRV WUDQVJpQLFRV aument 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectreas en 2009. Segn el ltimo informe del ISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnolgicas) estas hectreas fueron cultivadas por 14 millones de agricultores de 25 pases, siendo Argentina uno de los lderes en adopcin, con el 16% del rea global. Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacional para regular el desarrollo y la aplicacin de la ingeniera gentica al mejoramiento de organismos YLYRV FRQRFLGRV FRPR RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV X 2*0V  6L ELHQ pVWRV QR VH OLPLWDQ a plantas, en este trabajo se presentan slo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relacionados con los cultivos transgnicos. Esperamos que esta nueva edicin constituya una herramienta til y accesible para docentes, estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarn a la noble tarea de mejorar la agricultura.

Los Editores

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AGRADECIMIENTOS A todos y cada uno de los 141 autores, en su mayora investigadores y profesionales de instituciones argentinas, que han contribuido con sus aportes. Al Dr. Francisco Garca Olmedo, reconocido investigador y catedrtico espaol, por regalarnos tambin el prlogo de esta segunda edicin. Al Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa (ArgenBio), por auspiciar la publicacin del libro. A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar este proyecto. Los Editores

(O XVR GH IXHQWHV \ QRPEUHV FRPHUFLDOHV HQ HVWH GRFXPHQWR HV VyOR SDUD QHV GH LGHQWLFDFLyQ y no implica ningn aval ni recomendacin. Adems, los contenidos u opiniones expresadas en esta publicacin son de exclusiva responsabilidad de los autores.

LISTAS DE AUTORES (por orden alfabtico)


Abriata Aguilar Almasia Altieri Asurmendi Bazzini Bey Binaghi Bravo Almonacid Bulos Burachik Cardone Carrari Carrera Carrillo Casati Castagnaro Cervigni Chalfoun Chan Chantre Conci Confalonieri Conti del Vas del Viso Delucchi Luciano A. O. Mario Natalia Emiliano Sebastin Ariel Paula Mara Fernando Mariano Moiss Susana Fernando Alicia Nstor Paula Atilio Pedro Gerardo D. Nadia Raquel L. Guillermo Vilma Viviana Vernica Mariana Florencia Julio E. Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Nidera Semillas Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA INGEBI, CONICET Nidera Semillas Dir. de Biotecnologa, Min. de Agricultura, Ganadera y Pesca Facultad de Agronoma, UBA Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario EEAOC, Tucumn CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Universidad Nacional del Litoral CERZOS, CONICET, Universidad del Sur INTA IFFIVE Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) INTA-EEA Bordenave Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Monsanto Argentina

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Daz Daz Ricci DiRienzo Distfano Drincovich Durand Echenique Escandn Feingold Felitti Fernndez Fernndez Ferrari Ferrari Filippone Flaschland Franzone Fresco Friedrich Fusari Galdeano Gallo Garayalde Garbus Garca Garca Olmedo Gear Gmez Gonzlez Grasso Greizerstein Grellet Gutirrez Heinz Helguera Hopp Ibez Labarta Landau Lavia Lentz Levitus Lewi Lia Longo Loray Luciani Mamani Marcucci Poltri 0DUO Marinangeli Martnez

Marina L. Juan Carlos Miguel Ana Julia Mara F. Valeria Viviana Alejandro S. Sergio E. Silvina Aveliano Paula Germn Mara Rosa Paula Eduardo Pascual M. Anala Pablo Corina Ernestina Leonardo Antonio Ingrid Ana Mara Francisco Nicols Marisa Graciela Daniel H. Eduardo Carlos Agustina Ruth Marcelo Esteban Mercedes Marcelo Alejandra Graciela I. Ezequiel M. Gabriela Dalia Vernica Florencia Mara Alicia Gabriela Alicia Susana Carlos F. Pablo A. Ma. Carolina

CERZOS, CONICET, Universidad del Sur INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Crdoba Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario Ketchum Argentina - ArgenBio Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Instituto de Floricultura, INTA Castelar INTA - EEA Balcarce Universidad Nacional de Rosario Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONE Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Monsanto Argentina Universidad Nacional de Buenos Aires EEAOC, Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE IGEAF INTA Castelar Nidera Semillas Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE INTA - EEA Bariloche CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Agronoma, UBA Universidad Politcnica de Madrid Syngenta CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Instituto de Suelos, INTA Castelar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA EEA Marcos Jurez Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Universidad Nacional de Ro Cuarto Instituto Nacional de Semillas INASE Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE INGEBI, CONICET ArgenBio IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Direccin de Calidad - INASE CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA - EEA Mendoza CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

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Martnez-Zamora Masuelli Meier Mentaberry Miranda Morgenfeld Mroginski Nisensohn Olmos Ontivero Ortiz Pacheco Paniego Prez Camargo Prez de la Torre Pessino Picca Poggio Polci Poverene Prina Puebla Radice Rey Ros Rivero Robledo Roca Rodrguez Roncallo Rubinstein Sabbatini Sala Salazar Sansberro Scarpeci Schrauf Scocchi Segretin Seijo Selva Sharry Sols Neffa Spangenberg Tomas Tonello Torales Tranquilli Tuesca Ureta Valle Vzquez Rovere

Gustavo Ricardo W. Mauro Alejandro Rubn Mauro Luis Luisa Sofa Marta Juan Pablo Ma. Gabriela Norma Gladys Mariana Silvina C. Aurora Lidia Pablo Mnica Alberto Andrea F. Silvia Hebe Ral D. Mercedes Germn Cecilia Cecilia Pablo Clara Mario R. Carlos Sergio Pedro Telma E. Gustavo Adriana Ma. Eugenia Guillermo Juan P. Sandra Viviana G. Germn Pablo Ursula Susana Gabriela Daniel Soledad Estela M. Cecilia

INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn INTA - EEA Mendoza CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Asociacin Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del Sur INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE Universidad Nacional de Rosario Laboratorio de Biotecnologa, INTA Pergamino INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias, UNR IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Facultad de Agronoma, UBA Instituto de Floricultura, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias, UNR Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur IGEAF INTA Castelar Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE IGEAF INTA Castelar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE Dow Agrosciences Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar CERZOS, CONICET Monsanto Argentina ILSI CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Nidera Semillas INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR Facultad de Agronoma, UBA Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE INGEBI, CONICET Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE Victorian Department of Primary Industries (DPI) FCA, Universidad Nacional del Litoral INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn IRB, INTA Castelar IRB, INTA Castelar Facultad de Ciencias Agrarias, UNR CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

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Vellicce Vicario Vicin Vila Vojnov Winzer Wirth Wulff Zappacosta Zelada Zelener

Gabriel Ana Laura Carmen Alejandro J. Adrin Nlida Sonia Arturo Diego C. Alicia Noga

EEAOC, Tucumn Direccin de Calidad INASE Facultad de Agronoma, UBA IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Fundacin Pablo Cassar Universidad Nacional del Sur INGEBI, CONICET Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA IRB, INTA Castelar

PRLOGOS Prlogo a la primera edicin Recientemente, un periodista, que comparta una ensalada con un bilogo, exclam: Si yo slo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el bilogo le explic que al comer sta no haba ms opcin que engullir unos 25.000 genes del genoma de Lactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los miFURRUJDQLVPRV TXH KDELWXDO \ FyPRGDPHQWH KDELWDQ HQ OD VXSHUFLH GH ODV WXUJHQWHV KRMDV HO periodista qued atnito. Segn un eurobarmetro de hace unos meses, ms de dos tercios de los europeos estaban en contra de los alimentos transgnicos. Sin embargo, en la misma encuesta se inclua una aseveracin - los tomates normales no tienen genes, los transgnicos s - frente a la que tambin ms de dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es una lstima que dicho eurobarmetro no registrara la proporcin correspondiente al encabezamiento no saben, pero s contestan, aunque es fcil colegir que dicha fraccin era alta y en extremo vergonzante. Los avances del conocimiento biolgico y de la biotecnologa destacan en el panorama cienWtFRWpFQLFR GH HVWH Q GH VLJOR \ KDQ LPSUHJQDGR ODV PiV GLYHUVDV YHUWLHQWHV GH QXHVWUD YLGD cotidiana sin que se haya aceptado que un mnimo de estos conocimientos debera formar parte integral de la cultura general. La ignorancia de los hechos bsicos relativos a nuestra herencia JHQpWLFD R D QXHVWUD DOLPHQWDFLyQ VH FRQVLGHUD LQFOXVR GH EXHQ WRQR (VWR VH UHHMD GH HQWUDGD en el caos semntico que se ha creado en torno a la biotecnologa, del que hay que culpar no VyOR D OD LJQRUDQFLD GHO FLXGDGDQR VLQR WDPELpQ D OD WRUSH]D GH ORV FLHQWtFRV \ D OD GLFWDGXUD GH los medios de comunicacin. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir de la ciencia, y no a sus espaldas. 7pUPLQRV WDOHV FRPR RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 2*0V  DOLPHQWRV WUDQVJpQLcos, ingeniera gentica, ADN recombinante, transferencia gnica, clonacin, alimentos naturales, mejora gentica e, incluso, biotecnologa, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin orden ni concierto. A estas alturas empieza a ser difcil normalizar la situacin, pero tratemos de contribuir a ello. /D GHQLFLyQ GH ELRWHFQRORJtD DEDUFD D WRGDV ODV WHFQRORJtDV PHGLDGDV SRU XQ VHU YLYR R SRU SDUWHV GH pO VHDQ pVWDV FpOXODV R HQ]LPDV DLVODGDV %DMR HVWD GHQLFLyQ VH LQFOX\HQ GHVGH OD propia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricacin de las veinticuatro clases de cerveza mesopotmica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la ltima forma de producir

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insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el trmino de forma restringida para referirse exclusivamente a los ltimos avances basados en la biologa molecular. Para esto ltimo resulta ms adecuado el uso de la expresin biotecnologa molecular. 3UiFWLFDPHQWH OD WRWDOLGDG GH OR TXH SRQHPRV HQ QXHVWUD PHVD KD VLGR JHQpWLFDPHQWH PRGLcado. La domesticacin de plantas y animales supuso una alteracin muy drstica de sus genoPDV \ OD PHMRUD JHQpWLFD VXEVLJXLHQWH KD LGR DxDGLHQGR PRGLFDFLRQHV H[WHQVDV \ VXVWDQFLDOHV Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los mtodos empleados para ello. De hecho, la ingeniera gentica es slo uno de esos mtodos - una modalidad ms de meMRUD JHQpWLFD  \ VyOR VLUYH SDUD PRGLFDU XQR R SRFRV JHQHV GH IRUPD PX\ VHOHFWLYD 1R VHUYLUtD para obtener razas de perro tan distintas - en su tamao, morfologa y temperamento - como el Chihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a los mtodos genticos ms tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs slo a los productos de la ingeniera gentica para contraponerlos a los supuestamente naturales. Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayora de los organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivir por s mismos en la naturaleza. Es ms, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteraciones JHQpWLFDV TXH OHV SULYHQ GH LQQLGDG GH VXVWDQFLDV QDWXUDOHV TXH VRQ Wy[LFDV R LQKLELWRULDV SDUD HO VHU KXPDQR 8QD YDULHGDG PRGHUQD PRGLFDGD SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD HVWi WDQ OHMRV GH VHU natural como las que la precedieron. Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinnimo de inocuo. Se consideran organismos transgnicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingeniera JHQpWLFD R VL VH SUHHUH SRU VDVWUHUtD JHQpWLFD \D TXH ODV RSHUDFLRQHV IXQGDPHQWDOHV GH HVWD va experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN (una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una protena (una secuencia de aminocidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave gentica. Mediante la nueva tecnologa se puede alterar un genoma por la adicin de uno o varios (pocos) genes que previamente no formaban parte de l o por la inutilizacin de uno o varios genes entre los ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminar FDUDFWHUHV LQGHVHDEOHV GHO RUJDQLVPR UHVSHFWLYDPHQWH REMHWLYRV TXH QR GLHUHQ GH ORV GH OD mejora gentica tradicional. (Q OR TXH GLHUHQ OD YLHMD \ OD QXHYD WHFQRORJtD HV HQ HO UHSHUWRULR JpQLFR TXH VH SXHGH PDQHjar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nueYD  \ HQ HO PRGR GH LQWURGXFLU \ WUDQVIHULU OD PRGLFDFLyQ JHQpWLFD SRU YtD VH[XDO R SRU DGLFLyQ H[yJHQD WUDQVIRUPDFLyQ  UHVSHFWLYDPHQWH /RV RUJDQLVPRV PRGLFDGRV SRU WUDQVIRUPDFLyQ VH suelen denominar transgnicos. Llamar transgnicos a los alimentos derivados de dichos organismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrn, degradado es todo gen que entra por boca de cristiano. Es absurdo llamar transgnico al azcar procedente de una remolacha transgnica, ya que es un producto qumico puro, esencialmente indistinguible del aislado de la remolacha normal o de la caa de azcar. Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todos ORV PpWRGRV REMHWLYRV \ ORJURV GH OD DOWHUDFLyQ JHQpWLFD GH ODV SODQWDV FRQ QHV SUiFWLFRV )DOWDQ en nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra cultura general. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo por un nico autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnologa. De aqu que la aproximacin adoptada en esta obra, segn la cual cada captulo est a cargo de verdaderos especialistas, sea la ms apropiada en la actualidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2004

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Prlogo a la segunda edicin La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedan encadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segunda edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, un texto que, hace seis aos, supuso una esSOpQGLGD \ DIRUWXQDGD DSRUWDFLyQ D OD UHFHQVLyQ GH XQ iUHD WHFQRFLHQWtFD HQ YLJRURVD HEXOOLFLyQ \ de gran relevancia prctica. La necesidad de esta edicin surge de mltiples circunstancias, entre ODV TXH FDEH UHVDOWDU HO HQRUPH DYDQFH GHO FRQRFLPLHQWR TXH KD WHQLGR OXJDU OD UHGHQLFLyQ GH ORV UHWRV HQWRQFHV SODQWHDGRV \ OD DSDULFLyQ GH RWURV QXHYRV TXH KDQ GLYHUVLFDGR ORV REMHWLYRV prcticos de la disciplina. Adems, entre la aparicin de la primera edicin y la de esta segunda, ha RFXUULGR XQD FULVLV DOLPHQWDULD VLJQLFDWLYD TXH QR HV VHSDUDEOH GH RWUDV WDOHV FRPR OD HFRQyPLFD la climtica o la energtica. Segn todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores mltiples: la subida del precio del petrleo, el bajo nivel de reservas, la especulacin, el incremento de la poblacin y del consumo per capita, el desvo de una parte sustancial de la produccin agraria hacia la fabricacin de biocombustibles, la disminucin de los rendimientos por el estrs debido al cambio climtico y la falta de inversin en innovacin agropecuaria. Parece como si el xito relativo de las ltimas dcadas hubiera hecho bajar la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la produccin de alimentos ha ido por detrs de la del crecimiento de la poblacin durante la ltima dcada, justo el tipo de comportamiento relativo que propuso Malthus hace ms de dos siglos. En el ltimo medio siglo, ha sido la mejora gentica la TXH KD WHQLGR HO SURWDJRQLVPR WpFQLFR HQ OD GHUURWD GH OD DPHQD]D PDOWXVLDQD \D TXH OD VXSHUcie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto conciencia de que no se sabe bien cmo se va a conseguir el aumento de la produccin de alimentos en un 70-100 % para el ao 2050, necesidad que se considera mnima para alimentar una poblacin proyectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, adems, tendrn una demanda per cpita VLJQLFDWLYDPHQWH VXSHULRU D OD DFWXDO 6L VH TXLHUH ORJUDU GLFKR REMHWLYR KDEUHPRV GH VHU D~Q PiV HFDFHV HQ ODV SUy[LPDV GpFDGDV GH OR TXH OR KHPRV VLGR HQ ODV SUHFHGHQWHV Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni sern exclusivamente tcnicas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrn un importante componente tcnico y es sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita. El cambio climtico est alterando los estreses biticos y abiticos a que deben hacer frente las cosechas, lo que hace prioritaria la investigacin bsica y aplicada tanto en el esclarecimiento de los mecanismos involucrados como en la adaptacin de las cosechas tradicionales a las nuevas condiciones, as como el desarrollo de nuevas cosechas que sean ms apropiadas para condiciones extremas. La crisis energtica ha impulsado un nuevo inters por los biocombustibles, en los que se han centrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulacin de objetivos polticos que pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentacin mundial. As por ejemplo, los objetivos declarados para fechas prximas, tanto por lo EEUU como por la UE, estn determinando una competencia por el suelo agrcola de la generacin de biocombustibles con la produccin de DOLPHQWRV TXH QR SXHGH VLQR HQFDUHFHU VLJQLFDWLYDPHQWH ORV DOLPHQWRV \ DXPHQWDU HO Q~PHUR GH hambrientos en el mundo, as como contribuir a la destruccin de bosque tropical. Por otra parte, La bsqueda de especies y variedades aptas para la produccin de biocombustibles plantea retos formidables a la investigacin de su agronoma y a su mejora convencional y biotecnolgica. Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edicin de %LRWHFQRORJtD \ 0HMRUDPLHQWR 9HJHWDO ,, PDQLHVWD VX SOHQR SRWHQFLDO \ GHEH DOFDQ]DU VX Pi[Lma funcionalidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2010

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PARTE I Herramientas bsicas

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I - CAPTULO 1 Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales


Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland 1 Introduccin El cultivo de tejidos en su acepcin amplia SXHGH VHU GHQLGR FRPR XQ FRQMXQWR PX\ KHWHrogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en XQ PHGLR DUWLFLDO GH FRPSRVLFLyQ TXtPLFD GHQLGD \ VH LQFXED HQ FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV FRQWURODGDV /D LPSUHFLVLyQ GH HVWD GHQLFLyQ puede generar muchas polmicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es comn dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisOLGRV \ E FXOWLYRV HQ PHGLRV OtTXLGRV ORV TXH a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. Tambin es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubacin. La discusin de estos aspectos constituye el objetivo de este FDStWXOR $GLFLRQDOPHQWH VH LQFOX\H HO WHPD GH la aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro, TXH HV GH JUDQ LPSRUWDQFLD HQ OD PD\RUtD de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. 2 Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:

1. Objetivo del cultivo: VL ELHQ HV GLItFLO WUDWDU GH FODVLFDU ODV DSOLFDFLRQHV TXH VH SHUVLJXHQ FRQ HO FXOWLYR GH WHMLGRV VH SRGUtD HVTXHPDWLzarlas en aplicaciones para: Estudios bsicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema de callos SDUD HVWXGLDU DOJ~Q SURFHVR VLROyJLFR VH puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de FRQWDPLQDFLyQ FRQ PLFURRUJDQLVPRV $ YHFHV se hace uso del cultivo de tejidos porque repreVHQWD XQ VLVWHPD H[SHULPHQWDO TXH VLPSOLFD la complejidad generada por los fenmenos de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento GH ORV IUXWRV $VLPLVPR HO FXOWLYR GH yYXORV KD sido muy til para estudiar aspectos relacionaGRV FRQ OD IRUPDFLyQ GH ODV EUDV HQ DOJRGyQ El cultivo de discos de tallos brind una valiosa ayuda para estudiar la rizognesis in vitro. Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la ELRORJtD GH OD UHSURGXFFLyQ GH OD SODQWD SDUD aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de VHPLOODV VLQWpWLFDV YHU 3DUWH ,9 FDStWXOR  HO explante original deber posibilitar la induccin

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de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. 2EWHQFLyQ GH KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo FRPR D\XGD SDUD OD REWHQFLyQ GH KtEULGRV GHULYDGRV GH FUX]DPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV GRQGH se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en estadios tempranos de su GHVDUUROOR &RQ OD PLVPD QDOLGDG WDPELpQ VH utilizan ovarios u vulos fecundados. Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios 3DUD HVWD QDOLGDG ORV H[SODQWHV SXHGHQ VHU VHPLOODV SRU HM RUTXtGHDV R ELHQ VH DtVODQ ORV HPEULRQHV HQ XQ HVtado temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. Obtencin de plantas haploides (consiGHUDQGR FRPR KDSORLGH D XQ HVSRURWR TXH contiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no fertilizados. Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero VL OD QDOLGDG GH VX XWLOL]DFLyQ HV OD DSOLFDFLyQ en planes de mejoramiento gentico de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras. Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad GH H[SODQWHV /RV GH UDtFHV VXHOHQ VHU PX\ utilizados. Obtencin de hbridos somticos. Para esta QDOLGDG VH UHFXUUH D OD IXVLyQ GH SURWRSODVWRV (Q OD PD\RUtD GH ORV FDVRV VH DtVODQ ORV SURWRSODVWRV GH PHVyORV GH KRMDV \ GH VXVSHQViones celulares. Conservacin e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin D PHGLDQR \ ODUJR SOD]R FUtR FRQVHUYDFLyQ FRQ QLWUyJHQR OtTXLGR \ SDUD HO intercambio de material gentico.

Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los culWLYRV D SDUWLU GH H[SODQWHV H[WUDtGRV GH VHPLOODV en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledoQHV UDtFHV . 2. Posibilidad de contaminacin con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar HO XVR GH H[SODQWHV VXFLRV UDtFHV UL]RPDV que provienen de plantas crecidas en macetas R HQ HO FDPSR GDGR TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos. 3. (GDG VLROyJLFD. Este es un aspecto de JUDQ LQXHQFLD HQ OD PRUIRJpQHVLV &RPR UHJOD general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor FUtWLFR 6L ORV WHMLGRV VRQ MyYHQHV OD PLFURSURpagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes. 4. Tamao. En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un taPDxR PtQLPR GHO H[SODQWH TXH GHSHQGH GH OD especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados. 5. Epoca del ao. Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropa gacin y que generalmente est asociado al

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grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos. 3 Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos KRQJRV OHYDGXUDV EDFWHULDV WRSODVPDV YLrus). El ambiente generado por explante-medio GH FXOWLYRFRQGLFLRQHV ItVLFDV GH LQFXEDFLyQ es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es GLItFLO FXDQWLFDU HO LPSDFWR GH HVWDV SpUGLGDV pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrienWHV GHO PHGLR GH FXOWLYR R ELHQ OR PRGLFDQ (V PX\ GLItFLO FRQVHJXLU FXOWLYRV HVWULFWDPHQWH DVpSWLFRV GDGR TXH HQ OD PD\RUtD GH ORV casos es altamente probable que los mismos FRQWHQJDQ YLUXV \ WRSODVPDV SRU OR TXH HQ OD SUiFWLFD FXDQGR VH UHHUH D FXOWLYRV DVpSWLFRV HQ JHQHUDO VH TXLHUH VLJQLFDU TXH VRQ cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en OD VXSHUFLH GH ORV H[SODQWHV \ E IDOODV HQ ORV procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminacin \ SRU RWUR ODGR D\XGD D OD SODQLFDFLyQ GH ORV procedimientos para controlarlos. Varios gneros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium, Corynebacterium) y de honJRV ODPHQWRVRV Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos. Es conveniente inspeccionar visualmen-

te con la ayuda de un microscopio estereoscpico los cultivos en forma peridica (por lo menos semanalmente). Tambin se pueden realizar pruebas con medios de cultivo difeUHQFLDOHV \ WHVW ELRTXtPLFRV HVSHFtFRV Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se traEDMD \ ORV SRVLEOHV FRQWDPLQDQWHV HVSHFtFRV 2) Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes, cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con SURGXFWRV TXtPLFRV TXH HOLPLQHQ SDWyJHQRV \ HYHQWXDOHV PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV  3URFHGHU D OD GHVLQIHFFLyQ VXSHUFLDO GH los explantes mediante el uso de compuestos TXtPLFRV FRQ HO REMHWR GH HOLPLQDU ORV PLFURorganismos con el menor dao posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. $OJXQRV SURFHGLPLHQWRV VH EDVDQ HQ HO HPpleo de nicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril. En este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operacioQHV GH GHVLQIHFFLyQ VXSHUFLDO HQ XQD FiPDUD de transferencia con aire estril. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no es removido con facilidad del explante.

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En los casos en que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una prctica recomendada. (QWUH ORV PiV XVDGRV JXUDQ 7ZHHQ  0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o antimicticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composicin de los medios de cultivo y adems pueden ser metabolizados por los explantes. ltimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinacin de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones GH PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV 8QR GH HVWRV compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la FDxD GH D]~FDU (VWH FRPSXHVWR TXtPLFDPHQte: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plntulas crecidas in vitro como plantas donantes de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es aconsejable desinfectar tambin las plntulas resultantes. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubacin de los explantes mediante lo cual stos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio FRQWHQLHQGR VDFDURVD \ QDOPHQWH VRQ GHVLQfectados nuevamente y cultivados. 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o espoUDV 3DUD OD HVWHULOL]DFLyQ HQ OD PD\RUtD GH ORV casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo (en forma de vapor abierto o bajo presin), calor seco (aire caliente). Se pueden usar hornos a mi-

croondas. El agua caliente tambin puede ser usada. En el caso de sustancias termolbiles, OD HVWHULOL]DFLyQ VH SXHGH KDFHU PHGLDQWH OWUDFLyQ D WUDYpV GH OWURV EDFWHULROyJLFRV No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de mltiples factores entre los que interesan el tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: /D HVWHULOL]DFLyQ HQ HVWXIDV PHGLDQWH FDORU seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados. /D HVWHULOL]DFLyQ FRQ FDORU K~PHGR FRQ YDpor bajo presin (en autoclave o en una olla a presin). Es el procedimiento ms empleado para la esterilizacin de los medios de cultivo (salvo, como se indic ms arriba, para aquellos que posean componentes termolbiles). En este caso, lo ms comn es usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimtricas. 5) Cultivar los explantes en una cmara de WUDQVIHUHQFLD FRQ DLUH HVWpULO JDELQHWH GH Xjo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se des-

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infecten con etanol al 70 %. La utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras GH OD ERFD \ GH OD QDUL] DVt FRPR ORV JRUURV protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben DPHDU FXLGDGRVDPHQWH HQ OD OODPD GH XQ PHFKHUR 7DPELpQ HV QHFHVDULR DPHDU OD ERFD de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. 6) Incubar los cultivos en cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados. 4 Medios de cultivo 8Q PHGLR GH FXOWLYR SXHGH VHU GHQLGR como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de UHYLVDU PiV GH  WUDEDMRV FLHQWtFRV GHVcriben en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran: 8QD IXHQWH GH FDUERQR 1XWULHQWHV PLQHUDOHV 6XVWDQFLDV YLWDPtQLFDV 6XVWDQFLDV UHJXODGRUDV GHO FUHFLPLHQWR $JHQWH JHOLFDQWH HQ HO FDVR GH PHGLRV semislidos)

Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo in vitro de tejidos.


Compuestos Medio bsico MS N6 1.650 1.900 170 440 ----370 ----0,83 ----6,20 22,30 8,60 0,25 0,025 27,80 37,30 0,025 2,00 0,10 0,50 Nicotnico 100,00 30.000,00 5,7
-1- 1. 1

B5 ----2.500 ----150 134 250 150 0,75 10,00 3,00 ----2,00 0,25 0,025 27,80 37,30 0,025 ----10,00 1,00 0,50 100,00 20.000,00 5,5

NH 4NO3 KNO 3 KH 2PO4 CaCl 2.2H 2O (NH4) 2SO 4 MgSO4.7H 2O NaH 2PO 4.4H 2O KI MnSO 4.H2O H 3BO 3 MnSO 4.4H 2O ZnSO 4.7H 2O Na2MoO 4.2H 2O CuSO 4.5H 2O FeSO 4.7H 2O Na2EDTA CoCl 2.6H 2O Glicina Tiamina -HCl Piridoxina -HCl cido 1,00 Mioinositol Sacarosa PH
1)

----2.830 400 166 463 185 ----0,80 ----1,60 4,40 1,50 --------27,85 37,25 ----2,00 1,00 0,50 0,50 ----50.000,00 5,8

Composicin en mgL

MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962) N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C., y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell Res. 50: 151 - 158. 1968)

2WURV FRPSXHVWRV Fuente de carbono: Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente

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altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y FDVHtQD KLGUROL]DGD (V IXQGDPHQWDO TXH HO KLHrro sea incorporado juntamente con un agente TXHODQWH 1D('7$  OR TXH OR KDFH GLVSRQLEOH es un amplio rango de pH. Sustancias vitamnicas: De todas las que comnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En OD PD\RUtD GH ORV FDVRV ORV PHGLRV XWLOL]DGRV para el establecimiento de los cultivos conWLHQHQ DX[LQDV $1$ ' $,$ $,% 12$ 'LFDPED 3LFORUDP \R FLWRFLQLQDV %$ .,1 =($ L3 7KLGLD]XUyQ  /DV JLEHUHOLQDV HVSHFLDOPHQWH *$ VRQ UHTXHULGDV HQ DOJXQDV ocasiones para el cultivo de meristemas o para OD HORQJDFLyQ GH EURWHV (O $%$ HV XVDGR HQ algunos casos. $JHQWH JHOLFDQWH HQ HO FDVR GH PHGLRV VHmislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto ms utilizado. Tambin pueden emSOHDUVH $JDUJHO   7UDQVIHUJHO (2,0-2,60%), Phytagel (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%). Otros compuestos: Muchas sustancias, de YDULDGD FRPSRVLFLyQ TXtPLFD VXHOHQ VHU DGLFLRQDGDV D ORV PHGLRV EiVLFRV $GHPiV GH OD glicina, otros aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparaJLQD \ FLVWHtQD DXQTXH KD\ TXH WHQHU SUHVHQWH que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos txicos para los cultivos. En algunos medios se incorporan cidos RUJiQLFRV FRPR HO PiOLFR HO FtWULFR HO SLU~YLFR \ HO VXFFtQLFR \ HV IUHFXHQWH HO HPSOHR GH /JOXWDPLQD \ GH FDVHtQD KLGUROL]DGD $~Q KR\ se siguen utilizando ciertos componentes de FRPSRVLFLyQ TXtPLFD QR ELHQ GHQLGD FRPR HO

agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de banana. Tambin en ocasiones es necesaria la incorporacin de agentes antioxidantes /FLVWHtQD iFLGR DVFyUELFR SROLYLQLOSLUUROLGRna) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparacin de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas se citan manuales de laboratorio donde se describen detalladamente este punto. 5. Condiciones incubacin. ambientales para la

La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo meQRV HQ OR TXH VH UHHUH D WHPSHUDWXUD FDOLGDG H LQWHQVLGDG GH OX] IRWRSHUtRGR KXPHGDG DWmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire DFRQGLFLRQDGR IUtRFDORU \ XQD EXHQD \ XQLforme circulacin de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz HV JHQHUDOPHQWH SURYLVWD SRU OiPSDUDV XRUHVFHQWHV GHO WLSR OX] GtD FRQ XQD LUUDGLDQFLD GH HQWUH  \  PRO PV /D KXPHGDG DWmosfrica debe ser elevada (80- 90%). 6 Aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro. 'XUDQWH HO SHUtRGR GH LQFXEDFLyQ ORV FXOWLYRV VRQ H[SXHVWRV D FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV GLVtmiles al ambiente externo. La atmsfera interna se caracteriza por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, humedad relativa elevada, temperatura consWDQWH H LQWHQVLGDG OXPtQLFD EDMD $ VX YH] HO medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azcares (en aquellos sistemas hetertrofos y semiauttrofos de micropropagacin), sales y reguladores del crecimiento,

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sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anatPLFDV \ VLROyJLFDV TXH ODV SODQWDV GHEHUiQ corregir cuando son transferidas al ambiente H[WHUQR (VWH SHUtRGR GH DGDSWDFLyQ DO QXHYR hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratacin y, al mismo WLHPSR HVWLPXODU OD IRWRVtQWHVLV FRQ HO REMHWR GH generar un rpido crecimiento de los plantines. (O UHWUDVR HQ HO GHVDUUROOR GH OD FXWtFXOD \ OD escasa funcionalidad del aparato estomtico TXH SUHVHQWDQ ODV KRMDV GH OD PD\RUtD GH ODV especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin. El control de este SURFHVR VLROyJLFR HV GH YLWDO LPSRUWDQFLD GXrante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la disminucin de la transpiracin ser gradual y depender de la rehabilitacin de los estomas, DVt FRPR WDPELpQ GHO GHVDUUROOR GH OD FXWtFXla. El equipamiento necesario estar sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde tneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiracin (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a travs del empleo de cmaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicacin exgena de $%$ KRUPRQD LQYROXFUDGD HQ HO FRQWURO GHO FLHrre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa VHPLSHUPHDEOH HQ OD VXSHUFLH GH OD KRMD (Q este ltimo caso debern tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reDFFLRQHV GH WRWR[LFLGDG Resulta imprescindible evitar la exposicin a temperaturas extremas tanto en la fase area como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 C durante la estacin estival, mientras que en la poca invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas trmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel

del substrato, para mantener la temperatura por encima de los 18-20 C. Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado (saram). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de OX] QDWXUDO HV EDMR \ ORV GtDV VRQ FRUWRV GXrante una parte considerable del ao, la luz arWLFLDO SXHGH VHU DSOLFDGD FRPR FRPSOHPHQWR GH OD OX] QDWXUDO /DV OiPSDUDV WXEXODUHV XRUHVFHQWHV GHO WLSR OX] GtD VRQ HPSOHDGDV HQ KRUWLFXOWXUD SDUD SURORQJDU HO IRWRSHUtRGR $VLPLVPR ODV OiPSDUDV WXEXODUHV GH VRGLR DOWD presin presentan una distribucin espectral GH OD HQHUJtD DGHFXDGD SDUD HVWLPXODU IRWRVtQWHVLV \ VH HPSOHDQ SDUD WDO Q HQ XQD DPSOLD variedad de cultivos. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal creciPLHQWR \ GHVDUUROOR GH ODV UDtFHV 6H SXHGH HPplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de realizar una esterilizacin previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a travs del substrato (fertilizantes de liberacin controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); emplendose proporcioQHV ULFDV HQ IyVIRUR 13.  \ SRWDVLR 13.  TXH IDYRUHFHUiQ HO GHVDUUROOR UDGLFXODU \ OD UXVWLFDFLyQ GH ODV SODQWDV En todo momento deber realizarse un riguURVR FRQWURO WRVDQLWDULR HPSOHiQGRVH DQWLELyWLcos, fungicidas e insecticidas de uso universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de cmara de aclimatacin diseada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste. Bsicamente, est compuesta por una fase area construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que FRQWLHQH JUiQXORV GH DUFLOOD H[SDQGLGD D Q GH facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado, esta cmara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de PXOWLSOLFDFLyQ DVt FRPR WDPELpQ SDUD HO HQUDL]DPLHQWR FRQYHQFLRQDO D UDt] GHVQXGD de estacas de tallos u hojas.

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La humedad relativa de la fase area es controlada por un sensor (6) ubicado por encima GH OD WXEHUtD GH ULHJR   (O VLVWHPD KXPLGLcador est compuesto por picos tipo fog y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remaQHQWH HQ ODV FDxHUtDV HO VLVWHPD FRQVWD GH una vlvula solenoide de descarga y desage (7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cmara (3) los que, conjuntamente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal.

'HELGR D OD ODWLWXG JHRJUiFD HQ TXH VH HQcuentra, la cmara est equipada con un aconGLFLRQDGRU GH DLUH  IULJRUtDV SDUD HYLWDU situaciones de estrs trmico en poca estival. $ VX YH] \ GDGR TXH OD PD\RUtD GH ODV HVSHcies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema cuenta con mantas trmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. En este ltimo caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia la fase area.

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7. Agradecimientos. /RV DXWRUHV DJUDGHFHQ DO ,QJ 3DEOR $ /XQD SRU OD SODQLFDFLyQ GLJLWDO GH OD FiPDUD GH DFOLPDWDFLyQ $ OD 6HFUHWDUtD *HQHUDO GH &LHQFLD y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La CaFKXHUD SRU HO DSRUWH QDQFLHUR UHFLELGR SDUD construir la misma. 8. Lecturas Recomendadas
*(25*( () '-0 38772&. \ +- *(25GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formulations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pg. *(25*( () '-0 38772&. \ +- *(25*( 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pg. +857$'2 '9 \ 0(5,12 0(  &XOWLYR GH Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. Mxico. 232 pg. PREZ PONCE, J.N. 1998. Propagacin y Mejora *HQpWLFD GH 3ODQWDV SRU %LRWHFQRORJtD ,QVWLWXWR GH %LRORJtD GH 3ODQWDV6DQWD &ODUD &XED  pg. 326326,/29$ - , 7,&+$ 3 .$'/(&(. ' +$,6(/ 6 3/=$.29$  $FFOLPDWL]DWLRQ of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497. 52&$ :0 \ /$ 052*,16.,  VHJXQGD HGLFLyQ  &XOWLYR GH WHMLGRV HQ OD $JULFXOWXUD )XQGDPHQWRV \ DSOLFDFLRQHV &,$7 &DOL &RORPbia, 970 pg. 7255(6 $& /$ &$/'$6 \ -$ %862  Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pg. 7255(6 $& /$ &$/'$6 \ -$ %862  Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pg.

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I - CAPTULO 2 Morfognesis
Silvia Radice 1.- Introduccin La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametas, mientras que por organogQHVLV SXHGHQ REWHQHUVH WDOORV UDtFHV R RUHV Estos rganos son inducidos a partir de una clula o de un grupo de clulas que, segn las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa divisin. Esta totipotencialidad celular fue enunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teoUtD GH TXH WRGDV ODV FpOXODV YHJHWDOHV WLHQHQ la capacidad de regenerar plantas completas. Haberlandt no lleg a demostrar su hiptesis debido a que no pudo lograr la divisin celular. Los medios de cultivo que empleaba no LQFOXtDQ UHJXODGRUHV GHO FUHFLPLHQWR GHELGR D que esos compuestos eran an desconocidos. Los avances en el cultivo de tejidos vegetales IXHURQ PX\ OHQWRV HQ VXV LQLFLRV (Q  :KLte pudo mantener, en forma ilimitada, el creciPLHQWR GH UDtFHV HQ PHGLRV OtTXLGRV D SDUWLU GH iSLFHV GH WRPDWH $O PLVPR WLHPSR VH LGHQWLFy HO iFLGR LQGRO DFpWLFR $,$  TXH SRVLELOLWy HO PDQWHQLPLHQWR LQGHQLGR GH FDOORV GH ]Dnahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se descubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia GH XQD UHJXODFLyQ TXtPLFD HQ OD SDUWH DpUHD \ HQ OD UDt] 7UDEDMRV SRVWHULRUHV HQ FDOORV GH OD misma especie, con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, permitieron GHPRVWUDU TXH OD GLIHUHQFLDFLyQ GH EURWHV UDtces o de ambos, era regulada por el balance de auxinas/citocininas.

 7LSRV GH PRUIRJpQHVLV 'HQLFLRQHV En condiciones de cultivo in vitro, las clulas somticas pueden regenerar embriones (Fig  R EURWHV UDtFHV \R RUHV )LJ  FRPR UHVSXHVWD D XQ GHWHUPLQDGR HVWtPXOR /D UHJHQHracin es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfognesis citadas. De .OHUN \ FRODERUDGRUHV HQ  GHQRPLQDURQ a estas diferentes fases como adquisicin de la competencia; fase de induccin y fase de realizacin. En la primera fase, las clulas no responGHQ DO HVWtPXOR RUJDQRJpQLFR SHUR DGTXLHUHQ esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. En la segunda fase o fase de inGXFFLyQ ODV FpOXODV VRQ UHFHSWLYDV DO HVWtPXOR morfognico y hay una relacin directa con el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar. En la fase de realizacin, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado. $ SDUWLU GH OD VLHPEUD in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos rganos de manera directa, sin la formacin de callo. Si la formacin es GH EURWHV UDtFHV R RUHV VH GHQRPLQD organognesis directa. Si en cambio se induce la formacin de embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa (Figs. 1 y 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares (Figs.  $ \   /D GLIHUHQFLDFLyQ GH yUJDQRV D SDUWLU de callos, denominada morfognesis indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. Morfognesis directa o indirecta fueron trminos propuestos por Hicks en1980. 3.- Histologa de la morfognesis Despus de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado,

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Figura 1: A-F embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriognesis somtica en diferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de %$3 B-D-F, embriognesis somtica obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embriones zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 GH $1$   PJ O-1 GH .LQ FRQ XQD SUHYLD LQGXFFLyQ HQ 06 + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.

D SDUWLU GH XQD FpOXOD HSLGpUPLFD R GHO PHVyOR IROLDU FRPR RFXUUH HQ ODV FRQtIHUDV VH VXFHGHQ XQD VHULH GH GLYLVLRQHV PLWyWLFDV $Vt VH pueden observar, a travs del estudio histolgico, pequeas masas de clulas que contienen citoplasma denso y grandes nucleolos. Este conjunto de clulas, agrupadas a modo de esferas, fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966, y son responsables de la dife-

renciacin de los nuevos rganos. Este tipo de meristema puede iniciarse en forma directa, a partir de clulas diferenciadas pertenecientes a un explante cultivado in vitro, o indirectamente, a partir de una clula o grupo de clulas diferenciadas que promueven la proliferacin celuODU )LJ  $  6X HYROXFLyQ GHWHUPLQDUi HO FUHcimiento de un rgano, por ejemplo una yema adventicia (Fig 4 B).

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Figura 2: A-E Organognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, callo organognico obtenido en Abelia sp $QGUp 5HKGHU FXOWLYDGD HQ 06   PJ O-1 de picloran. B ,QLFLR GH EURWHV HFKDV HQ KRMDV crecidas in vitro de Crimson Gold (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 GH $1$   PJ O-1 de .LQ C, Brotes de Gerbera jamesonii %ROXV REWHQLGRV D SDUWLU GHO FXOWLYR GH FDStWXORV RUDOHV HQ 06  mg l-1 GH ,%$   PJ O-1 GH %$3   PJ O-1 GH *$3. D EURWHV RUHFLGRV in vitro de Abelia sp $QGUp Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 GH %$3 E UDtFHV HFKDV FUHFLGDV GH FDOOR GH Abelia sp $QGUp 5Hhder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las reglillas representan 5 mm

Las clulas embriognicas son similares a las clulas meristemticas debido a que no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo agrandado y pequeos granos de almidn. Estas clulas, que en general se agrupan, pueden variar en tamao y nmero. Dentro de un gru-

po de clulas embriognicas, el desarrollo de las mismas no est sincronizado. Estas clulas son capaces de dividirse o de transformarse en embriones segn las condiciones del medio GH FXOWLYR $TXHOODV FpOXODV TXH QR GHVDUUROODQ proembriones comienzan el proceso de diferenciacin, es decir se vacuolizan, disminuye

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noso, sufre divisiones polarizadas formando un embrin globular. Previo a esta polarizacin se deposita almidn, luego se forma la epidermis \ DGTXLHUH VLPHWUtD ELODWHUDO 6XFHVLYDPHQWH VH observa el crecimiento de uno o ms cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciacin de los pices radicales y de tallo y XQD SURJUHVLYD DFXPXODFLyQ GH DOPLGyQ OtSLGRV \ SURWHtQDV En el caso de un origen multicelular de los embriones somticos pueden observarse diversos patrones. Los embriones somticos se forman a partir de grupos de clulas epidrmicas y subepidrmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comnmente budding o embriognesis adventicia. Estas clulas pequeas tienen una alta relacin ncleo/ citoplasma, citoplasma denso y un nucleolo voluminoso que se tie fuertemente. Se diferencian de las clulas embriognicas por la falta de sustancias de reserva, por su delgada pared celular y su frecuente divisin celular. Estas estructuras se denominan proembriones JOREXODUHV )LJ  $ %  (Q una etapa posterior desarrollan una epidermis, un tejido provascular, acumulan material de reserva y se polarizan. Estas estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en embriones somticos que presentan pices caulinar y radicular. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio segn las condiciones de cultivo. El desarrollo de un embrin somtico de origen unicelular es comparable a la de un embrin cigtico. En dicotiledneas, la etapa globular es seguida por una etapa corazn que Fig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfognicos obtenidos se corresponde con la adquia partir de la siembra in vitro GH GLIHUHQWHV H[SODQWHV /DV OtQHDV FRQtinuas expresan organognesis o embriognesis directa mientras que VLFLyQ GH OD VLPHWUtD ELODWHUDO ODV OtQHDV TXHEUDGDV LQGLFDQ TXH OD PRUIRJpQHVLV VH REWLHQH SRU YtD desarrollo de la epidermis, el volumen de ncleo y nucleolo y desaparecen los grnulos de almidn. Las experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan slo cuando se PRGLFDQ ODV FRQGLFLRQHV GH FXOWLYR (Q JHQHral, cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o se elimina la auxina. Las clulas embriognicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que estas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos condiciones ontognicas diferentes, es decir que el origen de los embriones sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una clula, la PLVPD VH DtVOD GH ODV GHPiV SRU XQD LPSRUWDQWH PRGLFDFLyQ HQ VX SDUHG FHOXODU HQ SDUWLFXODU SRU OD JHOLFDFLyQ GH OD ODPLQLOOD PHGLD (VWD clula, rodeada por un polisacrido mucilagiindirecta.

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Figura 4: A-E Cortes histolgicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A PHULVWHPRLGHV HFKDV observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 GH $,$   PJ O-1 GH %$3  [ B, yemas DGYHQWLFLDV HFKDV HQ iSLFHV GH Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 GH ,%$   mg l-1 GH %$3   PJ O-1 GH *$3 4 x. C JUXSR GH FpOXODV HPEULRJpQLFDV HFKDV HQ Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn. 20 x. D, embriones somticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E, embriognesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x.

de los estratos procambiales y de manera sucesiva el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde, durante la etapa cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazn llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin del pice de

OD UDt] \ DO SURFDPELXP HQ UHVSXHVWD D OD HORQgacin axial del embrin somtico debido al transporte de auxinas (Fig 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que ORV FLJyWLFRV FRPR DVt WDPELpQ OD SURGXFFLyQ de sustancias de reserva.

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Sin el seguimiento histolgico detallado, la formacin del embrin somtico slo puede ser FRQUPDGD SRU OD JHUPLQDFLyQ )LJ  )  6LQ embargo, debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Comparados con los embriones cigticos de la misma especie, los embriones somticos frecuentemente desarrollan de manera anormal R VRQ LQPDGXURV /D DQRPDOtD PiV IUHFXHQWHmente encontrada es la formacin doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarizacin del transporte de auxinas. Tambin se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidn y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estn desarrollados o que la embriognesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). La falta del meristema apical o una escasa deposicin de sustancias lipoproteicas en los embriones somticos de algunas especies no GHEH VHU WRPDGD FRPR XQD DQRUPDOtD (VWR SXHGH VHU XQ VtQWRPD GH LQPDGXUH] GHELGR a la rpida formacin de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduracin de las estructuras formadas permitir incrementar el porcentaje de embriones somticos capaces de germinar. 4.- Factores que afectan los procesos morfognicos Los cuatro principales factores que condicionan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos in vitro son: 4.1.- el genotipo 4.2.- las FRQGLFLRQHV TXtPLFDV seleccionadas para realizar el cultivo. 4.3.- las FRQGLFLRQHV ItVLFDV seleccionadas para realizar el cultivo. 4.4.- el explante. 4.1.- El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos, desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro a la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rga-

nos. Por esta causa, no es posible generalizar PHWRGRORJtDV R SURWRFRORV GH WUDEDMR GHELGR D TXH ORV PHGLRV GH FXOWLYR DVt FRPR ODV FRQGLciones de cultivo seleccionados, deben ser esSHFtFRV SDUD FDGD VLWXDFLyQ HQ SDUWLFXODU 8Q ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp and Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtencin de embriones somticos a partir de embriones cigticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar "Pinot Noir".  9DULRV VRQ ORV FRPSXHVWRV TXtPLFRV TXH LQX\HQ HQ ORV SDWURQHV PRUIRJpQLFRV in vitro dentro de los cuales podemos considerar: 4.2.1.- la composicin salina del medio de cultivo. La composicin salina ms empleada para inducir la formacin de callo, la organognesis GLUHFWD R LQGLUHFWD HQ OD PD\RUtD GH ODV HVSHcies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseadas para inducir determinados patrones morfognicos. Existe adems una estrecha relacin entre la composicin hormonal del explante y la concentracin de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo. 4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfognesis an cuando la concentracin salina no sea la adecuada. En condiciones ptimas de cultivo SXHGHQ DXPHQWDU VLJQLFDWLYDPHQWH OD GLIHrenciacin de rganos. Para la induccin de embriones somticos en muchas especies vegetales es necesario el agregado de auxinas, como ocurre en Tilia spp. Sin embargo para otras, como es el caso del crotn (Codiaeum variegatum  HV VXFLHQWH FRQ HO DJUHJDGR GH thidiazurn. El genotipo y el tipo y concentracin de reguladores del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados. 4.2.3.- antibiticos. En procesos de transformacin con Agrobacterium tumefaciens es muy comn el agregado de antibiticos del tipo cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminacin de la bacteria. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se encontr que 250 mg L1 de cefotaxime DXPHQWDQ VLJQLFDWLYDPHQWH OD UHJHQHUDFLyQ de brotes mientras que 500 mg L1 de carbenicilina promueven la formacin de callo y la

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kanamicina inhibe los procesos morfognicos. 4.2.4.- carbn activado. En general se usa para adsorber compuestos txicos de la micro atmsfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo pero (. 3HWWHUVVRQ \ VX HTXLSR GH FRODERUDGRUHV GH OD 6ZHGLVK 8QLYHUVLW\ RI $JULFXOWXUH GHPRVWUDURQ que puede promover la embriognesis somtica debido a la incorporacin de ciertos compuestos al medio de cultivo por difusin. 4.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. 3XHGH HPSOHDUVH FRPR VHPLVyOLGR R OtTXLGR (O DJHQWH JHOLFDQWH PiV XWLOL]DGR HQ HO FXOWLYR in vitro HV HO DJDU H[WUDtGR GH GLYHUVDV DOJDV PDrinas. Las diferentes calidades existentes en el PHUFDGR PRGLFDQ OD H[SUHVLyQ PRUIRJpQLFD debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis (en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de $,$   PJ/ GH %$3 FX\D UHVSXHVWD PRUIRJpQLca vari segn el tipo de agar utilizado. Cuando HO JHOLFDQWH HPSOHDGR IXH &KXEXWDJDU GH SURduccin nacional, se observ una gran diferenciacin de yemas adventicias, mientras que con HO DJUHJDGR GH DJDU 6,*0$ R slo se indujo la proliferacin de callo. (Q FDVR GH VHOHFFLRQDU PHGLRV GH FXOWLYR OtTXLGRV OD UHVSXHVWD PRUIRJpQLFD REVHUYDGD YDUtD GH PDQHUD FRQVLGHUDEOH (O FXOWLYR OtTXLGR HV LPprescindible cuando se busca promover la morfognesis indirecta a travs de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos HQ PHGLR OtTXLGR FRQ DJLWDFLyQ SDUD SHUPLWLU TXH las clulas se disgreguen y puedan diferenciar UDtFHV EURWHV R HPEULRQHV VRPiWLFRV HQ IRUPD aislada. /D HOHFFLyQ GH XQ PHGLR GH FXOWLYR OtTXLGR R slido depende, adems, de la especie con la que se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se KD REVHUYDGR TXH HO HPSOHR GH PHGLR OtTXLGR promueve una mayor diferenciacin de protoFRUPRV UHVSHFWR GHO PLVPR JHOLFDGR $ VX YH] este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos, mientras que en medio de cultivo geOLFDGR VH REVHUYy TXH ORV SURWRFRUPRV WLHQGHQ a formar tallos. 4.2.6.- atmsfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfognicos y esta con-

dicionada por el tipo y tamao del envase selecFLRQDGR SDUD HO FXOWLYR DVt FRPR WDPELpQ SRU HO sistema de cobertura del mismo. Las tapas usadas en cultivo in vitro YDUtDQ GHVGH HO WDSyQ GH DOJRGyQ SDSHO GH DOXPLQLR SHOtFXOD GH UHVLQLWH WUDQVSDUHQWH R WDSDV UtJLGDV GH SROLSURSLOHQR (O intercambio gaseoso es diferente para cada tipo de tapa, en consecuencia la atmsfera interna tambin sufrir variaciones. En condiciones in vivo la atmsfera contiene 78 GH QLWUyJHQR  GH R[tJHQR \  GH dixido de carbono. En cultivos in vitro se han registrado adems, etileno y otros compuestos hidrocarbonados. (O QLYHO GH R[tJHQR GLVSRQLEOH SDUD HO H[SODQWH condiciona el crecimiento y los procesos morfognicos. En general se necesita una buena aireacin para obtener cualquier tipo de proceso morfognico. En alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriognicas cuando la solucin se VDWXUD FRQ  GH R[tJHQR 3RU HO FRQWUDULR XQD WHQVLyQ GH R[tJHQR GHO  HVWLPXOD OD SURGXFcin de plantas a partir de anteras de tabaco. La concentracin de dixido de carbono (CO2) en la atmsfera gaseosa in vitro YDUtD VHJ~Q OD UHVpiracin y la actividad fotosinttica de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa mientras que en condiciones de luz, disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables, entre 0,5 % y 8,5 %, segn el tipo de sello o tapa empleados. Concentraciones superiores al 1 %, que son generalmente txicas en condiciones in vivo, probablemente no fueron limitantes para la actividad fotosinttica. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Su acumulacin tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de clulas, callos y anteras, La cantidad de etileno producida in vitro YDUtD FRQ OD HVSHFLH HO WLSR GH explante, la concentracin de citocininas en el medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con la luz. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a travs de la esterilizacin del material de diseccin realizada con el material embebido HQ DOFRKRO \ DPHDGR FRQ PHFKHUR %XQVHQ (Q muchos casos el etileno acta como promotor de la morfognesis pero luego es inhibitorio del crecimiento de los rganos diferenciados

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 (QWUH ODV FRQGLFLRQHV ItVLFDV SRGHPRV PHQcionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz. 4.3.1.- La temperatura de incubacin de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en condiciones naturales las plantas exSHULPHQWDQ GLIHUHQFLDV WpUPLFDV GXUDQWH HO GtD \ la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta obtenida. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas se observ que la regeQHUDFLyQ PD\RU GH EURWHV VH SURGXFtD D  & mientras que por encima de los 30 C, prcticamente no se observ diferenciacin. 4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros ItVLFRV D WHQHU HQ FXHQWD /D +5 GHSHQGHUi GHO sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un intercambio gaseoso la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso de la HR puede promover una prdida veloz de agua del medio de cultivo variando la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Debergh, comunicacin personal). 4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad \ SHUtRGR GH VXPLQLVWUR /D UHVSXHVWD PRUIRJpnica de un explante puede variar segn si se le proporciona luz o no. Para estimular la formacin GH FDOOR HV FRP~Q TXH VH SUHHUD OD RVFXULGDG El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos. 4.4.- Tal como ya se seal anteriormente, los proceso morfognicos dependen del genotipo, pero a esto debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, ODV FRQGLFLRQHV ItVLFDV \ VLROyJLFDV HQ ODV TXH sta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarn a su vez la respuesta morfognica en condiciones in vitro. Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfognica observada en hojas de Camellia japonica

cultivadas en un mismo medio de cultivo, segn la porcin de la lmina utilizada (Pedroso y Pais, 1993). Estos investigadores cultivaron estas hojas in vitro durante seis semanas previa inmersin GHO H[SODQWH HQ XQD VROXFLyQ GH ,%$  PJ O1) durante 20 minutos (Fig 5).

Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestas morfognicas obtenidas despus de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. segn la porcin de la lmina. 1, callo organognico. 2 embriognesis somtica directa. 3, regeneraFLyQ GLUHFWD GH UDtFHV  FDOOR RUJDQRJpQLFR

Lecturas recomendadas
%XGGHQGRUI-RRVWHQ -0& DQG :ROWHULQJ (- 1994. Components of the gaseous environment DQG WKHLU HIIHFWV RQ SODQW JURZWK DQG GHYHORSPHQW LQ YLWUR 3ODQW *URZWK 5HJXODWLRQ   'H .OHUN *- $UQKROGW6FKPLWW % /LHEHUHL 5 DQG 1HXPDQQ .+  5HJHQHUDWLRQ RI URRWV shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66. George E. 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). Gran Bretaa. 1361pp. Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23. :LOOLDPV (* DQG 0DKHVZDUDQ *  6RPDWLF HPEU\RJHQLF IDFWRUV LQXHQFLQJ FRRUGLQDWHG EHKDYLRU RI FHOOV DV DQ HPEU\RJHQLF JURXS $QQ Bot. 57: 443-597.

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I - CAPTULO 3 La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas vegetales


Guillermo Seijo; Graciela I. Lavia; *HUPiQ 5REOHGR $YHOLDQR )HUQiQGH] 9LYLDQD * 6ROtV 1HIID 1 Introduccin La comprensin de la organizacin de los genomas lograda a travs del anlisis citogentico ha tenido un gran impacto en la evaluaFLyQ \ XWLOL]DFLyQ GH OD ELRGLYHUVLGDG DVt FRPR HQ HO PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR \ OD LQJHQLHUtD JHntica, en particular, desde el desarrollo de las tcnicas de citogentica molecular. El empleo VRQGDV GH $'1 \ GH DQWLFXHUSRV FRQMXJDGRV FRQ XRURFURPRV HQ XQ Q~PHUR FUHFLHQWH GH especies vegetales ha permitido, entre otros loJURV OD ORFDOL]DFLyQ GH VHFXHQFLDV HVSHFtFDV OD LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV SDUWLFXODUHV HO estudio del origen y la estructura de los genoPDV GH KtEULGRV \ SROLSORLGHV OD FRPSDUDFLyQ de regiones genmicas homlogas, el estudio del comportamiento cromosmico y el anlisis de la expresin gnica. Por ello, las tcnicas de hibridacin in situ (ISH) e inmunocitogentica constituyen actualmente herramientas indispensables para la comprensin de la organizacin y la expresin del genoma de las plantas. (Q HVWH FDStWXOR VH GHVFULEHQ HQ SULPHUD instancia, algunos de los criterios empleados tradicionalmente para la caracterizacin carioWtSLFD \ SRVWHULRUPHQWH VH SUHVHQWDQ ORV SULQcipios y las aplicaciones de diferentes tcnicas de hibridacin in situ de cidos nucleicos y de LQPXQRGHWHFFLyQ GH PRGLFDFLRQHV HSLJHQpWLcas de nucletidos e histonas. 2 Citogentica clsica La caracterizacin cromosmica de especies o variedades de plantas se inicia con la descripcin del cariotipo a travs del anlisis del nmero, el tamao y la forma de los cromosomas que presentan (complemento cro-

mosmico). Esta caracterizacin se realiza en metafase mittica debido a que, en esta fase, los cromosomas han alcanzado su mxiPR JUDGR GH FRQGHQVDFLyQ \ VXV OtPLWHV HVWiQ SHUIHFWDPHQWH GHQLGRV 3DUD HVWH DQiOLVLV JHneralmente se emplean tejidos meristemticos porque presentan un alto ndice mittico (i.e. la razn entre el nmero de clulas en divisin y el nmero total de clulas observadas). Los rganos (pices radicales o caulinares, vulos, etc.) son pre-tratados con diversas sustancias que inhiben la formacin del huso mittico (colFKLFLQD KLGUR[LTXLQROHtQD SDFORVRO HWF D los efectos de acumular metafases, dispersar los cromosomas en el citoplasma y producir una mayor condensacin de los mismos. Los PDWHULDOHV VH MDQ \ OXHJR VH WLxHQ FRQ FRORUDQWHV QXFOHDUHV IXFVLQD EiVLFD RUFHtQD FDUPtQ JLHPVD HWF  )LQDOPHQWH VH FRQIHFFLRnan los preparados por macerado y aplastado (squash) del material sobre un portaobjetos. Con estos mtodos de tincin, los cromosomas metafsicos observados con un microscopio ptico aparecen uniformemente teidos, excepto en el centrmero (constriccin primaria) y en algunas constricciones menores (secundarias). Mediante la observacin microscpica se determina el nmero cromosmico somtico (2n) y, a travs del anlisis de microfotograItDV R GLEXMRV GH PHWDIDVHV FRQ FURPRVRPDV ELHQ GHQLGRV \ VHSDUDGRV )LJ $  VH HVWDblecen los cariotipos. Para ello, se analiza la morfologa de los cromosomas determinando la posicin del centrmero y la longitud de los brazos corto (bc) y largo (bl  DVt FRPR la longitud total (lt GH FDGD FURPRVRPD $ partir de estas medidas, se calcula el ndice centromrico [IC = (bc / lt) 100], segn el FXDO ORV FURPRVRPDV VH FODVLFDQ HQ FXDWUR WLpos morfolgicos: metacntricos (m, IC = 50 37,5), submetacntricos (sm, IC = 37,5 - 25), subtelocntricos (st, IC = 25-12,5), acrocntricos (t, IC = 12,5 - 0) y telocntricos (T, IC = 0). Otro aspecto a considerar para caracterizar morfolgicamente a los cromosomas es la presencia y la posicin de las constricciones VHFXQGDULDV DVt FRPR OD SUHVHQFLD \ HO WLSR de satlites. En general, las primeras corresponden a regiones organizadoras de los nu-

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cleolos (NORs) y los ltimos a las porciones cromosmicas distales delimitadas por la constriccin secundaria y el telmero de los brazos que los portan. Los cromosomas que presentan satlites se denominan cromosomas SAT )LJ $ ( \ )  Para la confeccin del cariotipo los cromosomas del complemento se ordenan segn su PRUIRORJtD GH PHWDFpQWULFRV D VXEPHWDFpQWULcos, subtelocntricos, acrocntricos y telocn-

tricos) y, dentro de cada tipo, segn su tamao (de mayor a menor) ubicando los centrmeros alineados a una misma altura y los brazos cortos hacia arriba. En las plantas diploides (Fig. 1C y E) y alopoliploides, el cariotipo se compone de pares de cromosomas homlogos; mientras que en las autopoliploides (Fig. 1D y F) se compone de grupos de tres o ms croPRVRPDV GH DFXHUGR FRQ HO QLYHO GH SORLGtD El orden que ocupa en el cariotipo cada par o

FIGURA 1. A-D: Metafases mitticas teidas con coloracin de Feulgen. A: Lathyrus macropus, 2n = 2x =  ODV HFKDV VHxDODQ ORV VDWpOLWHV GH ORV FURPRVRPDV 6$7 B: Oziroe argentinensis [citada en Fernndez y Davia (1991) como )RUWXQDWLD ELRUD], 2n = 2x = 30, con un cariotipo asimtrico. C y D: Turnera sidoides subsp. SLQQDWLGD, C: citotipo diploide, 2n = 2x = 14 y D: citotipo tetraploide, 2n = 4x = 28. E-F: Idiogramas de los citotipos diploide y tetraploide de Turnera sidoides subsp. SLQQDWLD ilustrados en C y D, respectivaPHQWH (Q JULV VH UHSUHVHQWDQ ORV VDWpOLWHV GH ORV FURPRVRPDV 6$7 /D EDUUD UHSUHVHQWD  PLFUDV HQ $ \ B, 5 micras en C y D y 2,5 micras en E y F.

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grupo de cromosomas se indica mediante un nmero y, mediante una letra, el tipo cromosmico al que pertenece de acuerdo a su morfoORJtD /D UHSUHVHQWDFLyQ JUiFD GHO FDULRWLSR VH denomina idiograma (Fig. 1E y F). La composicin de un complemento cromosmico tambin se puede expresar mediante una frmula cariotpica, en la que se indica el nmero de cada tipo morfolgico de cromosomas que presenta el material analizado (ej. 16 m + 10 sm + 2 st + 2 t). Entre los parmetros cuantitativos ms utilizados para caracterizar los cariotipos se encuentra el grado de asimetra que presentan los mismos. Para ello, se emplean categoras o ndices de asimetra cromosmica que consideran las diferencias de tamao entre los cromosomas del cariotipo (asimetra intercromosmica), y las diferencias morfolgicas de los cromosomas derivadas de la proporcin entre sus brazos (asimetra intracromosmica). Un cariotipo simtrico es aquel cuyos cromosomas son aproximadamente del PLVPR WDPDxR \ HQ VX PD\RUtD PHWDFpQWULFRV mientras que uno asimtrico es aquel que presenta cromosomas de diferentes tamaos y predominantemente submetacntricos, acrocntricos o telocntricos (Fig. 1B). La informacin obtenida a partir del anlisis de los carioWLSRV SHUPLWH LGHQWLFDU FURPRVRPDV FODVLFDU los cariotipos, realizar anlisis comparativos entre grupos de especies ms o menos relacionadas e inferir sus tendencias evolutivas. $VLPLVPR SHUPLWH GHWHFWDU ODV DQRPDOtDV QXmricas y estructurales en los complementos cromosmicos de clulas o individuos. En numerosos grupos de plantas, la identiFDFLyQ GH ORV GLIHUHQWHV SDUHV GH KRPyORJRV del cariotipo puede resultar engorrosa debido D TXH SUHVHQWDQ FURPRVRPDV FRQ PRUIRORJtD muy similar. En estos casos, la aplicacin de determinados tratamientos en combinacin con diferentes tipos de tincin, puede revelar regiones cromosmicas con condensacin o FRPSRVLFLyQ FURPDWtQLFD GLIHUHQFLDO bandas), generando marcadores cromosmicos adicioQDOHV $Vt HO WUDWDPLHQWR GH ORV FURPRVRPDV con un lcali y la posterior tincin con Giemsa revela regiones de heterocromatina constitutiva, mientras que la impregnacin argntiFD EDQGHR $J125 UHYHOD ODV NORs activas

)LJ $  $GHPiV SXHGHQ XWLOL]DUVH GLYHUVRV XRURFURPRV TXH WLHQHQ OD FDSDFLGDG GH LQWHUFDODUVH SUHIHUHQWHPHQWH HQ UHJLRQHV GHO $'1 con una composicin de bases particular. Por ejemplo, las regiones ricas en adenina y timina VRQ UHYHODGDV FRQ '$3, (4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato) o quinacrina, mientras que ODV ULFDV HQ JXDQLQD \ FLWRVLQD OR VRQ FRQ &0$3 FURPRPLFLQD $3). Las bandas pueden ser de tamao e intensidad diferentes y presentar una distribucin particular sobre los cromosomas de un complemento generando un patrn de bandeo FDUDFWHUtVWLFR )LJ %  (VWDV WpFQLFDV de bandeo cromosmico han permitido, en PXFKRV FDVRV OD LGHQWLFDFLyQ LQHTXtYRFD GH cromosomas homlogos, la caracterizacin de JHQRPDV DVt FRPR HO VHJXLPLHQWR GH FURPRVRPDV R EORTXHV FURPRVyPLFRV HQ KtEULGRV \ OtQHDV GH LQWURJUHVLyQ La diferenciacin lineal de los cromosomas por tcnicas de bandeo no siempre es evidente en todos los grupos de plantas y, an en aquellas especies que presentan buenos patrones de bandas, a menudo no se cuenta con XQ Q~PHUR VLJQLFDWLYR GH PDUFDGRUHV FRPR para integrar los mapas de ligamiento con los PDSDV ItVLFRV /D SRVLELOLGDG GH SRVLFLRQDU VHcuencias particulares sobre los cromosomas y, de esta forma, generar un gran nmero de marcadores cromosmicos ha sido posible gracias al desarrollo de las tcnicas de hibridacin in situ, cuyo uso se ha generalizado a partir del desarrollo de sistemas de marcado y de deteccin de sondas no radiactivas.  +LEULGDFLyQ LQ VLWX XRUHVFHQWH ),6+ Esta tcnica se basa en reacciones de reconocimiento y asociacin de bases entre un VHJPHQWR GHO $'1 FURPRVyPLFR secuencia blanco) y una secuencia complementaria marcada (sonda). La misma se aplica a preparaciones de clulas somticas o germinales, previamente incubadas con enzimas (celulasa, pectinasa y citohelicasa) que remueven las paredes celulares. Las preparaciones son traWDGDV FRQ $51DVD $ SDUD HYLWDU KLEULGDFLRQHV LQHVSHFtFDV GH OD VRQGD FRQ $51V \ SRVWHriormente, son permeabilizadas mediante la incubacin con proteasas. Las sondas pueden

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ser marcadas con nucletidos unidos a hapteQRV GLJR[LJHQLQD ELRWLQD HWF R D XRURFURmos (Cy3, Cy5, etc.) por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), por una transferasa terminal o por medio de la actividad exonuFOHRWtGLFD \ GH OD VXEVLJXLHQWH SROLPHUL]DFLyQ UHDOL]DGDV SRU OD $'1 SRO , D SDUWLU GH HVFLVLRQHV VLPSOHV FDXVDGDV SRU XQD $'1DVD nick translation). La sonda marcada, componiendo una mezcla de hibridacin que contiene formaPLGD \ $'1 EORTXHDQWH HQWUH RWURV FRPSRnentes) es colocada sobre las preparaciones cromosmicas, para luego realizar una desnaturalizacin FRQMXQWD GHO $'1 GH ORV FURPRVRPDV \ GH OD VRQGD D WHPSHUDWXUDV TXH YDUtDQ entre 70 C y 90 C durante unos 10 minutos. Posteriormente, los preparados son incubados a 37 C durante al menos 1 hora (normalmente WRGD OD QRFKH D Q GH LQGXFLU OD hibridacin. En este paso, la sonda y la secuencia cromosmica complementaria al blanco compiten enWUH Vt SHUR GHELGR D OD DOWD FRQFHQWUDFLyQ GH la primera y a su menor tamao, bajo condiciones ptimas, la sonda hibrida en todos los sitios complementarios a lo largo de los cromosomas. En el caso de las sondas marcadas con haptenos, la deteccin de los sitios de hibridacin se realiza mediante una o dos rondas GH DQWLFXHUSRV FRQMXJDGRV FRQ XRURFURPRV Los preparados se analizan con microscopios GH HSLXRUHFHQFLD XWLOL]DQGR OWURV HVSHFtFRV SDUD FDGD XRURFURPR UHJLVWUDQGR OD presencia, el tamao y el Q~PHUR GH VHxDOHV XRrescentes por complemento. Normalmente, VH REWLHQH XQD PLFURIRWRJUDItD PRQRFURPiWLFD por cada sonda utilizada y una del complemenWR FURPRVyPLFR WHxLGR FRQ '$3, R LRGXUR GH SURSLGLR (VWDV PLFURIRWRJUDItDV VRQ VXSHUpuestas e integradas en una sola imagen. El posicionamiento relativo de las seales con respecto al centrmero, los telmeros u otros marcadores cromosmicos permite mapear con precisin cada sonda sobre el complemento cromosmico y representarlas en un idiograPD $ GLIHUHQFLD GH OD FLWRJHQpWLFD FOiVLFD OD LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV R GH VHJPHQWRV cromosmicos particulares usando sondas de ),6+ HV LQGHSHQGLHQWH GH OD PRUIRORJtD FURPRsmica y, por lo tanto, es posible reconocerlos en diferentes estados del ciclo celular.

Desde el desarrollo inicial de la tcnica de FISH, se han mejorado sustancialmente tanto la sensibilidad LH HO WDPDxR PtQLPR GH XQD secuencia que puede ser detectada bajo el microscopio) como el poder de resolucin espacial LH OD GLVWDQFLD ItVLFD PtQLPD D OD TXH GRV VHFXHQFLDV SXHGHQ VHU LGHQWLFDGDV FRPR independientes). Bajo condiciones ptimas de hibridacin y de deteccin, la sensibilidad de esta tcnica depende de la accesibilidad de la sonda a la regin complementaria sobre el $'1 /D PLVPD D VX YH] HVWi GHWHUPLQDGD por el grado de condensacin de la cromatina. El xito de FISH se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a las tcnicas clsiFDV SDUD LGHQWLFDU KRPRORJtDV \ VREUH WRGR D OD SRVLELOLGDG GH FRQWDU FRQ XQD DPSOLD EDWHUtD de sondas disponibles de acuerdo con la naturaleza de la secuencia blanco que se quiera detectar. En general, se pueden utilizar sondas de $'1 GH copia nica, moderadamente repetitivo o altamente repetitivo. Las secuencias repetitivas pueden ser conservadas o variables y estar dispuestas en tndem (i.e. una copia est seguida de otra en arreglos de decenas D PLOHV GH FRSLDV IRUPDQGR XQ ORFXV GHQLGR o dispersas (i.e. las repeticiones pueden estar dispuestas a lo largo de una regin cromosmica, de algunos cromosomas o de todo el complemento). Entre las secuencias repetitivas, las sondas de los genes ribosomales $'1U 45S y 5S son las empleadas con mayor frecuencia para la generacin de marcadores cromosmicos por FISH. Esto es debido a que son secuencias altamente conservadas y a que presentan una disposicin en tndem que facilita la deteccin de los loci. Los mismos pueden estar presentes en ms de un sitio por complemento cromosmico, proporcionando marcadores ~WLOHV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV \ SDUD UHDOL]DU FRPSDUDFLRQHV FDULRWtSLFDV )LJ 2C). Otra de las sondas de secuencias conservadas y repetidas en tndem que se emplean habitualmente en experimentos de FISH son las telomricas (Fig. 2D). Las mismas son utilizadas tanto para establecer con precisin ORV OtPLWHV FURPRVyPLFRV FRPR SDUD UHYHODU LQversiones que comprenden los segmentos cromosmicos distales y la ocurrencia de fusiones

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cromosmicas. Las sondas de secuencias no conservadas repetidas en tndem son muy ~WLOHV SDUD HO GHVDUUROOR GH PDUFDGRUHV HVSHFtFRV GH FURPRVRPDV \ GH FRPSOHPHQWRV FUR-

mosmicos; mientras que las de secuencias repetidas dispersas OR VRQ SDUD GHQLU UHJLRnes cromosmicas o genomios, en particular, SDUD LGHQWLFDU ORV JHQRPDV SDUHQWDOHV HQ ORV

FIGURA 2. A %DQGHR $J125 HQ XQD PHWDIDVH GH Arachis hypogaea GRQGH VH LGHQWLFDQ ODV UHJLRQHV RUJDQL]DGRUDV GHO QXFOHROR HQ PDUUyQ RVFXUR HFKDV  B: bandeo con quinacrina que distingue las regioQHV KHWHURFURPiWLFDV ULFDV HQ $7 HQ DPDULOOR LQWHQVR GH ODV UHJLRQHV HXFURPDWLFDV DPDULOOR SiOLGR HQ los cromosomas prometafsicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoi en donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratincin realizada con '$3, GLIHUHQFLD EDQGDV KHWHURFURPiWLFDV FHQWURPpULFDV ULFDV HQ $7 HQ EODQFR GH ODV SRUFLRQHV FURPRsmicas eucromticas (en azul). D: FISH que revela las regiones telomricas (verde) de A. hypogaea. E: ),6+ TXH UHYHOD OD GLVWULEXFLyQ SUHIHUHQFLDO GH XQ UHWURHOHPHQWR HQ HO JHQRPD $ GH A. hypogaea. F: GISH doble sobre una metafase de A. hypogaea XWLOL]DQGR FRPR VRQGDV $'1 JHQyPLFR GH A. ipaensis (rojo) y de A. duranensis YHUGH TXH GHPXHVWUD OD FRQVWLWXFLyQ DORSROLSORLGH GHO FXOWtJHQR \ ODV HVSHFLHV GLSORLGHV progenitoras ms probables. G y H $51),6+ HQ DQWHUD \ RYDULR GH Paspalum notatum utilizando como VRQGD XQ $51 PDUFDGR GH H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO \ WHMLGRHVSHFtFD HQ SODQWDV DSRPtFWLFDV SHUR QR VH[XDOHV /D LQWHQVLGDG GHO FRORU YLROHWD LQGLFD FDQWLGDGHV UHODWLYDV GHO $51 DQDOL]DGR SUHVHQWH HQ ORV GLIHUHQWHV WHMLGRV GH SODQWDV DSRPtFWLFDV /D EDUUD UHSUHVHQWD  PLFUDV HQ $ &)  PLFUDV HQ %  PLFUDV HQ * y 100 micras en H.

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KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV \ HQ ORV DORSROLSORLGHV )LJ (  $PERV WLSRV GH VHFXHQFLDV UHpetidas pueden mostrar diferencias notorias en ORV PRWLYRV TXH ODV FRPSRQHQ DVt FRPR HQ VX abundancia y distribucin, an entre especies estrechamente emparentadas. El anlisis del conjunto de las secuencias repetitivas constiWX\H XQD KHUUDPLHQWD H[FHOHQWH HQ Vt PLVPD R como complemento de otras tcnicas, para la LGHQWLFDFLyQ GH FURPRVRPDV \ JHQRPLRV HO estudio de la arquitectura nuclear y los anlisis ORJHQpWLFRV 7DPELpQ QRV SHUPLWHQ UHDOL]DU estudios detallados de aberraciones cromosmicas estructurales y numricas, hacer inferencias sobre los mecanismos involucrados en la evolucin cromosmica y realizar el seguimiento de cromosomas o regiones particulares en las sucesivas generaciones de los programas de mejoramiento. Las sondas de secuencias nicas KLEULGDQ FRQ HO $'1 FURPRVyPLFR FRUUHVSRQGLHQWH D XQ ORFXV HVSHFtFR $ GLIHrencia de las secuencias repetidas que pueden ser localizadas fcilmente por FISH, la deteccin de las secuencias nicas es ms laboriosa debido a que, por lo general, las regiones codiFDQWHV GH ORV JHQHV SUHVHQWDQ ORQJLWXGHV PHnores que las detectables por FISH convencional (10 kb). El empleo de grandes bloques de $'1 JHQyPLFR FORQDGR HQ YHFWRUHV FRPR ORV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV BACs), en combinacin con FISH (BAC-FISH), consWLWX\H XQ PpWRGR HIHFWLYR SDUD HO PDSHR ItVLFR GH VHFXHQFLDV ~QLFDV GH $'1 6LQ HPEDUJR HO $'1 UHSHWLWLYR SUHVHQWH HQ ODV UHJLRQHV QR FRGLFDQWHV GH ORV LQVHUWRV PXFKDV YHFHV JHQHUD SDWURQHV GH VHxDOHV GLVSHUVDV R LQHVSHFtFDV EDFNJURXQG  $ SHVDU GH HVWD GLFXOWDG KDVWD HO PRPHQWR %$&),6+ FRQVWLWX\H XQD GH ODV mejores tcnicas para correlacionar los mapas JHQpWLFRV FRQ ORV ItVLFRV \D TXH VH SXHGHQ GHVDUUROODU VRQGDV HVSHFtFDV SDUD FDGD FURPRsoma o locus en particular. 4 Hibridacin in situ genmica (GISH) (VWD WpFQLFD VH XWLOL]D SDUD LGHQWLFDU ORV GLferentes genomios presentes en un organismo KtEULGR R DORSROLSORLGH $XQTXH DSOLFD WRGRV ORV SULQFLSLRV GH ),6+ GLHUH GH pVWD SRUTXH ODV sondas que utiliza estn constituidas por ADN

genmico total \ QR SRU XQ IUDJPHQWR GH $'1 GH VHFXHQFLD FRQRFLGD (O $'1 XWLOL]DGR SDUD FRQVWUXLU HVWDV VRQGDV HV H[WUDtGR PHGLDQWH protocolos estndares y luego es marcado por QLFN WUDQVODWLRQ R SRU DPSOLFDFLRQHV DO D]DU usando cebadores cortos (random priming). El xito de GISH depende del grado de diferenciacin que presenten los genomios que se pretende analizar. Por lo general, las secuenFLDV FRGLFDQWHV GH ORV JHQRPDV GH GRV HVSHFLHV PiV R PHQRV UHODFLRQDGDV QR YDUtDQ VXEVWDQFLDOPHQWH HQWUH Vt SRU OR WDQWR OD KLbridacin diferencial de las sondas en GISH est determinada principalmente por el grado de divergencia del componente repetitivo de los genomas en cuestin. En la medida en que los dos genomas presenten ms secuencias HQ FRP~Q PD\RU VHUi OD GLFXOWDG SDUD GLVWLQguirlos. Una estrategia para mejorar la capacidad discriminante de esta tcnica consiste en realizar un GISH simple XWLOL]DQGR $'1 GH XQ genoma marcado (sonda) junto con una deterPLQDGD SURSRUFLyQ GH $'1 VLQ PDUFDU GHO JHnoma que no se va a detectar (sonda fra). En cambio, cuando la diferencia entre las secuencias de los genomas considerados es alta se puede utilizar GISH doble o triple, colocando sobre el preparado mezclas equimolares de las sondas marcadas diferencialmente para cada uno de los genomas que se quiere distinguir en una metafase. Las regiones cromosmicas que hibridan con una sola sonda se visualizan con HO FRORU RULJLQDO GHO XRURFURPR PLHQWUDV TXH las que presentan complementariedad con dos o ms sondas presentan colores intermedios. Entre las diferentes aplicaciones de GISH, se destaca el estudio de la composicin genmica de los alopoliploides y de los hbriGRV QDWXUDOHV R DUWLFLDOHV En estos casos, la tcnica VH EDVD HQ OD KLEULGDFLyQ GHO $'1 genmico marcado de los probables ancestros o progenitores sobre las preparaciones cromosmicas del material en estudio. La hibridacin diferencial de las sondas con slo un subgrupo de cromosomas en una metafase constituye una clara evidencia de que el material estudiado est compuesto por diferentes genomios. Mediante el empleo de GISH se han determinado los progenitores probables de algunas especies alopoliploides cultivadas como el ta-

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EDFR OD DYHQD HO WULJR \ HO PDQt )LJ )  2WUD GH ODV YHQWDMDV GH DQDOL]DU ORV KtEULGRV \ ORV alopoliploides con GISH doble o mltiple, consiste en la capacidad que ofrece esta tcnica para detectar translocaciones intergenmicas, las que pueden pasar inadvertidas con los mtodos convencionales de anlisis genmico. Aplicado a clulas meiticas, GISH proporciona un mtodo preciso para el anlisis de los apareamientos cromosmicos que ocurren en los genomas hbridos. El estudio de la capacidad de los cromosomas de aparearse en meiosis es el procedimiento utilizado tradicionalmente para establecer las relaciones genmicas entre diferentes especies. Sin embargo, HQ PXFKDV FRQJXUDFLRQHV PHWDIiVLFDV resulta difcil distinguir los apareamientos ocurridos entre cromosomas homlogos de aquellos ocurridos entre cromosomas homelogos (i.e. parcialmente homlogos). Mediante GISH es posible pintar los cromosomas y, de este modo, determinar el origen genmico de los cromosomas apareados y no apareados, tanto en profase como en metafase de la meiosis I. La tcnica de GISH tambin constituye una herramienta irreemplazable para el desarrollo de programas de mejoramiento vegetal que involucran KLEULGDFLRQHV LQWHUHVSHFtFDV R LQWHUJHQpULFDV \D TXH SHUPLWH  FRQUPDU HO RULJHQ KtEULGR de la progenie, 2) determinar el origen de los cromosomas en las distintas generaciones, HQ SDUWLFXODU FXDQGR ORV KtEULGRV )1 muestran inestabilidad cromosmica tal como la elimiQDFLyQ FURPRVyPLFD XQLSDUHQWDO  LGHQWLFDU bivalentes interparentales en la meiosis de los KtEULGRV )1 sexuales y 4) comprobar si los cromosomas recombinantes son transmitidos a las siguientes generaciones. Esta tcnica tambin ha sido utilizada para detectar regiones cromaWtQLFDV LQWURJUHVDQWHV HVSHFLDOPHQWH DTXHOODV que portan caracteres agronmicos de inters. 8Q HMHPSOR GH HOOR HV HO DQiOLVLV GH XQD OtQHD lite de cebada introgresada con Hordeum bulbosum resistente a roya. Mediante una combinacin de GISH y FISH se pudo determinar la localizacin de los fragmentos cromosmicos de H. bulbosum introgresados en el complemento cromosmico de cebada que le confeUtDQ GLFKD UHVLVWHQFLD

 0DSHR SRU DPSOLFDFLyQ GLUHFWD GH VHcuencias de inters por PCR in situ (PRINS) La tcnica de PRINS (primed in situ) es considerada como una alternativa a ISH para la deteccin de ciertos tipos de secuencias de cidos nucleicos. Esta tcnica involucra la extensin de cebadores diseados para las secuencias blanco por medio de la Taq polimerasa. Durante la extensin, se incorporan QXFOHyWLGRV PDUFDGRV FRQ XRURFURPRV R KDSWHQRV D Q GH SHUPLWLU OD ORFDOL]DFLyQ ItVLFD de las secuencias en forma directa o indirecta mediante protocolos adicionales de deteccin. Comparada con FISH convencional, PRINS ofrece algunas ventajas tales como: 1) el emSOHR GH FHEDGRUHV GLVHxDGRV D SDUWLU GH XQ Ptnimo de informacin de la secuencia blanco, 2) dichos cebadores pueden hibridar con secuenFLDV GH $'1 PiV IiFLO \ UiSLGDPHQWH TXH ODV sondas (de mayor tamao) usadas en FISH, an en cromatina compacta, 3) no requiere el marcado de sondas y 4) los cebadores pueden ser extendidos an dentro de las secuencias adyacentes (a diferencia de FISH que depende GH XQD VHFXHQFLD HVSHFtFD  UHIRU]DQGR OD LQtensidad de la seal para una secuencia corta. Mediante PRINS se han localizado secuencias repetitivas en tndem (secuencias telomricas, elementos mviles \ $'1U HQ FURPRVRPDV GH leguminosas (Vicia faba y Pisum sativum) y de JUDPtQHDV Hordeum vulgare, Avena sativa y /ROLXP PXOWLRUXP). Todos los loci encontrados fueron coincidentes con los hallados por FISH. Los resultados demuestran que la tcnica de PRINS es apropiada para la localizacin rpida de repeticiones en tndem sobre cromosomas vegetales cuando la distancia entre los cebadores es pequea (1 kb) y los blancos son largos (100 500 kb). Sin embargo, no se obtienen buenas seales cuando las secuencias UHSHWLGDV HVWiQ PX\ VHSDUDGDV HQWUH Vt FRPR ocurre con el gen de la vicilina. Este gen est repetido muchas veces en el genoma de Vicia faba, pero cada copia est separada por una distancia mayor de 12 kb. En estos casos, el empleo de FISH resulta ms adecuado dado que se obtienen mejores seales. Por otra parte, PRINS no ha presentado ventajas con respecto a FISH convencional para la deteccin

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GH VHFXHQFLDV VLPSOHV HQ OD PD\RUtD GH ORV FDVRV D~Q XWLOL]DQGR 35,16 FtFOLFR TXH LQYROXFUD GH  D  FLFORV GH DPSOLFDFLyQ 8QD GH las mayores desventajas de PRINS es el alto JUDGR GH DSDULFLyQ GH VHxDOHV LQHVSHFtFDV probablemente debido a la incorporacin de nucletidos marcados en los extremos 3OH libres que resultan de roturas espontneas de los cromosomas durante el procesamiento del material. Estas incorporaciones indeseables pueden disminuirse mediante el tratamiento con ligasa o incorporando 2, 3 - didesoxinucletidos (ddNTP) antes de PRINS. (Q VtQWHVLV HVWD WpFQLFD HV ~WLO SDUD OD GHteccin rpida de repeticiones en tndem grandes, pero no constituye una alternativa a FISH para la deteccin de genes de copia simple o para el pintado de los cromosomas en plantas mediante el uso de un cctel de cebadores FURPRVRPDHVSHFtFRV 6 FISH de alta resolucin Bajo este concepto se agrupan una serie de tcnicas que, utilizando los mismos principios de FISH convencional, permiten hacer hibridaciones sobre cromosomas profsicos o an sobre ncleos interfsicos. Estas estrategias permiten aumentar tanto la resolucin como la sensibilidad de la deteccin. - FISH sobre cromosomas poco condensados: consiste en el anlisis de cromosomas meiticos en paquitene o de cromosomas mitticos extendidos. La tcnica de cromosomas paquitnicos VH DSOLFD D FpOXODV PDGUHV GHO SROHQ MDGDV HQ etanol : cido actico (3:1) y tratadas con una mezcla de enzimas (celulasa, pectiolasa y citohelicasa) que digieren la calosa de las paredes celulares. En general, los cromosomas paquitnicos vegetales son de 7 a 40 veces ms largos que aquellos de metafases mitticas, HVWiQ FRPSXHVWRV SRU FXDWUR KHEUDV GH $'1 (iguales en los homocigotos), son ms accesibles a las sondas (debido a que tienen una HVWUXFWXUD FURPDWtQLFD PHQRV FRQGHQVDGD \ presentan marcadores cromosmicos particulares (bloques heterocromticos y knobs) que permiten individualizarlos con facilidad. Estas

FDUDFWHUtVWLFDV KDFHQ TXH ORV FURPRVRPDV SDquitnicos constituyan el material de eleccin para los estudios de FISH de alta resolucin, HQ SDUWLFXODU SDUD LGHQWLFDU VHFXHQFLDV EODQco de alrededor de 10 kb y resolver dos loci separados por menos de 100 kb. Por otra parte, la tcnica de FISH sobre cromosomas mitticos extendidos utiliza cromosomas metafsicos seleccionados por FLWRPHWUtD GH XMR a partir de meristemas radicales sincronizados. El estiramiento de los cromosomas se realiza mediante una digestin PRGHUDGD FRQ SURWHLQDVD . DQWHV GH OD MDcin con etanol-cido actico (3:1). Mediante este procedimiento, se pueden obtener cromosomas con una longitud de 10 a 100 veces mayor que la original. Esto permite aumentar la resolucin de los arreglos de secuencias gnicas y repetidas sobre los cromosomas, sin perder la informacin sobre la orientacin relativa con respecto al centrmero y los telmeros. Esta tcnica posee una resolucin similar a la que utiliza cromosomas paquitnicos y es muy til en aquellas especies en las que la obtencin GH EXHQRV SUHSDUDGRV PHLyWLFRV HV GLFXOWRVD o en aquellas que poseen cromosomas paquiWpQLFRV GLItFLOHV GH UHVROYHU - FISH en ncleos interfsicos: esta tcniFD VH DSOLFD D Q~FOHRV HQ FRUWHV GH WHMLGRV DVt como a ncleos aislados, y permite incrementar tanto la sensibilidad como la resolucin de FISH. Para el anlisis de los ncleos en tejidos, ORV yUJDQRV GH OD SODQWD VH MDQ FRQ IRUPDOGHKtGR R JOXWDUDOGHKtGR HVWH ~OWLPR HQ EDMD SURSRUFLyQ \D TXH SXHGH LQGXFLU DXWRXRUHVFHQcia), luego se cortan con micrtomo y los cortes se montan directamente sobre un portaobjetos. Debido a que la sonda necesita penetrar en el tejido para alcanzar el interior del ncleo, se realizan diversos pre-tratamientos tendientes a incrementar la permeabilidad de los tejidos y, adems, se emplean como sondas fragmentos marcados cuyo tamao no supera los 100-500 pb. El anlisis de las hibridaciones se realiza con un microscopio confocal, debido a que este tipo de microscopio permite visualizar las estructuras mediante la reconstruccin tridimensional de las secciones pticas de la muestra.

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Para el anlisis de ncleos aislados, los tejidos se disgregan en un buffer de estabilizacin apropiado y la fraccin de inters se obtiene por centrifugacin y tamizado en mallas con diferentes dimetros de poro. Los ncleos aislados se colocan directamente sobre un portaobjetos y se secan al aire y deshidratan en serie alcohlica. Este procedimiento, que tambin puede ser aplicado a suspensiones celulares, no presenta mayores problemas de permeabilidad para las sondas. Las regiones de hibridacin de las sondas sobre las secuencias de copia simple se observan como seales individuales dentro del ncleo (dos seales en los ncleos diploides), cada una de ellas correspondiente a cada uno de los cromosomas homlogos. Mediante estas tcnicas tambin se ha estudiado la organizacin y la disposicin de los centrmeros, de los telmeros y de los cromosomas en ncleos interfsicos de diferentes rganos y tejidos de trigo, arroz, tabaco y Arabidopsis thaliana. En particular, las mismas resultan muy tiles para el anlisis de los cambios que se producen durante el ciclo celular en las diferentes estructuras cromosmicas dependientes de secuencias. Tambin se emplean para el mapeo de secuencias separadas por distancias menores a 500-1000 kb, ya que en los cromosomas metafsicos las seales de las sondas separadas por estas distancias se superponen. - ),6+ HQ EUDV GH $'1 H[WHQGLGDV EHU FISH): se basa en la hibridacin de las sondas VREUH EUDV H[WHQGLGDV GH $'1 (VWD WpFQLFD LQYROXFUD ORV VLJXLHQWHV SDVRV  VH DtVODQ ORV ncleos por medio de mallas de nylon de diferentes dimetros de poro, 2) se deposita un pequeo volumen de la suspensin de ncleos en uno de los extremos de un portaobjetos tratado con poli-L-lisina (este compuesto reduce DO PtQLPR OD DSDULFLyQ GH VHxDOHV LQHVSHFtFDV \ IDYRUHFH OD H[WHQVLyQ GH ODV EUDV GH $'1  3) se agrega un buffer de lisis y se realiza la extensin usando un cubreobjetos de manera similar a como se hace un frotis de sangre, y 4) sobre estos extendidos se realizan las hibridaciones siguiendo el protocolo convencional de FISH. Normalmente, se realizan dos o tres

URQGDV GH DPSOLFDFLyQ FRQ DQWLFXHUSRV SDUD obtener una buena intensidad de las seales. /D SULQFLSDO YHQWDMD GH EHU),6+ IUHQWH D ),6+ en ncleos interfsicos es que se logra una mayor sensibilidad (200 pb) y una resolucin a nivel genmico de 1 kb. Esta tcnica es de gran utilidad para analizar clones solapantes, detectar rearreglos cromosmicos pequeos, GHWHUPLQDU GLVWDQFLDV ItVLFDV HQWUH JHQHV \ VX orientacin, medir tamaos de loci y acelerar el clonado posicional. Sin embargo, su utilidad para el mapeo de secuencias es limitada debido a que slo permite establecer posiciones relativas, perdiendo la orientacin real de las sondas con respecto al centrmero y a los telmeros. Una variante de esta tcnica es el empleo de cromatina estirada, un procedimiento TXH LQYROXFUD OD H[WHQVLyQ GH ODV EUDV FURPDWtQLFDV VLQ UHPRYHU ODV SURWHtQDV OD TXH UHVXOWD PX\ ~WLO SDUD H[DPLQDU ODV LQWHUDFFLRQHV $'1 SURWHtQDV 7 Mapas cromosmicos Estos mapas constituyen una herramienta IXQGDPHQWDO SDUD LQWHJUDU ORV PDSDV ItVLFRV (basados en el ordenamiento de secuencias y el armado de contiguos) y los mapas genticos (derivados de los anlisis de ligamiento). Los mapas cromosmicos permiten posicionar genes y/o marcadores ligados a stos, con respecto a marcadores estructurales propios de los cromosomas (por ejemplo, centrmeros, telmeros, bandas heterocromticas y constricciones secundarias) o a otros marcadores cromosmicos desarrollados por FISH. Esta integracin facilita el mapeo y el aislamiento de genes particulares por mtodos convencionales y son indispensables para el aislamiento de secuencias por microdiseccin y microclonado. Para el clonado posicional de secuencias es importante tener una estimacin precisa de la razn kb/cM existente en la regin del locus de inters. Esto posibilita la conversin de las distancias genticas establecidas entre los marcadores y el gen en estudio en distancias ItVLFDV (Q JHQHUDO VH KD REVHUYDGR TXH OD GLVtancia entre loci en los mapas genticos (y no el orden) puede diferir mucho de la distancia HVWDEOHFLGD HQ ORV PDSDV ItVLFRV /RV HVWXGLRV

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de los ndulos de recombinacin en complejos sinaptonmicos han revelado que la discrepanFLD HQWUH ORV PDSDV ItVLFRV \ JHQpWLFRV HV HO resultado de la distribucin no al azar de los eventos de crossing-over a lo largo de los cromosomas. En este marco, el desarrollo de los mapas cromosmicos ha cobrado importancia debido a que, dependiendo de las regiones cromosmicas que se analicen y a la frecuencia de recombinacin propia de cada una, los mapas genticos pueden ser mejores o peores HVWLPDGRUHV GH ODV GLVWDQFLDV ItVLFDV UHDOHV Por tal motivo, en varias especies modelo se ha puesto especial nfasis en el desarrollo de marcadores cromosmicos por las tcnicas de ,6+ SULQFLSDOPHQWH %$&),6+ \ )LEHU ),6+ para poder integrar los grupos de ligamiento gentico con cromosomas, y para relacionar las estimaciones de distancia por recombinaFLyQ FRQ OD GLVWDQFLD ItVLFD UHDO 9HU FDStWXOR GH Genmica). 8 Anlisis de la expresin gnica en tejidos por ARN-ISH /RV SURWRFRORV GH ,6+ GH $51 UHVXOWDQ DSURpiados para describir los patrones temporales y espaciales de expresin de un determinado gen a nivel celular o subcelular. En los organismos multicelulares, ISH constituye un complemento de los anlisis de northern blotting, RT-PCR y PLFURDUUD\V HQ ORV TXH OD H[WUDFFLyQ GH $51 de los tejidos resulta invariablemente en la prGLGD GH LQIRUPDFLyQ HVSDFLDO $VLPLVPR VL ELHQ los microarrays constituyen una de las tcnicas ms poderosas para analizar la expresin de muchos genes simultneamente, con frecuencia los resultados que se obtienen deben ser YHULFDGRV SRU PpWRGRV LQGHSHQGLHQWHV WDOHV como ISH. El anlisis de la expresin gnica por ISH generalmente se efecta sobre cortes de tejido, aunque tambin puede realizarse soEUH yUJDQRV HQWHURV ZKROHPRXQW ,6+ ,6+ :,6+  /D WpFQLFD VH EDVD HQ OD XWLOL]DFLyQ GH XQD VRQGD JHQHUDOPHQWH F'1$ PDUFDGD FRQ haptenos que se hibridar directamente sobre los cortes de tejido. Las detecciones se realizan con anticuerpos conjugados con fosfataVDV DOFDOLQDV R FRQ XRURFURPRV 3DUD DTXHOORV FDVRV HQ ORV TXH HO $51P D

detectar est poco representado en las muesWUDV VH SXHGHQ XWLOL]DU SURWRFRORV TXH DPSOLcan la seal mediante el precipitado enzimtiFR GH WLUDPLGD VREUH ORV VLWLRV EODQFRV 76$ 7\UDPLGH 6LJQDO $PSOLFDWLRQ  /D DSOLFDFLyQ GH 76$ HQ ORV SURWRFRORV HVWiQGDUHV GH ,6+ consiste en una deteccin inicial de la sonda marcada con anticuerpos o estreptavidina conjugados con una peroxidasa (por ejemplo la de rbano picante, horseradish peroxidase o HRP). Posteriormente, se agrega al preparado WLUDPLGD FRQMXJDGD FRQ DOJ~Q KDSWHQR R XRURcromo, la cual es precipitada masivamente por la HRP y unida en forma covalente al sitio de deteccin inicial. El sistema resultante es detectado mediante anticuerpos conjugados con fosfatasas alcalinas (para detecciones cromognicas estndares) o directamente con miFURVFRStD GH HSLXRUHVFHQFLD 'HELGR D TXH OD tiramida adicionada slo se deposita en las regiones prximas a la enzima, se logra aumenWDU VLJQLFDWLYDPHQWH OD VHQVLELOLGDG VLQ SHUGHU UHVROXFLyQ /D SULQFLSDO OLPLWDQWH GH $51,6+ radica en que, generalmente, se puede analizar una sola sonda por cada hibridacin. No obstante, esta tcnica se ha utilizado para comparar los niveles y sitios de expresin de secuencias en numerosas especies de plantas. Uno ejemplo de ello, es el anlisis espacial de transcritos expresados diferencialmente en SODQWDV FRQ UHSURGXFFLyQ VH[XDO \ DSRPtFWLFDV de Paspalum notatum (Fig 2 G y H). 9 FISH cuantitativo para estimar la expresin gnica (QUISH) $ GLIHUHQFLD GH OD WpFQLFD GH $51),6+ TXH utiliza anticuerpos sobre cortes de tejidos para la deteccin de la expresin gnica, QUISH se basa en la hibridacin de oligonucletidos JHQHVSHFtFRV PDUFDGRV FRQ XRURFURPRV directamente sobre porciones de tejidos u rganos enteros, combinada con el anlisis de secciones pticas realizadas con un microscopio lser confocal de barrido. De este modo, se logra mejorar notablemente la calidad de los resultados debido a que se eliminan los pasos que generan artefactos e impiden realizar una FXDQWLFDFLyQ SUHFLVD /D FDUDFWHUtVWLFD FODYH GH 48,6+ HV OD FXDQWLFDFLyQ GH OD H[SUHVLyQ

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gnica utilizando como estndar a los genes de mantenimiento celular (genes housekeeping, *$3'+ \ 6 $51U  (O HPSOHR GH HVWH HVtndar permite corregir la variacin de la razn citoplasma/vacuola en los diferentes tipos celulares, los efectos pticos de los tejidos y las VHxDOHV QR HVSHFtFDV /D QDWXUDOH]D FXDQWLWDtiva de esta tcnica hace posible el anlisis de la expresin gnica en rganos, a nivel tisular o celular, independientemente de las diferencias debidas a la edad o a los tipos de tejidos. Este mtodo es mas rpido que los mtodos tradicionales y puede utilizarse para estudiar la localizacin celular de la expresin de uno o YDULRV JHQHV HQ XQ SHUtRGR UHODWLYDPHQWH FRUWR GH WLHPSR $VLPLVPR FRQ 48,6+ HV SRVLEOH LQvestigar los cambios en los niveles de los transcriptos durante la ontogenia o, en respuesta a cambios de las condiciones ambientales en diIHUHQWHV OtQHDV GH SODQWDV PRGHOR  ,GHQWLFDFLyQ GH PRGLFDFLRQHV cromatnicas por inmunocitogentica La identidad celular est determinada por un programa nuclear establecido por un paWUyQ FRPSOHMR GH LQWHUDFFLRQHV HQWUH HO $'1 \ ODV SURWHtQDV /D RUJDQL]DFLyQ GHO $'1 HQ la cromatina regula la expresin y el mantenimiento de la informacin gentica (replicacin, reparacin, recombinacin y segregacin) en forma dinmica. Las colas N-terminales de las histonas que conforman el ncleo de los nucleosomas estn sujetas a diferentes modiFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV DFHWLODFLyQ PHtilacin, fosforilacin, ubiquitinacin, etc.) las TXH FRQMXQWDPHQWH FRQ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 controlan el empaquetamiento de los nucleosomas en arreglos de orden superior y proveen seales para diversos procesos celulares. $XQTXH ODV KLVWRQDV \ VXV PRGLFDFLRQHV VRQ altamente conservadas, la distribucin de las mismas en los cromosomas puede variar a lo largo de los procesos de diferenciacin y del FLFOR FHOXODU DVt FRPR GHQWUR \ HQWUH JUXSRV de eucariotas. Recientemente, se han producido grandes avances en el esclarecimiento del llamado cdigo de las histonas y del intrincado mecanismo de regulacin epigentica. La citogentica se encuentra en una posicin privile-

giada para realizar estudios de este tipo ya que permite unir estructuras nucleares con caracWHUtVWLFDV ELRTXtPLFDV WDOHV FRPR OD DFWLYLGDG WUDQVFULSFLRQDO OD UHSOLFDFLyQ GHO $'1 ODV PRGLFDFLRQHV GH ODV KLVWRQDV \ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 PHGLDQWH OD LQPXQRGHWHFFLyQ GH GLVWLQWRV blancos celulares con anticuerpos conjugados FRQ IRVIDWDVD DOFDOLQD R FRQ XRURFURPRV /D SUHSDUDFLyQ GHO PDWHULDO OD MDFLyQ OD GLJHVtin de las paredes celulsicas, la permeabilizacin y la incubacin con anticuerpos se realizan de igual modo que en FISH, aunque se omiten los pasos de desnaturalizacin e hibridacin. Las tcnicas de inmunocitogentica se emplean para analizar la estructura cromaWtQLFD \ OD GLVSRVLFLyQ GH ODV GLIHUHQWHV PROpFXlas que intervienen en las divisiones celulares. En particular, estas tcnicas son tiles para HVWXGLDU OD GLVWULEXFLyQ GH ODV PRGLFDFLRQHV KLVWyQLFDV \ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 HQ UHODFLyQ FRQ OD HVWUXFWXUD FURPDWtQLFD HQ FURPRVRPDV y ncleos durante el ciclo celular. Merecen especial mencin aquellos anlisis relacionados FRQ ODV PRGLFDFLRQHV TXH LQGLFDQ HVWUXFWXUDV FURPDWtQLFDV DELHUWDV FRQ SRWHQFLDOLGDG GH transcripcin, y las que delimitan estructuras FURPDWtQLFDV FHUUDGDV FRQ DFWLYLGDG WUDQVFULScional reprimida. El advenimiento de las tcnicas de citogentica molecular y de inmunocitogentica ha permitido disectar progresivamenWH HO Q~FOHR D QLYHO GH PLFURVFRStD ySWLFD /D deteccin individual de complejos proteicos y GH VHFXHQFLDV GH $51V \ $'1 KD UHYHODGR OD existencia de muchos compartimientos nucleares. Las variaciones en la arquitectura nuclear UHHMDQ OD UHODFLyQ H[LVWHQWH HQWUH OD RUJDQL]Dcin nuclear y la regulacin gnica. El anlisis de dicha arquitectura incluye varios parmetros cuantitativos y cualitativos, tales como el tamao y forma nuclear, el contenido relativo y la distribucin de heterocromatina, los patroQHV JHQHUDOHV GH PRGLFDFLyQ FURPDWtQLFD OD presencia de compartimientos nucleares (nucleolos, cromocentros, territorios cromosmicos y cuerpos nucleares) y la organizacin de los cromosomas en el ncleo (ie. la posicin y la orientacin de los cromosomas en el ncleo) \ ODV GLIHUHQFLDV HQ OD FRQGHQVDFLyQ FURPDWtQLca a nivel local.

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11 Anlisis de la posicin de la insercin de los transgenes Diferentes ensayos han demostrado que la expresin de los transgenes puede variar VLJQLFDWLYDPHQWH HQWUH HVSHFLHV GLSORLGHV UHODFLRQDGDV HQWUH OtQHDV WUDQVIRUPDGDV LQGHpendientes, y an entre generaciones de las OtQHDV WUDVIRUPDGDV /RV QLYHOHV GH H[SUHVLyQ de estas secuencias pueden ser afectados por diversos factores, entre ellos, la presencia de numerosas copias de la construccin en uno o varios loci y el contexto genmico en que se encuentran las copias. La tcnica de FISH permite mapear los trangenes en cromosomas PHWDIiVLFRV HQ Q~FOHRV LQWHUIiVLFRV R HQ EUDV H[WHQGLGDV GH $'1 \ D VX YH] GHWHUPLnar el nmero de loci en que se encuentran los mismos. Para el mapeo se utiliza una sonda marcada correspondiente al transgen y otras VRQGDV TXH SHUPLWDQ LGHQWLFDU ORV SDUHV FURmosmicos, un genoma o un subgenoma parWLFXODU HQ HO FDVR GH KtEULGRV R DORSROLSORLGHV  Uno de los ejemplos clsicos, en el cual se combinaron diferentes tcnicas moleculares y citogenticas para analizar los efectos del contexto genmico en la expresin de los transgenes fue realizado en tabaco. En el mismo se emple FISH para mapear los trangenes sobre ORV FURPRVRPDV \ *,6+ SDUD LGHQWLFDU ORV JHQRPDV GHO DORSROLSORLGH $ SDUWLU GH HVWRV HVtudios, se ha demostrado que, en general, los transgenes con expresin estable estn localizados en las proximidades de las regiones telomricas y ricas en genes, mientras que los de expresin inestable se localizan en las regiones intercalares o paracentromricas que son ms pobres en genes. Por otra parte, la combinacin de FISH con tcnicas de inmunocitogentica permite analizar el contexto epigentico de la cromatina circundante a los transgenes y su relacin con la expresin de los mismos. Lecturas / sitios recomendados
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)HUQiQGH] $ DQG 'DYLxD -5  +HWHURFKURPDtin and genome size in Fortunatia and Camassia +\DFLQWKDFHDH  .HZ %XOOHWLQ 46, 307-316. )UDQV] 3) $ORQVR%ODQFR & /LKDUVND 7% 3HHWHUV $-0 =DEHO 3 DQG -RQJ -+  +LJK resolution physical mapping in Arabidopsis thaliana DQG WRPDWR E\ XRUHVFHQFH in situ hyEULGL]DWLRQ WR H[WHQGHG '1$ EHUV 7KH 3ODQW -Rurnal, 9, 421-430. .SHU + 2UW 6HLE / 6LYDJXUX 0 +RHNHQJD 2$ DQG .RFKLDQ /9  $ PHWKRG IRU FHOOXODU ORcalization of gene expression via quantitative in situ hybridization in plants. The Plant Journal, 50, 159-175. /DVSLQD 19 9HJD 7 6HLMR -* *RQ]iOH] $0 0DUWHORWWR /* 6WHLQ - 3RGLR 0 2UWL] -3$ (FKHQLTXH 9& 4XDUtQ &/ DQG 3HVVLQR 6& 2008. Gene expression analysis at the onset of aposporous apomixis in Paspalum notatum. Plant Molecular Biology, 67, 615-628. /DYLD *, )HUQiQGH] $ DQG 6HLMR -*  &\WRgenetic and molecular evidences on the evolutionary relationships among Arachis species. In: 6KDUPD $. DQG 6KDUPD $ HGV  3ODQW *Hnome: Biodiversity and Evolution. Volume 1E: 3KDQHURJDP$QJLRVSHUP 6FLHQFH 3XEOLVKHUV (QHOG 1+ 86$  SS  0RVFRQH ($ 0DW]NH 0$ DQG 0DW]NH $-0 1996. The use of combined FISH/GISH in conMXQFWLRQ ZLWK '$3, FRXQWHUVWDLQLQJ WR LGHQWLI\ chromosomes containing transgene inserts in amphidiploid tobacco. Chromosoma, 105, 231236. Robledo G., Lavia G.I. and Seijo G. 2009. Species UHODWLRQV DPRQJ ZLOG Arachis VSHFLHV ZLWK WKH $ JHQRPH DV UHYHDOHG E\ ),6+ PDSSLQJ RI U'1$ loci and heterochromatin detection. Theoretical DQG $SSOLHG *HQHWLFV 118, 1295-1307. 6FKZDU]DFKHU 7 DQG +HVORS+DUULVRQ 3  3UDFWLFDO LQ VLWX K\EULGL]DWLRQ %,26 6FLHQWLF Publishers, Oxford, 2000. pp. 203. 6HLMR -* /DYLD *, )HUQiQGH] $ .UDSRYLFNDV $ 'XFDVVH ' DQG 0RVFRQH ($  3K\VLFDO PDSSLQJ RI 6 DQG 66 U51$ JHQHV HYLGHQFHV WKDW $UDFKLV GXUDQHQVLV DQG $ LSDHQVLV DUH WKH ZLOG GLSORLG VSHFLHV LQYROYHG LQ WKH RULJLQ RI $ K\SRJDHD /HJXPLQRVDH  $PHULFDQ -RXUnal of Botany, 91, 1294-1303. 6HLMR -* /DYLD *, )HUQiQGH] $ .UDSRYLFNDV $ 'XFDVVH ' %HUWLROL '- DQG 0RVFRQH ($  *HQRPLF UHODWLRQVKLSV EHWZHHQ WKH FXOWLYDWHG SHDQXW $UDFKLV K\SRJDHD  /HJXPLQRVDH and its close relatives revealed by double GISH. $PHULFDQ -RXUQDO RI %RWDQ\   6ROtV 1HIID 9* DQG )HUQiQGH] $ .DU\RW\SLF VWX-

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dies in Turnera sidoides complex (Turneraceae, /HLRFDUSDH   $PHULFDQ -RXUQDO RI %RWDQ\ 89, 551-558. Stein N., Ponelies N., Musket T., McMullen M. and :HEHU *  &KURPRVRPH PLFURGLVVHFWLRQ DQG UHJLRQVSHFLF OLEUDULHV IURP SDFK\WHQH chromosomes of maize (Zea mays L.). The Plant Journal, 13, 281289. 7HUNHOVHQ & .RFK - .OYUDD 6 +LQGNMU - 3Hdersena S. and Bolund L. 1993. Repeated primed in situ labeling: formation and labeling of VSHFLF '1$ VHTXHQFHV LQ FKURPRVRPHV DQG nuclei. Cytogenetics and Genome Research, 63, 235-237.

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I.-CAPTULO 4 Herramientas Bsicas de Ingeniera Gentica


Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Viviana Echenique Introduccin +DVWD SULQFLSLRV GH ORV DxRV  HO $'1 era la molcula de la clula que planteaba PiV GLFXOWDGHV SDUD VX DQiOLVLV ELRTXtPLFR ([FHVLYDPHQWH ODUJD \ TXtPLFDPHQWH PRQyWRQD OD VHFXHQFLD GH QXFOHyWLGRV GHO '1$ WDQ VROR SRGtD VHU HVWXGLDGD SRU FDPLQRV LQGLUHFWRV tales como la determinacin de la secuencia de SURWHtQDV R GHO 51$ $FWXDOPHQWH HV SRVLEOH VHSDUDU UHJLRQHV GHWHUPLQDGDV GHO $'1 REtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos nucletidos. Estos adelantos tcnicos forman SDUWH GH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH de cuyo desarrollo han sido pilares fundamentales el conocimiento de las enzimas de restriccin, el esclarecimiento de los procesos de

UHSOLFDFLyQ \ UHSDUDFLyQ GH $'1 DVt FRPR GH OD UHSOLFDFLyQ GH YLUXV \ SOiVPLGRV \ OD VtQWHVLV TXtPLFD GH VHFXHQFLDV GH QXFOHyWLGRV 'H HVWD PDQHUD SXHGH GHFLUVH TXH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH HVWD LQWHJUDGD SRU GLYHUVDV estrategias metodolgicas, muchas de las cuales son adaptaciones de procesos naturales de la gentica microbiana que han sido estudiados y se conocen en profundidad. LA CLONACIN MOLECULAR CLONACIN DE GENES O

/D QDOLGDG GH OD FORQDFLyQ PROHFXODU HV OD obtencin de un determinado fragmento de $'1 TXH SXHGH FRUUHVSRQGHU D XQ JHQ LQVHUto en un vector capaz de replicarse, pudindoVH SRVWHULRUPHQWH DPSOLFDU D YDULRV PLOORQHV de copias, por ejemplo para anlisis de secuencia o para obtener grandes cantidades de un producto gnico. (O GHVDUUROOR GH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHcombinante y la clonacin molecular han aporWDGR VRVWLFDGRV SURFHGLPLHQWRV TXH SHUPLWHQ HO DLVODPLHQWR SXULFDFLyQ \ UHSOLFDFLyQ GH IUDJPHQWRV HVSHFtFRV GH $'1 /D FORQDFLyQ GH VHJPHQWRV GH $'1 WDPELpQ OODPDGD FUHDFLyQ GHO $'1 UHFRPELQDQWH requiere esencialmente de las etapas que se enumeran a continuacin (Fig. 1) 1. Obtencin del ADN a clonar Segn la estrategia experimental involucrada, el $'1 D FORQDU SXHGH WHQHU diferentes procedencias. 3XHGH WUDWDUVH GH $'1 de origen genmico, de XQ SURGXFWR GH DPSOLFDcin por PCR, provenir de OD VtQWHVLV in vitro, a partir de una retrotranscripcin $'1F WRPDQGR FRPR PROGH HO $51P R GH OD VtQWHVLV in vitro de secuenFLDV SUHYLDPHQWH GHQLdas. Cuando el material de

Figura 1. (WDSDV EiVLFDV HQ OD FORQDFLyQ GH XQ IUDJPHQWR GH $'1 (Q SULPHU OXJDU HO $'1 D FORQDU \ HO YHFWRU SOiVPLGR VH FRUWDQ FRQ OD PLVma enzima de restriccin. Luego se ponen en contacto en presencia de OD HQ]LPD OLJDVD SDUD REWHQHU XQD PROpFXOD GH $'1 UHFRPELQDQWH TXH se introduce en bacterias que multiplicarn el plsmido junto con el fragmento de inters.

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SDUWLGD HV HO $'1 JHQyPLFR ORV IUDJPHQWRV D ser clonados deben ser escindidos mediante el empleo de enzimas de restriccin. En algunas situaciones, particularmente cuando se trata de la clonacin de productos de PCR, los fragmentos deben ser aislados en funcin de su tamao. Este aislamiento se lleva a cabo a travs de electroforesis en geles de poliacrilamida o agarosa. 2. Eleccin del vector de clonacin Un vector de clonacin es una molcula de $'1 TXH YHKLFXOL]DUi DO IUDJPHQWR GH LQWHUpV \ SHUPLWLUi VX DPSOLFDFLyQ UHVXOWDQGR GH HVWD manera indispensable para la creacin del $'1 UHFRPELQDQWH 8QR GH ORV SULQFLSDOHV UHTXLVLWRV SDUD TXH XQD PROpFXOD GH $'1 SXHGD actuar como vector, es la capacidad de autorreplicacin que ir acompaada de la replicacin del fragmento inserto. Tambin es necesario que los vectores tengan un tamao que permita su manipulacin fuera de la clula. Los ms pequeos se manipulan con mayor faciliGDG TXH ODV PROpFXODV GH $'1 PiV JUDQGHV que tienden a ser ms frgiles. Los vectores de clonacin ms utilizados derivan del genoma viral o de plsmidos bacterianos. Los componentes esenciales de un vector de clonacin son el origen de replicacin, un gen marcador UHVSRQVDEOH GH DOJXQD FDUDFWHUtVWLFD IHQRWtSLca para la seleccin y al menos un sitio nico de restriccin. 3. Generacin del ADN recombinante (O WpUPLQR $'1 UHFRPELQDQWH VH HPSOHD para hacer referencia al material gentico a clonar unido al vector de clonacin. Para su obtencin es requisito contar con los dos fragPHQWRV GH $'1 HQ IRUPD SXUD \ OLJDUORV HQ]LPiWLFDPHQWH SRU DFFLyQ GH OD HQ]LPD $'1 OLJDVD HQ SUHVHQFLD GH $73 4. Introduccin del ADN recombinante en el organismo hospedador Este proceso es realmente el verdadero HYHQWR GH FORQDFLyQ HQ HO FXDO HO $'1 UHcombinante es clonado para producir varias

copias idnticas. Los organismos hospedaGRUHV XWLOL]DGRV HQ ELRORJtD PROHFXODU GHEHQ contener toda la maquinaria gentica para la DPSOLFDFLyQ GHO $'1 UHFRPELQDQWH 3XHGH tratarse de organismos procariotas (bacterias) R HXFDULRWDV OHYDGXUDV FpOXODV GH PDPtIHURV cultivadas). En el caso de la utilizacin de sistemas bacterianos, la introduccin se realiza valindose de los procesos naturales de la geQpWLFD PLFURELDQD R PRGLFDFLRQHV HVSHFtFDV GH ORV PLVPRV 'H HVWRV PpWRGRV PRGLFDGRV el ms ampliamente utilizado es el de transformacin en clula competente (ver vectores de FORQDFLyQ  2WUD IRUPD GH LQWURGXFLU HO $'1 HQ la clula hospedadora, de eleccin para molFXODV GH $'1 GH JUDQ WDPDxR HV HO SURFHVR de electroporacin, que consiste en la creacin de poros en la membrana celular inducida por descargas elctricas que permiten la introducFLyQ GHO $'1 /RV SOiVPLGRV KtEULGRV LQWURGXcidos a travs de alguno de estos procesos, continuarn replicndose en la clula hospedadora mientras sta crezca y se divida, siempre que sea mantenida la presin de seleccin.  ,GHQWLFDFLyQ \ VHOHFFLyQ GH ODV FpOXODV que contienen al ADN recombinante (Q HO HVTXHPD GH WUDQVIHUHQFLD GHO $'1 UHcombinante al hospedador descripto anteriormente, se asume que durante la transformacin, no todas las bacterias reciben una copia GHO YHFWRU KtEULGR (V QHFHVDULR VHOHFFLRQDU aquellas clulas que han incorporado el vector, a travs de la utilizacin de marcadores gnicos presentes en los vectores de clonacin. Los ms comnmente empleados son los genes de resistencia a antibiticos y el fragmento funcional de lac Z, el gen de E. coli TXH FRGLFD SDUD la enzima E-galactosidasa (E-gal). Estos genes marcadores tienen insertado un sitio mltiple de restriccin (polylinker), de manera que cuando ORV IUDJPHQWRV GH $'1 VRQ FORQDGRV HQ HO SRlylinker del gen lacZ, anulan la actividad de la E-galactosidasa. Esta enzima hidroliza un comSXHVWR TXtPLFR GHQRPLQDGR ;JDO \ VH OLEHUD un colorante azul relativamente insoluble. El ;JDO VH LQFRUSRUD DO PHGLR GH FXOWLYR HQ SODFD de Petri donde desarrollarn las clulas hospeGDGRUDV GHO $'1 UHFRPELQDQWH 6L HO $'1 FOR-

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nado se insert en el polylinker y desactiv la E-galactosidasa, no se producir pigmento azul y las clulas formarn colonias que se vern blancas en la placa de Petri. Caso contrario las colonias de las clulas hospedadoras se vern de color azul. Cuando el marcador es un gen de resistencia a los antibiticos, las clulas se LQRFXODQ HQ PHGLR DJDULFDGR TXH FRQWLHQH HO DQWLELyWLFR FX\D UHVLVWHQFLD FRQHUH HO YHFWRU de manera que slo sobrevivirn aquellas clulas que lo contienen. Luego deber buscarse HVSHFtFDPHQWH DTXHOODV FpOXODV TXH SRVHHQ el fragmento de inters. Estos dos marcadores suelen ser utilizados en forma conjunta de manera que solo las colonias portadoras del vector crecern en medio con antibitico, y, paralelamente, las colonias que poseen el plsmido recombinante sern de color blanco. Una vez obtenidas las colonias recombinanWHV ORV SDVRV D VHJXLU LQFOX\HQ OD DPSOLFDFLyQ GH OD FRORQLD HQ PHGLR OtTXLGR FRQ DQWLELyWLFR SXULFDFLyQ GHO SOiVPLGR D SDUWLU GH OD VXVSHQsin de bacterias y comprobacin de la presencia del inserto esperado. Para la deteccin del inserto, pueden utilizarse diversas estrategias. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se puede utilizar cuando la secuencia del fragPHQWR FORQDGR HV FRQRFLGD R SDUD LGHQWLFDU la secuencia de los fragmentos clonados por DPSOLFDFLyQ FRQ VRQGDV FRPSOHPHQWDULDV D la secuencia terminal del vector. La hibridacin PROHFXODU FRQ XQD VRQGD HVSHFtFD PDUFDGD puede ser utilizada cuando se conoce la secuencia de inters y se dispone de dicha sonda. En otros casos, se realiza la seleccin en funcin del tamao del inserto, para lo que el plsmido recombinante es digerido mediante enzimas de restriccin y posteriormente se realiza una corrida electrofortica en gel de agarosa. HERRAMIENTAS Y PROCEDIMIENTOS IMPLICADOS. $ SHVDU GH TXH OD REWHQFLyQ GH $'1 UHFRPbinante pudo ser explicada a travs de cinco pasos sencillos, es muy amplio el conjunto de KHUUDPLHQWDV \ PHWRGRORJtDV H[SHULPHQWDOHV que estn involucradas en su desarrollo. El objetivo de esta parte del capitulo es introducir

al lector en las herramientas metodolgicas de ELRORJtD PROHFXODU PiV DPSOLDPHQWH XWLOL]DGDV 1. VECTORES DE CLONACIN Como hemos mencionado, un vector es una PROpFXOD GH $'1 D OD TXH VH XQLUi HO IUDJPHQWR GH LQWHUpV UHVXOWDQGR HQ HO $'1 UHFRPELnante y, debido a su capacidad de autorrepliFDFLyQ SHUPLWLUi OD DPSOLFDFLyQ GHO IUDJPHQWR insertado. Los vectores de clonacin de ltima generacin son muy prcticos y sencillos de manejar. Incluyen un sitio mltiple de clonacin o sitio de restriccin mltiple (polylinker) que HV XQ VHJPHQWR FRUWR GH $'1 FRQ VLWLRV GH UHVtriccin para varias enzimas diferentes, cada uno de ellos nico para el vector (Fig. 2). Este sitio suele formar parte del marco abierto de lectura (ORF) de un gen responsable de alguQD FDUDFWHUtVWLFD IHQRWtSLFD SRU OR TXH UHVXOWD VHQFLOOR FRQUPDU VL WUDV OD UHVWULFFLyQ VH KD REWHQLGR HO SOiVPLGR KtEULGR \D TXH OD LQFOXVLyQ del inserto produce la prdida de funcionalidad del gen mediante inactivacin por insercin. Existen diferentes tipos de vectores de clonacin, entre los que se incluyen: A) Plsmidos: 6RQ PROpFXODV GH $'1 FLUFXODU GH GREOH cadena, extracromosmicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy tiles como vectores de clonacin, a saber: 1. Pequeo tamao que hace sean fciles de aislar y manipular.  6RQ FLUFXODUHV OR TXH KDFH TXH HO $'1 VHD PiV HVWDEOH GXUDQWH VX DLVODPLHQWR TXtPLFR 3. Su replicacin transcurre independientePHQWH GHO $'1 QXFOHDU HQ OD FpOXOD EDFWHULDQD 4. Existen mltiples copias en la clula, dependiendo del plsmido y de la especie hospedadora puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1000 a 3000 copias de pBR322 por clula). 5. La presencia de genes de resistencia a los antibiticos que actan como marcadores seleccionables facilita la deteccin y seleccin de los clones que los contienen. El tamao de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable, sin embargo si son

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Figura 2. Elementos genticos que constituyen un vector de clonacin. a) Sitio de restriccin mltiple que FRQVLVWH HQ XQ FRUWR VHJPHQWR GH $'1 FRQ YDULRV VLWLRV GH UHVWULFFLyQ FDGD XQR GH HOORV ~QLFR SDUD HO vector. b) representacin esquemtica del plsmido pBR322 con el origen de replicacin (Ori) y los genes marcadores de resistencia a tetraciclina (TETR) y ampicilina ($03R) que contienen los sitios de restriccin de BamHI y PstI, respectivamente;

mayores de 10 kb, el plsmido se hace generalmente inestable. $XQTXH HQ HO DPELHQWH QDWXUDO ORV SOiVPLGRV FRQMXJDWLYRV JHQHUDOPHQWH VH WUDQVHUHQ SRU contacto clula a clula, los plsmidos vectores de clonacin generalmente han sido modiFDGRV D Q GH HYLWDU VX WUDQVIHUHQFLD SRU FRQMXJDFLyQ \ DVt ORJUDU VX FRQWHQFLyQ ELROyJLFD Sin embargo, en el laboratorio es posible realizar la transferencia a la clula hospedadora por transformacin, utilizando choque trmico en presencia de cloruro de calcio o mediante electroporacin. $XQTXH ORV SULPHURV SOiVPLGRV XWLOL]DGRV H[LVWtDQ HQ IRUPD QDWXUDO ORV YHFWRUHV GH FORnacin actuales constituyen una generacin posterior de vectores construidos in vitro, como el plsmido pBR322 (Fig. 2). En este plsmido, el sitio de restriccin de BamHI est dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI est dentro del gen de resistencia a la ampicilina. Si se inserta un fragmento de un $'1 HQ XQR GH HVWRV VLWLRV OD UHVLVWHQFLD DO DQtibitico conferida por el gen que contiene este sitio se pierde (inactivacin por insercin). Por

tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHI \ VH OLJD D XQ $'1 \ OXHJR VH DtVODQ ORV FORQHV transformados, aquellos transformantes que posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina QR SRUWDQ QLQJ~Q $'1 FORQDGR $TXHOODV FpOXlas que continan siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen HO SOiVPLGR FRQ HO IUDJPHQWR GHO $'1 FORQDGR Como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina puede determinarse independientemente en placas con agar, resulta fcil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las clulas que no los contengan. B) Bacterifagos o fagos: )DJR : se caracteriza por ser un fago especializado en la transduccin (transduccin especializada) por lo tanto este fago puede utilizarse tambin como vector de clonacin para la recombinacin in vitro. Es un vector de clonacin particularmente til porque: 1. Se conoce bien su estructura, gentica molecular y funcionamiento

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3XHGH LQVHUWDU PD\RU FDQWLGDG GH $'1 TXH OD PD\RUtD GH ORV SOiVPLGRV HQWUH  \  NE (O $'1 SXHGH VHU HFLHQWHPHQWH HPSDTXHtado in vitro GHQWUR GH ODV SDUWtFXODV GHO IDJR /DV SDUWtFXODV GHO IDJR VRQ PXFKR PiV Hcientes en la infeccin de las clulas hospedadoras (transfeccin) que la transformacin. (O IDJR WLHQH XQ PDSD JHQpWLFR FRPSOHjo. El tercio central del cromosoma, que contiene genes requeridos para la lisogenia pero QR SDUD HO FLFOR OtWLFR SXHGH VHU HVFLQGLGR SRU UHVWULFFLyQ \ VXEVWLWXLGR SRU $'1 IRUiQHR )LJ D  (O $'1 UHFRPELQDQWH UHVXOWDQWH SXHGH VHU empaquetado en las cabezas del fago in vitro, pudindolas el fago inyectar en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen los fragmentos a clonar. 'DGR TXH HO IDJR VLOYHVWUH WLHQH H[FHVLYD cantidad de sitios de restriccin, no es indicado como vector de clonacin por lo que se han FRQVWUXLGR IDJRV PRGLFDGRV &KDURQ  HQ los cuales los sitios de restriccin no deseados KDQ VLGR PRGLFDGRV Fago M13 HV XQ IDJR ODPHQWRVR TXH FRQWLHQH $'1 PRQRFDWHQDULR \ VH UHSOLFD VLQ PDtar a su hospedador. Sin embargo, para poder usar M13 para la clonacin es necesario disponer de una forma bicatenaria ya que las enzimas de restriccin slo trabajan sobre $'1 ELFDWHQDULR (O $'1 ELFDWHQDULR GH 0 puede obtenerse de clulas infectadas, donde se encuentra en forma replicativa bicatenaria. La mayor parte del genoma del tipo silvestre contiene informacin gentica esencial para la replicacin. Sin embargo existe una pequea regin, llamada secuencia intergnica, que puede ser utilizada como sitio de clonacin. (V SRVLEOH FORQDU $'1 GH ORQJLWXGHV YDULDEOHV hasta 5kb sin afectar la viabilidad del fago. El $'1 PRQRFDWHQDULR GH 0 \ GH VXV YHFWRUHV derivados, ha sido extremadamente til para VHFXHQFLDU $'1 Tanto en el fago O como el M13 se ha insertado como marcador el gen lacZ. C) Csmidos: 6RQ KtEULGRV HQWUH SOiVPLGRV \ HO IDJR \ combinan las ventajas de ambos como vectores. Poseen la habilidad del plsmido para replicarse autnomamente en las clulas de E.

coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro GHO FURPRVRPD GH \ FRQWLHQHQ HO RULJHQ GH replicacin y los genes de resistencia a los antibiticos de su plsmido parental. Cos proviene de sitio cohesivo (cohesive site) en referencia a la terminal de simple cadena de 12 bases FRPSOHPHQWDULD HQ HO FURPRVRPD GH PDGXro. El sitio cos es reconocido por el sistema GH HPSDTXHWDPLHQWR GH $'1 GH  KDFLHQGR cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. La principal ventaja de los csmidos como vectores es su habilidad para LQVHUWDU IUDJPHQWRV GH $'1 GH  D  NE D) Fsmidos (fagmidos): 6RQ YHFWRUHV KtEULGRV HQWUH HO IDJR 0  \ HO SOiVPLGR S%5 TXH FRQWLHQHQ ORV RUtJHnes de replicacin de ambos. Normalmente la replicacin depende del plsmido, pero cuando una clula que contiene un fsmido se infecta con un fago de tipo salvaje, el origen del fago es responsable de la replicacin y se generan FRSLDV PRQRFDWHQDULDV (VWH $'1 PRQRFDWHnario es empaquetado en viriones y puede aislarse fcilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente los fsmidos pueden transportar GH IRUPD HVWDEOH XQ IUDJPHQWR GH $'1 FORQDGR PD\RU TXH XQ YHFWRU WtSLFR GHULYDGR GH M13. ( &URPRVRPDV DUWLFLDOHV $ SDUWLU GH OD FUHDFLyQ GH SUR\HFWRV GH VHcuenciacin de genomas completos se gesta la necesidad de obtener vectores que alberJXHQ SRUFLRQHV GH $'1 GH PD\RU WDPDxR SDUD efectuar el anlisis genmico y obtener mapas ItVLFRV GH FURPRVRPDV (O primer sistema de FORQDGR GH JUDQGHV IUDJPHQWRV GH $'1 IXH informado en 1987 por Burke y colaboradoUHV ORV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV GH OHYDGXUDV (YACs), minicromosomas con la capacidad de FRQWHQHU LQVHUWRV GH $'1 GH  NES )LJ E  /RV <$&V VRQ YHFWRUHV GH '1$ OLQHDUHV que contienen los elementos esenciales de los cromosomas de la levadura, como por ejemplo HO RULJHQ GH UHSOLFDFLyQ $56 $XWRQRPRXVO\ Replicating Sequence). Introducidos en la cOXOD GH OHYDGXUD ORV <$&V VH UHSOLFDQ \ VHJUHgan junto con el complemento cromosmico

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Figura 3. Vectores de clonacin. Se muestran los elementos genticos que constituyen los vectores de FORQDFLyQ D )DJR ODPEGD (O FURPRVRPD VH RUJDQL]D GH DFXHUGR FRQ ODV SURWHtQDV FRGLFDGDV SRU ORV JHQHV & & FDEH]D \ FROD JHQHV GH SURWHtQDV GH OD FiSVLGH GH XQLyQ FDEH]DFROD \ GH HVWDELOL]DFLyQ \ HPSDTXHWDPLHQWR GH $'1 UHF JHQHV GH UHFRPELQDFLyQ SURWHtQDV SDUD OD LQWHJUDFLyQ \ HVFLVLyQ GHO $'1 del fago en el cromosoma de la bacteria hospedadora, reg: genes regulatorios, para el cambio entre los distintos ciclos del fago, rep: regin de replicacin, con el origen de replicacin y los genes O y P, lisis: JHQHV TXH SRVLELOLWDQ OD OLVLV FHOXODU E &URPRVRPD DUWLFLDO GH OHYDGXUD <$&  $56 RULJHQ GH UHSOLFDFLyQ &(1 FHQWUyPHUR 7(/ WHOyPHURV 85$ JHQ PDUFDGRU VHOHFFLRQDEOH SDUD HO GHVDUUROOR HQ PHGLR FRQ XUDFLOR $PS JHQ PDUFDGRU VHOHFFLRQDEOH HQ PHGLR FRQ DPSLFLOLQD (O $'1 HV FORQDGR HQ HO VLWLR BamHI. C) &URPRVRPD DUWLFLDO GH EDFWHULDV %$&  'HULYD GHO IDFWRU EDFWHULDQR ) 6X HVTXHOHWR FRQWLHQH UHJLRQHV esenciales que le otorgan estabilidad y bajo nmero de copias en cada bacteria, parA, parB y parC. oriS: origen de replicacin unidireccional. CMr: gen marcador seleccionable en medio con cloranfenicol, repE: JHQ GH SURWHtQD DXWRUHJXODWRULD HVHQFLDO SDUD OD UHSOLFDFLyQ GHVGH oriS S%HOR%$& HO YHFWRU %$& PDV utilizado, tiene tres sitios nicos de clonado, HindIII, BamHI y SphI dentro del gen marcador lacZ.

habitual. El marcador seleccionable suele ser XQ JHQ GH WLSR VLOYHVWUH TXH OH FRQHUH OD FDSDFLGDG SURWRWUyFD D OD FpOXOD KRVSHGDGRUD (O PDV FRP~QPHQWH XWLOL]DGR HV 85$ TXH FRQHUH D ODV DX[yWURIRV 85$ OD FDSDFLGDG de desarrollarse en un medio de cultivo sin uraFLOR 'XUDQWH OD PHLRVLV ORV <$&V VH DSDUHDQ FRQ FXDOTXLHU <$& KRPyORJR SUHVHQWH UHVXOtando en una alta frecuencia de recombinacin entre los fragmentos clonados. Esta alta frecuencia de quimerismo lleva a predicciones LQH[DFWDV HQ ORV PDSDV ItVLFRV PROHFXODUHV \

junto con la falta de familiaridad en el manejo de levaduras entre bilogos moleculares, limiWDURQ HO XVR GH ORV <$&V 3DUD VXSHUDU HVWDV GLFXOWDGHV IXHURQ GHVDUUROODGRV ORV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV %$&V FRQVWLtuyen un sistema de clonacin que mantiene un bajo nmero de copias en cada bacteria, JDUDQWL]DQGR XQD UHFRPELQDFLyQ PtQLPD HQWUH GLIHUHQWHV IUDJPHQWRV GH $'1 \ VRQ GH VHQFLOOD manipulacin. Los BACs se basan en el plsmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300 kb aunque el promedio es de 100

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kb (Fig. 3c). Contienen como elementos esenciales una copia del origen de replicacin de E. coli, un marcador de seleccin que suele ser un gen de resistencia a antibiticos y un sistePD GH UHFRPELQDFLyQ VLWLRHVSHFLFR FUHOR[  cuyo rol consiste en forzar la circularizacin de JUDQGHV LQVHUWRV /RV FURPRVRPDV DUWLFLDOHV derivados del fago P1 (PACs) permiten la cloQDFLyQ GH IUDJPHQWRV GH  .SE \ DO LJXDO TXH ORV %$&V SUHVHQWDQ EDMR JUDGR GH TXLmerismo. El fago P1 se replica primero como plsmido de bajo nmero de copias y luego FRPR XQ ODUJR VHJPHQWR GH $'1 FRPSXHVWR por mltiples copias de la secuencia repetida (concatemero), que es empaquetado en la cabeza del fago por un mecanismo similar al del fago lambda. Las propiedades de los clones 3$& SHUPLWHQ OD LQLFLDFLyQ GH HPSDTXHWDPLHQto en las etapas de clonacin, escisin de las secuencias de alto nmero de copias despus de la infeccin bacteriana y la induccin de la UHSOLFDFLyQ LQPHGLDWDPHQWH DQWHV OD DPSOLFDFLyQ GHO $'1 8WLOL]DQ DO LJXDO TXH ORV %$&V HO sistema cre-lox. Introduccin del vector en la clula hospedadora En el caso de la utilizacin de sistemas bacterianos, la introduccin del vector en la clula hospedadora se realiza valindose de los mecanismos naturales de la gentica microbiana dado que en los procariotas existen mecanismos de intercambio gentico, que permiten tanto la transferencia de genes como la recombinacin del inserto, a travs de uno de los siguientes procesos genticos: Transformacin: es un proceso por cual HO $'1 OLEUH GHO PHGLR DPELHQWH VH LQFRUSRUD en una clula receptora, trayendo aparejado XQ FDPELR JHQpWLFR 8QD FDGHQD GH HVWH $'1 libre, llamado donador, es captada y puede transformar genticamente la clula receptora por recombinacin con una regin homloga del cromosoma. El movimiento de las molcuODV GH $'1 D WUDYpV GH OD PHPEUDQD \ GHQtro del citoplasma de la clula receptora es un SURFHVR DFWLYR TXH UHTXLHUH HQHUJtD /DV Fplulas que son capaces de tomar una molcu-

OD GH $'1 \ VHU WUDQVIRUPDGDV VH GHQRPLQDQ competentes. Estas clulas secretan el factor GH FRPSHWHQFLD TXH HV XQD SHTXHxD SURWHtQD TXH LQGXFH OD VtQWHVLV GH RWUDV  D  QXHYDV SURWHtQDV UHTXHULGDV SDUD OD WUDQVIRUPDFLyQ La transformacin es un proceso que ocurre slo en algunas especies bacterianas. Transduccin VH UHHUH D OD WUDQVIHUHQFLD GHO $'1 GH XQD FpOXOD D RWUD SRU PHGLR GH un fago, denominacin utilizada para los virus cuando se trata de hospedadores bacterianos. Esta transferencia de genes puede ocurrir de dos maneras: a) transduccin generalizada: una fracFLyQ GHO $'1 FHOXODU TXH SXHGH SURFHGHU GHO cromosoma o del plsmido del hospedador, durante el ensamblaje del virus pasa a formar SDUWH GHO $'1 GH OD SDUWtFXOD YtULFD PDGXUD UHemplazado el genoma del fago. Una vez que son liberados, estos fagos anormales pueden SHJDUVH D RWUDV FpOXODV \ GRQDU $'1 SHUR QR dan lugar a lisogenia ni a lisis dado que no pueden replicarse independientemente por carecer GH JUDQ SDUWH GHO $'1 IiJLFR 6L ORV JHQHV GHO donador no sufren recombinacin homloga con el cromosoma de la bacteria de la clula receptora se perdern. b) transduccin especializada (restringida): ocurre slo en algunos virus atemperados, es decir, aquellos que se integran en el genoma como parte de su ciclo biolgico. En HVWH PHFDQLVPR HO $'1 GH XQD UHJLyQ HVSHFtFD GHO FURPRVRPD GHO KRVSHGDGRU VH LQWHJUD directamente en el genoma del fago, reemplazando algunos de sus genes. El genoma fgico recombinante puede empaquetarse seguidamente en una cabeza de fago y el resto del fago puede ensamblarse normalmente. Este fago puede carecer de la capacidad de repliFDU QR REVWDQWH SXHGH LQ\HFWDU VX $'1 TXH contiene adems algunos genes de la clula receptora a una nueva clula receptora. Puede tambin ocurrir recombinacin homloga, VLQ HPEDUJR FRPR HO $'1 GRQDGRU EDFWHULDno est formando parte del genoma de un fago atemperado se presentan dos posibilidades: TXH HO $'1 VH LQWHJUH HQ HO FURPRVRPD GHO hospedador durante la lisogenizacin, o que el $'1 VH UHSOLTXH HQ HO UHFHSWRU FRPR SDUWH GH

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XQD LQIHFFLyQ OtWLFD (Q DPERV FDVRV OD SDUWtFXOD YtULFD WUDQVGXFWRUD HV QRUPDOPHQWH GHIHFWLYD FRPR YLUXV \D TXH ORV JHQHV YtULFRV KDQ sido reemplazados. Si bien no todos los fagos tienen la capacidad de transducir, ni todas las bacterias son transducibles, el fenmeno est OR VXFLHQWHPHQWH H[WHQGLGR FRPR SDUD DVXmir que desempea un importante papel en las transferencias genticas que se producen en la naturaleza. Conjugacin: mecanismo de transferencia gentica mediada por un plsmido que requiere contacto de clula a clula. Ciertos plsmidos y WUDQVSRVRQHV FRQMXJDWLYRV FRQHUHQ D VXV Fplulas hospedadoras la capacidad de transferir $'1 D RWUDV FpOXODV SRU FRQMXJDFLyQ /D FRQMXgacin requiere una clula donadora, que contiene un tipo particular de plsmido conjugativo, y una clula receptora que carece de l. El proFHVR GH FRQMXJDFLyQ SUHVHQWD FDUDFWHUtVWLFDV diferenciales segn se trate de bacterias Gram positivas o Gram negativas. En el primer caso, las clulas receptoras secretan un pptido de pequeo tamao que provoca que la clula donadora sintetice un componente adhesivo en la VXSHUFLH FHOXODU (O $'1 SODVPtGLFR HV SRVteriormente transferido desde el donador a la clula receptora adherida. Estos cruzamientos SXHGHQ WHQHU OXJDU HQ PHGLRV OtTXLGRV (Q HO VHJXQGR FDVR HO SOiVPLGR FRGLFD HQWUH RWUDV SURWHtQDV ODV VXEXQLGDGHV GH OD SURWHtQD GHO pelo sexual, mediante el cual se realiza el contacto. El pelo constituye un puente de conjugaFLyQ D WUDYpV GHO FXDO SDVD HO $'1 SHUPLWLHQGR HO DSDUHDPLHQWR HVSHFtFR 'XUDQWH OD FRQMXgacin, pueden resultar movilizados otros elementos genticos, como grandes bloques del cromosoma del hospedador u otros plsmidos. Transposicin conjugativa: es una conjugacin independiente del plsmido, un tipo de conjugacin facilitada por un transposn conjugativo, que pueden encontrarse tanto en el cromosoma como en los plsmidos. El contacto entre las bacterias donadora y receptora induce la escisin del transposn en el donador: en cada extremo del transposn (integrado), se producen un par de cortes alternos de modo que al escindirse una de las cadenas en

cada extremo del transposn porta con ella (generalmente) seis nucletidos de la molcula hospedadora. (Estas secuencias terminales de simple cadena se denominan secuencias acoplantes). El transposn escindido se circulariza entonces como resultado del apareamiento de entre las secuencias acoplantes. Parece proEDEOH TXH VyOR VH WUDQVHUD XQD VLPSOH FDGHQD al receptor, y que la cadena complementaria se sintetice, en el receptor, antes de la insercin. Las estrategias de introduccin de vectores en clulas hospedadoras utilizadas en las tcnicas in vitro del ADN recombinante, han sido GHVDUUROODGDV HQ EDVH D PRGLFDFLRQHV GH HVtos procesos naturales de transferencia de material gentico en procariotas. 2. ENZIMAS UTILIZADAS EN LA GENERACIN DE ADN RECOMBINANTE El requisito primordial para la clonacin GH XQ JHQ R VHJPHQWR GH $'1 GH LQWHUpV HV poder contar con dicho fragmento en forma individual, aislado desde su entorno gnico. 3DUD HOOR OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQte cuenta con una herramienta indispensable, las endonucleasas de restriccin. Estas HQ]LPDV UHFRQRFHQ VHFXHQFLDV HVSHFtFDV GH $'1 GH  D  EDVHV GH H[WHQVLyQ \ HVcinden los enlaces fosfodister del material gentico en dichos sitios, denominados sitios de restriccin. Para actuar como sustrato de HVWDV HQ]LPDV HO $'1 GHEH KDOODUVH FRPR doble hebra. 6RQ H[WUDtGDV GH RUJDQLVPRV SURFDULyWLcos, donde actan como un mecanismo de defensa para degradar material gentico extrao que entra en la clula, proveniente principalmente de fagos. Para diferenciar el $'1 SURSLR GHO H[WUDxR ODV EDFWHULDV WLHQHQ OD FDSDFLGDG GH PHWLODU VX SURSLR $'1 LQPHdiatamente despus de la replicacin, hacindolo de este modo irreconocible por las endonucleasas. Las endonucleasas se nombran en relacin a las bacterias de las que fueron aisladas por primera vez, considerando que la primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta OHWUD LQGLFD OD FHSD \ XQ Q~PHUR DO QDO LQGLFD HO RUGHQ HQ TXH IXH LGHQWLFDGD OD HQ]LPD en esa cepa. Segn este criterio, la enzima EcoRI, representa a la primer endonucleasa

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Figura 4. &RUWH GHO $'1 SRU HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ 5HFRQRFLPLHQWR \ HVFLVLyQ GH secuencias palindrmicas originando: a) extremos cohesivos o b) extremos romos. En este caso puede utilizarse la enzima transferasa terminal para la incorporacin de extremos cohesivos. c) reconocimiento y corte de secuencias QR SDOLQGUyPLFDV /DV HFKDV LQGLFDQ ORV VLWLRV GH FRUWH PLHQWUDV TXH ODV VHFXHQFLDV UHFRQRFLGDV VH VHalan en negrita.

aislada en el gnero Escherichia, especie coli, cepa RV 13. Se utiliza el trmino isoquizmeros para las enzimas que reconocen la PLVPD VHFXHQFLD GH $'1 SHUR KDQ VLGR REtenidas de diferentes especies de bacterias. Pueden diferenciarse tres tipos de enzimas de restriccin. Las de tipo I y III escinden en sitios alejados de la secuencia de reFRQRFLPLHQWR UHTXLULHQGR GH $73 SDUD UHDOLzar el traslado del sitio de reconocimiento al de accin y tienen actividad de restriccin y metilacin simultneamente. En cambio, las de tipo II cortan en el sitio de reconocimiento, tienen actividad de restriccin exclusivamente y reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Estas ltimas son las utilizaGDV SDUD HO FORQDGR GH $'1 DXQTXH WLHQHQ otras aplicaciones como las construccin de mapas de restriccin de un plsmido o bacWHULyIDJR IUDJPHQWDFLyQ GHO $'1 JHQyPLFR para su separacin por electroforesis con aplicacin en tcnicas como Southern Blot R QJHUSULQWLQJ R OD JHQHUDFLyQ GH IUDJPHQtos para ser usados como sondas.

Las escisiones realizadas por las endonucleasas de tipo II, pueden resultar en extremos romos o cohesivos. En el primer caso, se producen cortes escalonados que crean colas cortas de cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. Estas colas tienden a asociarse con una cadena complementaria por apareamiento de bases (Fig. 4a), a secuencias complementarias de otro fragmento con colas generadas por la misma enzima. Cuando se generan extremos romos, el $'1 HV FOLYDGR HQ HO FHQWUR GH OD VHFXHQcia de reconocimiento, en el mismo punto en ambas cadenas, no quedando bases desapareadas en los extremos por lo que no presentan tendencia a unirse con otros fragmentos por complementariedad (Fig. 4b). $XQTXH SRU VX HVSHFLFDG \ YHUVDWLOLGDG las endonucleasas de restriccin son las enzimas las mas renombradas, la tecnoORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH QR VHUtD IDFtible sin la participacin en el proceso de otras enzimas de roles diversos (Tabla 1).

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Enzima Endonucleasas de tipo II Ligasa de ADN

Accin

Aplicacin

Clivaje sitio -especifico del ADN Generacin de fragmentos de ADN Unin de dos fragmentos de ADN con extremos romos, en presencia de ATP. Forma enlaces covalentes entre el extremo 5 de una cadena polinucleotdica y el extremo 3 de otra cadena Construccin de bibliotecas de cDNA. Amplificacin por PCR Permite ligado con otro polinucletido o incorporacin de fosfato marcado. Genera extremos cohesivos oligo dT u oligo dA

Transcriptasa reversa Polinucleotido kinasa

Sntesis de una hebra de ADNc utilizando como molde ARN. Incorporacin de un grupo fosfato al e xtremo 5de un polinucletido. Adicin de colas homopolimricas al extremo 3OH de ADN doble hebra lineal Remocin de nucletidos del extremo 3 de un ADN doble hebra. Remocin de nucletidos del extremo 5 de ADN doble hebra. Remocin de fosfatos terminales de extremos 5 Fragmento de una enzima ADN polimerasa, con actividad DNA polimerasa y exonucleasa en direccin 3'?5'.

Transferasa Terminal

Exonucleasa III

Expone los extremos 5.

Exonucleasa del fago l

Expone los extremos 3.

Fosfatasa alcalina

Fragmento klenow

Impide autoligado de vectores. Permite la incorporacin de fosfato 5 marcado. Genera extremos romos desde el ext remo 3, por sntesis complementaria o clivaje de nucletidos desapareados.

Tabla 1. $OJXQDV HQ]LPDV XWLOL]DGDV HQ OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH

3. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ADN: ELECTROFORESIS EN GEL La electroforesis es una tcnica que permite la separacin de molculas en funcin de su diferente movilidad en un campo elctrico, siendo el parmetro esencial su diferencia en carga elctrica. Sin embargo, determinados soportes como los geles de agarosa o poliacrilamida, ofrecen una resistencia notable al avance de ODV PROpFXODV $XQTXH HO SDUiPHWUR TXH ULJH el avance es la relacin carga/masa, como en los cidos nucleicos la carga elctrica es proporcional a la longitud en nucletidos, la relacin carga/masa es la misma para todas las molculas. Como resultado, el efecto de retardo del gel depende del tamao molecular por lo que la electroforesis separa los fragmentos de cido nucleico segn su tamao o longitud. La agarosa es un polisacrido, cuyas disolu-

ciones (0,5 - 2%) forman un gel semislido al enfriarse, constituido por una matriz o trama triGLPHQVLRQDO GH EUDV SROLPpULFDV TXH UHWDUGD el paso de las molculas de cido nucleico a su travs, en funcin de su tamao. Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de acrilamida y bis-acrilamida, catalizada por el agente oxidante persulfato de amonio y la amina terciaria TEMED como agente reductor. La variacin de la concentracin de acrilamida SRVLELOLWD OD PRGLFDFLyQ FRQWURODGD HO WDPDxR del poro. Estos geles presentan menor rango de separacin que los geles de agarosa, pero mayor poder de resolucin, pudiendo discrimiQDU IUDJPHQWRV GH $'1 FRQ GLIHUHQFLD GH WDmao de slo una base. Se usan adems para OD VHSDUDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH SURWHtQDV Para establecer el tamao de fragmentos separados se utilizan marcadores moleculares, que consisten en una mezcla de fragmentos de

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$'1 GH WDPDxR FRQRFLGR D SDUWLU GH ORV TXH se puede inferir el tamao de la muestra analizada. Se establece una curva de calibrado en OD TXH VH FRQVLJXH OD OLQHDOLGDG JUDFDQGR HO tamao en funcin de la inversa de la movilidad o el logaritmo del tamao respecto de la movilidad. Dentro de las aplicaciones ms comunes de OD HOHFWURIRUHVLV HQ JHO HQ ELRORJtD PROHFXODU SRGHPRV PHQFLRQDU FKHTXHR GH OD DPSOLFDFLyQ GH IUDJPHQWRV GH 3&5 LGHQWLFDFLyQ GH SROLPRUVPRV \ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV PHdiante el establecimiento de sus patrones de restriccin. 4. HIBRIDACIN. ANLISIS MOLECULAR DE ADN, ARN Y PROTENAS /D KLEULGDFLyQ HV OD FRQVWUXFFLyQ DUWLFLDO GH un cido nucleico bicatenario por apareamiento (emparejamiento) de bases complementarias de dos cidos nucleicos monocatenarios. 3DUD TXH H[LVWD OD IRUPDFLyQ GH KtEULGRV HVWDbles debe haber un alto grado de complemenWDULGDG 6H GHQH IRUPDOPHQWH FRPR VRQGD SUREH D XQ IUDJPHQWR GHWHUPLQDGR GH $51 R $'1 PDUFDGR TXtPLFD R UDGLRDFWLYDPHQWH utilizado para localizar determinadas secuencias de cidos nucleicos mediante hibridacin. A) Anlisis de ADN por hibridaciones Southern Blot Los procedimientos utilizados, para separar iFLGRV QXFOHLFRV \ SURWHtQDV VH ULJHQ SRU HO mismo principio, pero involucran algunas difeUHQFLDV GH WpFQLFDV GHELGDV D ODV FDUDFWHUtVWLcas particulares de cada clase de molculas. En 1975, E. M. Southern, public un nuevo procedimiento que permiti a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias de $'1 VREUH IUDJPHQWRV GH UHVWULFFLyQ VHSDUDdos por electroforesis en gel. La principal caUDFWHUtVWLFD GH HVWD WpFQLFD HV OD WUDQVIHUHQFLD GH ODV PROpFXODV GH $'1 TXH KDQ VLGR GLJHULdas por endonucleasas de restriccin y separadas por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se GHQRPLQD 6RXWKHUQ %ORW HQ KRQRU DO FLHQWtco que desarroll la tcnica (Fig. 5). Para reaOL]DUOD HO $'1 HV GHVQDWXUDOL]DGR DELHUWR HQ

Figura 5. Mtodo de hibridacin de Southern. a) EsFLVLyQ HQ]LPiWLFD R PHFiQLFD GHO $'1 E LQFOXVLyQ GHO $'1 HQ HO JHO GH DJDURVD \ FRUULGD HOHFWURIRUpWLFD F WUDQVIHUHQFLD GH ODV PROpFXODV GH $'1 GHVGH HO JHO GH DJDURVD KDFLD XQ OWUR GH QLWURFHOXORVD SRU FDSLODULGDG SUHYLD GHVQDWXUDOL]DFLyQ GHO $'1 d) hibridacin con la sonda monohebra, seguida de ODYDGRV \ GHWHFFLyQ SRU DXWRUUDGLRJUDItD

sus dos cadenas), ya sea antes o durante la transferencia, mediante tratamiento alcalino. 8QD YH] FRPSOHWDGD OD WUDQVIHUHQFLD HO $'1 es inmovilizado sobre la membrana por exposicin a elevada temperatura o a radiacin UV. 8QD VRQGD GH $'1 FRQWHQLHQGR OD VHFXHQFLD GH LQWHUpV HV HQWRQFHV LQFXEDGD FRQ HO $'1 inmovilizado. La sonda slo va a hibridar con PROpFXODV GH $'1 TXH FRQWLHQHQ OD VHFXHQFLD

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de nucletidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada se elimina mediante repetidos lavados de la membrana. Las sondas pueden marcarse por diferentes mtodos: con elementos radioactivos, o compuestos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la hibridacin, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al mtodo con el que haya sido marcada. B) Anlisis de ARN por transferencia e hibridacin: Northern Blot De manera similar al tratamiento realizado FRQ ODV PROpFXODV GH $'1 ODV PROpFXODV GH $51 WDPELpQ SXHGHQ VHU VHSDUDGDV SRU HOHFtroforesis en geles de agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de $51 VH GHQRPLQD 1RUWKHUQ EORW HQ UHFRQRFLmiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la tcnica Southern blot. $PERV SURFHGLPLHQWRV VRQ HVHQFLDOPHQte idnticos. Sin embargo, las molculas de $51 VRQ PX\ VHQVLEOHV D OD GHJUDGDFLyQ SRU HQ]LPDV $51DVDV 3RU OR WDQWR VH GHEH WHQHU mucha precaucin para evitar la contaminacin GH ORV PDWHULDOHV FRQ HVWDV HQ]LPDV $GHPiV OD PD\RUtD GH ODV PROpFXODV GH $51 FRQWLHQHQ estructuras secundarias (producidas por apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas en base a su tamao. La desnaturalizacin VH SURYRFD LQFRUSRUDQGR IRUPDOGHKtGR X RWUR TXtPLFR GHVQDWXUDOL]DQWH D OD VROXFLyQ WDPSyQ (buffer) utilizada en la electroforesis. Despus de la transferencia a la membrana apropiada, ODV PROpFXODV GH $51 SXHGHQ KLEULGDU FRQ VRQGDV GH $'1 R $51 C) Anlisis de protenas por transferencia e inmunodeteccin o Western Blot La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta muy importante para la sepaUDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH SURWHtQDV 'HELGR D TXH PXFKDV GH ODV SURWHtQDV HVWiQ FRPSXHVtas por dos o ms subunidades, las cadenas SROLSHSWtGLFDV LQGLYLGXDOHV VRQ VHSDUDGDV SRU electroforesis en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que acta como

DJHQWH GHVQDWXUDOL]DQWH GH ODV SURWHtQDV /RV polipptidos separados por electroforesis tambin pueden ser transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados XWLOL]DQGR DQWLFXHUSRV HVSHFtFRV (VWD WUDQVIHUHQFLD GH SURWHtQDV VH GHQRPLQD :HVWHUQ blotting y se realiza utilizando una corriente HOpFWULFD SDUD WUDVODGDU ODV SURWHtQDV GHVGH HO JHO D OD VXSHUFLH GH OD PHPEUDQD 'HVSXpV GH OD WUDQVIHUHQFLD OD SURWHtQD GH LQWHUpV HV LGHQWLFDGD PHGLDQWH OD XQLyQ D XQ DQWLFXHUSR HVSHFtFR TXH HVWi FRQMXJDGR PDUFDGR \D sea con istopos radioactivos, que permiten la GHWHFFLyQ SRU DXWRUDGLRJUDItD R FRQ HQ]LPDV que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente. 5. AMPLIFICACION DEL ADN: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) /D 3&5 FRQVWLWX\H XQD WHFQRORJtD SRGHURVD TXH LQYROXFUD OD VtQWHVLV HQ]LPiWLFD in vitro de PLOORQHV GH FRSLDV GH XQ VHJPHQWR HVSHFtFR GH $'1 /D UHDFFLyQ VH EDVD HQ OD KLEULGDFLyQ de un par de oligonucletidos, diseados en base a la secuencia de inters y sintetizados DUWLFLDOPHQWH D OD VHFXHQFLD GH $'1 )LJ   Estos oligonucletidos funcionan como iniciadores o cebadores (primers) que delimitan la VHFXHQFLD D VHU DPSOLFDGD /D SULPHUD HWDSD de la reaccin involucra la desnaturalizacin GHO $'1 GH GREOH FDGHQD SRU HOHYDFLyQ GH la temperatura a 92-95C. Posteriormente comienzan los ciclos de PCR, que comprenden: desnaturalizacin de la doble cadena, unin SRU FRPSOHPHQWDULHGDG GHO FHEDGRU DO $'1 GH VLPSOH KHEUD \ UHSOLFDFLyQ GHO $'1 D SDUtir del cebador, catalizada por la enzima Taq polimerasa. La temperatura de unin de los FHEDGRUHV DO $'1 GH FDGHQD VLPSOH GHSHQGH de la secuencia y tamao del oligonucletido, DVt FRPR GH OD HVWUDWHJLD HVSHFLFD GH WUDEDMR comprendindose en trminos generales entre ORV & /D IDVH GH VtQWHVLV GH $'1 FRPplementario se lleva a cabo a la temperatura ptima para que la Taq polimerasa realice la replicacin a partir de cada extremo 3 de los FHEDGRUHV 6H WUDWD GH XQD $'1 SROLPHUDVD termo-resistente aislada de Thermus aquaticus, bacteria que vive en fuentes termales.

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Figura 6. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). a) Representacin de una reaccin de PCR de tres FLFORV (Q FDGD FLFOR VH VXFHGHQ WUHV HWDSDV L GHVQDWXUDOL]DFLyQ SRU FDORU GHO $'1 & SDUD VHSDUDU las hebras, ii- unin por complementariedad de los cebadores a las monohebras (en este ejemplo 55C), LLL UHDFFLyQ GH SROLPHUL]DFLyQ GH SRU OD HQ]LPD 7$4 SROLPHUDVD GDQGR OD KHEUD FRPSOHPHQWDULD DO PROGH GH $'1 &  E &RPSRUWDPLHQWR GH XQD IUDJPHQWR GH $'1 EODQFR GH ORV FHEDGRUHV D WUDYpV GH ORV PHQFLRQDGRV FLFORV GH 3&5 (Q FDGD FLFOR VH LQFUHPHQWD OD FDQWLGDG GH $'1 EODQFR VLJXLHQGR OD UHODFLRQ 2n, donde n es el nmero de ciclos. En el ejemplo, con tres ciclos de PCR, se obtienen 23 FRSLDV F 9HULcacin de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En la calle de la izquierda se muestra el marcador de peso molecular. En la primera calle, se observan dos fragmentos de 700 y 650 pares de bases (bp), respectivamente, sugiriendo que el cebador ha encontrado complementariedad en ms de un sitio en el genoma. Las calles 2 y 3 presentan banda nica de 700 y 550 bp aaproximadamente en cada caso.

Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada polimerizacin sirve como molde para el siguiente, en cada ciclo se duplica la cantidad de producto sintetizado. Es necesario tener en cuenta que, DGHPiV GH OD HQ]LPD ORV FHEDGRUHV \ HO $'1 GH LQWHUpV SDUD TXH VH SURGX]FD OD DPSOLFDcin es necesaria la presencia de un medio tamponado y desoxinucletidos (dNTPs) y cloruro de magnesio que acta como cofactor de la enzima. El resultado de la reaccin es un IUDJPHQWR GH $'1 GH GREOH FDGHQD FX\RV H[tremos corresponden a los extremos 5 de los cebadores y su tamao a la distancia entre los PLVPRV $ SHVDU GH TXH VH IRUPDQ PROpFXODV ms largas a partir del molde original en cada ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no FRQWULEX\HQ VLJQLFDWLYDPHQWH D OD PDVD QDO de secuencia blanco.

Despus de apenas 20 ciclos se logra ms de un milln de veces la cantidad inicial de la VHFXHQFLD GH LQWHUpV (VWD HVFDOD GH DPSOLcacin permite, por lo tanto, iniciar el proceso FRQ FDQWLGDGHV PtQLPDV GH $'1 GHO RUGHQ GH pico o nanogramos) y terminar la reaccin con grandes cantidades de una secuencia de inters. La versatilidad de esta reaccin es enorme y la combinacin de la PCR y la secuenciacin constituye una poderosa herramienta para el anlisis de genes. Como hemos mencionado, la tcnica de 3&5 HV GH VXPD XWLOLGDG SDUD DPSOLFDU $'1 a partir de fragmentos clonados en distintos vectores, donde los cebadores son complePHQWDULRV D ORV VLWLRV GHO YHFWRU TXH DQTXHDQ el fragmento inserto. La versatilidad de la PCR LQFOX\H OD DPSOLFDFLyQ D SDUWLU GH $'1 GH PDWHULDO HPEHELGR HQ SDUDQD SRU YDULRV DxRV

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de material PRPLFDGR GH UHVWRV IyVLOHV HWF Dentro de los usos mas frecuentes, podemos mencionar la deteccin de enfermedades genticas, determinacin del sexo en embriones humanos, clonacin de genes, mutagnesis in vitro y mapeo y secuenciacin de genomas. A) RT-PCR Se trata de una reaccin de PCR, secundaria D OD WUDQVFULSFLyQ UHYHUVD GHO $51P FDWDOL]DGD por la enzima transcriptasa reversa (RT). Esta HQ]LPD HV FDSD] GH VLQWHWL]DU $'1 XWLOL]DQGR $51 FRPR PROGH \ IRUPD SDUWH GH OD EDWHUtD HQ]LPiWLFD GH ORV UHWURYLUXV YLUXV GH $51 TXH UHTXLHUHQ OD VtQWHVLV GH $'1 SDUD VHU LQWHJUDGRV en el genoma del hospedador. El esquema general de la RT-PCR consiste en un primer paso GH VtQWHVLV GH $'1 FRPSOHPHQWDULR $'1F GH FDGHQD VLPSOH WRPDQGR FRPR PROGH HO $51 (Q HVWD HWDSD OODPDGD VtQWHVLV GH OD SULPHUD KHEUD UVW VWUDQG V\QWKHVLV VH XWLOL]DQ FHEDGRUHV TXH SXHGHQ VHU HVSHFtFRV SDUD HO JHQ GH LQWHUpV hexmeros de secuencia al azar u oligodT, seJ~Q VH EXVTXH VLQWHWL]DU VyOR HO $'1F HVSHFtFR R ORV $'1F FRUUHVSRQGLHQWHV D WRGRV ORV $51V del tejido en cuestin. Por lo tanto, mientras que HO XVR GH SULPHUV HVSHFtFRV DXPHQWD OD HVSHFLFLGDG ORV RWURV GRV WLSRV GH FHEDGRUHV PD[LPL]DQ HO Q~PHUR GH PROpFXODV GH $51P TXH pueden ser analizadas en una muestra pequexD GH $51 (O XVR GH KH[iPHURV DO D]DU SXHGH ocasionar distorsiones por exceso en el nmero GH FRSLDV GH XQ GHWHUPLQDGR $51P FRPSDUDGR FRQ ORV FHEDGRUHV HVSHFtFRV /D VHJXQGD etapa consiste en subsecuentes ciclos de PCR FRQ ORV FHEDGRUHV HVSHFtFRV SDUD OD VHFXHQcia de inters, lo que permite obtener cantidaGHV DSURSLDGDV GHO $'1 SDUD GLYHUVDV PDQLpulaciones genticas. Esta estrategia conjunta de retrotranscripcin y PCR puede ser utilizada SDUD HO HVWXGLR GH $51P D QLYHO GH XQD FpOXOD individual. Los principales alcances de esta tcnica incluyen la determinacin de la presencia o ausencia de un transcripto, estimacin del nivel GH H[SUHVLyQ \ SDUD HO FORQDGR GH $'1F VLQ OD construccin de una genoteca. La tcnica de PCR por transcriptasa reversa es denominada como RT-PCR, la cual desafortunadamente, puede ser confundida con la PCR de Tiempo Real, ya que ambas tienen la misma

VLJOD 57 3&5  'H OR H[SXHVWR HV REYLR OD QHFHVLGDG GH VHU HVSHFtFRV HQ ODV GHQRPLQDFLRnes, sobre todo cuando se combinan ambas tcnicas: Real Time de RT PCR B) PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiempo real (RT-PCR). Una variante de la PCR convencional que se EDVD HQ OD GHWHFFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ VLPXOWiQHD GH OD XRUHVFHQFLD HPLWLGD SRU ORV SURGXFWRV GH PCR que se acumulan durante el proceso de DPSOLFDFLyQ /D 3&5 FXDQWLWDWLYD RIUHFH OD SRsibilidad de detectar, en tiempo real, el nivel de DPSOLFDFLyQ GH XQD VHFXHQFLD GH LQWHUpV FRQ el objeto de estimar la cantidad de esa secuencia presente en la muestra original. En la PCR a WLHPSR UHDO ORV SURFHVRV GH DPSOLFDFLyQ \ GHteccin se producen en el mismo vial cerrado, sin QHFHVLGDG GH QLQJXQD DFFLyQ SRVWHULRU $GHPiV PHGLDQWH GHWHFFLyQ SRU XRUHVFHQFLD VH SXHGH PHGLU GXUDQWH OD DPSOLFDFLyQ OD FDQWLGDG GH $'1 VLQWHWL]DGR HQ FDGD PRPHQWR \D TXH OD HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD SURGXFLGD HQ OD UHDFFLyQ HV SURSRUFLRQDO D OD FDQWLGDG GH $'1 IRUPDdo. Esto permite conocer y registrar en todo moPHQWR OD FLQpWLFD GH OD UHDFFLyQ GH DPSOLFDFLyQ Los termocicladores para llevar a cabo la PCR D WLHPSR UHDO LQFRUSRUDQ XQ OHFWRU GH XRUHVFHQcia y estn diseados para poder medir, en cualTXLHU PRPHQWR OD XRUHVFHQFLD HPLWLGD HQ FDGD XQR GH ORV YLDOHV GRQGH VH UHDOLFH OD DPSOLFDFLyQ /RV VLVWHPDV GH GHWHFFLyQ SRU XRUHVFHQcia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas HVSHFtFDV PDUFDGDV /RV DJHQWHV LQWHUFDODQWHV VRQ XRURFURPRV FX\D HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD DXPHQWD QRWDEOHPHQWH FXDQGR VH XQHQ D $'1 de doble hlice. El ms empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I. El incremento GH $'1 HQ FDGD FLFOR VH UHHMD HQ XQ DXPHQWR SURSRUFLRQDO GH OD XRUHVFHQFLD HPLWLGD (VWH sistema de deteccin es de fcil implementacin \ PDV HFRQyPLFR TXH HO XVR GH VRQGDV HVSHFtFDV 6LQ HPEDUJR SUHVHQWD EDMD HVSHFLFLGDG (O ULHVJR GH DPSOLFDFLRQHV LQHVSHFtFDV SXHde disminuirse iniciando la reaccin de PCR a temperaturas elevadas (hot-start PCR). Pueden utilizarse polimerasas recombinantes que funcionan despus de ser activadas por temperatura o polimerasas unidas a anticuerpos que mantie-

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nen bloqueado el centro activo de la enzima hasWD TXH VRQ GHVQDWXUDOL]DGRV SRU FDORU $GHPiV OD PD\RUtD GH ORV HTXLSRV GH 573&5 WLHQHQ OD posibilidad de determinar el Tm de los fragmenWRV DPSOLFDGRV TXH GHSHQGH GH VX ORQJLWXG \ de la composicin de sus bases, resultando caUDFWHUtVWLFR GH FDGD IUDJPHQWR /DV VRQGDV GH VHFXHQFLD HVSHFtFD HVWiQ PDUFDGDV FRQ GRV WLSRV GH XRURFURPRV XQ GRQDGRU \ XQ DFHSWRU Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis, denominadas tambin sondas TaqMan que conWLHQHQ XQ XRURFURPR GH H[WLQFLyQ GH XRUHVcencia (Q, quencher) unido en el extremo 3 y otro reportero (R) en el extremo 5. Cuando se produce la extensin de la cadena de la sonda por accin de la Taq polimerasa, como resultado del clivaje del extintor por su actividad de exoQXFOHDVD HV HPLWLGD OD XRUHVFHQFLD /D XRUHVcencia detectada durante cada ciclo de la PCR VHUi SURSRUFLRQDO D OD FDQWLGDG GH $'1 TXH VH HVWi DPSOLFDQGR /D FRQDELOLGDG GH ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV mediante esta tcnica requiere de la realizacin en paralelo una curva patrn en las mismas conGLFLRQHV SDUD FRQRFHU OD FDQWLGDG WRWDO GH $'1 TXH VH HVWi DPSOLFDQGR Ente las principales aplicaciones de PCR en tiempo real, podemos mencionar: $PSOLFDFLyQ \ GHWHFFLyQ GH $'1 R $51 HVSHFtFR HQ XQD PXHVWUD Los blancos de deteccin pueden estar asociados a la presencia de agentes patgenos, resultando una herraPLHQWD GH H[WUHPD XWLOLGDG SDUD QHV GH GLDJQyVWLFR FOtQLFR (Q HO FDVR GHO $51P GHEH VHU SUHYLDPHQWH UHWURWUDQVFULSWR D F'1$ PHGLDQWH una transcriptasa reversa que posee actividad HQGR + HV GHFLU UHPXHYH HO $51P SHUPLWLHQGR TXH VH IRUPH OD VHJXQGD KHEUD GH $'1 7DPbin puede aplicarse al estudio de las variantes de splicing (corte y empalme de intrones) del $51P &XDQWLFDFLyQ GHO $'1 R $51 GLDQD HQ OD muestra. 6H SXHGH FXDQWLFDU OD FRQFHQWUDFLyQ LQLFLDO GH $'1 R $51 GLDQD HQ OD PXHVWUD GH manera muy sencilla, a travs de la construccin de una curva de calibrado. El control de la amSOLFDFLyQ FRPR PHGLGD GH OD FRQFHQWUDFLyQ HQ la muestra se obtiene en las fases iniciales de la reaccin, en las que la concentracin de los reactivos no es limitante y el efecto de la variabi-

OLGDG HQ OD HFLHQFLD GH DPSOLFDFLyQ HV PHQRV importante. C) Variantes de la qPCR PCR mltiple: es una variante de la PCR FXDQWLWDWLYD HQ OD TXH VH DPSOLFDQ VLPXOWiQHDmente dos o ms secuencias blanco en una nica reaccin. Este anlisis en simultneo de varias secuencias optimiza el aprovechamiento de la muestra cuando se trata de materiales de disponibilidad limitada y ofrece la posibilidad de realizar controles internos, por ejemplo, la expresin de un gen constitutivo en ensayos de expresin. La PCR mltiple suele ser ms complicada que la simple adicin de varios cebadores a la PCR cuantitativa simple. Se requiere extremar ORV FXLGDGRV HQ FXDQWR DO GLVHxR HVSHFtFR GH cebadores, sugirindose que tengan igual temperatura de fusin (meeting point, Tm), un contenido de GC del 45-60% y que carezcan de homoORJtD HQWUH Vt /D DOWD HFLHQFLD GH ORV FHEDGRUHV en la PCR individual, no asegura el xito en la PCR mltiple, pero aumenta considerablemente las posibilidades de obtenerlo. La combinacin GH RXUyIRURV D XWLOL]DU HQ ORV GLIHUHQWHV FHEDGRres tambin debe elegirse de manera cuidadosa, para que no exista superposicin entre los espectros absorcin y emisin entre ellos. Anlisis de curvas de disociacin. Se basa en la aplicacin de un gradiente de temperaturas creciente despus de la PCR para monitorizar la cintica de disociacin de los fragmentos DPSOLFDGRV SXGLpQGRVH HVWDEOHFHU VX 7P SDUD FRPSUREDU VX HVSHFLFLGDG 7DPELpQ SHUPLWH HO anlisis de mutaciones puntuales, usando una VRQGD FRPSOHPHQWDULD FRQ HO $'1 GH WLSR VDOYDMH TXH DEDUTXH OD SRVLFLyQ GHO SROLPRUVPR (O KtEULGR IRUPDGR HQWUH VRQGD \ $'1 GH WLSR VDOYDje tendr una estabilidad mayor que el formado HQWUH OD VRQGD \ HO $'1 PXWDGR SXHVWR TXH HQ este caso la complementariedad no es absoluta, UHHMiQGRVH HQ XQD 7P VXSHULRU $GLFLRQDOPHQte, permite establecer adems, de forma relatiYD OD FDQWLGDG GH $'1 GH WLSR VDOYDMH \ OD GH tipo mutado cuando ambos estn presentes en la misma muestra. En la Seccin IX, Captulo 4, se detalla ms este punto y se aplica esta tcnica para la deWHFFLyQ GH RUJDQLVPRV JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV 2*0V .

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6. GENOTECAS Una genoteca (gene library) es una colecFLyQ GH IUDJPHQWRV GH $'1 FORQDGRV TXH UHSUHVHQWDQ HQ VX FRQMXQWR HO $'1 WRWDO GH XQ RUJDQLVPR GH LQWHUpV R ELHQ HO $'1F TXH UHpresenta el conjunto de genes que se estn expresando en un rgano o tejido determinado o bajo una situacin particular o momento de crecimiento o desarrollo. En el primer caso hablamos de una genoteca genmica, donde se encuentran todas las secuencias que se expresan y no se expresan en el organismo mientras que en el segundo se trata de una genoteca de $'1F GRQGH VH HQFXHQWUDQ VROR ODV VHFXHQcias expresadas. Estas genotecas consisten en una coleccin bacterias, conteniendo cada una un vector con HO $'1 LQVHUWR GLVSXHVWDV HQ SRFLOORV /DV JHnotecas carecen de un catlogo a travs del cual se pueda saber cul es el clon que contiene una secuencia de inters, por lo que es necesario realizar un relevamiento de las colonias bacterianas. Para ello se utiliza una sonda GH $'1 FRPSOHPHQWDULD D OD VHFXHQFLD R JHQ buscados, que puede ser conocida o deducirse a partir de la secuencia de aminocidos de la SURWHtQD SXULFDGD 8QD GH ODV SULQFLSDOHV GLFXOWDGHV HQ HO FORQDGR GH $'1 JHQyPLFR HV TXH DOJXQDV VHcuencias estn representadas una sola vez en HO JHQRPD \ HV GLItFLO KDOODUODV 3DUD VXSHUDU HVWD OLPLWDFLyQ GH OD PHWRGRORJtD SXHGH FORQDUVH GLUHFWDPHQWH HO $'1F \D TXH HO Q~PHUR GH FRSLDV GHO $51P HQ HO WHMLGR FRUUHVSRQGLHQte a un gen que se esta expresando es ms elevado. El problema se plantea cuando no se sabe en qu circunstancias o en qu tejido se H[SUHVD XQ JHQ HQ SDUWLFXODU $FWXDOPHQWH HV SRVLEOH FORQDU XQ $'1F D SDUWLU GH PHQVDMHURV poco abundantes en la clula, con concentraciones de 1 a 2 molculas por clula. A) Genotecas de ADNc El primer paso en la construccin de una geQRWHFD GH $'1F FRQVLVWH HQ HO DLVODPLHQWR GHO $51 D SDUWLU GHO WHMLGR R FRQGLFLyQ H[SHULPHQWDO planteada. Los cambios en la expresin gnica DVRFLDGRV D OD H[SRVLFLyQ D HVWtPXORV GLYHUVRV hacen necesaria la preservacin del material

nitrgeno liquido para impedir cambios cuali o cuantitativos de la expresin. La susceptibiliGDG GHO $51 DO FOLYDMH SRU $51DVDV UHTXLHUH de cuidados especiales en el material del laboUDWRULR D VHU HPSOHDGR HQ HO DLVODPLHQWR $ SDUWLU GHO $51 WRWDO HV SRVLEOH VHSDUDU HO $51P WRPDQGR YHQWDMD GH OD FDUDFWHUtVWLFD FROD GH poliadeninas que posee en el extremo 3, meGLDQWH FURPDWRJUDItD GH DQLGDG XWLOL]DQGR columnas de celulosa que tienen ligados oligonucletidos compuestos solo por desoxitimina ROLJR G7  $O SDVDU HO $51 SRU OD FROXPQD HO $51P queda unido por complementariedad DO ROLJR G7  D WUDYpV GH OD FROD GH SROL$ 8QD YH] VHSDUDGR GHO $51 WRWDO HO $51P HV HOXtGR de la columna utilizando una solucin tampn adecuada. (VWDV FRODV GH SROL$ WDPELpQ VRQ XWLOL]DGDV en el prximo paso de clonado, donde funcionan como sitio de unin de los cebadores oligo(dT), para la reaccin catalizada por la enzima transcriptasa reversa. El producto de OD UHDFFLyQ HV XQ KtEULGR $51$'1 /D SULQFLpal limitacin de esta tcnica radica en que en ORV FDVRV HQ ORV TXH HO $'1F HV PX\ ODUJR DO comenzar en el extremo 3, muchas veces no llega la retrotranscripcin al extremo 5. Para VXEVDQDU HVWD GLFXOWDG VH XWLOL]DQ SULPHUV DO azar de 6 a 10 nucletidos de longitud y estn confeccionados de manera de representar muchas secuencias diferentes, por lo que la reaccin comienza a partir de muchos sitios diferentes, no solo del extremo 3. Cualquiera de estas estrategias conduce a la obtencin de XQ KtEULGR $51$'1 D SDUWLU GHO FXDO PHGLDQWH 3&5 VH REWLHQH $'1 GH GREOH FDGHQD TXH puede clonarse en el vector apropiado. Para obtener la segunda cadena, se desarroll inicialmente un mtodo que tomaba ventaja de una vuelta o giro que da la hebra recin sintetizada, como un efecto de cambio de rumER GH OD WUDQVFULSWDVD UHYHUVD DO OOHJDU DO QDO GH OD FDGHQD GH $51 (VWH DUWHIDFWR SURYHH XQ FHEDGRU DGHFXDGR SDUD OD VtQWHVLV GH OD VHJXQGD FDGHQD GH $'1 \ SXHGH HOLPLQDUVH XQD YH] obtenida la segunda cadena, con una nucleasa S1, perdindose parte de la secuencia correspondiente al extremo 5 del mensajero. Existe una segunda tcnica, que presenta dos ventajas sobre la anterior. Una es que ge-

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QHUD PROpFXODV GH $'1F PiV ODUJDV \ OD VHgunda es que contiene prcticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5. Se basa en la utilizacin de la enzima RNasaH, TXH UHFRQRFH PROpFXODV KtEULGDV $51$'1 \ GLJLHUH OD FDGHQD GH $51 GHMDQGR WUR]RV SHqueos que permanecen unidos a la primera FDGHQD GHO $'1F \ VLUYHQ FRPR primers para OD $'1 SROLPHUDVD , TXH XVD HO $'1F RULJLQDO como molde para sintetizar la hebra complePHQWDULD GH $'1 6ROR TXHGD XQ SHTXHxR VHJPHQWR GH $51 HQ HO H[WUHPR  /D VHJXQGD FDGHQD GH $'1 WLHQH DOJXQRV VHFWRUHV QR XQLGRV TXH VRQ VHOODGRV SRU XQD OLJDVD GH $'1 (VWDV PROpFXODV GH $'1F GH GREOH FDGHQD estn listas ahora para ser insertadas en un vector, que puede ser un plsmido o un deriva-

do del fago . Para ello se utiliza la transferasa WHUPLQDO TXH DGLFLRQD FRODV GH SROL$ R SROL7 o se agregan adaptadores, que son sitios arWLFLDOHV GH UHFRQRFLPLHQWR GH DOJXQD HQ]LPD de restriccin que se unen a los extremos de la secuencia. Se trata de oligonucletidos arWLFLDOHV  ES TXH VH XQHQ DO IUDJPHQWR XWLOL]DQGR XQD OLJDVD GH $'1 \ VRQ FRUWDGRV con la enzima de restriccin apropiada (Fig.   $PERV SURFHGLPLHQWRV VLUYHQ SDUD JHQHUDU H[WUHPRV FRKHVLYRV D Q GH XQLU HO IUDJPHQWR al vector, que posee extremos cohesivos cortados por la misma enzima. Si se utilizan como vectores los plsmidos, se introducen en las clulas husped (bacterias) por transformacin, Si se eligen los fagos, son empaquetados in vitro para formar

Figura 7. &ORQDGR GH $'1F GH GREOH FDGHQD HQ XQ IDJR (O $'1 GHO IDJR FRQWLHQH GRV VLWLRV GH UHVWULFFLyQ Eco5, (O $'1 GH OD UHJLyQ FHQWUDO QR HVHQFLDO GHO IDJR VH UHHPSOD]D SRU $'1 IRUiQHR XQLHQGR ORV IUDJPHQWRV GHO IDJR FRQ HO $'1 D FORQDU D WUDYpV GH OD HQ]LPD $'1 OLJDVD (V QHFHVDULR SUHYLDPHQWH DGLFLRQDU DO $'1F DGDSWDGRUHV TXH OOHYDQ VLWLRV Eco5, SDUD JHQHUDU H[WUHPRV FRKHVLYRV SDUD DFRSODUVH FRQ HO $'1 GHO IDJR 6H JHQHUD DVt XQD VHULH GH PROpFXODV UHFRPELQDQWHV GLVSXHVWDV HQ WDQGHP DQTXHGDV SRU VLWLRV cos (VWH $'1 UHFRPELQDQWH VH HPSDTXHWD IRUPDQGR SDUWtFXODV LQIHFFLRVDV GHO IDJR TXH VH XWLOL]DUiQ para infectar un csped de bacterias. Esto se visualizar como placas o calvas. Cada placa surge de una molcula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. Para la localizacin del gen de inters en la genoteca, es necesario hacer una copia de la placa en membrana de nylon, que luego ser hibridada con una sonda para el gen marcada apropiadamente. Si la marcacin es radiactiva, por ejemplo, VHUi UHYHODGD SRU DXWRUDGLRJUDItD \ HO FORQ VH LGHQWLFD SRU FRPSDUDFLyQ HQWUH OD PDUFD GH OD PHPEUDQD de nylon y la placa de bacterias.

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SDUWtFXODV YtULFDV TXH LQWURGXFLUiQ VX $'1 HQ el hospedador apropiado por infeccin de un FpVSHG GH EDFWHULDV FUHFLGR VREUH OD VXSHUFLH de una placa de agar (Fig. 7). Si bien los vectoUHV SODVPtGLFRV VRQ PiV IiFLOHV GH PDQLSXODU ODV JHQRWHFDV FRQVWUXtGDV HQ ORV IDJRV SRVHHQ fragmentos de mayor tamao. Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un milln colonias bacterianas o de placas de fagos (zonas claras o de lisis resultado de la SURGXFFLyQ GH SDUWLFXODV YtULFDV  GHSHQGLHQGR del vector utilizado, cada una conteniendo un fragmento clonado, distribuidas sobre la placa GH DJDU $ Q GH UHDOL]DU OD E~VTXHGD GH XQ JHQ particular (screening), la genoteca es replicada en membranas de nylon o nitrocelulosa, de manera tal que el patrn de placas en la caja original se vea exactamente reproducido en la PHPEUDQD GH Q\ORQ R OWUR )LJ   /D E~VTXHda se lleva a cabo por hibridacin con una sonda de cido nucleico, lo cual requiere un conocimiento previo de la secuencia de inters. Eleccin de la sonda: En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se utiliza para buscar las partes faltantes. Si se XVD XQ VRQGD GRQGH OD KRPRORJtD HV FRPSOHWD el screening puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con lavados ms fuertes, que tienden a despegar lo que se ha XQLGR LQHVSHFtFDPHQWH  6L OD VRQGD QR HV completamente homloga el screening deber realizarse a menores temperaturas y utilizando concentraciones salinas ms elevadas en los lavados. Si no se tiene conocimiento previo de la secuencia puede construirse una sonda a partir de la secuencia de aminocidos GH OD SURWHtQD Cuando se utiliza esta estrateJLD HO WDPDxR PtQLPR GH OD VRQGD GHEH VHU de 15 a 16 nucletidos (que permite encontrar VHFXHQFLDV ~QLFDV HQ JHQRWHFDV GH $'1F HXcariticos. Generalmente se utilizan sondas de 17 a 20 nucletidos (correspondientes a 6 aminocidos contiguos). Otra consideracin a tener en cuenta cuando se construye la sonda es TXH H[LVWH PiV GH XQ FRGyQ R WULSOHWH SDUD GHQLU OD PD\RUtD GH ORV DPLQRiFLGRV HV OR TXH VH conoce como la degeneracin del cdigo gentico) por lo que un aminocido puede estar HVSHFLFDGR SRU KDVWD  FRGRQHV GLIHUHQWHV

3RU HOOR HVWDV VRQGDV ROLJRQXFOHRWtGLFDV HVWiQ FRQVWLWXtGDV SRU XQD PH]FOD de todas las combinaciones posibles. Una de ellas corresponder a la secuencia correcta del gen buscado. El problema de esta estrategia es el elevado nmero de falsos positivos que pueden dar las secuencias adicionales. Una variante consiste en usar un menor nmero de oligonucletidos o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nuFOHyWLGRV  HOLJLHQGR XQD UHJLyQ GH OD SURWHtQD que contenga el menor nmero posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los codones ms probables para la especie en estudio. Existen otras tcnicas para localizar genes HQ ODV JHQRWHFDV GH $'1F FRPR KLEULGDFLyQ diferencial, si se trata de genes expresados en diferentes tejidos o la utilizacin de sondas de UHJLRQHV FRQVHUYDGDV HQ IDPLOLDV GH SURWHtQDV para encontrar genes relacionados o bien la utilizacin de vectores de expresin. B) Genotecas Genmicas Un genoteca genmica puede obtenerse de cualquier tejido ya que todas las clulas de un organismo tienen la misma constitucin gentica. Se encuentran en ella, no solo las secuencias expresadas sino tambin las correspondientes secuencias regulatorias. Pueden utilizarse fagos como vectores, pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy JUDQGHV HO GH PDPtIHURV SRU HMHPSOR FRQWLHne 3x109 SE GH $'1 6L HO SURPHGLR WtSLFR GH inserto es de 15.000 pb, se necesitarn unos 200.000 fagos para contener el genoma completo. Para asegurar que todas las secuencias estn representadas al menos una vez, los FiOFXORV HVWDGtVWLFRV GLFHQ TXH GHEHUiQ DQDlizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos. Por este motivo, especialmente cuando se trata de genomas muy grandes, como es el caso del genoma humano o de varias especies vegetales y animales, se utilizan las genotecas GH <$&V R %$&V Genotecas genmicas en cromosomas DUWLFLDOHV La capacidad de clonar fragmentos de ms de 100 kb es crucial para la genmica estruc-

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tural, funcional y comparativa de organismos complejos. Las primeras genotecas genmicas fueron construidas utilizando como vectores los <$&V DXQTXH SRU VXV OLPLWDFLRQHV VH SUHHUH DFWXDOPHQWH HO XVR %$&V \ 3$&V FRPR YHFWRres. Cuando se trata de genomas de plantas, pueden utilizarse como vectores los cromosoPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV ELQDULRV %,%$&V  que presentan la ventaja adicional de pueden usarse directamente para transformar plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens. Para preparar una genoteca genmica el $'1 HV HVFLQGLGR FRQ HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ o mecnicamente al azar, si se desea evitar la presencia de fragmentos demasiado largos o FRUWRV 8Q SDVR FUtWLFR HQ HO SURFHVR HV HO DLVODPLHQWR GH PROpFXODV LQWDFWDV GH $'1 GH HOHYDGR SHVR PROHFXODU HVHQFLDOPHQWH $'1 FURmosmico. Para ello las clulas se embeben en bloques de agarosa de baja temperatura GH JHOLFDFLyQ y se tratan con enzimas y otros UHDFWLYRV SDUD VHSDUDU HO $'1 GH ODV SURWHtQDV FHOXODUHV \ GHO 51$V /D IXQFLyQ GHO EORTXH GH agarosa es proteger a las grandes molculas, que, embebidas en esta matriz, se someten a la digestin con enzimas de restriccin que realicen cortes poco frecuentes (rare cutters). /D SUHSDUDFLyQ GH $'1 GH DOWD FDOLGDG HQ SODQtas es ms complicada que la correspondiente para el caso de animales debido a la presencia GH OD SDUHG FHOXODU TXH GLFXOWD HO HPEHELGR HQ EORTXHV GH D]DURVD 3DUD VXSHUDU HVWD GLcultad se trabaja directamente con los ncleos aislados. Si se desea separar estos fragmentos por electroforesis, los bloques de agarosa FRQWHQLHQGR HO '1$ GLJHULGR SXHGHQ VHU GLUHFtamente embebidos en la matriz del gel que se correr. /D FDQWLGDG GH FORQHV %$&V TXH FRQVWLWXyen una genoteca, se relaciona con el tamao del genoma, el tamao promedio de los insertos y la cobertura genmica esperada. Considerando el tamao de inserto promedio GH ORV FORQHV %$&V SDUD FXEULU FLQFR YHFHV HO JHQRPD XQD JHQRWHFD GH %$&V GH OD HVSHFLH modelo Arabidopsis thaliana, cuyo genoma es pequeo, requerir la obtencin de 7.000 cloQHV %$&V PLHQWUDV TXH XQD GH WULJR FDQGHDO cuyo genoma es dos ordenes de magnitud mayor, tendr que estar compuesta por 500.000 clones.

Separacin de grandes trozos de ADN: electroforesis de campo pulsti. Las tcniFDV HVWiQGDU GH VHSDUDFLyQ GH $'1 HQ JHOHV de agarosa no son adecuadas para molculas mayores de 10 kb. Esta limitacin ha sido subsanada con la electroforesis de campo pulstil, en la que el campo elctrico en el gel de agarosa cambia peridicamente de orientacin. De esta manera pueden separarse molculas tan grandes como los cromosomas de levaduras (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separacin de las molculas de este tamao depende de su UHODWLYD IDFLOLGDG R GLFXOWDG SDUD UHRULHQWDUVH en respuesta a direcciones cambiantes de un campo elctrico. Esta tcnica puede utilizarse SDUD KDFHU PDSDV ItVLFRV D JUDQ HVFDOD Preparacin de una genoteca de BACs. Como todo proceso de clonacin, consiste en la preparacin del vector, aislamiento y digesWLyQ GHO $'1 VHOHFFLyQ GH ORV IUDJPHQWRV SRU tamao, transformacin de las bacterias y ensamblado de la genoteca. (O YHFWRU GHEH HVWDU SXULFDGR GLJHULGR \ defosforilado (cuando se corta con una sola enzima, se eliminan los fosfatos terminales, para evitar la recircularizacin). La digestin GHO $'1 HV FUtWLFD SDUD REWHQHU IUDJPHQWRV adecuados para clonar. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de campo pulstil y se separan de la matriz de agarosa por digestin de la misma con agarasa o gelasa, o SRU HOXVLyQ GHO $'1 GHVGH HO JHO (VWR SHUPLWH construir genotecas con fragmentos de tamaos similares, de aproximadamente 150 kb. Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para investigacin genmica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando son utilizadas para proyectos de secuenciacin y mapeo a gran escala. En general, cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuidadosamente el genotipo de la especie utilizada FRPR IXHQWH GH $'1 HO WLSR GH LQVHUWR HWF dado que la misma puede utilizarse para variados propsitos. En la Fig. 8 se esquematiza la bsqueda de XQ JHQ HQ XQD JHQRWHFD GH %$&V 0iV GHtalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados puede encontrarse en el FDStWXOR FRUUHVSRQGLHQWH D JHQyPLFD

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Figura 8. %~VTXHGD GH XQ JHQ HVSHFtFR HQ XQD JHQRWHFD GH %$&V PHGLDQWH 3&5 /DV  SODFDV GH cultivo, de 96 pocillos cada una, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, agruSDGDV GH D  HQ OWURV R PHPEUDQDV 6H UHDOL]D OXHJR XQD UHDFFLyQ GH 3&5 FRQ HO FHEDGRU HVSHFtFR DO $'1 REWHQLGR GH XQ WXER TXH FRQWLHQH ORV FORQHV FRUUHVSRQGLHQWHV D WUHV OWURV UHSUHVHQWDQGR  SODFDV TXH IXHURQ SUHYLDPHQWH DJUXSDGRV &RPR FRQWURO SRVLWLYR VH XWLOL]D HO $'1 YHJHWDO WRWDO WDPELpQ DPSOLcado por PCR. La reaccin se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presencia GHO JHQ HQ HO $'1 JHQyPLFR GHO YHJHWDO \ WDPELpQ HQ XQR GH ORV WXERV FRQWHQLHQGR HO $'1 GH  SODFDV GH  SRFLOORV HQ OD JXUD FRUUHVSRQGH DO WXER  TXH FRQWLHQH ORV FORQHV GH ODV SODFDV   \  6H UHDliza en mismo procedimiento con tubos que contienen los clones de cada placa. Cuando se chequean los FRQMXQWRV LQGLYLGXDOHV VH HQFXHQWUD TXH HO FORQ SRVLWLYR SHUWHQHFH DO OWUR  (O SURGXFWR GH 3&5 VH KLEULGD OXHJR FRQ HVWH OWUR \ HVWR QRV GDUi OD SRVLFLyQ H[DFWD HQ OD SODFD GH  SRFLOORV GRQGH VH HQFXHQWUD HO gen de inters.

& *HQRWHFDV GH FURPRVRPDV HVSHFtcos o de segmentos de cromosomas Cuando se busca un gen que se sabe est XELFDGR HQ XQ FURPRVRPD HVSHFtFR VLPSOLFD mucho el trabajo hacer una genoteca de ese cromosoma solamente. Se trata de una tcnica que permite separar cromosomas metafsicos WHxLGRV FRQ HO FRORUDQWH XRUHVFHQWH +RHFKVW  SDUD UHJLRQHV ULFDV HQ $7 \ FURPRPLFLQD $ SDUD UHJLRQHV ULFDV HQ *& /RV FURPRVRPDV WHxLGRV XRUHVFHUiQ FXDQGR VH H[SRQJDQ D OX] UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm +RHFKVW  R  QP FURPRPLFLQD $  Las cantidades y proporciones de colorantes YDUtDQ SDUD FDGD FURPRVRPD \ XQD FRPSXWD-

GRUD UHFRQRFH HO SDWUyQ XRUHVFHQWH WtSLFR GH FDGD FURPRVRPD $OJXQRV FURPRVRPDV VRQ muy similares por lo que no pueden ser separados. Se necesita un milln de cromosomas para hacer una genoteca. Equipos automticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas. Tambin puede microdisectarse un cromosoma, tomando un segmento del mismo que tenga la regin de inters. En principio se utiliz esta tcnica para cromosomas grandes, IiFLOPHQWH GLVWLQJXLEOHV SRU PLFURVFRStD GH FRQWUDVWH GH IDVH $FWXDOPHQWH OD FRPELQDFLyQ con PCR posibilita la aplicacin de la tcnica a cualquier cromosoma. Estos son teidos con

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Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son FRUWDGDV FRQ DJXMDV GH YLGULR XOWUDQDV \ FORnadas. Cebadores posicionados en el vector SHUPLWHQ DPSOLFDU VHFXHQFLDV GHVFRQRFLGDV (O $'1 DPSOLFDGR VH FORQD HQ XQ YHFWRU DSURpiado y la localizacin cromosmica de cada clon se determina utilizando hibridacin in situ (ver III.5) 7. SECUENCIACIN DEL ADN CLONADO Una vez que se ha obtenido el clon con el fragmento de inters, el paso siguiente es secuenciarlo. La determinacin de la secuencia puede UHDOL]DUVH SRU HO PpWRGR TXtPLFR GH 0D[DP \ Gilbert o por el mtodo enzimtico de Sanger. El primero consiste en la utilizacin de compuestos que destruyen selectivamente una o dos de las EDVHV TXH FRQVWLWX\HQ HO $'1 SDUWLHQGR GH PROpFXODV GH $'1 PDUFDGDV UDGLDFWLYDPHQWH HQ XQ extremo. La destruccin no debe ser total, sino TXH HQ SURPHGLR FDGD PROpFXOD GH $'1 LQGLYLdual, debe ser clivada una vez. En funcin del FRPSXHVWR TXtPLFR XWLOL]DGR \ GH ODV FRQGLFLRQHV GH UHDFFLyQ VH REWLHQHQ IUDJPHQWRV GH $'1 KLGUROLVDGRV D OD DOWXUD GH ODV EDVHV * $* 7& R C. Se generan fragmentos de distinto tamao en funcin de la distancia de la base destruida al extremo marcado del fragmento a secuenciar. Los productos de las 4 reacciones se corren en un gel de poliacrilamida que es revelado por autoUUDGLRJUDItD \ OD VHFXHQFLD GHO IUDJPHQWR TXHGD determinada por el patrn de bandas. El mtodo de Sanger, se basa en la interrupcin controlada de la replicacin enzimtica del $'1 DxDGLHQGR D OD UHDFFLyQ GH VtQWHVLV MXQWR con los cuatro desoxinucletidos, un 2,3- didesoxinucletido (ddNTP) marcado. Los ddN73V SXHGHQ VHU LQFRUSRUDGRV DO $'1 SRU OD $'1 SROLPHUDVD SHUR LQWHUUXPSH OD VtQWHVLV GH OD FDdena por carecer del OH en posicin 3, necesario para la formacin del enlace con la base siguiente. Se preparan cuatro reacciones con HO $'1 PROGH HO FHEDGRU ORV FXDWUR G173V \ en cada una de ellas diferencialmente un ddNTPS. Con la proporcin ddNTP:dNTP adecuada, se generan fragmentos de distinta longitud, dependiendo de la distancia de la ltima base incorporada al extremo marcado GHO $'1 (VWRV fragmentos son separados en un gel de polia-

FULODPLGD GRQGH PHGLDQWH DXWRUUDGLRJUDItD VH GHWHUPLQD HO SDWUyQ GH EDQGDV TXH UHHMD OD VHFXHQFLD GHO $'1 )LJ   $FWXDOPHQWH VH XWLOL]DQ digitalizadores de imgenes para la lectura de la DXWRUUDGLRJUDItD Messing desarroll una serie de vectores de FORQDGR EDVDGRV HQ HO IDJR ODPHQWRVR 0 muy tiles para el secuenciado enzimtico, con los que se utiliza un cebador universal que se posiciona en un lugar adyacente al sitio de policlonado del vector. La ventaja es que solo una de las cadenas del vector es empaquetada en ODV FDEH]DV GHO IDJR (VWH $'1 GH VLPSOH FDGHna es ideal para utilizar con el mtodo de Sanger. $FWXDOPHQWH VH XWLOL]DQ IiVPLGRV /D DGLFLyQ GH un fago ayudante (helper phage) a las clulas TXH OR FRQWLHQHQ KDFH TXH HO $'1 GHO PLVPR de simple cadena, sea replicado, empaquetado \ H[WUXtGR GH OD FpOXOD $O VHU GH PHQRU WDPDxR (aprox. 3000 bp) que M13 permite la insercin GH IUDJPHQWRV GH $'1 PiV ODUJRV Los proyectos de secuenciacin genmica han requerido mtodos de secuenciado ms veloces y econmicos. Para ello se ha desarrollado una tcnica llamada Multiplex, que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. 6H XWLOL]DQ  YHFWRUHV SODVPtGLFRV TXH SHUPLten construir 20 genotecas diferentes a partir del PLVPR $'1 &DGD YHFWRU OOHYD GRV VHFXHQFLDV ~QLFDV TXH DQTXHDQ DO VLWLR GH FORQDGR TXH pueden ser usadas como etiquetas (tags) para HO $'1 FORQDGR \ HVWDUiQ SUHVHQWHV VREUH FDGD fragmento a ser secuenciado. Se toma un clon de cada una de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y se mezclan. Se hace crecer el cultiYR VH DtVOD HO $'1 \ VH VHFXHQFLDQ ORV SOiVPLdos utilizando el mtodo Maxam y Gilbert. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de seFXHQFLDFLyQ VH FRUUHQ HQ XQ JHO \ VH WUDQVHUHQ D XQD PHPEUDQD GH Q\ORQ (O OWUR VH KLEULGD VHcuencialmente (es decir, se despega una sonda SDUD OXHJR KLEULGDU FRQ ODV VLJXLHQWH \ DVt VXcesivamente), utilizando como sonda la etiqueta de cada uno de los 20 vectores. En cada caso se van leyendo las secuencias correspondientes a cada uno de los distintos vectores. De esta manera, una sola reaccin produce datos de 20 clones a la vez. $FWXDOPHQWH H[LVWHQ HTXLSRV URERWL]DGRV que pueden llevar a cabo dos de las reacciones ms limitantes en el proceso de secuen-

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Figura 9. (VTXHPD GH OD VHFXHQFLDFLyQ GH $'1 SRU HO PpWRGR GH GLGHVR[LQXFOHyWLGRV GH PDQHUD D PDnual, usando marcacin radiactiva b) automtica, utilizando ddNTPs que emiten color. Se representa a OD KHEUD GH $'1 D VHFXHQFLDU FRQ HO FHEDGRU XQLGR SRU FRPSOHPHQWDULHGDG /D UHDFFLyQ GH VtQWHVLV GHO $'1 FRPSOHPHQWDULR SRU OD HQ]LPD $'1 SROLPHUDVD 3&5 VH GHVDUUROOD D HQ FXDWUR WXERV LQGLYLGXDOHV cada uno con los cuatro desoxinucletidos (dNTPs) y un didesoxinuletido particular (ddNTP). En general, HO G173 PDUFDGR UDGLDFWLYDPHQWH HV G$73 y E HQ XQ ~QLFR WXER FRQ FDGD GG173 XQLGR D XQ PDUFDGRU XRUHVFHQWH GLIHUHQWH /XHJR UHDOL]D OD FRUULGD HOHFWURIRUpWLFD HQ JHO GH SROLDFULODPLGD \ OD VHFXHQFLD HV OHtGD GHVGH OD EDQGD PiV FRUWD H[WUHPR  KDFLD HO GH PD\RU ORQJLWXG H[WUHPR  GH PDQHUD D PDQXDO y E GLJLWDO OXHJR GH OD H[FLWDFLyQ FRQ OiVHU \ HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD REWHQLpQGRVH XQ FURPDWRJUDPD

ciaGR OD GHWHFFLyQ GH ODV EDQGDV GH $'1 \ OD traduccin de un patrn de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucletidos PDUFDGRV FRQ XRURFURPRV 6H XWLOL]DQ  FRlorantes diferentes, que al ser exitados por lser emiten luz de diferente longitud de onda. Los colorantes pueden utilizarse para marcar el primer universal de secuenciacin de M13 o cada uno de los 4 terminadores de cadena didesoxi. En este caso, cada mezcla de reaccin con un terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reaccin es

completada los productos de las 4 reacciones se mezclan y se corren en una sola calle de un JHO HQ XQ VHFXHQFLDGRU DXWRPiWLFR $ PHGLGD que los fragmentos pasan a travs del lser, VXV PDUFDV XRUHVFHQWHV VH H[FLWDQ \ HPLWHQ luz que se detecta mediante un fotomultiplicador. Despus de ser procesada por una computadora, la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma, donde cada uno de los 4 colores representa a un nucletido diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro: guanina y azul: citosina) (Fig. 9).

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Lecturas Recomendadas
Madigan M. T., Martinko J. M. and Parker J. 1999 %URFN %LRORJtD GH ORV 0LFURRUJDQLVPRV 2FWDva edicin revisada. Prentice Hall Iberia. Madrid, Espaa. 6LQJOHWRQ 3  %DFWHULDV HQ %LRORJtD %LRWHFQRORJtD \ 0HGLFLQD WD (GLFLyQ $FULELD Sambrook J., Fmitsch E. F. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor. 6RXWKHUQ ( 0  'HWHFWLRQ RI VSHFLF VHTXHQFHV DPRQJ '1$ IUDJPHQWV VHSDUDWHG E\ JHO electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-517 )WWHUHU - *LVHO $ ,JOHVLDV 9 .ORWL $ .RVW % Mittelsten Scheid O., Neuhaus G., Neuhaus-Url G., Schrott M., Shillito R., Spangenberg G. and :DQJ = <  6WDQGDUG 0ROHFXODU 7HFKQLTXHV IRU WKH $QDO\VLV RI 7UDQVJHQLF 3ODQWV (Q Gene Transfer to Plants. Potrykus Y, Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual. :DWVRQ - ' %DNHU 7 $ %HOO 6 3 *DQQ $ /HYLQH 0 DQG /RVLFN < 5  %LRORJtD 0ROHFXODU del Gen. 5 Edicin, Ed. Mdica Panamericana. Madrid.

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I. CAPTULO 5. Marcadores Moleculares


0DUtD &DUROLQD 0DUWtQH] 0DUFHOR +HOJXHUD $OLFLD &DUUHUD 5.1. Introduccin Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar genotiSRV VXSHULRUHV D SDUWLU GH OD LGHQWLFDFLyQ GH fenotipos superiores. El grado de xito en este proceso depende de: i) el nmero de genes involucrados en el control gentico del carcter (herencia monognica o polignica) y las relaciones interallicas (dominancia o aditividad), ii) OD LQXHQFLD GHO DPELHQWH TXH VH PLGH QRUPDOmente a travs del parmetro heredabilidad. El proceso de caracterizacin y/o seleccin se YXHOYH PiV HFLHQWH D WUDYpV GHO XVR GH PDUFDGRUHV JHQpWLFRV GHQLGRV FRPR FDUDFWHUHV TXH SUHVHQWDQ SROLPRUVPR R YDULDELOLGDG H[perimentalmente detectable en individuos de una poblacin segregante y un tipo de herencia predecible segn las leyes de Mendel. Esta variacin puede considerarse a diferentes niveles ELROyJLFRV GHVGH FDPELRV IHQRWtSLFRV KHUHGDEOHV VLJQLFDWLYRV PDUFDGRU PRUIROyJLFR KDVWD OD YDULDFLyQ GH XQ VROR QXFOHyWLGR GH $'1 PDUFDGRU PROHFXODU  (O PDUFDGRU LGHDO GHEHUtD VHU DOWDPHQWH SROLPyUFR GHQWUR \ HQWUH HVSHFLHV  de herencia mendeliana no episttica, insensible a los efectos ambientales, codominante (capaz de diferenciar individuos heterocigotas de KRPRFLJRWDV  GH UiSLGD LGHQWLFDFLyQ \ VLPSOH anlisis, y de deteccin en los estadios tempranos del desarrollo de la planta. En la actualidad existe una gran variedad de marcadores genticos y a lo largo de este FDStWXOR GHVDUUROODUHPRV DTXHOORV PiV IUHFXHQtemente utilizados en plantas. Para una mejor FRPSUHQVLyQ VH SURSRQH FODVLFDU ORV PDUFDGRUHV HQ ODV VLJXLHQWHV FDWHJRUtDV L PDUFDGRUHV PRUIROyJLFRV LL PDUFDGRUHV ELRTXtPLFRV iii) marcadores moleculares, iv) marcadores funcionales o de expresin, vi) marcadores basados en SNPs. 5.2 Marcadores Morfolgicos 6RQ FDUDFWHUtVWLFDV IHQRWtSLFDV GH VHQFLOOD

LGHQWLFDFLyQ YLVXDO WDOHV FRPR IRUPD GH KRMD pubescencia, color de fruto, etc. En todos los casos debe tratarse de caracteres de herencia monognica y predecible segn las leyes de Mendel. Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plntula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para LQVFULELU H LGHQWLFDU YDULHGDGHV GH WULJR HQ OD 6HFUHWDUtD GH $JULFXOWXUD *DQDGHUtD 3HVFD \ $OLPHQWDFLyQ GH OD $UJHQWLQD (VWH WLSR GH PDUFDGRUHV FRQWULEX\y VLJQLFDWLYDPHQWH DO desarrollo terico del concepto de ligamiento gentico y a la construccin de los primeros mapas genticos de plantas (como por ejemSOR HQ WRPDWH \ PDt]  (Q HO PHMRUDPLHQWR GH JLUDVRO ORV SULPHURV KtEULGRV VH REWXYLHURQ utilizando color de hipoctile como marcador ligado al gen ms de androesterilidad; de este modo las plantas verdes que eran androestULOHV VH XWLOL]DEDQ FRPR OtQHDV PDWHUQDV \ ODV plantas con antocianas que eran frtiles se eliminaban del lote de produccin al comienzo de su desarrollo. Las principales limitaciones de los marcadores morfolgicos son: i) se encuentran disponibles en un nmero restringido de especies vegetales, utilizadas como sistemas modelo para HVWXGLRV JHQpWLFRV WDOHV FRPR HO PDt] HO WRPDWH \ OD DUYHMD LL EDMR QLYHO GH SROLPRUVPR LLL SXHGHQ SURGXFLU DOWHUDFLRQHV IHQRWtSLFDV TXH GLFXOWDQ HO GHVDUUROOR GH OD SODQWD DOELQLVmo), iv) generalmente de herencia dominante y en algunos casos polignica y, v) muchos de ellos se expresan en estadio de planta adulta, lo cual prolonga los tiempos de evaluacin en los programas de mejoramiento. Un enorme espectro de especies vegetales carece de informacin a este nivel. No obstante, los marcadores morfolgicos permanecen FRPR FDUDFWHUHV ~WLOHV HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH materiales dado que representan un conjunto de genes que pueden ser evaluados con mtodos sencillos y a bajo costo. 5.3 Marcadores Bioqumicos 6RQ SROLPRUVPRV SUHVHQWHV HQ FLHUWDV SURWHtQDV GHWHFWDGRV D WUDYpV GH WpFQLFDV ELRTXtPLFDV (O GHVDUUROOR GH ORV PDUFDGRUHV ELRTXt-

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micos produjo una revolucin en los estudios genticos en plantas, que hasta el momento KDEtDQ FRQWDGR FRQ XQ OLPLWDGR Q~PHUR GH PDUFDGRUHV PRUIROyJLFRV /D WpFQLFD SHUPLWtD incluir potencialmente a todas las especies de SODQWDV (Q HVWD SDUWH GHO FDStWXOR QRV UHIHULUHPRV D ODV ,VRHQ]LPDV \ D ODV 3URWHtQDV GH reserva. 5.3.1 Isoenzimas /DV LVRHQ]LPDV VH GHQHQ FRPR GLIHUHQWHV formas moleculares de una enzima, que poVHHQ XQD DFWLYLGDG FDWDOtWLFD FRP~Q HV GHFLU actan sobre el mismo sustrato. Ciertos camELRV HQ HO $'1 TXH FRGLFD HVWDV HQ]LPDV (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composicin de aminocidos, originando proWHtQDV FRQ OD PLVPD DFWLYLGDG ELROyJLFD SHUR con diferente carga neta y por lo tanto con diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas diferencias determinan patroQHV FDUDFWHUtVWLFRV GH PLJUDFLyQ HOHFWURIRUpWLFD de las formas iso-enzimticas. Varios factores GHQHQ HO SDWUyQ GH EDQGDV R ]LPRJUDPD L 1~PHUR GH JHQHV TXH ODV FRGLFDQ OD SUHVHQFLD GH YDULRV JHQHV FRGLFDQGR SDUD XQD misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicacin gnica y subsecuente divergencia a travs de mutaciones diferentes en cada caso; ii) Estados allicos: el proceso ms simple de generacin de nuevas formas enzimticas es la mutacin de un gen estructural, las variantes allicas se denominan aloenzimas. Estos marcadores muestran codominancia (en un individuo diploide ambos alelos de un ORFXV VRQ H[SUHVDGRV \ YLVXDOL]DGRV  $ PRGR de ejemplo, la enzima alcohol dehidrogenasa $'+  SXHGH FRPSUHQGHU YDULRV ORFL \ DOHORV con denominacin Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c, etc.; iii) Estructura cuaternaria de los productos proteicos: la enzima funcional puede estar compuesta por un nmero variable de sub-unidades. En las formas ms simples o monomricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve ms compleja, encontramos enzimas activas compuestas por GtPHURV WHWUiPHURV HWF (Q HVWH FDVR HO LQGLYLduo heterocigota presenta bandas adicionales

no presentes en los homocigotas, que se generan por la combinacin de sub-unidades coGLFDGDV SRU ORV GLVWLQWRV DOHORV R ORFL )LJXUD 1). Finalmente, iv) Compartimentalizacin subcelular: se encuentran formas enzimticas localizadas en citoplasma, cloroplasto o mitoFRQGULD FRGLFDGDV WRGDV SRU JHQHV QXFOHDUHV pero con diferentes velocidades de migracin.

Figura 1.

Las isoenzimas se extraen por homogenei]DFLyQ GHO WHMLGR VHPLOOD UDt] KRMD HQ FRQGLciones no desnaturalizantes (que preservan la DFWLYLGDG FDWDOtWLFD GH OD HQ]LPD \ VH DQDOL]DQ mediante electroforesis en un soporte slido, generalmente almidn. El gel puede ser cortado en capas horizontales y cada una se destiQD D XQD VROXFLyQ GH UHYHODGR HVSHFtFD TXH consta de un sustrato, un colorante y cofactores, disueltos en un buffer apropiado. La reaccin que ocurre entre las enzimas presentes en el gel y el correspondiente sustrato generan productos coloreados que conforman el patrn GH EDQGDV /DV PHWRGRORJtDV HPSOHDGDV HQ la extraccin y electroforesis son relativamente sencillas y rpidas y el equipamiento es de bajo costo. Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura gentica, sisWHPiWLFD \ ELRORJtD HYROXWLYD DVt FRPR HQ GHVFULSFLyQ GH JHUPRSODVPD H LGHQWLFDFLyQ GH variedades. Su aplicacin en la construccin de mapas se ha visto limitada por el nmero de marcadores isoenzimticos disponibles (en general menor a 50), y por su reducido poliPRUVPR  DOHORV  3RU RWUR ODGR ODV IRUPDV HQ]LPiWLFDV H[WUDtGDV GH KRMD R UDt] QR DVt ODV de semilla) presentan variaciones en relacin a

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las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la reproducibilidad de los zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de referencia para relacionar mapas obtenidos a partir GH GLVWLQWRV PDUFDGRUHV GH $'1 5.3.2 3URWHtQDV GH UHVHUYD /DV SURWHtQDV GH UHVHUYD VRQ XQ JUXSR KHWHURJpQHR GH SURWHtQDV SUHVHQWHV HQ OD VHPLlla de planta que tienen por funcin proveer HQHUJtD DO HPEULyQ HQ ORV SULPHURV HVWDGLRV GH FUHFLPLHQWR (VWDV SURWHtQDV KDQ VLGR H[WHQVDmente estudiadas en cereales y oleaginosas y se relacionan directamente con la calidad del grano. /DV SURWHtQDV GH UHVHUYD VH H[WUDHQ PHdiante procedimientos sencillos a partir de las semillas y se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con detergentes). No se requiere detectar actividad enzimtica, las proWHtQDV VH YLVXDOL]DQ GLUHFWDPHQWH SRU WLQFLyQ FRQ $]XO GH &RRPDVVLH HYLGHQFLiQGRVH ORV SROLPRUVPRV FRPR GLIHUHQFLDV HQ OD PRYLOLGDG electrofortica. (Q OD PD\RUtD GH ORV FHUHDOHV HVWDV SURWHtQDV HVWiQ FRGLFDGDV SRU YDULRV JHQHV UHODFLR-

nados conformando familias. Varios estudios demuestran que durante la evolucin de estos genes se han detectado duplicaciones, translocaciones, inserciones de elementos mviles, entre otros rearreglos cromosmicos, que seUtDQ ORV UHVSRQVDEOHV GH JHQHUDU XQ DOWR QLYHO GH SROLPRUVPR SURWpLFR HQWUH \ GHQWUR GH especies. Por ejemplo, en el caso del trigo, las principaOHV SURWHtQDV GH UHVHUYD GHO JUDQR VH GHQRPLQDQ JOXWHQLQDV \ JOLDGLQDV HVWDV SURWHtQDV VRQ capaces de polimerizar durante el amasado de la harina formando una red denominada gluten de importancia fundamental en la elaboracin de pan. Desde un punto de vista gentico, las JOXWHQLQDV VH KD\DQ FRGLFDGDV HQ ORV ORFL Glu1 y Glu-3 y las gliadinas en Gli-1 y Gli-2 pudiendo tener cada uno de estos loci 1, 2 o ms genes; mutaciones en estos genes generan nuevas variantes allicas. Numerosos estudios electroforticos han revelado alto grado de poOLPRUVPR HQ HO Q~PHUR \ OD PRYLOLGDG HOHFWURIRUpWLFD GH HVWDV SURWHtQDV \ PXFKRV GH HVWRV SROLPRUVPRV VRQ XWLOL]DGRV FRPR PDUFDGRUHV genticos para mejorar la calidad panadera del trigo, principalmente en el caso de las gluteninas (Figura 2). Las gliadinas muestran patrones electroforticos ms complejos que las

Figura 2.

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gluteninas y han sido utilizadas en la descripFLyQ GH JHUPRSODVPD H LGHQWLFDFLyQ GH YDULHdades. Como en el caso de las isoenzimas, la DSOLFDFLyQ GH SURWHtQDV GH UHVHUYD HQ OD FRQVtruccin de mapas genticos es limitada por el nmero de marcadores genticos disponibles, sin embargo estos loci representan importantes marcas de referencia, por ejemplo, para los cromosomas 1 y 6 de trigo, donde estn presentes los principales genes de gluteninas y gliadinas. Para ms informacin sobre estructura, proSLHGDGHV \ URO GH ODV SURWHtQDV GH UHVHUYD HQ grano se recomienda la lectura de la revisin de Branlard et al. (2001). La principal ventaja de los marcadores bioTXtPLFRV HV VX IiFLO LPSOHPHQWDFLyQ HQ HO ODERUDWRULR \D TXH LQYROXFUDQ PHWRGRORJtDV VHQFLllas, rpidas y de bajo costo. Como desventajas se pueden citar: baja cobertura del genoma, diFXOWDGHV HQ OD LQWHUSUHWDFLyQ GH ORV UHVXOWDGRV (principalmente para las Isoenzimas) y, en el FDVR GH ODV SURWHtQDV GH UHVHUYD GDGR TXH PXFKRV GH ORV JHQHV FRGLFDQWHV VXHOHQ HVWDU HVtrechamente ligados (familias multignicas), no se puede asumir independencia entre los loci. 5.4 Marcadores moleculares Un marcador molecular es simplemente un VHJPHQWR GH $'1 FRQ XQD XELFDFLyQ HVSHFtFD HQ XQ FURPRVRPD SXQWR GH UHIHUHQFLD cuya herencia puede seguirse en individuos de una poblacin. La secuencia puede pertenecer D UHJLRQHV FRGLFDQWHV JHQHV R VLQ IXQFLyQ conocida. Con el advenimiento de las tcnicas moderQDV GH ELRORJtD PROHFXODU SDUD PiV GHWDOOH YHU I.- 4), surgieron diversos mtodos de deteccin GH SROLPRUVPR JHQpWLFR GLUHFWDPHQWH D QLYHO GH $'1 (Q OD DFWXDOLGDG VH SXHGH REWHQHU XQ nmero prcticamente ilimitado de marcadores en cualquier organismo vivo que permiten analizar la totalidad de la informacin gentica (genoma) de un organismo. Para describir los distintos tipos de marcaGRUHV PROHFXODUHV VH VHJXLUi XQD FODVLFDFLyQ DUELWUDULD HQ EDVH D ODV PHWRGRORJtDV TXH HPplean para su deteccin. Todas estas tcnicas SDUWHQ FRPR SULPHU SDVR GH H[WUDHU $'1 JHnmico de la planta bajo estudio.

5.4.1 Marcadores basados en la hibridacin GHO $'1 5.4.1.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism R SROLPRUVPR HQ OD ORQJLWXG de fragmentos de restriccin (Botstein et al., 1980) Son los marcadores moleculares ms antiguos y an son usados para algunas aplicaciones importantes como mapeo comparativo y estudios de sintenia entre especies (ver Parte ,,, &DStWXOR  $SOLFDFLRQHV GH ORV 0DUFDGRUHV Moleculares"). Este marcador se basa en la comparacin de SHUOHV GH EDQGDV JHQHUDGRV D SDUWLU GHO $'1 de distintos individuos por digestin con enzimas de restriccin. Los fragmentos obtenidos se separan por su tamao mediante electroforeVLV \ VH WUDQVHUHQ D XQD PHPEUDQD GRQGH VRQ desnaturalizados y luego hibridados con una VRQGD (VWD VRQGD HV XQ IUDJPHQWR GH $'1 GH cadena simple (de secuencia conocida o no) que est marcado radioactivamente. La sonda se unir a aquellos fragmentos de restriccin con secuencia complementaria a la misma (ver enzimas de restriccin y mtodo de Southern Blot HQ 3DUWH , &DStWXOR  +HUUDPLHQWDV EiVLcas de Ingenieria Genetica). Para la visualizacin, la membrana se exSRQH D XQD SODFD UDGLRJUiFD (Q FXDQWR D la sonda empleada esta puede ser genmica FRQ DOWD SURSRUFLyQ GH $'1 QR FRGLFDQWH QR SHUWHQHFLHQWH D QLQJ~Q JHQ R GH $'1F FXDQdo proviene de un transcripto). Tambin puede REWHQHUVH D SDUWLU GH $'1 GH RUJDQHODV PLtocondrias o cloroplastos). Pueden emplearse sondas aisladas de especies relacionadas (por ejemplo, sondas aisladas de tomate pueden emplearse en papa y viceversa). La variabilidad gentica presente en el marcador molecular proviene de diferencias en la VHFXHQFLD GHO $'1 JHQyPLFR GHELGDV D PXtaciones puntuales en los sitios de restriccin, a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc., TXH PRGLFDQ OD GLVWDQFLD HQWUH SDUHV GH VLtios de restriccin generando fragmentos poOLPyUFRV GH GLIHUHQWHV WDPDxRV )LJXUD   8Q ORFXV 5)/3 HVWi GHQLGR SRU OD FRPELQDcin de una enzima de restriccin y una sonda. Individuos homocigotas poseen el mismo pa-

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Figura 3.

trn de restriccin en ambos cromosomas homlogos y por lo tanto producen una sola banda. Ejemplos de nomenclatura utilizada para loci RFLP son XNpb136 de arroz o Xpsr912-2A de trigo, que hacen referencia al laboratorio de origen y a las sondas utilizadas. Las ventajas de los RFLPs radican en que son altamente reproducibles, codominantes y multiallicos. Por otro lado, cuentan con las GHVYHQWDMDV GH VHU PX\ ODERULRVRV GLItFLOHV GH automatizar, se necesita disponer de las sondas para la especie en estudio y requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas y trabajar con radiactivo, lo que los hace relativamente costosos. 5.4.1.2 VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) o repeticiones en tandem de nmero variable Los VNTR, tambin conocidos como mini-

satlites, son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pares de bases. El nmero de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas de detectar los VNTR: por hibridacin o por tcnicas de PCR. En el priPHU FDVR HO $'1 JHQyPLFR HV GLJHULGR FRQ enzimas de restriccin que reconocen sitios adyacentes a la regin repetida. Los fragmentos se separan por electroforesis, se inmovilizan en una membrana y se detectan mediante sondas. La longitud de los fragmentos de restriccin producidos en diferentes individuos vaUtD GH DFXHUGR DO Q~PHUR GH UHSHWLFLRQHV GHO minisatlite. La diferencia bsica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la tcnica de VNTR las sondas estn constituidas por secuencias homlogas a las secuencias repetidas de los minisatlites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma son detectados simultneamente, mientras que en RFLP, las sondas son homlogas a secuencias ~QLFDV GHO JHQRPD GHWHFWDQGR DVt XQR R SRcos loci cada vez. De esta manera, en el autorradiograma, al contrario del patrn simple de bandas obtenido por RFLP, para minisatlites VH REWLHQH XQ SHUO FRPSOHMR GH EDQGDV P~OWLples. Los VNTR tienen la ventaja que adems GH H[SORUDU HO SROLPRUVPR HQ OD ORQJLWXG GH los fragmentos de restriccin en cada locus hiSHUYDULDEOH XWLOL]DQ WDPELpQ HO SROLPRUVPR HQ el nmero y distribucin de estos loci a lo largo GHO JHQRPD SRVLELOLWDQGR DVt OD YLVXDOL]DFLyQ simultnea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta tcnica, son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. Los minisatlites tambin pueden ser detecWDGRV PHGLDQWH OD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH ORV segmentos conteniendo diferente nmero de repeticiones, utilizando iniciadores o "primers" TXH DQTXHHQ ORV 9175 \ OXHJR VX YLVXDOL]Dcin mediante electroforesis y tincin con bromuro de etidio. Esta opcin se ha vuelto ms frecuente con el aumento de informacin de secuencias en bases de datos que permiten el GLVHxR GH LQLFLDGRUHV DQTXHDQWHV D GHWHUPLnados minisatlites. Sin embargo estos marcadores han sido poco utilizados en plantas. 5.4.2 0DUFDGRUHV EDVDGRV HQ OD DPSOLFDFLyQ DUELWUDULD R VHPL DUELWUDULD GHO $'1

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5.4.2.1 5$3'V 5DQGRP $PSOLHG Polymorphic DNAs R $'1 SROLPyUFR DPSOLFDGR DOHDWRULDPHQWH :LOOLDPV HW DO  :HOVK \ 0F&OHOODQG  /D PHWRGRORJtD GH 5$3' IXH GHVDUUROODGD de forma independiente por dos grupos de (VWDGRV 8QLGRV 8Q JUXSR OD GHQRPLQy 5$3' \ HO RWUR $33&5 Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction o reaccin en cadena de la polimerasa con iniciadores arbitrarios). /D WpFQLFD GH 5$3' HV XQD YDULDQWH GH 3&5 que utiliza un solo oligonucletido de 10 bp TXH KLEULGD DO D]DU FRQ HO $'1 HQ HVWXGLR 3DUD TXH VH JHQHUH XQ IUDJPHQWR 5$3' HV QHFHsario que el oligonucletido iniciador hibride HQ ODV GRV FDGHQDV GHO $'1 HQ RULHQWDFLRQHV RSXHVWDV VXFLHQWHPHQWH FHUFDQDV PHQRV GH  ES FRPR SDUD SHUPLWLU OD DPSOLFDFLyQ La secuencia del oligonucletido es aleatoria DO LJXDO TXH ORV VLWLRV GH KLEULGDFLyQ HQ HO $'1 SRU OR WDQWR OD VHFXHQFLD DPSOLFDGD HV GHVFRnocida. El iniciador puede hibridar en distintos VLWLRV GHO $'1 VLQ QHFHVLGDG GH FRPSOHPHQWDriedad exacta de bases, dado que la PCR se hace con temperaturas de unin del iniciador bajas, generando varios fragmentos que son resueltos mediante electroforesis y posterior tincin (Figura 4). Cada banda del patrn de DPSOLFDFLyQ HV FRQVLGHUDGD XQ ORFXV 5$3' GHQLGR SRU OD VHFXHQFLD GHO LQLFLDGRU \ HO SHVR PROHFXODU (O SROLPRUVPR TXH VH REVHUYD HQ-

tre distintos individuos consiste en la presencia R DXVHQFLD GH IUDJPHQWRV GH $'1 DPSOLFDGR debido a mutaciones en el sitio de reconocimiento del iniciador, deleciones, inserciones. Este marcador no permite diferenciar individuos heterozigotas, por lo que es un marcaGRU GRPLQDQWH /RV PDUFDGRUHV 5$3' HVWiQ basados en una tcnica sencilla, de bajo costo de implementacin, automatizable y no radioDFWLYD $ GLIHUHQFLD GH ORV PDUFDGRUHV EDVDGRV en PCR convencional no se requiere informaFLyQ QXFOHRWtGLFD SUHYLD SDUD VX GHVDUUROOR VH dispone de un nmero ilimitado de marcadores \ HO QLYHO GH ORFL SROLPyUFRV HV DOWR /D SULQFLpal desventaja de esta tcnica es su baja reproducibilidad entre laboratorios, en el sentido GH TXH SHTXHxDV PRGLFDFLRQHV HQ OD WpFQLFD FRPR SRU HMHPSOR FRQFHQWUDFLyQ GH $'1 LQLFLDO PRGHOR GH WHUPRFLFODGRU RULJHQ GH $'1 Polimerasa termoestable, etc., pueden alterar HO SDWUyQ GH IUDJPHQWRV GH $'1 JHQHUDGRV SRU 5$3' GH XQD PXHVWUD 5HODFLRQDGRV FRQ ORV 5$3'V HQFRQWUDPRV D ORV PDUFDGRUHV '$) '1$ $PSOLFDWLRQ Fingerprinting &DHWDQR $QROOpV HW DO  \ $33&5 $rbitrary Primed 3&5 :HOVK \ 0F&OHOODQG   '$) \ $33&5 VRQ WpFQLFDV VLPLODUHV D 5$3' '$) LQYROXFUD HO XVR de iniciadores arbitrarios de 5 pares de bases de longitud. Esto incrementa la probabilidad de DSDUHDPLHQWR FRQ HO $'1 PROGH UHVSHFWR DO

Figura 4.

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5$3' \ SRU OR WDQWR UHVXOWD HQ XQ SHUO PiV complejo de bandas. La visualizacin se lleva a cabo por medio de geles de poliacrilamida WHxLGRV FRQ SODWD $33&5 XWLOL]D LQLFLDGRUHV ligeramente ms largos que la tcnica anterior (aprox. 20 pares de bases). Los productos de DPSOLFDFLyQ VRQ PDUFDGRV UDGLDFWLYDPHQWH \ tambin pueden ser resueltos por electroforesis en geles de poliacrilamida. Las ventajas y limitaciones de estas tcnicas son similares a ODV GHVFULSWDV SDUD ORV 5$3'  $)/3V $PSOLHG )UDJPHQW /HQJWK Polymorphism R SROLPRUVPRV HQ OD ORQJLWXG GH IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV 9RV HW DO  /RV PDUFDGRUHV $)/3 FRQVWLWX\HQ XQD KHrramienta poderosa de anlisis del genoma dado que poseen un alto poder de deteccin GH OD YDULDELOLGDG JHQpWLFD (O HQVD\R GH $)/3 FRPELQD OD HVSHFLFLGDG UHVROXFLyQ \ SRGHU de muestreo de la digestin con enzimas de restriccin con la velocidad y practicidad de la GHWHFFLyQ GH SROLPRUVPRV PHGLDQWH 3&5 VLQ necesidad de disponer de informacin previa del genoma a estudiar. Desde su desarrollo y divulgacin esta tcnica se utiliza ampliamente en el anlisis de plantas. Consiste esencialmente en cuatro etapas: i) HO $'1 JHQyPLFR HV FRUWDGR FRQ GRV HQ]LPDV de restriccin. Generalmente una es de corte raro (ej. EcoRI), que reconoce de 6 a 8 pares de bases y otra es de corte frecuente (ej. MseI) que reconoce 4 pares de bases; ii) fragmenWRV GH $'1 GREOH FDGHQD GH  D  SDUHV GH bases llamados adaptadores se ligan en forma HVSHFtFD D ORV H[WUHPRV GH ORV IUDJPHQWRV REWHQLGRV HQ HO SDVR DQWHULRU JHQHUDQGR DVt HO PROGH SDUD OD DPSOLFDFLyQ SRVWHULRU GHO $'1 LLL VH DPSOLFDQ VHOHFWLYDPHQWH IUDJPHQWRV por PCR. En esta etapa, se utilizan iniciadores de aproximadamente 20 nucletidos que conWLHQHQ XQD VHFXHQFLD HVSHFtFD FRPSOHPHQWDria a la secuencia de los adaptadores y adems, 1 a 3 nucletidos selectivos adicionales de secuencia arbitraria en su extremo 3. Dado que slo una subpoblacin de los fragmentos RULJLQDOHV HV DPSOLFDGD VH REWLHQH XQ SDWUyQ de bandas que permite un registro adecuado. /D DPSOLFDFLyQ GHVFULSWD HQ LLL VH UHDOL]D HQ GRV HWDSDV XQD SULPHUD DPSOLFDFLyQ VHOHFWL-

YD HPSOHDQGR XQ QXFOHyWLGR DUELWUDULR DPSOLFDFLyQ  R SUHDPSOLFDFLyQ \ OXHJR HVWH SURGXFWR GH DPSOLFDFLyQ REWHQLGR HV HPSOHDGR FRPR PROGH HQ XQD QXHYD DPSOLFDFLyQ HPpleando iniciadores que poseen 2 nucletidos VHOHFWLYRV DGLFLRQDOHV DO DQWHULRU DPSOLFDFLyQ  R DPSOLFDFLyQ QDO  LY (O DQiOLVLV GH ORV IUDJPHQWRV DVt DPSOLFDGRV VH UHDOL]D PHdiante electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Si uno de los iniciadores empleados est marcado radiactivamente, se YLVXDOL]DUi PHGLDQWH DXWRUUDGLRJUDItD VL XQR GH los iniciadores est marcado con un compuesWR XRUHVFHQWH SXHGH VHU UHVXHOWR HPSOHDQGR XQ VHFXHQFLDGRU DXWRPiWLFR $OWHUQDWLYDPHQWH se puede visualizar mediante tincin con nitrato de plata (Figura. 5).

Figura 5.

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/D EDVH JHQpWLFD GHO SROLPRUVPR GH $)/3 es la ausencia o presencia de fragmentos amSOLFDGRV GH XQ WDPDxR GHWHUPLQDGR GDGR SRU mutaciones puntuales, inversiones, inserciones y deleciones que llevan a la prdida o ganancia de un sitio de restriccin o la alteracin GH OD VHFXHQFLD UHFRQRFLGD R DPSOLFDGD SRU ORV LQLFLDGRUHV $O LJXDO TXH HQ ORV 5$3'V QR es posible distinguir individuos heterocigotas por lo que se trata de un marcador dominante. 8QD EDQGD $)/3 VH LQWHUSUHWD FRPR XQ ORFXV GHQLGR SRU ODV GRV HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ una combinacin de primers que incluyen las bases selectivas (Ej. Eco5,$7&Mse,$$* \ un peso molecular. Su implementacin en laboratorio requiere de una infraestructura considerable, son relativamente laboriosos para su obtencin y el costo es medio a alto. Estos marcadores presentan un alto poder de deteccin de la variabilidad gentica, ya que se explora simulWiQHDPHQWH HO SROLPRUVPR GH DXVHQFLDSUHsencia de sitios de restriccin (como los RFLP) \ OD RFXUUHQFLD R QR GH DPSOLFDFLyQ D SDUWLU GH VHFXHQFLDV DUELWUDULDV FRPR ORV 5$3'V  Es un marcador mucho ms robusto que los 5$3'V \D TXH HQ OD DPSOLFDFLyQ VH XWLOL]DQ oligonucletidos ms largos, que aumentan VLJQLFDWLYDPHQWH OD HVSHFLFLGDG GH OD UHDFFLyQ VLQ SHUGHU ODV YHQWDMDV GH OD DPSOLFDFLyQ de secuencias al azar (no requiere informacin SUHYLD GH VHFXHQFLD GH $'1  $VLPLVPR VH pueden emplear distintas enzimas de restriccin e iniciadores selectivos, resultando en una LOLPLWDGD SRVLELOLGDG GH JHQHUDU SROLPRUVPRV 2WUD YHQWDMD GH ORV $)/3V HV HO Q~PHUR GH fragmentos (marcadores) obtenidos por reaccin y resueltos por electroforesis (oscila entre    FRQWUD ORV   GH 5$3'V  Una variante de esta tcnica es la llamaGD F'1$$)/3 TXH HQ YH] GH $'1 JHQyPLFR SDUWH GH $51 PHQVDMHUR TXH HV FRSLDGR D $'1F (VWD PHWRGRORJtD HV HPSOHDGD HQ anlisis de expresin diferencial de genes, estudios del transcriptoma y genmica funcional. 5.4.3. Marcadores moleculares basados en OD DPSOLFDFLyQ VLWLRHVSHFtFD GHO $'1 En contraste con los marcadores basados en OD DPSOLFDFLyQ GH VHFXHQFLDV DUELWUDULDV ORV

PDUFDGRUHV LQFOXLGRV HQ OD SUHVHQWH FDWHJRUtD UHTXLHUHQ GHO GLVHxR GH LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV SDUD OD DPSOLFDFLyQ GH XQ ORFXV HQ SDUWLFXODU 5.4.3.1 Microsatlites (Litt y Luty 1989) Los microsatlites son regiones hipervariables del genoma que contienen arreglos de secuencias simples en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucletidos que se repiten entre 10 y 100 veces. Los marcadores microsatlites, tambin denominados Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP), Simple Sequence Repeat Polymorphism (SSRP), Simple Sequence Repeats (SSR) o SequenceTagged Microsatellite Sites (STMS) se encuentran distribuidos por todo el genoma de la ma\RUtD GH ODV HVSHFLHV HXFDULRWDV Los microsatlites se detectan mediante su DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 XVDQGR LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV GH  D  SE GH ORQJLWXG TXH KLEULGDQ HQ OD UHJLyQ TXH DQTXHD DO WDQGHP GH repeticiones (microsatlite). Estos marcadores se resuelven por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, mediante tincin con plata o por autoradiograItD HQ HO FDVR GH XVDU XQ LQLFLDGRU PDUFDGR radioactivamente). Si se dispone de un secuenciador automtico, se pueden resolver por tamao en este equipo mediante el empleo de XQ LQLFLDGRU PDUFDGR FRQ XQ XRUyIRUR SRVLELlitando un anlisis automatizado. /D EDVH JHQpWLFD GHO SROLPRUVPR GHWHFWDdo en microsatlites se basa en la variabilidad del nmero de repeticiones en tandem y, consecuentemente, en el tamao del microsatliWH DPSOLFDGR HQ LQGLYLGXRV GH XQD HVSHFLH Estas diferencias son originadas durante la reSOLFDFLyQ GHO $'1 GHELGR D IDOODV HQ OD DFFLyQ GH OD $'1 SROLPHUDVD GXUDQWH HO FRSLDGR GH una regin repetida donde incorpora o elimina repeticiones. Otro mecanismo responsable de la variacin es el entrecruzamiento desigual entre cromosomas homlogos. En este caso se generan alelos con diferencias mayores en el nmero de repeticiones. El desarrollo de marcadores microsatlites requiere del conocimiento de las secuencias DQTXHDQWHV DGHFXDGDV SDUD HO GLVHxR GH ORV LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV /RV SULPHURV 665 se desarrollaron a travs de un proceso ex-

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perimental complejo que implic la obtencin de genotecas enriquecidas en microsatlites, secuenciacin, diseo de iniciadores aptos SDUD DPSOLFDU PLFURVDWpOLWHV SRU 3&5 \ VHleccin de loci con patrones de herencia simSOH $FWXDOPHQWH ODV VHFXHQFLDV DQTXHDQWHV pueden obtenerse a partir de las secuencias depositadas en las bases de datos (bsqueda in silico). El uso de programas informticos especializados en la bsqueda de microsatlites ha revelado que existen secuencias con estas FDUDFWHUtVWLFDV IRUPDQGR SDUWH GH VHFXHQFLDV que se expresan (genes), denominndose SSR JpQLFRV R (67665V $XQTXH WHQGUtDQ XQ QLYHO GH SROLPRUVPR PHQRU VHUtDQ PiV IiFLOPHQWH transferibles entre especies relacionadas. 8Q ORFXV 665 HVWi GHQLGR SRU ODV VHFXHQFLDV GH ORV LQLFLDGRUHV DQTXHDQWHV DO PLFURVDWpOLWH 3RU HO DOWR SROLPRUVPR TXH VXHOHQ presentar por locus (multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies autgamas como el trigo. Estos marcadores son codominantes (ambos alelos de un individuo heterocigota pueden ser YLVXDOL]DGRV  JHQRPDHVSHFtFRV \ DOWDPHQWH SROLPyUFRV HQ FRPSDUDFLyQ FRQ ORV 5)/3V \ 5$3'V 6X LPSOHPHQWDFLyQ HQ XQ ODERUDWRULR requiere de mayor infraestructura y presupuesWR TXH ORV 5$3'V VLHQGR VHPHMDQWHV HQ HVWH DVSHFWR D ORV $)/3V 5.4.3.2 Otros marcadores basados en los microsatlites Una de las limitaciones para la utilizacin de los marcadores microsatlites es la necesidad GH FRQRFHU ODV UHJLRQHV TXH DQTXHDQ D ODV repeticiones para poder desarrollar los iniciaGRUHV HVSHFtFRV $Vt VH GHVDUUROODURQ PDUcadores moleculares buscando explorar las repeticiones microsatlites sin necesidad de VHFXHQFLDU HO $'1 (QWUH HVWD FODVH GH PDUFDdores podemos encontrar: MP-PCR (Microsatellite-Primed PCR): en el desarrollo de este marcador molecular, se utiliza un iniciador que contiene las repeticiones GH XQ PLFURVDWpOLWH HVSHFtFR SDUD DPSOLFDU HO $'1 (Q ODV UHJLRQHV GHO $'1 TXH SRVHHQ las dos secuencias inversamente orientadas GH HVWH PLFURVDWpOLWH HVSHFtFR KLEULGDUi HO LQLFLDGRU \ DPSOLFDUi HO IUDJPHQWR GH $'1 OR-

FDOL]DGR HQWUH HOODV &RQFHSWXDOPHQWH VHUtD VLPLODU D 5$3' HPSOHDQGR XQ LQLFLDGRU FRQ OD secuencia repetida del microsatlite. ISSR (,QWHU665 DPSOLFDWLRQ): se basan en OD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 HPSOHDQGR LQLFLDGRres que contienen en su secuencia repeticiones de di o trinucletidos junto con 4 bases nucleoWtGLFDV GHWHUPLQDGDV HQ XQR GH VXV H[WUHPRV (VWR SHUPLWH OD DPSOLFDFLyQ SDUFLDO GH WRGDV ODV UHJLRQHV SRWHQFLDOPHQWH DPSOLFDGDV SRU el marcador MP-PCR, descripto anteriormente, aumentando la reproducibilidad, que es una de ODV OLPLWDFLRQHV GHO XVR GH ORV 033&5 $O WHner en el iniciador esas 4 bases extras, a este tipo de marcador se lo conoce tambin como PLFURVDWpOLWH DQFODGR $033&5 Anchored Microsatellite-Primed PCR). 6$03/( 6HOHFWLYH $PSOLFDWLRQ RI Microsatellite Polymorphic Loci R DPSOLFDFLyQ VHOHFWLYD GH ORFL PLFURVDWpOLWHV SROLPyUFRV (Q HVWD PHWRGRORJtD VH DPSOLFDQ ORFL PLFURVDWpOLtes a partir de un iniciador arbitrario empleando GRV WpFQLFDV PLFURVDWpOLWHV \ $)/3 6H UHDOL]DQ WRGDV ODV HWDSDV GH $)/3 HV GHFLU GLJHVtin con dos enzimas de restriccin, ligacin de DGDSWDGRUHV SUHDPSOLFDFLyQ \ DPSOLFDFLyQ VHOHFWLYD GHO $'1 6yOR TXH HQ OD DPSOLFDFLyQ VHOHFWLYD QDO VH HPSOHD HO LQLFLDGRU GH $)/3 con sus tres nucletidos selectivos en combiQDFLyQ FRQ XQ LQLFLDGRU 6$03/( (VWH LQLFLDdor, posee en su secuencia bases complemenWDULDV D XQ PLFURVDWpOLWH /D EDQGD SROLPyUFD UHVXOWDQWH GH OD DPSOLFDFLyQ GHO $'1 FRQ HO PDUFDGRU 6$03/( SXHGH VHU FRQYHUWLGD HQ XQ marcador microsatlite convencional, a parir del clonado y secuenciacin de la misma. 5.4.3.3. STS (Sequence-Tagged Sites) o sitios marcados por secuencias (Olson et al. 1989) STS es un trmino general dado a un locus HQ SDUWLFXODU GHQLGR SRU ODV VHFXHQFLDV GH VXV LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV 8Q 676 SXHGH VHU JHnerado para cualquier sitio del genoma siempre y cuando ese sitio (locus) pueda ser clonado y secuenciado. Un STS debe satisfacer dos condiciones: se debe conocer su secuencia, TXH SHUPLWH GLVHxDU LQLFLDGRUHV HVSHFtFRV TXH SHUPLWLUiQ VX DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 \ WHner una localizacin nica en el cromosoma o

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genoma estudiado. Estos marcadores son suPDPHQWH XVDGRV HQ PDSHR ItVLFR GHWDOODGR GH genomas grandes para ensamblar, por ejemSOR FORQHV GH %$& HQWUH Vt $OWHUQDWLYDPHQWH SDUD XQD XWLOL]DFLyQ PiV HFLHQWH GH PDUFDGRUHV PROHFXODUHV HQ SURgramas de mejoramiento existe la posibilidad de convertir marcadores complejos y costosos R LQHVWDEOHV FRPR 5)/3V $)/3V \ 5$3'V HQ PDUFDGRUHV 3&5 DOHORHVSHFtFRV TXH VRQ econmicos, robustos y de sencilla implemenWDFLyQ HQ FXDOTXLHU ODERUDWRULR GH ELRORJtD PROHFXODU ORV PDUFDGRUHV 3&5 DOHORHVSHFtFRV WDPELpQ VHUtDQ 676 HQ HO VHQWLGR GH TXH VH WUDWD GH XQD VHFXHQFLD GH $'1 FRUWD TXH LGHQWLFD XQ ORFXV HVSHFtFR GHO JHQRPD \ SXHGH VHU DPSOLFDGD SRU 3&5  /D HVWUDWHJLD FRQVLVWH HQ DLVODU HO IUDJPHQWR GH $'1 SROLPyUFR GHO JHO se clona, se secuencia y se disean iniciadores HVSHFtFRV GH DOUHGHGRU GH  SE SDUD DPSOLcar por PCR dicho fragmento. Cuando se parte GH XQ IUDJPHQWR 5$3' HO PDUFDGRU GHULYDGR mediante este proceso ha sido descripto como 6&$5 6HTXHQFH &KDUDFWHUL]HG $PSOLHG Region, Paran y Michelmore 1993). El problema que enfrentan estas estrategias VXHOH VHU HO EDMR QLYHO GH SROLPRUVPR HQWUH variedades de una misma especie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las posibilidades de encontrar mutaciones tiles para desarrollar estos marcadores. De todos modos, existen antecedentes exitosos de desarrollo de marcadores GH 3&5 DOHORHVSHFtFRV HQ WULJR SDUD FDUDFteres de inters agronmico como pueden ser alelos de gluteninas, genes de resistencia a patgenos, genes vinculados a adaptacin, etc.

Una segunda variante de los STS son ORV PDUFDGRUHV &$36 &OHDYDJH $PSOLHG Polymorphic Sequence) o "secuencia poliPyUFD DPSOLFDGD \ FOLYDGD .RQLHF]Q\ \ $XVXEHO   (Q HVWD WpFQLFD WDPELpQ FRQRFLGD FRPR 5)/33&5 XQ IUDJPHQWR GH $'1 HV DPSOLFDGR SRU 3&5 OXHJR GLJHULGR FRQ enzimas de restriccin y resuelto por electroforesis en agarosa o poliacrilamida. Este mtodo aprovecha la capacidad que posee la tcnica GH 3&5 GH DPSOLFDU VHJPHQWRV HVSHFtFRV GH $'1 FRQ OD FDSDFLGDG TXH SRVHHQ ODV HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ GH FRUWDU HO $'1 HQ VHcuencias blanco de la enzima de restriccin. La EDVH JHQpWLFD GHO SROLPRUVPR GHWHFWDGR SRU HO PDUFDGRU &$36 HV OD SUHVHQFLDDXVHQFLD GH VLWLRV GH UHVWULFFLyQ HQ OD VHFXHQFLD DPSOLFDGD SRU 3&5 (VWH PDUFDGRU SHUPLWH LGHQWLFDU individuos heterocigotas, por lo que se comporta como marcador codominante (Figura 6). /RV PDUFDGRUHV 676 \ VXV YDULDQWHV 6&$5 \ &$36 WLHQHQ OD YHQWDMD GH UHTXHULU XQ HQVDyo metodolgico sencillo y altamente reproducible por los que son fcilmente transferibles a otros laboratorios, permitiendo que sean muy usados en seleccin asistida por marcadores. $VLPLVPR VHJ~Q ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH VX GLVHo, pueden ser codominantes y ser analizados en simultneo varios loci STS en un mismo gel. $FWXDOPHQWH GDGD OD GLVSRQLELOLGDG GH VHcuencias en base de datos es posible tambin disear marcadores STS directamente a partir de secuencias de inters (secuencias genmicas, secuencias ESTs, etc) evitndose de este modo el trabajo previo de secuenciacin del STS.

Figura 6.

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5.5 Marcadores Expresin

Funcionales

de

(Q OD DFWXDOLGDG ODV WHFQRORJtDV GH PDUFDdores moleculares en plantas superiores han VXIULGR XQ FDPELR $Vt OD PD\RUtD GH ORV PDUcadores descriptos anteriormente derivan del $'1 JHQyPLFR \ SRU OR WDQWR SXHGHQ SHUWHnecer a regiones transcriptas y no transcriptas del genoma. Estos marcadores basados en $'1 GHULYDGR GH FXDOTXLHU UHJLyQ GHO JHQRma, han sido descriptos como marcadores de $'1 DO D]DU 5'0V Random DNA Markers). Sin embargo, durante los ltimos aos se ha observado una fuerte tendencia hacia el desarrollo de marcadores moleculares derivados de la regin transcripta del genoma (genes). Esto ha sido posible gracias a la disponibilidad de un gran nmero de secuencias de clones de $'1F $51P WUDQVFULSWR D $'1 HPSOHDQGR transcriptasa reversa, tambin conocidos como Expressed Sequence Tags o ESTs), en bases de datos pblicas (TIGR, NCBI; EBI, etc., ver 3DUWH , &DStWXOR  $QiOLVLV LQIRUPiWLFR GH VHcuencias moleculares). Los tipos de marcadores desarrollados a partir de la regin expresada del genoma son numerosos, complejos y variados. Slo se describirn en detalle aquellos marcadores ms relevantes y que no fueron enunciados anteriormente, recomendndose la lectura de la revisin de Gupta y Rustgi (2004) para informacin adicional. 5.5.1 Marcadores COS (Conserved Orthologue Set) Los marcadores COS representan genes funcionales conservados en un amplio rango de plantas dicotiledneas. Inicialmente, estos marcadores fueron desarrollados a partir de la comparacin de la secuencia genmica de Arabidopsis con la base de datos de ESTs de tomate. Se postula que estos marcadores podrn ser aplicados en el mapeo comparativo entre genomas emparentados y, por lo tanto, sern tiles para estudios taxonmicos y en la GHGXFFLyQ GH ODV UHODFLRQHV ORJHQpWLFDV 5.5.2 Marcadores GTMs (Gene Targeted Markers)

/RV *70V VH EDVDQ HQ SROLPRUVPRV GHQWUR de genes, independientemente de si se conocen o no sus funciones. Estos marcadores se pueden desarrollar a partir de secuencias disSRQLEOHV HQ ODV EDVHV GH GDWRV F'1$(67VHcuencias genmicas que representan genes) o D SDUWLU GH JHQRWHFDV GH $'1 JHQyPLFR HQULquecidas para secuencias de genes. Un ejemSOR GH *70V VRQ ORV $QiORJRV D *HQHV GH Resistencia (Resistance Gene Analogs 5*$V que son marcadores basados en secuencias derivadas de genes de resistencia a patgeQRV /DV VHFXHQFLDV 5*$V VRQ ~WLOHV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH QXHYRV JHQHV GH UHVLVWHQFLD D patgenos en plantas. 5.5.3 Marcadores Funcionales propiamente dichos (FM: Functional Markers) El desarrollo reciente de varios proyectos de genmica estructural y funcional en especies cultivadas, ha generado un enorme caudal de informacin a nivel de secuencias y esto ha posibilitado el desarrollo de un nuevo tipo de marcadores denominados marcadores funcionales (FM). Estos marcadores derivan de motivos SROLPyUFRV PXWDFLRQHV GHQWUR GH ORV JHQHV \ HVWRV SROLPRUVPRV DIHFWDQ GLUHFWDPHQWH OD H[SUHVLyQ IHQRWtSLFD GHO FDUiFWHU DVRFLDGR DO JHQ $QGHUVHQ \ /EEHUVWHGW   /RV )0 reciben tambin el nombre de marcadores diagnsticos, marcadores de genes blanco o marcadores perfectos (perfect markers). El desarrollo de FM requiere de secuencias allicas de genes caracterizados funcionalPHQWH D SDUWLU GH ORV FXDOHV SXHGDQ LGHQWLFDUVH PRWLYRV SROLPyUFRV IXQFLRQDOPHQWH UHVponsables de afectar el fenotipo de la planta. El primer paso en el desarrollo de FM es disponer de la secuencia de un gen con una funcin asignada. En Arabidopsis, menos del 10% de sus aproximadamente 25.000 genes han sido caracterizados funcionalmente. En otras especies, el nmero de secuencias caracterizadas funcionalmente es sustancialmente menor. Sin embargo, considerando la identidad de secuencias es posible asignar funciones putativas (probables) a un 30-50% de las secuencias expresadas (ESTs) en otras especies. Esta estrategia de considerar genes candidatos y las relaciones sintnicas (similitud) entre genomas

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de plantas ha sido explotada exitosamente para LGHQWLFDU JHQHV DJURQyPLFDPHQWH LPSRUWDQWHV El segundo paso en el desarrollo de FM es la E~VTXHGD GH VHFXHQFLDV SROLPyUFDV R DOHORV del gen en cuestin. Para ello se deben analizar las secuencias del gen en ms de un genotipo por especie. Las estrategias de desarrollo GH PDUFDGRUHV IXQFLRQDOHV YDUtDQ GHVGH OD GHWHFFLyQ GH SROLPRUVPRV GH XQ VROR QXFOHyWLGR (SNPs), el descubrimiento en regiones gnicas de secuencias tipo microsatelites (SSRs), la LGHQWLFDFLyQ GH VLWLRV GH UHVWULFFLyQ TXH GLIHUHQFLHQ DOHORV &$3V  OD GHWHFFLyQ GH LQVHUciones y/o deleciones (InDels), las variaciones a nivel de secuencias que se pueden revelar HPSOHDQGR OD PHWRGRORJtD GH FRQIRUPDFLyQ GH $'1 VLPSOH FDGHQD HQ HOHFWURIRUHVLV SDUFLDOmente desnaturalizantes (SSCP), etc. Posteriormente, se debe probar la existenFLD GH YDULDFLyQ IHQRWtSLFD DVRFLDGD DO DOHOR HQ cuestin. Esto puede realizarse indirectamente, por estudios de asociacin en poblaciones segregantes, o directamente, mediante la comparacin de genotipos isognicos generados por PXWDJpQHVLV HVSHFtFD HQ OD VHFXHQFLD GHO JHQ mediante TILLING, Targeting-Induced Local Lesions In Genomes (McCallum et al., 2003), etc. En varias aplicaciones, la gran ventaja que presentan los FM es su ligamiento completo con motivos (mutaciones) funcionales. En contraste con los marcadores tradicionales (distribuidos al azar en el genoma), los FM permiten: L OD DSOLFDFLyQ FRQDEOH GH PDUFDGRUHV HQ SRblaciones sin necesidad de mapeo previo; ii) el uso de marcadores en poblaciones segregantes sin el riesgo de perder informacin debido a la recombinacin; iii) una mejor representacin de la variacin gentica en poblaciones naturales o de mejoramiento. (Q JHQHUDO ORV )0 VRQ ~WLOHV SDUD L OD MDFLyQ PiV HFLHQWH GH DOHORV HQ FXDOTXLHU SREODcin segregante; ii) el anlisis de alelos tanto en poblaciones naturales como de mejoramiento; iii) la combinacin de alelos de FM que afectan idnticos o diferentes caracteres en mejoramiento de plantas; iv) la construccin de haplotipos de FM ligados. En la actualidad se encuentran disponibles varios genes con potencial para el desarrollo

de FM sobre caracteres de importancia agronmica, por ejemplo, altura de planta en cereaOHV WLHPSR GH RUDFLyQ HQ PDt] UHTXHULPLHQtos de vernalizacin en Brassica y trigo, tamao de fruto en tomate, calidad de alimento en arroz; resistencia a enfermedades y respuesta a stress en varias especies, etc. Sin embargo, an en especies modelo, slo el 10% de los genes han sido caracterizados funcionalmente mientras que para especies no modelo, este nmero es probablemente menor al 5%. Los FM derivan de estudios de asociacin realizados en grandes colecciones de genotiSRV R GH OD FRPSDUDFLyQ GH OtQHDV LVRJpQLFDV las cuales tienen un costo alto para su desarrollo, limitando el estudio inicial a uno o unos pocos fondos genticos. Luego estos FM deben ser evaluados en otros fondos genticos, con lo cual, para todo esto es necesario desarroOODU XQ PDUFR H[SHULPHQWDO HVWDGtVWLFR \ ELRinformtico para la acumulacin de datos y las evaluaciones a lo largo de diferentes estudios. Teniendo en cuenta estos factores y el laborioso desarrollo de los FM, la generacin de )0 GHEHUtD FRQFHQWUDUVH HQ JHQHV TXH FRQHUDQ XQD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD VXVWDQFLDO $Vt OD seleccin de genes claves para caracteres de inters agronmico ser crucial y el paso limitante para el desarrollo de FM tiles.  $UUHJORV GH $'1 SDUD HVWXGLRV GH H[presin de genes /RV DUUHJORV GH $'1 arrays) permiten, entre otras cosas, analizar sistemticamente el patrn de expresin gnica de un organismo en escala genmica. De este modo, es posible examinar la expresin simultnea de cientos a miles de genes en varios estadios del desarrollo, en respuesta a diferentes condiciones amELHQWDOHV \ HQ WHMLGRV HVSHFtFRV /RV DUUHJORV GH $'1 VRQ VRSRUWHV VyOLGRV comnmente vidrio o nylon, en los cuales esWiQ MDGDV GH IRUPD RUGHQDGD JUDQ FDQWLGDG GH VHFXHQFLDV GH $'1 GH LQWHUpV PDUFDGRUHV  Estas secuencias pueden ser genes completos o parciales. El empleo de estos arreglos como herramienta para el estudio de expresin GH JHQHV D HVFDOD JHQyPLFD VLJXH WtSLFDPHQte los siguientes pasos: i) la construccin del DUUHJOR GH $'1 LL OD SUHSDUDFLyQ GH VRQGDV

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D SDUWLU GH $51P GH ODV GLVWLQWDV VLWXDFLRQHV a comparar); iii) la hibridizacin del arreglo; iv) la deteccin de la seal y anlisis de los datos por herramientas computacionales apropiadas. Existen diferentes sistemas de arreglos se $'1 GHSHQGLHQGR GH OD IXHQWH GH $'1 GH inters, naturaleza del soporte slido y el sistema de deteccin de la hibridizacin. El sistema ms simple es el que requiere menos inversin, comnmente se lo llama macroarreglo (macroarray) y emplea una membrana de nylon como soporte en combinacin con VRQGDV UDGLDFWLYDV (O VLVWHPD PiV VRVWLFDGR XWLOL]D OiPLQDV GH YLGULR \ VRQGDV XRUHVcentes y se lo llama microarreglo (microarray). $VLPLVPR HQ ORV PDFURDUUHJORV VH GHSRVLWDQ FHQWHQDV GH VHFXHQFLDV GH $'1 PLHQWUDV TXH en los microarreglos la densidad de secuencias es al menos un orden de magnitud mayor. Es importante destacar la existencia de distintos trminos empleados para describir estos arreglos, de modo que glass array, chips GH $'1 \ biochips son denominaciones usadas para los microarreglos sobre placas de vidrio, en cuanto que nylon array y high density membranes son para los macroarreglos sobre nylon. En el rea vegetal, la utilizacin de arreglos GH $'1 SDUD HO DQiOLVLV GH OD H[SUHVLyQ JpQLFD DXPHQWy VLJQLFDWLYDPHQWH GH OD PDQR GH ORV proyectos de secuenciacin completa del genoma de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa (arroz) (para mas detalles ver Rensink y Buell, 2005). $GHPiV GH OD FRQWULEXFLyQ SDUD HO HQWHQGLmiento de la expresin gnica a gran escala, se vislumbra la posibilidad de emplear la tcniFD GH DUUHJORV GH $'1 HQ PHMRUDPLHQWR DVLVtido por marcadores, QJHUSULQWLQJ, seleccin

de accesiones de germoplasma, desarrollo de plantas tolerantes a diferentes tipos de estrs, HWF $VLPLVPR OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV H[presados diferencialmente, en especial aquellos cuya expresin no es abundante o estn involucrados en cascadas de transduccin de seales, ampliar enormemente los horizontes una vez que esos genes puedan ser empleados como marcadores para seleccin asistida (Galbraith, 2006). 5.6 Marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Si bien, son una clase particular de marcaGRUHV PROHFXODUHV TXH SRGUtDQ VHU LQFOXLGRV dentro del punto 5.4, se los decidi tratar aparte dado que los SNPs pueden derivar tanto de VHFXHQFLDV JHQyPLFDV FRGLFDQWHV TXH VH H[SUHVDQ FRPR QR FRGLFDQWHV Recientemente, de la mano de los proyectos de secuenciacin de genomas enteros de plantas, una nueva clase de marcadores molecuODUHV GHQRPLQDGRV 613V SROLPRUVPR GH XQ nucletido), est siendo utilizada en distintos estudios genticos. Estos marcadores se baVDQ HQ OD GHWHFFLyQ GH SROLPRUVPRV UHVXOWDQtes de la alteracin de una nica base en una VHFXHQFLD GH $'1 (Q OD JXUD  VH PXHVWUDQ VHFXHQFLDV GH $'1 HMHPSOLFDQGR DOJXQDV YDULDFLRQHV GH SXQWR ODV FXDOHV VH GHQHQ FRPR 613V $OJXQRV DXWRUHV FRQVLGHUDQ 613V VyOR cuando ocurre una sustitucin de base, otros consideran tambin la insercin/delecin de una base (InDel). Los SNPs pasaron a tener mayor importancia a partir de la secuenciacin del genoma humano, al descubrirse que el 90% de polimorVPR HQFRQWUDGR HQ HO JHQRPD HUDQ 613V

Figura 7.

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Recientemente en el rea vegetal, la secuenciacin a gran escala de genomas completos y de secuencias expresadas (ESTs), ha permitido evidenciar la presencia de SNPs en especies como Arabidopsis thaliana, meln, soja, girasol, DUUR] PDt] FHEDGD WULJR \ FDxD GH D]~FDU HQtre otras. Los marcadores genticos SNP poseen naturaleza biallica y son muy abundantes en el genoma, siendo la frecuencia de SNPs de 1 cada 100-300 pb para los genomas de plantas. Los SNPs pueden localizarse en regiones codiFDQWHV UHJXODWRULDV \ QR FRGLFDQWHV &XDQGR HVWiQ SUHVHQWHV HQ UHJLRQHV FRGLFDQWHV muestran 100% de asociacin con el carcter GH LQWHUpV SRU OR TXH VRQ PX\ ~WLOHV HQ 0$6 (marker assisted selection o seleccin asistida por marcadores) y en el aislamiento de genes. Debido a su frecuencia de distribucin, los SNPs surgen como importantes marcadores para la obtencin de mapas genticos de alta resolucin. Estudios llevados a cabo utilizando Arabidopsis como organismo modelo, han demostrado que estos marcadores posibilitan la obtencin de mapas de una resolucin cerca de 100 veces superior a la obtenida con los marcadores convencionales. Los SNPs son estables desde el punto de vista evolutivo, lo que facilita su empleo en esWXGLRV GH SREODFLRQHV 2WUD FDUDFWHUtVWLFD LPSRUWDQWH HV TXH OD JHQRWLSLFDFLyQ GH ORV 613V no est basada en la medida del tamao de los alelos como ocurre con los otros marcadores moleculares, y la distincin de los alelos puede ser automatizada. Por lo tanto, los SNPs, por tener una tasa de mutacin relativamente baja, ser mucho ms frecuentes en el genoma y ser detectables en forma automatizada, surgen FRPR LPSRUWDQWHV PDUFDGRUHV JHQRWtSLFRV En tiempos recientes se han desarrollado YDULDV PHWRGRORJtDV SDUD GHWHFWDU 613V TXH utilizan diferentes estrategias para comparar UHJLRQHV HVSHFtFDV GHO $'1 REWHQLGDV GH YDrios individuos. La eleccin de uno de los mtodos depender de muchos factores: costos, potencial para el procesamiento de los datos generados, los equipamientos necesarios y la GLFXOWDG GH ORV HQVD\RV Inicialmente, los abordajes para la deteccin GH 613V FRQVLVWtDQ HQ DPSOLFDU \ VHFXHQFLDU

fragmentos genmicos equivalentes de regioQHV JpQLFDV HVSHFtFDV GHO $'1 GH YDULRV LQdividuos y comparar sus secuencias buscando SNPs. La adopcin de esa estrategia involucra HO GLVHxR GH LQLFLDGRUHV SDUD DPSOLFDU VHJPHQWRV GH $'1 GH HQWUH  D  SE GHULvados frecuentemente de genes de inters o SURYHQLHQWHV GH (67V 3DUD OD DPSOLFDFLyQ VH HPSOHDQ $'1V GH YDULRV LQGLYLGXRV SUHIHrencialmente representativos de la diversidad de la poblacin de inters. Estos productos GH DPSOLFDFLyQ UHVXOWDQWHV VH VHFXHQFLDQ directamente y las secuencias resultantes se alinean, empleando programas bioinformticos DSURSLDGRV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH SROLPRUVmos (SNPs). $FWXDOPHQWH OD VHFXHQFLDFLyQ D JUDQ HVFDla del genoma de varios organismos permite la LGHQWLFDFLyQ GH 613V PHGLDQWH OD FRPSDUDcin de millares de secuencias depositadas en las bases de datos, incluyendo clones genmiFRV \ SULQFLSDOPHQWH VHFXHQFLDV GH $'1F \R ESTs. Independientemente del mtodo utilizado SDUD LGHQWLFDU ORV 613V HV LQGLVFXWLEOH OD FRQtribucin de la bioinformtica en dicho proceso. Por otra parte, la necesidad de la validacin experimental de los datos es indispensable. $FWXDOPHQWH HVWiQ GLVSRQLEOHV GLVWLQWRV Pptodos de validacin y genotipado (deteccin), XQR GH HOORV VRQ ORV FKLSV GH $'1 R PLFURDUUHJORV GH $'1 &RPR VH GLMR DQWHULRUPHQWH HVtos chips consisten en arreglos de oligonucletidos de secuencia conocida depositados sobre un soporte slido. Para el caso de la deteccin GH 613V ORV ROLJRQXFOHyWLGRV GLHUHQ HQWUH Vt HQ VLWLRV HVSHFtFRV HQ QXFOHyWLGRV LQGLYLGXDles (en el sitio del SNP). La tcnica es apropiada para analizar varios SNPs en paralelo a partir de cada muestra (en forma multiplex). En una columna del arreglo cuatro oligonucletidos diferirn solamente en el sitio del SNP (tendr cada uno, una de las cuatro bases en la posicin del SNP). Cuando este arreglo es hibridado con productos de PCR o fragmentos GH $'1 JHQyPLFR REWHQLGRV SRU QHEXOL]DFLyQ URPSHU HO $'1 HQ IUDJPHQWRV GH XQ WDPDxR determinado y al azar), estos se unirn solo a los oligonucletidos perfectamente complementarios y los productos no perfectamente

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complementarios (con mismatch) sern lavados. La unin perfecta de cada caso podr ser WRPDGD SRU XQ VLVWHPD GH GHWHFFLyQ $Vt HQ un nico microarreglo (chip) es posible analizar miles de SNPs, correspondientes a distintos loci en simultneo. Otros mtodos de anlisis de SNPs incluyen: FURPDWRJUDItD OLTXLGD GH DOWD UHVROXFLyQ GHVQDWXUDOL]DQWH '+3/&  HVSHFWURPHWUtD GH PDVD ensayos con extensin de iniciadores, PCR en tiempo real, minisecuenciacin, secuenciacin de una nica base, digestin por enziPDV GH UHVWULFFLyQ 5)/3  &$36 HQWUH RWURV Puede encontrarse una revisin detallada de HVWRV PpWRGRV HQ .ZRN   7VXFKLKDVKL \ Dracopoli (2002). En cuanto a las aplicaciones y perspectivas de los marcadores SNPs cabe destacar que han sido fundamentales para el anlisis de genes y el descubrimiento de la base gentiFD PROHFXODU GH LPSRUWDQWHV FDUDFWHUtVWLFDV agronmico-industriales. Como por ejemplo en arroz, el descubrimiento de SNPs involucrados en la calidad de coccin, procesamiento y aroma del grano (Larkin y Park, 2003). La comparacin directa de SNPs tambin ha sido empleada en estudios de gentica de SREODFLRQHV \ ORJHQLD LGHQWLFDFLyQ GH YDriedades, construccin de mapas genticos y ItVLFRV DQiOLVLV IXQFLRQDOHV DQiOLVLV GH DVRFLDcin en mejoramiento gentico vegetal etc. El uso de mtodos masivos de anlisis, como los arreglos de alta densidad de oligonucletidos, se estn empleando en la actualidad SDUD LGHQWLFDU Single Feature Polymorphisms 6)3V 3ROLPRUVPRV GH &DUDFWHUtVWLFD QLFD como una alternativa atractiva para detectar SNPs y otro tipo de mutaciones entre genotipos. Los SFPs son detectados sobre arreglos de alta densidad de oligonucletidos (chips) \ UHSUHVHQWDQ SROLPRUVPRV GH VHFXHQFLD GH $'1 HQWUH GRV JHQRWLSRV GHQWUR GH XQ ROLJRQXcletido individual, el cual se detecta por difeUHQFLD HQ OD DQLGDG GH KLEULGDFLyQ (O WpUPLQR FDUDFWHUtVWLFD feature UHHUH D OD VHxDO GH hibridacin dada por una sonda (oligonucletido) en el arreglo (Zhu y Salmeron, 2007). El descubrimiento de los SNPs, asociado a la posibilidad de utilizarlos como marcadores, permite a los investigadores explorar nuevas

hiptesis. Se considera que muchos de estos SNPs estn localizados en el interior de seFXHQFLDV JpQLFDV HVWR SXHGH VLJQLFDU XQD importante reduccin en el tiempo y costos para el descubrimiento de genes de inters, comparado con los marcadores actualmente GLVSRQLEOHV $VLPLVPR HO GHVDUUROOR FRQVWDQWH GH WHFQRORJtDV SDUD VX DSOLFDFLyQ SHUPLWLUi DXtomatizar el mapeo de alta densidad y, consecuentemente, reducir los costos de su empleo en estudios moleculares a gran escala. 5.7 Lecturas recomendadas
$QGHUVHQ -3 /EEHUVWHGW 7  )XQFWLRQDO markers in plants. Trends Pl. Sc. 8: 554-560. %RWVWHLQ ' :KLWH 5/ 6NROQLFN 0 'DYLV 5 : Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. $P - +XP *HQHW    Branlard G., Dardevet M., Saccomano R., Lagoutte F. & Gourdon J. 2001. Genetic diversity of ZKHDW VWRUDJH SURWHLQV DQG EUHDG ZKHDW TXDOLW\ Euphytica 119: 59-67. &DHWDQR$QROOpV * %DVVDP %- *UHVVKRII 30  '1$ DPSOLFDWLRQ QJHUSULQWLQJ XVLQJ very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/ Technology 9: 553-557. Se puede borrar *DOEUDLWK ':  '1$ 0LFURDUUD\ $QDO\VLV LQ +LJKHU 3ODQWV 20,&6 $ -RXUQDO RI ,QWHJUDWLYH Biology. 10(4): 455-473. *XSWD 3. 5XVWJL 6  0ROHFXODU PDUNHUV from the transcribed/expressed region of the genome in higher plants. Funct Integr Genomics 4:139-162. .RQLHF]Q\ $ ) $XVXEHO  $ SURFHGXUH IRU PDSSLQJ $UDELGRSVLV PXWDWLRQV XVLQJ FRGRPLQDQW HFRW\SHVSHFLF 3&5 EDVHG PDUNHUV 3ODQW J. 4:403410. .ZRN 3<  0HWKRGV IRU JHQRW\SLQJ 6LQJOH 1XFOHRWLGH 3RO\PRUSKLVPV $QQX 5HY *HQRPLFV Hum. Genet. 2: 235-258. /DUNLQ 3' 3DUN :'  $VVRFLDWLRQ RI ZD[\ JHQH VLQJOH QXFOHRWLGH SRO\PRUSKVLP ZLWK VWDUFK characteristics in rice (Oryza sativa L.). Mol Breed 12:335-339. /LWW 0 /XW\ -$  $ K\SHUYDULDEOH PLFURVDWHOOLWH UHYHDOHG E\ LQ YLWUR DPSOLFDWLRQ RI D GLQXFOHRWLGH UHSHDW ZLWKLQ WKH FDUGLDF PXVFOH DFWLQ JHQH $P - +XP *HQHW   0F&DOOXP &0 &RPDL / *UHHQH ($ +HQLNRIIHW S. 2003. Targeting induced local lesions in genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123:439-442.

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I CAPITULO 6 Construccin de mapas de ligamiento gentico, localizacin de genes y regiones cromosmicas asociadas a caracteres de inters en plantas
Gerardo D L Cervigni, -XDQ 3DEOR $ 2UWL] 6HUJLR ( )HLQJROG 1. Introduccin La posibilidad de construir mapas de ligamiento gentico en especies vegetales o animales es una de las contribuciones de mayor impacto de las tcnicas de marcadores moleculares en las ciencias biolgicas. Los marcadores moleculares utilizados pueden corresSRQGHU D UHJLRQHV LQWHUJpQLFDV QR FRGLFDQWHV o a segmentos gnicos, en cuyo caso son denominados funcionales y constituyen marcadores ideales a los efectos de seleccin de genotipos. Un mapa gentico establece de maQHUD SUREDELOtVWLFD HO DUUHJOR OLQHDO GH XQ JUXSR marcadores (o genes) sobre el genoma de una especie. Si bien el concepto data de principios GH VLJOR ;; D SDUWLU GH ORV WUDEDMRV GH 0RUJDQ y Bridges con mutantes de Drosophila, recin a partir del advenimiento de los marcadores moleculares fue tcnicamente posible construir PDSDV JHQpWLFRV VDWXUDGRV HQ OD PD\RUtD GH las especies vegetales de inters agronmico. Usando este tipo de mapas es posible idenWLFDU OD SRVLFLyQ \ HO HIHFWR GH JHQHV VREUH caracteres de importancia mediante asociaFLRQHV HVWDGtVWLFDV HQWUH ORV YDORUHV IHQRWtSLcos y las variantes allicas de los marcadores. La disponibilidad de mapas genticos permite tambin la seleccin indirecta de genotipos deseables, comnmente denominada MAS (del ingls Marker Assisted Selection), mediante el seguimiento de marcadores localizados en regiones genmicas determinadas. La utilizacin de marcadores comunes permite comparar la estructura del genoma de diferentes especies (comparative mapping H LGHQWLFDU UHDUUHJORV cromosmicos a pequea y gran escala (micro y macro sintenia) SDUD HVWXGLRV GH ORJHQLD \ evolucin molecular. Por otro lado, el desarro-

llo de mapas genticos altamente saturados permite el clonado posicional de genes. 2. Introduccin a la construccin de mapas genticos en vegetales Para comprender mejor las bases tericas y metodolgicas empleadas en el mapeo gentico es necesario recordar algunos conceptos bsicos de gentica Mendeliana. Gregor Mendel realiz sus experimentos en Pisum sativum (arveja cultivada) efectuando cruzamientos controlados entre individuos que se GLIHUHQFLDEDQ HQ GHWHUPLQDGDV FDUDFWHUtVWLFDV FRPR SRU HMHPSOR HO FRORU GH OD RU WLSR GH tegumento de las semillas y largo de los tallos), y estudi la forma en que estos caracteres se WUDQVPLWtDQ D OD GHVFHQGHQFLD $ SDUWLU GH GDWRV experimentales formul una hiptesis simple para explicarlos y posteriormente dise experimentos para contrastarla. Sus trabajos permitieron inferir la existencia de factores hereditarios y sus mecanismos de transmisin antes GH FRQRFHU OD H[LVWHQFLD GHO $'1 FRPR PDWHrial de transmisin gentico. En base a sus datos experimentales Mendel formul su primera ley, o ley de la segregacin. Ella establece que los miembros de un par gnico (alelos) se segregan (se separan) uno de otro durante la formacin de las gametas. Como consecuencia, la mitad de las mismas portan un alelo y la otra mitad el otro. La progenie es luego formada por la combinacin al azar de las gametas de ambos progenitores. La segunda ley de Mendel, o ley de la segregacin independiente, indica que la segregacin de los alelos de un gen es independiente de la segregacin de los alelos de otro gen. Estas dos leyes fueron los puntos de partida sobre los cuales se elabor WRGD OD WHRUtD GH KHUHQFLD TXH KR\ FRQRFHPRV Incluso an en el presente, los anlisis de las frecuencias en que aparecen los caracteres en las progenies de cruzamientos controlados son una parte fundamental de los anlisis genticos. Los caracteres genticos pueden estar controlados por uno o pocos genes, o poseer un control complejo que involucra muchos genes, denominados loci de caracteres cuantitativos o QTLs (del ingls Quantitative Traits Loci), a menudo afectados por el ambiente. La disponibilidad de un gran nmero de marcadores

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(loci SROLPyUFRV QR DIHFWDGRV SRU HO PHGLR ambiente, neutros, sin efectos deletreos y cuya herencia pude determinarse con relativa IDFLOLGDG VLPSOLFy HQRUPHPHQWH ORV DQiOLVLV genticos en especies vegetales y animales. La construccin de un mapa de ligamiento gentico es esencialmente una representacin JUiFD OLQHDO GHO RUGHQ PiV SUREDEOH GH PDUcadores moleculares o genes a partir de los valores de recombinacin observados entre ellos. Cada arreglo lineal es denominado grupo de OLJDPLHQWR (Q WHRUtD XQ PDSD VDWXUDGR GHEH contener el mismo nmero de grupos de ligamiento que nmero bsico de cromosomas. (Q HVWH &DStWXOR VH GHVDUUROODUiQ ORV FRQceptos bsicos del mapeo gentico en vegetales y algunas de sus aplicaciones. De ninguna manera se pretende abordar el tema en toda su extensin debido a que la misma supera ODUJDPHQWH ORV REMHWLYRV GH HVWH OLEUR $TXHOORV lectores que deseen ampliar y profundizar los WHPDV TXH DTXt VH GHVDUUROODQ SXHGHQ FRQVXOtar los textos que se citan en la lista de referenFLDV ELEOLRJUiFDV DO QDO GHO &DStWXOR Los pasos fundamentales a seguir en la construccin de un mapa gentico de una deWHUPLQDGD HVSHFLH R HO PDSHR HVSHFtFR GH XQ gen (locus) de inters pueden resumirse en: 1) seleccin de progenitores y desarrollo de una poblacin segregante (poblacin de mapeo), 2) JHQHUDFLyQ GH XQ Q~PHUR VXFLHQWH GH PDUFDdores y registro de los mismos en cada uno de los individuos de la poblacin (genotipado), 3) determinacin de las frecuencias de recombinacin entre marcadores y determinacin de grupos de ligamiento y 4) determinacin del orden de los marcadores y conversin de la frecuencia de recombinacin (r) en unidades de mapeo o centiMorgan (cM). 2.1. Poblaciones de mapeo El primer paso en todo proyecto de mapeo es el desarrollo de una poblacin segreganWH SDUD XQD R PiV FDUDFWHUtVWLFDV GH LQWHUpV La seleccin de los progenitores es un punto importante debido a que no slo deben ser FRQWUDVWDQWH SDUD OD FDUDFWHUtVWLFD HQ HVWXGLR sino que adems deben presentar diferencias D QLYHO GH VHFXHQFLDV GHO $'1 \ DVt REWHQHU VXFLHQWHV PDUFDGRUHV SROLPyUFRV TXH SHU-

mitan la construccin del mapa gentico. En DXVHQFLD GH SROLPRUVPRV JHQpWLFRV ORV DQilisis de segregacin y ligamiento son impracticables. En general los cruzamientos entre especies algamas presentan mayor grado de SROLPRUVPR TXH HQWUH DXWyJDPDV /D IDOWD GH SROLPRUVPRV HV FRP~Q HQ SREODFLRQHV GHULvadas de cruzamientos entre progenitores de base gentica estrecha, como los realizados entre distintos cultivares de la misma especie o entre individuos de especies silvestres deriYDGRV GH OD PLVPD SREODFLyQ QDWXUDO (Q WHRUtD es posible desarrollar varios tipos de poblaciones segregantes y la decisin de cual utilizar depende de la resolucin que se desee alcanzar con el mapa y la posibilidad y/o facilidad de desarrollarla. En la Figura 1 se muestra un esquema del desarrollo de 5 poblaciones bsicas de mapeo. Las poblaciones de tipo retrocruza (backcross o BC1) y F2 son generalmente DGHFXDGDV \ IiFLOHV GH JHQHUDU HQ OD PD\RUtD GH ODV HVSHFLHV FXOWLYDGDV FRPR WULJR PDt] y soja. Las poblaciones F2 proveen mayor informacin gentica que las retrocruzas para el mismo nmero de individuos debido a que pueden evaluarse dos cromosomas recombinantes por planta. En especies autoincompatibles y altamente heterocigotas las poblaciones F1 tambin son segregantes y pueden emplearse para mapeo. Estos 3 tipos de familias son HItPHUDV HV GHFLU TXH FDGD LQGLYLGXR VHJUH-

Figura 1.

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gar las combinaciones gnicas que porta en la siguiente generacin. Si no es posible mantenerlas clonalmente como por ejemplo a partir de rganos vegetativos o por cultivo in vitro, la informacin obtenida en ellas debe ser transferida a una nueva poblacin utilizando algunos de los marcadores que fueron previamente localizados (mapeados) de manera de conservar puntos de referencia entre ambas. En el caso de requerirse mltiples ensayos, (repeticiones intra experimento, ensayos en distintas localidades o en varios aos), es necesario desarrollar poblaciones de maSHR LQPRUWDOHV FRPR ODV /tQHDV (QGRFULDGDV Recombinantes (RILs por Recombinant Inbred Lines) o poblaciones de Haploides Duplicados '+V  $PEDV SREODFLRQHV VH FRPSRQHQ GH XQ FRQMXQWR GH OtQHDV KRPRFLJRWDV TXH SXHGHQ ser replicadas por semillas varias veces y por YDULRV FLFORV GH FXOWLYR (VWDV FDUDFWHUtVWLFDV las hacen especialmente adecuadas para mapear QTLs. Las RILs son generadas a partir de una poblacin F2 por descendencia de semilla nica de un nmero determinado de individuos durante cinco o ms generaciones. Finalmente, FDGD OtQHD UHSUHVHQWDUi ORV GLIHUHQWHV EORTXHV de ligamiento presentes en un individuo F2 de la poblacin original, pero en estado homocigota. Una vez estabilizadas, las RILs pueden ser mantenidas y multiplicadas por semillas ao tras ao. Una de las desventajas de este mtodo es que algunas regiones del genoma pueden seguir en el estado heterocigota a pesar de las mltiples autofecundaciones. Por otro lado, no es posible desarrollarlas en especies autoincompatibles. Las poblaciones DH se generan a partir del cultivo de tejidos de anteras de individuos F1. En algunas especies es posible regenerar plantas enteras a partir GH PLFURJDPHWRWRV KDSORLGHV JUDQR GH SROHQ en el estado uninucleado). Si la planta dadora es una F1, sus granos de polen portarn las gametas derivadas de la meiosis con diferentes combinaciones allicas. Posteriormente, por tratamientos de duplicacin cromosmica con colchicina, las plantas haploides obtenidas pueden diploidizarse llevando todos los loci al estado homocigota. Como resultado se obtiene XQD VHULH GH OtQHDV TXH UHSUHVHQWDQ ODV FRPbinaciones gnicas presentes en las gametas

de la F1. La desventaja de este mtodo es que HV QHFHVDULR GLVSRQHU GH XQ SURWRFROR HFLHQWH para la regeneracin de plantas in vitro a partir del cultivo de anteras y la posterior duplicacin cromosmica. Una vez establecido el tipo de poblacin a utilizar, el nmero de individuos es tambin un punto importante debido a que la resolucin del mapa y el ordenamiento de los marcadores en los grupos de ligamiento dependen de ste. En general, poblaciones de 60 a 100 individuos son adecuadas para trabajos de tipo acadmico, como la localizacin de un determinado locus en el genoma o el mapeo de un carcter cualitativo. Sin embargo, para proyectos de mapeo de QTLs o la construccin de mapas de alta resolucin son necesarias poblaciones de 500 a 1000 individuos. 2.2. Registro de marcadores moleculares \ FODVLFDFLyQ GH OD SREODFLyQ Los marcadores moleculares tiles para mapeo deben existir en 2 o ms formas allicas distinguibles, de manera que los genotipos de FDGD LQGLYLGXR SXHGDQ VHU FODUDPHQWH LGHQWLcados. Los mismo pueden ser de tipo dominante (presencia o ausencia de una banda como HQ 5$3' \ $)/3 SRU OR FXDO QR HV SRVLEOH GLVWLQJXLU HQWUH HO JHQRWLSR KRPRFLJRWD $$ GHO KHWHURFLJRWD $D R FRGRPLQDQWHV WRGRV ORV DOHORV SXHGHQ LGHQWLFDUVH SRU HM XVDQdo SSR y RFLP), donde los 3 genotipos de un mismo locus diallico pueden ser discriminados $$ $D \ DD  &RPR FULWHULR JHQHUDO XQD YH] que se dispone de entre 100-200 marcadores en una determinada poblacin es posible identiFDU JUXSRV GH OLJDPLHQWR UHJLRQHV JHQyPLFDV HVSHFtFDV \ PDSHDU JHQHV R 47/V $VLPLVPR prcticamente cualquier nuevo marcador que se agregue pude integrarse a los preexistentes. El genotipo de cada individuo de la poblacin, para cada uno de los marcadores debe ser determinado (genotipado). En general se toman como marcadores informativos aquellos que muestran relaciones de segregacin, por presencia/ausencia, que se ajusten a las frecuencias esperadas considerando el tipo de poblacin y marcador molecular utilizado (por ej.: 1 $D  DD HQ XQD UHWURFUX]D R  $B DD HQ XQD F2), por medio de la prueba del ji-cuadrado 2).

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2.3. Estimacin de las frecuencias de recombinacin y deteccin de grupos de ligamiento 2.3.1. Concepto de ligamiento Dos loci que se encuentran muy cercanos en el mismo cromosoma no segregan independientemente durante la meiosis. Esta relacin se denomina ligamiento gentico y explica la aparicin de una proporcin mayor de individuos portando combinaciones allicas parentales que lo esperado segn la Segunda Ley de Mendel. Los genes ligados pueden ser seSDUDGRV SRU XQ LQWHUFDPELR ItVLFR GH SDUWHV GH cromosomas (cromtidas hermanas) durante la meiosis por el proceso de entrecruzamiento o crossing-over (CO), el cual genera gametas recombinantes, distintas de las parentales (Figura 2).

para que el nmero de plantas recombinantes sea igual al de no recombinantes, se dice que los mismos segregan independientemente. Por otro lado, si el nmero de plantas recombinantes es menor al esperado (50%) se considera que ambos loci estn ligados genticamente. De esta manera, determinando la frecuencia de aparicin de individuos con combinaciones allicas recombinantes es posible realizar una medida relativa de la distancia entre ellos. 2.3.2 Deteccin del ligamiento El primer paso en el estudio del ligamiento entre 2 loci SRU HM $ \ % FRQVLVWH HQ GHWHUminar si los mismos segregan individualmente de acuerdo al modelo esperado (1:1, 3:1, 1:2:1, etc.), y posteriormente, si lo hacen en forma independientemente o no. En ambos FDVRV OD SUXHED HVWDGtVWLFD DGHFXDGD HV HO 2

Figura 2.

([LVWH XQD UHODFLyQ HQWUH OD GLVWDQFLD ItVLFD a la que se encuentran 2 loci y la probabilidad de que se produzca un CO entre ellos. Cuanto ms alejados estn uno del otro mayor ser la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento y se generen gametas recombinantes. Consecuentemente, si dos loci HVWiQ OR VXcientemente separados en el cromosoma como

FRQVLGHUDQGR XQ QLYHO GH VLJQLFDQFLD SUHGHWHUPLQDGR S  R   DXQTXH WDPELpQ es posible utilizar el LOD score (ver punto 2.4). 6L OD SUREDELOLGDG DVRFLDGD DO 2 obtenido para cada locus en forma individual es superior a la predeterminada, se considera que ambos marcadores segregan de acuerdo a lo esperado. En el segundo paso, el nmero de progenies

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REVHUYDGDV HQ FDGD FODVH JHQRWtSLFD VH FRQtrasta con los valores esperados para una segregacin independiente (Tabla 1).
Tabla 1: Segregaciones esperadas para 2 loci independientes en distintas poblaciones de mapeo.

1 producto de cada 100 meiosis es del tipo recombinante. Un ejemplo de los pasos a seguir en la estimacin del ligamiento entre dos genes se muestra en la Figura 3.

(i)

Tipo de Marcador poblacin dominante BC 1 F2 RILs DH 1:1:1:1 9:3:3:1 1:1:1:1 1:1:1:1

Marcador co-dominante 1:1:1:1 1:2:1:2:4:2:1:2:1

F1 A a B b
x

P2 a a b b

(ii) Datos derivados del cruzamiento prueba

Gametas Parentales AB ab Ab aB

Fenotipos AB ab Ab aB

Genotipos AaBb aabb Aabb aaBb

No. 60 59 4 3 126

1:1:1:1 1:1:1:1

Gametas F1

Recombinantes

Total

BC1: poblacin de retrocruzamiento; F2: poblacin tipo F2 derivada del cruzamiento entre 2 progenitores heterocigotas; RIL: poblacin de lneas endocriadas recombinanWHV 5,/V SRU 5HFRPELQDQW ,QEUHG /LQHV \ '+ SREODFLyQ de haploides duplicados.

(iii) Prueba de segregaci n de factores simples A/a y B/b

Nmero de individuos con fenotipo A Nmero de individuos con fenotipo a X2 1 g.l Nmero de individuos con fenotipo B Nmero de individuos con fenotipo b

= 60 + 4 = 64 = 59 + 3 = 62
.=

0.03 n.s

= 60 + 3 = 63 = 59 + 4 = 63 X2 1 g.l = 0.00

La hiptesis nula (Ho) es que ambos loci segregan independientemente y la hiptesis alternativa (H$) es que ambos loci estn ligados. 6L ORV GHVYtRV REWHQLGRV HQWUH ORV YDORUHV REservados y esperados tienen una probabilidad de ocurrencia menores que 1/20 o 1/100 (p < 0,05-0,01), se considera que los loci $ \ % QR segregan independientemente y por lo tanto se acepta H$ que indica la existencia de ligamiento entre ellos (ver ejemplo Figura 3). 2.3.3. Estimacin de la frecuencia de recombinacin 8QD YH] YHULFDGD OD H[LVWHQFLD GH OLJDPLHQto entre 2 loci es posible estimar la frecuencia de recombinacin (r) entre ellos. En el caso ms simple de una retrocruza, todas las clases IHQRWtSLFDV R JHQRWtSLFDV SXHGHQ VHU LGHQWLFDGDV )LJXUD   (O YDORU GH r expresado en porcentaje se calcula:

(iv) Prueba de segregaci n independiente de locus A y B

Fenotipos (genotipos) AB (AaBb) Ab (Aabb) aB (aaBb) ab (aabb)

Frecuencia esperada xn xn xn xn

No. esperado 31,5 31, 5 31, 5 31, 5 Total


X2 =

No. observado 60 4 3 59 126

( E - O )2 = 99, 56* E
*(P < 0.001)

(v) Clculo del porcentaje derecobminacin (% r)

%r=

nmero de gametas recombinantes (4 + 3) = = 0,0555 o 5,55 % nmero total de gametas 126

Figura 3.

r(%)=

nmero de gametas recombinantes x100 nmero total de gametas

Una estimacin de r   HV GHQLGD como una unidad de mapeo (u.m), y corresponde a la distancia entre dos loci en la cual

En este caso la frecuencia de recombinacin HQWUH $ \ % HV GH   &RPR OD IUHFXHQcia de recombinacin es una proporcin, su variancia (derivada de la distribucin binomial) est dada por la expresin: R (1-R)/N, donde R es la frecuencia de recombinacin y N es el nmero total de los individuos de la poblacin. Por lo tanto, un valor de r = 5,55 % (como el de nuestro ejemplo), posee el siguiente error estndar:

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[0,055x(1-0,055)/126]=0,020 .
De esta manera es posible establecer el grado de ligamiento entre 2 loci. Sin embargo, en algunos tipos de poblaciones como las F2, no WRGDV ODV FODVHV JHQRWtSLFDV SXHGHQ VHU LGHQWLFDGDV IiFLOPHQWH HVSHFLDOPHQWH FXDQGR VH trabaja con marcadores co-dominantes. Esto es debido a que no es posible diferenciar si los dobles heterocigotas derivan de 1 o 2 gametas recombinantes. Para estos casos se han desarrollado procedimientos alternativos para estimar las distancias genticas. El mtodo de mxima probabilidad (maximum likelihood method) es el ms utilizado. Debido a que se WUDWD GH XQ PpWRGR HVWDGtVWLFR GH HVWLPDFLyQ de probabilidades las frmulas empleadas en los clculos son generalmente complejas. $OODUG  GHVDUUROOy HO PpWRGR GH ORV scores para derivar las frmulas, estimar las distancias genticas y calcular las desviaciones estndares para varios tipos de poblaciones. $IRUWXQDGDPHQWH HQ HO SUHVHQWH VH GLVSRQH GH programas de computacin que utilizan estas frmulas y permiten trabajar con grandes archivos de datos derivados de poblaciones de un gran nmero de individuos. Entre los ms populares se encuentran el Mapmaker (Lander 1987) y el JoinMap (Stam et al. 1993).

2.3.4. Ordenamiento de los marcadores y conversin de frecuencias a unidades de mapeo


Cuando se estudia el ligamiento simultneo HQWUH  R PiV PDUFDGRUHV SRU HM $ % \ &  se puede establecer un orden en base a las distancias relativas entre ellos (mapeo de 3 SXQWRV  6XSRQLHQGR TXH HO RUGHQ VHD $%& OD distancia estimada en la prueba de 2 puntos HQWUH $ \ & VHUi DSUR[LPDGDPHQWH LJXDO D OD VXPD GH OD GLVWDQFLD HQWUH $%  %& 6LQ HPEDUJR IUHFXHQWHPHQWH OD GLVWDQFLD HQWUH $ \ & (medida como prueba de dos puntos) suele ser PHQRU D OD GH $%  %& (VWR VH GHEH D OD presencia de entrecruzamientos dobles entre $ \ & FX\R UHVXOWDGR QDO HV OD IRUPDFLyQ GH JDPHWRV SDUHQWDOHV $& \ DF TXH VH FRPSXWDQ como "no recombinantes", cuando en realidad Vt OR VRQ 6L QR KXELpUDPRV PDSHDGR HO JHQ

B nunca hubiramos detectado estos dobles entrecruzamientos. Extendiendo este razonamiento, en realidad tampoco sabemos si entre $% KXER HQWUHFUX]DPLHQWRV GREOHV \ SRU OR tanto, haber subestimado la proporcin de recombinantes entre ellos. Cuanto ms grande es la distancia entre 2 marcadores, ms inexacta VHUi OD PHGLGD GH OD GLVWDQFLD $VLPLVPR RWUR hecho que debe considerarse es el fenmeno de interferencia (I). La interferencia se relacioQD FRQ OD LPSRVLELOLGDG ItVLFD GH TXH DG\DFHQWH a un punto de entrecruzamiento se produzca otro en la misma meiosis debido a un impediPHQWR ItVLFR HQWUH HOORV VH LQWHUHUHQ  (VWDV FDUDFWHUtVWLFDV KDFHQ TXH ODV IUHFXHQFLDV GH recombinacin no sean magnitudes aditivas para grandes segmentos cromosmicos. Para solucionar esto, los valores de r se convierten en unidades de mapeo (centMorgan cM) mediante la aplicacin de las funciones de mapeo. Las ecuaciones para convertir r en cM derivan de funciones de distribucin y son fundamentalmente dos, la funcin de Haldane (1919) y la GH .RVDPEL   /D GLIHUHQFLD EiVLFD HQWUH ellas es el supuesto que asumen con respecto a la interferencia en la ocurrencia de dobles CO. La funcin de Haldane considera interferencia nula (I=0) mientras que la funcin de .RVDPEL HVWLPD HO YDORU GH , (VWRV YDORUHV JHneralmente se encuentran entre 0 y 1 (interferencia completa). El valor real de interferencia se ubicar entonces en algn lugar en medio de ambos valores. Los valores de cM estimados con ambas funciones son equivalentes cuando se consideran valores de r de hasta 10 %, para valores mayores la transformacin de .RVDPEL HV PiV H[DFWD

2.4. Programas de mapeo


La utilizacin de programas de mapeo como el Mapmaker 3.0 (Lander et al. 1987; KWWSZZZQVOLMJHQHWLFVRUJVRIWPDSPDNHU R -RLQ0DS    6WDPS  KWWSZZZ kyazma.nl), permiten el anlisis simultneo de muchos marcadores en poblaciones de gran nmero de individuos, mediante la utilizacin de mtodos de estimacin de parmetros FRPR HO GH Pi[LPD SUREDELOLGDG R PtQLPRV cuadrados. Estos programas poseen diferentes procedimientos, o rutinas, que permiten la

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estimacin de r entre pares de marcadores, OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV JUXSRV GH OLJDPLHQWR \ la determinacin del orden de los marcadores dentro de cada grupo. El programa Mapmaker XWLOL]D HO WHVW HVWDGtVWLFR /2' score para evaluar el valor de r estimado y la posicin ms probable de un marcador en el grupo de ligamiento. El LOD score (logaritmo de los odds) es el logaritmo en base 10 del cociente entre la probabilidad de obtener los datos observados en caso de que los loci considerados estuvieran ligados, sobre la probabilidad de obtener los datos en ausencia de ligamiento. Un LOD = 3 para un par de marcadores indica que es mil veces ms probable que los loci estn ligados respecto a que no lo estn. El programa Mapmaker tambin utiliza LOD score para comparar difeUHQWHV yUGHQHV SRVLEOHV HQWUH YDULRV JHQHV $O orden ms probable le asigna un 0 y a los restantes le asigna valores negativos. Por su parte, el programa JoinMap (Stam, 1993) permite trabajar con distintos tipos de poblaciones e inclusive con distintos tipos de segregacin dentro de la misma poblacin. Este programa fue especialmente diseado para estimar datos de ligamiento gentico en poblaciones derivadas de especies altamente heterocigotas y/o donde QR HV SRVLEOH REWHQHU OtQHDV SXUDV 2WUD GH VXV principales ventajes es que permite combinar mapas derivados de distintas poblaciones (o GDWRV ELEOLRJUiFRV VL GLVSRQHQ PDUFDGRUHV HQ comn (Stam 1993). Debido a que las unidades de mapeo gentico estn basadas en frecuenFLD GH UHFRPELQDFLyQ VX VLJQLFDGR HQ FXDQWR D GLVWDQFLD ItVLFD Q~PHUR GH QXFOHyWLGRV HQWUH dos loci YDUtD VHJ~Q OD HVSHFLH FRQVLGHUDGD HO cromosoma y la localizacin dentro del mismo. Es conocido que existen regiones de alta frecuencia de recombinacin localizadas sobre los brazos cromosomales (comnmente llamados hotspots) y regiones donde la recombinacin est fuertemente restringida como por ejemplo FHUFD GH ORV FHQWUyPHURV R WHOyPHURV $XQTXH se corre el riesgo de cometer un error grosero puede considerarse que en promedio 1 cM equivale aproximadamente a 1 Mpb (un milln de pares de bases) en humanos y entre 500 y 750 kpb (mil pares de bases) en plantas superiores (como el arroz y tomate, respectivamente).

3. Mapeo de QTL 0XFKDV GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH LPSRUWDQcia agronmica presentan una distribucin continua de valores, esto es, dentro de una poblacin determinada no existe una clara disWLQFLyQ HQ FODVHV IHQRWtSLFDV /D EDVH JHQpWLFD GH HVWDV FDUDFWHUtVWLFDV IXH HVFODUHFLGD SRFR despus del redescubrimiento de las leyes de Mendel, cuando Yule en 1902 propuso que esa variacin era la consecuencia de la accin aditiva de muchos genes. Entre stos se sueOH LGHQWLFDU D JHQHV GH HIHFWRV SURQXQFLDGRV denominados genes mayores y genes con pequeos efectos que fueron inicialmente denominados poligenes. Sin embargo, la distincin entre poligenes y genes mayores (tambin llamados oligogenes) no result satisfactoria ya que el efecto de un gene depende del entorno gentico, el ambiente y del alelo presente en el locus del gen. Geldermann (1975) propuso denominar a estos loci controladores de caracWHUtVWLFDV FXDQWLWDWLYDV FRPR 47/V GHO LQJOpV Quanitative Traits Loci). Esta nomenclatura result ms adecuada ya que no asocia al gen con la magnitud de su efecto. Si bien la gentica cuantitativa ha propuesto y utilizados modelos biomtricos con gran xito a lo largo de la historia del mejoramiento de plantas y animales, estos modelos se basan en la estimacin de los efectos gnicos y no tanto en el nmero de genes involucrados. Utilizando marcadores moleculares ligados a los QTLs, es posible estimar el genotipo, los efectos genticos y tener una aproximacin menos sesgada del nmero de o genes/QTLs determinantes del carcter. Es indispensable TXH HO OHFWRU QR FRQVLGHUH OD PHWRGRORJtD GH marcadores moleculares sustituta de de los PRGHORV JHQpWLFRVHVWDGtVWLFRV XWLOL]DGRV SRU la gentica cuantitativa, por el contrario, ellos son la base de los estudios de mapeo de genes/QTL utilizando marcadores moleculares. 8QD GH ODV WpFQLFDV GH LGHQWLFDFLyQ GH QTLs es la denominada asociacin con marcas simples o marcadores individuales. En este caso, la utilizacin de un mapa gentico no es necesaria, aunque un mapa gentico ayuda a la interpretacin de los resultados. Las posibiOLGDG GH LGHQWLFDU XQ 47/ XVDQGR PDUFDGRUHV

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moleculares depende de la distancia gentica existente entre el marcador y el QTL, y de la magnitud de los efectos genticos, aditivo (a) y de dominancia (d) (ver ms abajo), del propio QTL. La estimacin de estos efectos es indirecta pues se realiza con base en el marcador OLJDGR DO 47/ $GHPiV OD HVWLPDFLyQ GH HVWRV efectos ser ms o menos exacta dependiendo de la tcnica de mapeo utilizada, siendo la ms adecuada aquellas tcnicas derivadas del mapeo por intervalo. Consideremos M/m el locus del marcador molecular y Q/q el locus del QTL. Para saber si M y Q estn ligados, son necesarias las siguientes etapas: obtener una poblacin segregante para ambos loci M y Q(poblacin de mapeo), PHGLU OD FDUDFWHUtVWLFD IHQRWtSLFD < FRQtrolada por el QTL (Q), obtener el fenotipo del marcador (M) en cada planta de esta poblacin, y registrarlo en una matriz de datos. Considerando el caso de un nico locus (Q/q), en que el alelo Q aumenta el valor de OD FDUDFWHUtVWLFD \ KDFLHQGR PQQ, PQq y Pqq las medias de los individuos con genotipos QQ, Qq y qq, respectivamente, y P = (PQQ + Pqq)/2 la media entre los genotipos homocigotos, los siguientes efectos genticos pueden ser obtenidos una poblacin F2:

Efecto aditivo :

a=

m MM - m mm 2(1 - 2r )

Efecto de dominancia:

m Mm d=

m MM + m mm 2 (1 - 2r ) 2

Razn d/a (grado medio de dominancia):

2m Mm - m MM + m mm d d = a (1 - 2r )( m MM - m mm)
Si el QTL no estuviera ligado al marcador, (r = 0,5) las diferencias entre las tres medias QR VHUiQ HVWDGtVWLFDPHQWH VLJQLFDWLYDV 'H OD misma forma, si a y d fuesen iguales a cero (auVHQFLD GH HIHFWR  QR VH GHWHFWDUtDQ GLIHUHQFLDV HVWDGtVWLFDV HQWUH ODV PHGLDV 'H HVWD PDQHUD slo si r < 0,5 es posible detectar asociaciones entre M y Q, dependiendo esta deteccin del grado de ligamiento o magnitud de r (pequeos valores de r facilitan la deteccin) y del efecto del alelo Q sobre el carcter. Formalmente tenemos: Ho: MM=Mm=Pmm; H$: MM z Mm; H$a2: MM z mm; H$:Mm z mm.

Pqq

P d -a

PQq

PQQ

Medias de los genotipos

9DORUHV JHQRWtSLFRV

a
/D DVRFLDFLyQ 0DUFDGRU47/ VH FRQUPD VL ODV GLIHUHQFLDV HQWUH ODV PHGLDV IHQRWtSLFDV GH JUXSRV GH PDUFDGRUHV VRQ HVWDGtVWLFDPHQte diferentes de cero (se rechaza de Ho). Las diferencias pueden ser evaluadas por medio GHO DQiOLVLV GH OD YDULDQ]D $129$ R SUXHED t, HOLJLHQGR XQ QLYHO GH VLJQLFDQFLD GH 3  FRPR VH HMHPSOLFD HQ OD 7DEOD  En una poblacin F2, la asociacin entre el marcador y el QTL puede ser valorada a travs de la regresin entre los genotipos y su corres-

a) efecto aditivo (a) y (d) efecto de la dominancia donde:

a=

mQQ - mqq mQQ + mqq d = mQq 2 2

n una generacin F2 cuyos genotipos marcadores MM, Mm y mm estarn presente en la frecuencia de 1/4, 1/2 y 1/4, respectivamente. En este caso los efectos a, d y d/a son estimados con base en el marcador ligado al QTL, como sigue:

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Tabla 2: $129$ HQWUH ORV WUDWDPLHQWRV 00 0P \ PP obtenidos de una poblacin F2


FV Tratamiento Residuo Total GL 2 142 144 SC 202791,97 262030,95 464822,93 CM 101395,98 1845,28 F 54,94 P 0,0000

Observe que: a = g1 - g2 d = g2 + g1

por lo que para estimar los efectos a y d en una poblacin de retroFV: fuente de variacin, GL: grados de libertad, SC: suma de cuadracruzamiento debe retrocruzarse la GRV &0 FXDGUDGRV PHGLRV ) YDORU GHO HVWDGtVWLFR ) &0 7UDWDPLHQWR F1 con cada uno de los progenitoCM Residuo) y P: probabilidad de rechazar una Ho verdadera. Cuando res. Un problema adicional es que P < 0,05 indica asociacin entre el marcador (M) y el QTL (Q).v a y d pueden anularse. Si existiera dominancia completa de Q sobre q pondiente fenotipo. En este caso, es necesario (d = a), g1 = 0 y si existiera dominancia compleFRGLFDU ORV WUHV JHQRWLSRV 00 0P \ PP ta de q sobre Q (d = -a), g2 = 0. como 1, 0 y -1 para el modelo aditivo, y 0, 1 y 0 (O DQiOLVLV GH $129$ \ OD UHJUHVLyQ VRQ WpFpara el modelo dominante. QLFDV TXH SHUPLWHQ OD LGHQWLFDFLyQ GH PDUcadores ligados a QTLs, pero poseen ciertas El modelo de regresin adoptado es: limitaciones: 1) no indican si hay uno o ms QTLs asociaYi = E0 + E1;1j +E2;2j + Hj. dos al marcador, 2) no estiman la posicin del QTL y donde: 3) el efecto del QTL puede ser subestimado Yi YDORU GH OD FDUDFWHUtVWLFD ;1j= cdigo del debido a que es confundido con la frecuencia marcador para efecto aditivo (MM = 1, Mm = 0, PP   ;2j= cdigo del marcador para efec- de recombinacin. to dominante (MM = 1, Mm = 0, mm = -1); E0 3.2. Mapeo por intervalos = intercepto de la regresin (media de la caEl mapeo por intervalo (interval mapping) fue UDFWHUtVWLFD  E1 = inclinacin de la recta para el modelo aditivo; E2 = inclinacin de la recta para propuesto originalmente por Lander y Botstein el modelo dominante y Hj = error aleatorio para (1989) y es la base de todos los mtodos de mapeo de QTL utilizados actualmente. Para j-simo individuo. FRQFHSWXDOL]DU HVWD PHWRGRORJtD SRGHPRV 8QD YH] HYDOXDGR \ FRQUPDGR HO PRGHOR considerar el cruzamiento entre dos progenitocompleto (modelo aditivo + dominante), debe res homocigotos cuya F1 posee la constitucin analizarse la importancia relativa de cada uno JHQpWLFD TXH VH HMHPSOLFD HQ OD )LJXUD  $ GLIHUHQFLD GHO PDSHR SRU PDUFDV VLPSOHV de los modelos, por ejemplo mediante la meen el mapeo por intervalo es indispensable WRGRORJtD GH UHJUHVLyQ P~OWLSOH GH HOLPLQDFLyQ poseer un mapa gentico ya que la unidad de SRU SDVR VWHSZLVH  En poblaciones de retrocruzamiento, slo el anlisis es el intervalo gentico y no un marcagenotipo heterocigoto (Qq) y uno de los homo- dor individual. De manera resumida el mapeo cigotos (QQ o qq) estn presentes por lo que por intervalo utiliza la siguiente estrategia: 1) el efecto aditivo y dominante quedan confun- como la distancia entre cada par de marcadodidos, en este apartado denominados g1 y g2, res es conocida, el mtodo estima los parmetros del modelo a incrementos de distancias respectivamente, y estimados como sigue: JHQpWLFDV SUHGHQLGRV 2) los parmetros del modelo pueden ser estimados mediante la funcin de verosimilitud o regresin, 3) la hiptesis g1=mMM-mMm = (a-d)(1-2r) H0: ausencia de QTL/ H$: QTL en un intervalo Yg2=mMm-mmm = (a+d)(1-2r) entre marcadores, son contrastadas a travs

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Figura 4.

de la razn de dos verosimilitudes, LR (LR por Likelihood Ratio) o LOD score y 4) la presencia de un QTL es inferida cuando el mximo valor de LR o de LOD obtenido es mayor a un umbral previamente establecido (punto 3.4). +DOH\ \ .QRWW   SUHVHQWDURQ XQ PRGHOR de mapeo por intervalos basados en regresin. El modelo adoptado para poblaciones F2 es: Yj = + ax* + dz*  j. donde: Yj YDORU GH OD FDUDFWHUtVWLFD < HQ HO LQGLYLGXR M PHGLD GH OD FDUDFWHUtVWLFD HQ OD poblacin; a = efecto aditivo del locus que est VLHQGR HVWXGLDGR VREUH OD FDUDFWHUtVWLFD < G efecto de dominancia del locus que est siendo HVWXGLDGR VREUH D FDUDFWHUtVWLFD < [* y z* son las variables indicadoras (utilizadas para estimar los efectos a y d del QTL) y dependen de ORV JHQRWLSRV GH ORV PDUFDGRUHV DQTXHDQWHV del QTL, en el individuo j y Hj = error aleatorio para j-simo individuo. Expliquemos como se obtienen los valores de las variables indicadoras x* y z* presentados en la Tabla 3. Para adjudicar estos valores debemos respondernos la pregunta: Dado un intervalo gentico de marcadores moleculares, cuyo fenotipos son conocidos, cul es la probabilidad que dentro del intervalo el genotipo del QTL sea QQ, Qq o qq?. Consideremos el intervalo gentico M1M1M2M2. El genotipo de los marcadores indica que fue generado por el encuentro al azar de las gametas parentales M1M2. Dado que no existi recombinacin

entre los marcadores, el genotipo de QTL ms SUREDEOH GHQWUR GHO LQWHUYDOR VHUtD 44 $Vt la nica variable indicadora que asume valor es x* y ese valor es 1 (p = 1), pues no exisWHQ GHVYtRV GHELGR D OD GRPLQDQFLD \ HO DOHOR Q incrementa el valor del carcter. El intervalo M1M1M2m2 fue generado por una gameta paUHQWDO \ RWUD UHFRPELQDQWH $KRUD HV SUREDEOH que dentro del intervalo gentico el genotipo del QTL sea QQ o Qq con probabilidades 1-p y p, respectivamente. El valor 1-p ser mximo cuando estemos cerca del genotipo marcador M1M1 \ PtQLPR FXDQGR HVWHPRV SUy[LPRV GH M2m2. Lo contrario suceder con el valor de p. Las variables x* y z* asumirn valores 1-p y p, respectivamente, cuyos valores variaran conforme nos desplacemos en el intervalo a distancias ra. Con el mismo razonamiento se pueden encontrar las probabilidades condicionales de los genotipos QQ, Qq y qq para los intervalos M1M1m2m2 y M1m1M2m2. 6HJ~Q HO PRGHOR GH 6HJ~Q +DOH\ \ .QRWW (1992) una regresin es realizada para cada valor de ra entre los marcadores M1 y M2. El valor de ra que produzca el mayor valor de R2 FRHFLHQWH GH GHWHUPLQDFLyQ  /5 R GH /2' indica la localizacin del QTL. El test de sigQLFDQFLD GH KLSyWHVLV /5 VHJ~Q SXHGH VHU expresado como:

LR = 2 ln

SCR SCR

(reducido) (completo)

= Suma de cuadrados del residuo del educido) modelo reducido: Yj = + ej; SCR(completo) = Suma de cuadrados del residuo del modelo completo: Yj  D[  G\  j ( para F2), Yj = + g1x*  j (para Retrocruzamientos) y Yj = + ax* + (para RIL y DH). Los valores de LOD se enj cuentran dividiendo el valor LR por 4,61 (LOD = LR / 4,61). 3.3. Mapeo por intervalo compuesto En el mapeo por intervalo, los tests de hiptesis no son independientes de otros QTLs ligados al intervalo siendo analizado. Para QTLs no ligados al intervalo el efecto no es tan dramtico, pero deben hacerse las siguientes consideraciones: 1) la segregacin del QTL no

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Tabla 3: (VSHUDQ]D GH ORV HIHFWRV JHQRWtSLFRV PHGLRV SDUD XQ 47/ SDUD WRGRV ORV SRVLEOHV JHQRWLSRV GH ORV PDUFDGRUHV DQTXHDQWHV HQ XQD SREODFLyQ )2, cuando no se considera la ocurrencia de recombinaciones dobles en el intervalo.

Genotipo Marcador

Probabilidad c ondicional QQ Qq qq 0 p 2p(1-p) 1-p 1-2cp(1-p) 1-p 2p(1-p) p 0 0 0 p2 0 Cp(1-p) p (1-p)2 1-p 1

Variables indicadoras (d)z* (a)x* 1 1-p 1-2p p 0 -p -(1-2p) -(1-p) -1 0 p 2p(1-p) 1-p 1-2cp(1-p) 1-p 2p(1-p) p 0

M1 M1 M2 M2 1 1-p M1 M1 M2m 2 M1 M1 m2m2 (1-p)2 M1m1 M2 M2 p M1m1 M2m 2 cp(1-p) M1m1 m2m2 0 p2 M1m1 M2 M2 m1 m1M2m 2 0 m1 m1m2m2 0

p=ra/r ; (1-p)= rb/r; c=r2/[r2+(1-r)2] (Tomado de Schuster & Cruz, 2004).

OLJDGR FRQWULEX\H D OD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD 2) LQWHUHUH HQ OD HVWLPDFLyQ GHO HIHFWR GHO 47/ y 3) removiendo el efecto de la segregacin del otro QTL se reduce la varianza residual del intervalo en consideracin, aumentando el poder de deteccin y precisin. El mapeo por intervalo compuesto (Jansen 1993, 1994; Zeng 1993, 1994), combina el mapeo por intervalo con la regresin mltiple. Esta ltima, permite incluir en el mapeo marcadores ubicados por fuera del intervalo como cofactores, incrementando el poder de deteccin y precisin en la estimativa de la posicin del QTL. La pregunta de cuntos cofactores deben utilizarse no es de fcil respuesta. En principio los dos marcaGRUHV TXH DQTXHHQ HO LQWHUYDOR GHEHQ VHU LQcluidos, al igual que aquellos que resulten sigQLFDWLYRV HQ XQD UHJUHVLyQ P~OWLSOH 'HQLGRV los marcadores que se utilizarn como cofacWRUHV OD PHWRGRORJtD GH PDSHR SRU LQWHUYDOR compuesto se aplica exactamente igual a la de mapeo por intervalo simple. 3.4. Test de hiptesis y nivel de VLJQLFDQFLD La formulacin de hiptesis adecuadas y XWLOL]DFLyQ GH HVWDGtVWLFRV DSURSLDGRV SDUD OD evaluacin de las mismas, es esencial para declarar la presencia de un QTL. En una po-

blacin F2 pueden ser estimados los efectos aditivo y de dominancia, en un RC el efecto g1 o g2 y slo el efecto aditivo en poblaciones de RILs y DH. Para determinar si el valor de cada efecto estimado es diferente de cero se usan ODV HVWDGtVWLFDV /5 R /2' (Q PXFKRV WUDEDMRV de mapeo un valor de LOD superior a 2 3 es utilizado como criterio para declarar la presencia de un QTL. Esta forma de determinar el YDORU XPEUDO R FUtWLFR HV DUELWUDULR \ OD PD\RUtD de los autores no lo consideran el ms adecuado, pues la probabilidad e detectar al menos un falso positivo (declarar la real la presencia de un QTL inexistente) en alguna regin del genoma es prcticamente 1 (100 %). Se propuso disminuir este sesgo determinando un nivel de VLJQLFDQFLD SDUD FDGD FURPRVRPD (Q HVWH caso, el nivel de corte para cada cromosoma FRUUHVSRQGHUtD DO GHO JHQRPD FRPSOHWR GLYLGLdo el nmero de cromosoma o grupos de ligaPLHQWRV REWHQLGRV 7DPELpQ HV SRVLEOH GHQLU XQ QLYHO GH VLJQLFDQFLD SDUD FDGD LQWHUYDOR GLYLGLHQGR OD VLJQLFDQFLD GHO FURPRVRPD SRU HO nmero de intervalos en el grupo de ligamiento (nmero de marcadores menos uno). )LQDOPHQWH HO YDORU FUtWLFR GH FRUWH SXHGH HVWDEOHFHUVH HPStULFDPHQWH PHGLDQWH HO WHVW de permutaciones que es actualmente el ms usado. Para realizar este test deben numerar-

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se los individuos de 1 a n /RV YDORUHV IHQRWtSLFRV GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV VRQ WRPDGRV DO D]DU y atribuidos a los individuos conforme vayan VLHQGR UHWLUDGRV (O SULPHU YDORU IHQRWtSLFR UHWLrado es asignado al individuo 1, el segundo vaORU IHQRWtSLFR DO LQGLYLGXR  DVt VXFHVLYDPHQWH VH DVLJQDQ WRGRV ORV YDORUHV IHQRWtSLFRV D FDGD uno de los individuos. Los datos permutados son analizados para detectar la presencia de QTL, almacenando el mayor valor de LOD obtenido. El proceso se repite de forma completa 1 YHFHV QDOPHQWH ORV YDORUHV GH /2' UHWHnidos, son ordenados por orden de magnitud permitiendo estimar el valor critico de cada WHVW (O YDORU FUtWLFR GH FDGD LQWHUYDOR WHQGUi OD magnitud N   R VHD VL VH UHDOL]DURQ  SHUPXWDFLRQHV OD VLJQLFDQFLD GH  VHUi HO 950 valor ordenado. Se procede de la misma forma para obtener el valor de corte para un determinado grupo de ligamiento o para el genoma completo (conjunto de grupos de ligamientos) considerando uno u otro en el test de permutacin. Cuanto mayor el nmero de permutaciones, mayor la precisin en el valor FUtWLFR 4. Mapas y marcadores funcionales En la historia del desarrollo de los marcadores moleculares se ha priorizado la deteccin GH SROLPRUVPRV HQ UHJLRQHV QR FRGLFDQWHV del genoma. Esto ha sido en funcin de aseguUDU OD QHXWUDOLGDG IHQRWtSLFD GH ORV PDUFDGRUHV y posibilidad de maximizar la variacin entre GLIHUHQWHV JHQRWLSRV (VWD ~OWLPD FDUDFWHUtVtica est sustentada en que las regiones no gnicas del genoma no han sufrido presin de seleccin sobre las mutaciones que pudieran haber ocurrido en el transcurso de la evolucin y por consiguiente ser ms variables. La asociacin de los marcadores con caracteres de inters, como se ha visto anteriormente, est determinada por la distancia de recombinacin R ItVLFD GHO PDUFDGRU FRQ HO JHQ UHVSRQVDble del fenotipo. De esta manera, los mapas genticos basados en marcadores moleculares han posibilitado la localizacin de regiones FURPRVyPLFDV HVWDGtVWLFDPHQWH DVRFLDGDV D caracteres de tipo cualitativos (monognicos) o cuantitativos (polignicos o QTLs). Como ya se ha visto, la determinacin de QTLs permite

establecer el nmero, posicin y efecto individual de cada uno de los loci involucrados. Sin HPEDUJR OD LGHQWLFDFLyQ GH 47/V HQ GLYHUVRV FXOWLYRV QR KD FRQFOXLGR FRQ OD LGHQWLFDFLyQ GH los genes responsables del fenotipo, cuya existencia se presume en el intervalo comprendido HQWUH PDUFDGRUHV DQTXHDQWHV GH ORV PLVPRV Como consecuencia, la funcin biolgica (o el modo de accin) de los genes responsables de los efectos de los QTLs es an desconocida en OD PD\RUtD GH ORV FDVRV UHSRUWDGRV $VLPLVPR la posibilidad de realizar un caminado cromosmico (cromosome walking) desde el marcaGRU DQTXHDQWH DO 47/ KDFLD OD UHJLyQ ItVLFD GRQGH UHVLGH HO JHQ UHVSRQVDEOH FRQ HO Q GH aislarlo, depende de la distancia de recombinacin entre el marcador y el gen, y de la UHODFLyQ GH HVD GLVWDQFLD FRQ OD GLVWDQFLD ItVLca real, que puede estar afectada por varios otros factores, como fuera mencionado antes HQ HVWH FDStWXOR La creciente disponibilidad pblica de inforPDFLyQ GH VHFXHQFLDV GH WUDQVFULSWRV GH $'1 mensajero (Expressed Sequence Tags, ESTs), MXQWR FRQ HO JUDGR GH KRPRORJtD HYLGHQFLDGR entre especies, ha permitido la generacin de los llamados marcadores gnicos o funcionaOHV FX\D FDUDFWHUtVWLFD UHOHYDQWH HV OD GH HVWDU ORFDOL]DGRV HQ UHJLRQHV FRGLFDQWHV GHO genoma. ticipan en las llamadas mutaciones silencioVDV (VWR HV FXDQGR HO FDPELR QXFOHRWtGLFR VH produce en la tercera base del codn sin alteUDU HO DPLQRiFLGR SDUD HO FXDO FRGLFD /D LGHQWLFDFLyQ GH 613V SXHGH LQIHULUVH GLUHFWDPHQte a partir de datos de secuencias pblicas, si estas corresponden a distintos genotipos, o por VHFXHQFLDFLyQ GH IUDJPHQWRV GH JHQHV DPSOLcados por PCR de individuos diversos. $XQTXH KLVWyULFDPHQWH VH KD DVXPLGR TXH las secuencias tipo microsatlites son propias GHO $'1 QR FRGLFDQWH KR\ VDEHPRV TXH ODV mismas pueden encontrarse tambin en regiones gnicas. Si bien la frecuencia relativa de estos motivos es baja (< 5 %) la gran abundancia de secuencias de ESTs en diversos cultivos, ha ocasionado que varios estudios hayan usado esta estrategia para el desarrollo de marcadores moleculares. La seleccin de motivos de trinucletidos, aumenta la posibilidad

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GH HQFRQWUDU 665V SROLPyUFRV HQ UHJLRQHV FRGLFDQWHV PLQLPL]DQGR ORV SRVLEOHV FDPbios en el marco de lectura ocasionados por una variacin en el nmero de repeticiones de motivos de di, tetra o pentanucletidos. Estos marcadores, denominados SSRs gnicos o EST-SSRs, presentan las mismas ventajas que los SSRs neutros que han sido enunciadas HQ HO &DStWXOR  /RV PDUFDGRUHV &$3V UHTXLHUHQ OD H[LVWHQFLD GH XQ VLWLR GH UHVWULFFLyQ SROLPyUFR HQ OD secuencia gnica, y si bien se han reportado casos, los mismos son de baja ocurrencia. La aproximacin ms sencilla para el desarrollo de un marcador funcional es a travs de XQD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH XQ IUDJPHQWR GH un gen y estableciendo la existencia de polimorVPR HQWUH JHQRWLSRV D WUDYpV GH OD UHVROXFLyQ GHO SURGXFWR HQ JHOHV GH 66&3 /RV SROLPRUVmos detectados mediante esta tcnica se basa HQ TXH KHEUDV VLPSOHV GH $'1 FRQ VHFXHQFLDV distintas, migrarn diferencialmente en un campo elctrico, en funcin de un diferente plegamiento intra-cadena dado por la complementariedad de bases. Patrones de bandas distintos HQWUH JHQRWLSRV HVWDUtDQ LQGLFDQGR XQD YDULDFLyQ GH VHFXHQFLD HQ HO IUDJPHQWR DPSOLFDGR Sin embargo, no puede asegurarse identidad GH VHFXHQFLD GH GRV IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV por no observarse diferencias en los patrones de electroforesis, ya que la deteccin de las mismas es un balance entre el nmero de SNPs presentes y el tamao del fragmento amSOLFDGR /RV SROLPRUVPRV SUHVHQWDGRV SRU los marcadores funcionales pueden entenderse como variantes allicas, que pueden o no estar asociados a una variacin a nivel proteico, ya sea en estructura o expresin. De todos modos, estos marcadores, anlogamente a lo HQXQFLDGR DQWHV HQ HVWH FDStWXOR SXHGHQ XWLlizarse para generar mapas genticos, que al estar formados por marcadores funcionales se denominan mapas funcionales. Los mapas funcionales en general estn basados en mapas pre-existentes de marcadores neutros con el agregado de marcadores funcionales. Estos marcadores funcionales pueGHQ FRUUHVSRQGHU D JHQHV VLQ UHODFLyQ HQWUH Vt como por ejemplo en mapas de ESTs-SSRs, o incluir anlogos de genes de resistencia

(5*$V R JHQHV SHUWHQHFLHQWHV D UXWDV PHWDEyOLFDV SDUWLFXODUHV SRU HMHPSOR VtQWHVLV GH carbohidratos), o a integrantes de una familia gnica (por ejemplo: genes de la familia P450). Los mapas genticos funcionales posibilitan establecer una estrategia de genes candidatos HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH IDFWRUHV UHVSRQVDEOHV GH QTLs a nivel molecular, a travs de la coincidencia en la localizacin de QTLs y marcadores gnicos. Un marcador funcional se convierte en gen candidato cuando est asociado al carcWHU IHQRWtSLFR D WUDYpV GH XQ DQiOLVLV GH PDUFDV simple, o cuando en un mapa su localizacin coincide con un QTL. En el primer caso, tanto el PDUFDGRU FRPR HO FDUiFWHU IHQRWtSLFR GHEHQ HVtar evaluados en la misma poblacin, mientras que en el segundo caso esto no es necesario, y es factible comparar la posicin de un marcador funcional con QTLs de mapas de otras poblaciones de la misma u otra especie. Por ejemplo, se ha encontrado que el locus del gen Lin5 del croPRVRPD ,; GHO WRPDWH FRUUHVSRQGLHQWH D XQD invertasa vacuolar (responsable de la degradacin de sacarosa en glucosa y fructosa) colocalizada con el QTL Brix9-2-5 de rendimiento de azcar de fruto, mientras que en papa el gen ortlogo invGE est asociado a variaciones en el nivel de azcares reductores en tubrculos de una poblacin segregante, y su posicin coincide con el QTL Sug9a, responsable del endulzaPLHQWR SRU IUtR HQ WXEpUFXORV GH RWUD SREODFLyQ GH SDSD $QiORJDPHQWH VH KD HQFRQWUDGR TXH marcadores funcionales, basados en anlogos D JHQHV GH UHVLVWHQFLD 5*$V VH DVRFLDQ HQ diferentes especies a resistencias a distintas enfermedades fngicas y virales. $VLPLVPR HQ FDUDFWHUHV FRPSOHMRV GRQGH VH hayan establecido mltiples QTLs, los marcadores funcionales permiten establecer la interaccin entre stos a la luz de las rutas metablicas LQYROXFUDGDV SXGLpQGRVH LGHQWLFDU HQ]LPDV claves para la manifestacin del carcter. Esta informacin genera un marco adecuado para HVWXGLRV GH LQJHQLHUtD PHWDEyOLFD El mejoramiento gentico asistido por marcaGRUHV PROHFXODUHV 0$6 HQFXHQWUD HQ ORV PDUcadores funcionales una situacin ideal en la que la recombinacin entre el gen responsable y el marcador es nula, ya que ambos guardan identidad.

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$O HVWDU GLVHxDGRV VREUH JHQHV OD WUDQVIHrencia de estos marcadores a travs de espeFLHV HVWi EHQHFLDGD GDGD OD PD\RU FRQVHUYDFLyQ GH ODV VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV $VLPLVPR la comparacin de mapas funcionales aporta LQIRUPDFLyQ HQ HVWXGLRV GH VLQWHQtD FRQVHUYDcin del tipo y orden de marcadores entre especies relacionadas), evolucin y especiacin entre diferentes organismos. Del mismo modo, la utilizacin de marcadores funcionales en la conservacin de los recursos genticos permite ponderar la diversidad gentica existente en base a las variantes allicas LQWUD H LQWHUHVSHFtFDV &RQFRUGDQWHPHQWH los estudios de gentica de asociacin (o mapeo de asociacin), basados en el desequilibrio de ligamiento entre un marcador y un carcter IHQRWtSLFR HQ XQD SREODFLyQ GH LQGLYLGXRV QR relacionados (como es el caso de los bancos de germoplasma) se presenta robustecido por el uso de marcadores gnicos. Finalmente, la correlacin de los marcadores IXQFLRQDOHV FRQ GDWRV IHQRWtSLFRV R FRQ 47/V slo sugiere la funcin putativa de un gen y sus variantes allicas. Es por esto que la conUPDFLyQ GHQLWLYD GH OD IXQFLyQ JpQLFD GHEH realizarse mediante estrategias ms directas como ensayos de complementacin y/o silenciamiento gnico.

5. Bibliografa y lecturas recomendadas:


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I CAPTULO 7. Genmica
Viviana Echenique; Juan P. Selva; Mauro Meier; Pablo Roncallo; Gustavo Schrauf

1 Introduccin La genmica se desarroll en las ultimas dos dcadas como consecuencia de los DYDQFHV UHDOL]DGRV HQ ELRORJtD PROHFXODU H Informtica, dos reas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnolgico enorme, generando una revolucin en el conocimiento y en la comprensin de los procesos biolgicos. El trmino fue acuado en 1986 por Thomas Roderick para referirse a la subdisciplina de la gentica que se ocupa del mapeo, secuenciacin y anlisis de las funciones de genomas completos y sirvi de nombre para una revista especializada en la publicacin de los mencionados temas, Genomics. Consiste en la caracterizacin molecular de genomas enteros y aporta informacin acerca de la secuencia y de la funcin de cada sector del genoma en diferentes situaciones de desarrollo \ EDMR GLIHUHQWHV FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV DVt como de los mecanismos implicados en la regulacin de la expresin e interaccin gnica. Para ello, las herramientas que se utilizan para el anlisis individual de genes o pequeas regiones cromosmicas, se aplican al anlisis global de genomas completos, estudianGR HQ FRQMXQWR ORV PLOHV GH JHQHV SURWHtQDV y metabolitos que constituyen un organismo, DVt FRPR ODV FRPSOLFDGDV UHGHV GH LQWHUDFciones que operan entre ellos. La informacin generada es enorme y es clave para la identiFDFLyQ \ HO DLVODPLHQWR GH JHQHV GH LQWHUpV \ permitir interpretar, en trminos moleculares, los procesos biolgicos. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas bioinformticas que permiten almacenar e interpretar esta informacin. Las aplicaciones de la genmica alcanzan a todos los mbitos de la actividad humana reODFLRQDGRV FRQ OD ELRORJtD FRPR OD VDOXG OD DOLPHQWDFLyQ \ HO PHGLR DPELHQWH $FWXDOPHQWH

se encuentran disponibles las secuencias de nucletidos y aminocidos de miles de genes \ SURGXFWRV JpQLFRV FRGLFDGRV SRU ORV JHnomas de varios organismos complejos. Esta informacin se utiliza para el estudio de enfermedades humanas complejas y para comSUHQGHU IHQyPHQRV WDOHV FRPR OD VLRORJtD celular, el desarrollo, la conducta, la evolucin, etc. Tambin aportan informacin acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, diferenciacin y respuesta a estreses biticos y abiticos. Gracias al potencial de relacionar fenotipos biolgica y econmicamente importantes con los genes responsables de los PLVPRV DFWXDOPHQWH HV SRVLEOH LGHQWLFDU JHnes de inters para ser transferidos a otros orJDQLVPRV SRU PHGLR GH WHFQRORJtD JpQLFD 3RU otro lado, el conocimiento de la secuencia de los genes posibilita el desarrollo de marcadores perfectos, basados en la secuencia del mismo gen, lo cual facilita la seleccin y la transferencia de los mismos a variedades de inters. La FRQMXQFLyQ HQWUH WHFQRORJtD JpQLFD PDUFDGRres moleculares, genmica y bioinformtica ha revolucionado el mejoramiento gentico vegetal, dando origen a lo que se denomina mejoramiento molecular y se estn desarrollando nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1). La genmica puede dividirse en: - Genmica estructural, que se ocupa de OD FDUDFWHUL]DFLyQ ItVLFD GH ORV JHQRPDV - Genmica funcional, que caracteriza el transcriptoma, que est constituido por el conjunto completo de transcriptos producidos por un organismo, el proteoma o conjunto de SURWHtQDV FRGLFDGDV SRU XQ JHQRPD \ HO metaboloma o conjunto total de metabolitos de una clula, consecuencia de la funcin de los $51 \ SURWHtQDV El objetivo de la genmica es la dilucidacin FRPSOHWD \ H[DFWD GH OD VHFXHQFLD GH $'1 GH un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades. Por anlisis computacional de la misma y utilizando principios conocidos de gentica es posible:

100 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Figura 1: /D FRQMXQFLyQ HQWUH WHFQRORJtD JpQLFD PDUFDGRUHV PROHFXODUHV JHQyPLFD \ ELRLQIRUPiWLFD UHvolucionaron el mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos cultivares. Los nuevos genes KDOODGRV VRQ LQWURGXFLGRV HQ SODQWDV SRU WHFQRORJtD JpQLFD (VWR D VX YH] SHUPLWH HVWDEOHFHU OD IXQFLRQDlidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia permite la obtencin de mapas, marcadores perfecWRV \ UHDOL]DU VHOHFFLyQ DVLVWLGD SRU PDUFDGRUHV PROHFXODUHV 0$6  DVt FRPR HO IHQRWLSHDGR PROHFXODU Gentileza de G. Spangenberg.

Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biolgicas y comprender la funcin de las mismas. Realizar predicciones acerca de toGDV ODV SURWHtQDV FRGLFDGDV SRU XQD especie. Establecer las variaciones genticas entre distintas poblaciones de una misma especie. Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos. Esto ha dado origen a la genmica comparativa y ha demostrado que existe considerable sintenia, es decir, una localizacin conservada de genes en posiciones equivalentes en especies relacionadas (Fig. 2). Tambin ha sido una H[FHOHQWH KHUUDPLHQWD SDUD LGHQWLFDU PRWLYRV de secuencia altamente conservados y, por lo tanto, funcionalmente importantes en regio-

QHV FRGLFDQWHV \ QR FRGLFDQWHV GHO JHQRPD Catalogar las variaciones genticas entre individuos ayudar a LGHQWLFDU DTXHOORV FDPELRV TXH conducen a enfermedades genticas, investigar nuevas terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores. Para la comparacin de secuencias se utiliza el algoritmo BLAST (basic local alignement search tool: herramienta de bsqueda de alineacin local bsica), para lo cual existen distintos programas que permiten hallar regiones similares entre diferentes genes (Parte I, Cap. 12). En Febrero de 2001, coincidiendo con el cincuenta aniversario de la publicacin del modelo HVWUXFWXUDO GHO '1$ SRU :DWVRQ \ &ULFN OD UHYLVta Nature public el primer borrador del genoma humano, que ha sido secuenciado completamente. Tambin se han secuenciado otros geQRPDV FRPR PDt] FRO]D VRMD WUpERO raigrs, etc. (Tabla 1).

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 101

Tabla 1. Ejemplos de genomas secuenciados en los ltimos aos.


Especie Haemophilus influenzae Mycoplasma genitalium Methanococcus jannaschii Helicobacter pylori Escherichia coli Bacillus subtilis Treponema pallidum Levadura (Saccharomyces cerevisiae )
Trichomonas vaginalis Nematodo (Caenorhabditis elegans) Mosca del vinagre ( Drosophila melanogaster ) Mosquito de la malaria ( Anopheles gambiae ) Mosquito del dengue y fiebre amarilla (Aedes aegypti ) Abeja (Apis mellifera) Protozoo malaria ( Plasmodium falciparum ) Sorgo (Sorghum bicolor ) Arroz (Oryza sativa ssp. japonica e indica) Pez globo (Tetraodon nigroviridis ) Gallo rojo de la jungla ( Gallus gallus) Zarigeya (Marsupial, Monodelphis domestica) Ratn (Mus musculus ) Rata (Rattus norvegicus ) Perro (Canis familiaris ) Chimpanc (Pan troglodytes ) Macaco rhesus (Macaca mulatta) Humano (Homo sapiens )

Tamao del genoma 1.830.137 pb 580.070 pb 1.660.000 pb 1.667.867 pb 4.639.221 pb 4.214.810 pb 1.138.006 pb 12.052.000 pb
160 Mpb 97 Mpb 120 Mpb 278 Mpb 1.380 Mpb 236 Mpb 22 Mpb 700 Mbp 420 - 466 Mpb 300 Mpb 1.000 Mpb 3.475 Mpb 2.500 Mpb 2.750 Mpb 2.411 Mpb 2.843 Mpb 2.870 Mpb 3.000 Mpb

Bacterias

Organismos Eucariotas

Plantas

Vertebrados

Figura 2: 6LQWHQLD HQWUH ORV JHQRPDV GH YDULDV JUDPtQHDV (O JHQRPD GH DUUR] FRQWLHQH JUXSRV GH PDUcadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas pueden VLQWHWL]DUVH EiVLFDPHQWH FRPR FRPSXHVWRV SRU EORTXHV GH OLJDPLHQWR GH DUUR] (Q OD JXUD VH PXHVWUD HO DOLQHDPLHQWR GH ORV FURPRVRPDV \ VHJPHQWRV GH FURPRVRPDV LGHQWLFDGRV FRQ OHWUDV PD\~VFXODV GH YDULDV JUDPtQHDV FRQ ORV GHO DUUR] FHQWUR  (O JHQRPD GHO PDt] WLHQH GRV FRSLDV VHPHMDQWHV GH FDGD EORTXH GH JHQHV SRU OR TXH HVWi UHSUHVHQWDGR SRU GRV DQLOORV GHO FtUFXOR /DV OtQHDV H[WHUQDV SXQWHDGDV FRQHFWDQ VHFWRUHV DG\DFHQWHV GH ORV FURPRVRPDV GH WULJR 0RGLFDGR GH *DOH \ 'HYRV  

102 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Tambin es posible estudiar todos los genomas bacterianos asociados a genomas ms complejos, sin necesidad de aislar y de cultivar especies microbianas particulares. Esto se denomina metagenmica (Parte I, Cap. 11). Para este estudio se extrae WRGR HO $'1 GH XQD FRPXQLGDG PLFURELDQD GH XQ ambiente particular (suelo, agua de mar, intestino humano, etc.), se determina que genes se encuentran presentes, cuales son sus funciones y las diferencias que existen entre distintas comunidades a este nivel. Ms recientemente ha surgido la denominada Genmica Sinttica, que pretende crear formas VLQWpWLFDV GH YLGD UHFUHDQGR JHQRPDV DUWLFLDOHV FpOXODV FRQ YtDV PHWDEyOLFDV SUHGHWHUPLQDGDV \ SURSLHGDGHV FDWDOtWLFDV HVSHFLFDV ,QYROXFUD HO UHGLVHo y la fabricacin de sistemas biolgicos. Como ejemplo podemos citar el transplante de un genoma de una clula bacteriana a otra. $ FRQWLQXDFLyQ VH EULQGD XQ SDQRUDPD JOREDO acerca de la forma en que se articulan los proyectos de genmica, algunos resultados relevantes, las aplicaciones en agricultura y el estado de la investigacin en Sudamrica.

2 Genmica estructural Como su nombre lo indica, el objetivo de la misma es caracterizar la estructura del genoma. Conocer la estructura de un genoma individual puede ser de XWLOLGDG SDUD PDQLSXODU JHQHV \ VHJPHQWRV GH $'1 en una especie particular. El anlisis comparativo de diferentes genomas posibilitar deducir reglas generales que gobiernan la estructura de todos los genomas. La genmica estructural procede a travs de niYHOHV LQFUHPHQWDOHV GH UHVROXFLyQ DQDOtWLFD FRPHQzando con la asignacin de genes y marcadores a cromosomas individuales, mapeando estos genes y PDUFDGRUHV GHQWUR GH ORV FURPRVRPDV QDOL]DQGR FRQ OD SUHSDUDFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR D WUDYpV GH la secuenciacin. Es decir, que se procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, hacia uno de alta resolucin, basado en marcadores moleculares, OOHJDQGR D OD UHDOL]DFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR EDVDdo en la secuencia de fragmentos clonados parcialmente solapantes (Fig. 3). Los pasos a seguir son:

1) -Asignacin de genes a los cromosomas

2) -Mapeo Cromosmico

marcador 2 marcador 1 gen marcador 3

3) -Mapeo de Restriccin gen marcador 2

3) -Mapeo Fsico gen fragmentos clonados

Figura 3: Niveles de complejidad de la genmica estructural. La genmica estructural procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, a uno de alta resoOXFLyQ EDVDGR HQ PDUFDGRUHV PROHFXODUHV KDVWD OD UHDOL]DFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR EDVDGR HQ OD VHFXHQFLD GH IUDJPHQWRV FORQDGRV VRODSDQWHV 0RGLFDGD GH *ULIIWKV et al. (2004).

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 103

- Mapeo cromosmico de baja resolucin (ubicacin de genes que producen fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). Las distancias genticas se basan en frecuencias de entrecruzamientos (crossing overs) y son medidas como porcentaje de recombinacin en centimorgans (cM). - Mapeo gentico de alta resolucin de cada cromosoma (con marcadores moleculares ubicados PX\ SUy[LPRV HQWUH Vt  - Mapeo fsico, basado en distancias moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restriccin parcialmente superpuestos. La distancia entre dos marcadores puede ser medida determinando el tamao de los fragmentos de restriccin que los contienen, siendo el fragmento ms pequeo que lleva ambos marcadores una estimacin de la distancia entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restriccin puede construirse un mapa

ItVLFR GHWHUPLQDQGR TXp IUDJPHQWRV SRVHHQ PDUFDGRUHV HQ FRP~Q /DV GLVWDQFLDV ItVLFDV VH PLGHQ HQ kilobases (kb) o megabases (Mb). - Anclado del mapa gentico en el mapa fsico. - Secuenciacin de ADN a gran escala, que brinda un mapa completo de cada cromosoma. - Anclado del mapa gentico y del mapa fsico en el de secuencia. /DV GLVWDQFLDV ItVLFDV JHneralmente no se correlacionan directamente con las distancias genticas porque las frecuencias de recombinacin no son siempre proporcionales a las distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las dos correlacionan razonablemente bien en regiones eucromticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas, que se colorean de manera ms difusa). En humanos, un cM es equivalente, en promeGLR D DSUR[LPDGDPHQWH  0E GH $'1

1) -Asignacin de genes a los cromosomas

2) -Mapeo Cromosmico

marcador 2 marcador 1 gen marcador 3

3) -Mapeo de Restriccin gen marcador 2

3) -Mapeo Fsico gen fragmentos clonados

Figura 3: Niveles de complejidad de la genmica estructural. La genmica estructural procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, a uno de alta resoOXFLyQ EDVDGR HQ PDUFDGRUHV PROHFXODUHV KDVWD OD UHDOL]DFLyQ GH XQ PDSD ItVLFR EDVDGR HQ OD VHFXHQFLD GH IUDJPHQWRV FORQDGRV VRODSDQWHV 0RGLFDGD GH *ULIIWKV et al. (2004).

104 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

2.1 Asignacin de loci a crosomas HVSHFtFRV Se utilizan los siguientes mtodos: - Ligamiento a loci conocidos: anlisis tradicional basado en cruzamientos, en especies en las que es factible hacerlo. - Electroforesis de campo pulstil: se usa en el caso de especies que poseen cromosomas pequeos, separables por esta tcnica, como sucede con los de levaduras. Las banGDV HQ HO JHO FRUUHVSRQGHUtDQ D FURPRVRPDV individuales y pueden utilizarse para localizar nuevos genes por hibridacin. Primero, utilizando sondas de localizacin conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de ubicacin desconocida se utiliza como sonda para asignarle una posicin en un cromosoma determinado.  +tEULGRV FHOXODUHV LQWHUHVSHFtFRV, por ejemplo humano-ratn. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de especies animales. Se establecen bancos de OtQHDV FHOXODUHV TXH FRQWHQJDQ WRGRV ORV FURmosomas del roedor y un cromosoma humano particular. Siempre incluye un cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo SDUD XQD IXQFLyQ ELRTXtPLFD GHWHUPLQDGD HQ HO genoma del ratn. Si sobreviven en un cultivo GHFLHQWH SDUD HO IDFWRU TXH QR VLQWHWL]DQ HV porque llevan el alelo humano equivalente, que complementa la funcin faltante. 2.2 Ubicacin de los genes a lo largo del cromosoma El prximo nivel de resolucin consiste en determinar la posicin de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma. Este paso es importante porque los mapas genticos pueGHQ DOLQHDUVH FRQ ORV PDSDV ItVLFRV \ XWLOL]DUVH para validar los mismos. - Mapeo por recombinacin: en los casos en que ha sido factible hacerlo (organismos experimentales como levaduras, mosca de la IUXWD UDWyQ $UDELGRSVLV HWF KD SRVLELOLWDGR OD construccin de mapas que a lo largo de los aos aparecen repletos de genes con efectos IHQRWtSLFRV GHWHUPLQDGRV 6LQ HPEDUJR ORV

intervalos recombinacionales entre genes conocidos contienen cantidades muy grandes de $'1 (VWRV LQWHUYDORV R JDSV QR SXHGHQ VHU completados utilizando anlisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. Para llenarlos y construir mapas de alta resolucin surgieron los marcadores moleculares, entre los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini y microsatlites)(Parte I, Cap. 5). Estos marcadores permiten la construccin de mapas genticos con una densidad de un PDUFDGRUFHQWLPRUJDQ F0  $XQTXH WDO UHVRlucin es un logro muy importante, un centimorgan representa, en humanos, una megabase, lo que equivale a un milln de pares de bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolucin actualmente existen los SNP, que son marcaGRUHV EDVDGRV HQ HO SROLPRUVPR GH XQ VROR nucletido. - Hibridacin in situ: cuando se dispone de un gen clonado ste puede ser utilizado como para hibridar con los cromosomas in situ, para OR FXDO VH OR PDUFD UDGLDFWLYDPHQWH R SRU XRUHVFHQFLD 3XHGH GH HVH PRGR LGHQWLFDUVH a los cromosomas portadores de la secuencia, GHWHUPLQDU VL VRQ VHFXHQFLDV HVSHFtFDV GH XQ cromosoma y determinar la posicin del gen en HO PLVPR (Q HO FDVR GH XRUHVFHQFLD OD WpFnica se denomina FISH XRUHVFHQFH in situ hybridization). La localizacin del fragmento en el cromosoma se visualiza como un punto brillante (Parte I, Cap. 3). - Mapeo fsico de los cromosomas: aporta un nivel de resolucin mayor. Se trata de LGHQWLFDU XQ FRQMXQWR GH IUDJPHQWRV GH $'1 clonados superpuestos que, juntos representen un cromosoma o un genoma completo. Los PDSDV DVt REWHQLGRV VH OODPDQ mapas fsicos, SRUTXH HO $'1 HV HO PDWHULDO ItVLFR GHO JHQRPD 2.3 Secuenciacin a gran escala del genoma - Generacin de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas) La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera aproximacin, no abordar el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar slo una fraccin del mismo, es decir, aquellos genes que se estn expresando en un momento determinado de la

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 105

ADN Genmico

Genoteca de BACS Clones organizados en Contigs BAC a ser secuenciado

Subclones (shotgun clones) Secuenciado Ensamblado

Figura 4: Estrategia de secuenciado jerrquico (hierarchical shotgun sequencing strategy). El primer SDVR FRQVLVWH HQ FRQVWUXLU XQD JHQRWHFD SRU IUDJPHQWDFLyQ GHO $'1 H LQWURGXFFLyQ GHO PLVPR HQ YHFWRUHV TXH DFHSWDQ JUDQGHV LQVHUWRV HQ HVWH FDVR GH %$&V /RV IUDJPHQWRV GH $'1 UHSUHVHQWDGRV HQ OD PLVPD VRQ RUJDQL]DGRV HQ XQ PDSD ItVLFR \ ORV FORQHV LQGLYLGXDOHV VRQ VHOHFFLRQDGRV \ VHFXHQFLDGRV SDUD OR FXDO se hace una nueva genoteca de trozos ms pequeos (shotgun library). La secuencia de los clones se HQVDPEOD QDOPHQWH SDUD UHFRQVWUXLU OD VHFXHQFLD GHO JHQRPD 0RGLFDGD GH OD SXEOLFDFLyQ GHO ,QWHUQDtional Human Genome Sequencing Consortium, 2001

vida del organismo. Para ello se obtienen poEODFLRQHV GH $'1F TXH UHHMDQ VyOR VHFXHQcias expresadas) que se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (Parte I, Cap. 8). Estas secuencias de entre 300-500 pb. suelen VHU VXFLHQWHV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV JHnes mediante comparacin con las secuencias existentes en las bases de datos pblicas (ej. Genbank, EMBL), utilizando para ello programas de anlisis informtico (Parte I, Cap.12). Si la informacin contenida en la secuencia SDUFLDO QR HV VXFLHQWH KDEUtD TXH GHWHUPLQDU OD HVWUXFWXUD GHO $'1F FRPSOHWR SDUD HVWXGLDU su funcin por otros mtodos. - Secuenciacin genmica La aproximacin anterior no permite idenWLFDU JHQHV TXH VH H[SUHVDQ D EDMR QLYHO R HQ VLWXDFLRQHV VLROyJLFDV QR FRQVLGHUDGDV R UHJLRQHV QR UHSUHVHQWDGDV HQ HO $51P 3DUD obtener esta informacin debe secuenciarse el

JHQRPD FRPSOHWR 3DUD HOOR HO $'1 JHQyPLco total se digiere con enzimas de restriccin apropiadas o se fragmenta mecnicamente en fragmentos de gran tamao (100-300 kb.), que se clonan en vectores apropiados, para construir genotecas que contienen, al menos, una representacin completa del genoma, que puede estudiarse en detalle y secuenciarse (Parte I, Cap. 4  $ Q GH GLVWLQJXLU ODV UHJLRQHV FRGLFDQWHV GH ODV QR FRGLFDQWHV ODV VHFXHQFLDV VH FRPSDUDQ FRQ ODV GH (67V \ $'1F SUHYLDmente estudiados. Para reconstruir la secuencia del genoma original a partir de los fragmentos clonados se utilizan las siguientes estrategias: a) Secuenciacin de los clones y ensamblado de los fragmentos El clonado comienza obteniendo un nmero elevado de fragmentos al azar que se clonan en un vector apropiado. En la preparacin de

106 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

PDSDV ItVLFRV GH JHQRPDV VH XWLOL]DQ YHFWRUHV FRPR ORV FyVPLGRV <$&V %$&V \ 3$&V TXH aceptan insertos de gran tamao (Parte I, Cap 4). El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan, buscando los puntos de solapamiento o superposicin. Un conjunto de clones solapantes se llama contiguo. Para establecer el solapamiento de clones se secuencian regiones cortas del inserto proximas al sitio de clonado utilizando primers posicionados en el vector. Los intervalos sin secuencias (gaps) se FRPSOHWDQ XWLOL]DQGR HO QDO GH XQ IUDJPHQWR clonado para llegar al siguiente (primer walking  $ PHGLGD TXH VH YDQ FDUDFWHUL]DQGR ORV clones, los contiguos se alargan y van convergiendo unos con otros. El proyecto termina cuando se tiene un conjunto de contiguos que equivale al nmero de cromosomas de la especie en estudio. En la Figura 4 se resume una estrategia de secuenciacin jerrquica (hierarchical shotgun sequencing). Esta se usa para genomas grandes. Para genomas ms pequeos se utiliza otra, llamada secuenciacin de

genomas completos (whole genome shotgun sequencing) (Fig. 5). Todos los estadios del anlisis genmico como la preparacin de cloQHV HO DLVODPLHQWR GH $'1 OD HOHFWURIRUHVLV \ la secuenciacin han sido bien adaptados a diferentes mquinas o robots, automatizando el trabajo. b) Ordenamiento de los clones Se utilizan varias tcnicas para ordenar los clones en contiguos. Entre ellas: - FISH: para localizar las posiciones aproximadas de insertos grandes.  )HQRWLSLFDFLyQ QJHUSULQWLQJ  se corta el clon con enzimas de restriccin que generan un grupo de bandas que representan XQ QJHUSULQW R KXHOOD GLJLWDO GHO FORQ /DV bandas generadas por varios clones pueden alinearse visualmente o por un programa de computacin para determinar si se superponen o solapan. - STS (sequence tag sites o sitios de secuencia marcada): son secuencias cortas

Figura 5: Montaje de un genoma complejo mediante la secuenciacin completa del genoma por tiros de escopeta (ZKROH JHQRPH VKRWJXQ VHTXHQFLQJ). En primer lugar, se construyen los contiguos con las secuencias que se superponen. Finalmente se utilizan los extremos apareados para cubrir los intervalos VLQ VHFXHQFLD \ DVt RULHQWDU \ RUGHQDU ORV FRQWLJXRV HQ XQLGDGHV OODPDGDV DQGDPLRV scaffolds 0RGLFDGR de Griffths et al. (2004).

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 107

de insertos grandes clonados. Se rene un conjunto de clones al azar y se cortan en fragmentos PiV SHTXHxRV TXH VH FORQDQ HQ \ se secuencian pequeas regiones de cada uno. Para ello se disean primers TXH DPSOLFDQ XQD VHFXHQFLD FRUWD GH $'1 676  $FWXDOPHQWH H[LVWH XQD WHFQRORJtD PiV moderna para el secuenciado de genomas, la pirosecuenciacin. Esta tcnica utiliza esferas atrapadas en una placa que contiene 1.600.000 microceldas. Cada esfera (una por microcelda) permite realizar una reaccin de VHFXHQFLDFLyQ LQGLYLGXDO EDVDGD HQ OD VtQWHVLV FRPSOHPHQWDULD GH XQ $'1 GH FDGHQD VHQFLOOD previamente multiplicado por PCR y alineado a cada esfera. La incorporacin de cada nucleWLGR GXUDQWH OD VtQWHVLV GH $'1 OLEHUD XQD PRlcula de pirofosfato (PPi), que al interactuar con enzimas presentes en el medio (luciferasa, entre otras) produce una seal quimioluminiscente captada por una cmara de deteccin de fotones, la traducida en una computadora como la adicin de un nucletido determinado, generando una secuencia individual por cada FHOGD (VWD WHFQRORJtD GHVDUUROODGD SRU OD HPpresa 454 Life Sciences, dio lugar a la creacin del primer equipo de secuenciacin masiva (Secuenciador GS 20) diseado para secuenciar genomas bacterianos, con una capacidad para descifrar 20 millones de bases por corrida (4hrs) en secuencias individuales de 100 bases. En el proyecto del gnero Bacillus, que tiene un genoma de aproximadamente 4 Mb, con seis corridas se descifraron 129.6 Mb, con una cobertura mayor a 20x de su genoma. En comparacin, por el mtodo de Sanger, se logr una cobertura de 3x (12,5Mb). 3 Utilizacin de mapas genmicos para el anlisis gentico /RV PDSDV JHQpWLFRV \ ORV ItVLFRV VRQ XQ LPportante punto de partida para varios tipos de anlisis gentico, incluyendo el aislamiento de genes y genmica funcional. Por ejemplo: - Aislamiento de genes por clonado posicional: para ubicar un gen cuya secuencia se desconoce se puede partir de un marcador conocido que est estrechamente ligado al

mismo. El mismo acta como punto de partida para el caminado cromosmico (chromosome walking  GRQGH ORV IUDJPHQWRV QDOHV GHO PDUcador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restriccin y los fragmentos obtenidos son utilizados para realizar una nueva ronda de seleccin de clones VXSHUSXHVWRV $Vt HO SURFHVR GH FDPLQDGR se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial, que culmina cuando se llega al gen de inters. Existe otra tcnica relacionada llamada salto cromosmico, que permite saltar a travs de reas distantes y potencialmente no clonaEOHV GHO $'1 \ JHQHUD PDUFDV DPSOLDPHQte espaciadas a lo largo de la secuencia, que pueden utilizarse como puntos de inicio para mltiples caminatas cromosmicas bidireccionales. Esta tcnica consiste en crear fragmentos grandes (entre 80-150 kb) por restriccin GHO $'1 HQ OD UHJLyQ TXH VH FUHH FRQWLHQH DO JHQ GH LQWHUpV &DGD IUDJPHQWR GH $'1 HV luego circularizado, poniendo en contacto los extremos libres. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la regin de genoma en estudio. Se trata de generar en esa unin un sitio que no sea cortado en una posterior restriccin, de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma DKRUD HVWpQ XQLGDV HQ XQ IUDJPHQWR (O FtUFXOR se corta con una nueva enzima de restriccin y los fragmentos obtenidos, entre los que se encuentran los sitios de unin, se clonan en fagos. Esto es lo que se llama una genoteca de saltos. Una sonda del sector de comienzo de la regin que contiene al gen de inters puede utilizarse como punta de partida para comenzar a saltar por el genoma. Un salto puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de LQWHUpV 8QD YH] DOOt HO RWUR extremo de la unin del fragmento inicial se corta y se usa para buscar el siguiente punto de salto en la genoteca. O sea que a travs de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Cada posicin de salto es un punto de partida para una caminata cromosmica. Estas regiones VH YDQ VHFXHQFLDQGR $OOt FRPLHQ]D la bsqueda de genes utilizando programas

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de prediccin y se seleccionan las secuencias candidatas. Esta estrategia de saltos se utiliz SDUD FORQDU HO JHQ GH OD EURVLV TXtVWLFD que es una enfermedad humana que resulta fatal y es causada por mutaciones en un gen de gran tamao localizado en el cromosoma 7. - Estrategia del gen candidato: la caracterizacin de una regin cromosmica hace que aparezcan varios genes de funcin desconocida. Si un gen de inters es mapeado en esa regin, estas secuencias pasan a ser candidatas. Para cada una de ellas, o para la ms probable, de acuerdo al anlisis de secuencia, se disean experimentos tendientes a determinar en cuales tejidos se expresa, en qu condiciones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. Si el patrn de expresin encontrado coincide con el patrn esperado es altamente probable que hayamos encontrado el gen de inters. El H[SHULPHQWR LGHDO SDUD FRQUPDU HVWR VHUtD OD transformacin de un individuo mutante para esta funcin con el gen normal. Si se produce la reversin del fenotipo mutante (complementacin), tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado. - Genes con patrones complejos de herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Puede suceder que: - La variacin fenotpica sea cuantitativa, como peso o altura. Este tipo de variacin se debe a la interaccin acumulativa entre alelos + y de varios genes y el ambiente. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP, dispuestos a lo largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variacin cuantitativa cuyos loci son llamados QTL (quantitative trait loci) (Parte I, Cap. 5 y 6). Para abordar este problema, se buscan GRV WLSRV GH OtQHDV TXH PXHVWUHQ IHQRWLSRV contrastantes para un carcter cuantitativo y se cruzan para generar descendencia homocigota que contenga solo un segmento o un pequexR Q~PHUR GH VHJPHQWRV GH XQD GH ODV OtQHDV Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede estimarse la contribucin de ORV VHJPHQWRV HVSHFtFRV D OD YDULDFLyQ REVHUYDGD /RV 613 SROLPRUVPRV GH XQ QXFOHytido simple) aceleran el mapeo de caracteres complejos.

4 Anlisis funcional de los genes Una vez secuenciado el genoma completo SXHGHQ LGHQWLFDUVH OD PD\RUtD GH ORV JHQHV GH XQD HVSHFLH 5HVWDUtD HQWRQFHV GHWHUPLQDU cul es la funcin de cada uno de ellos y cmo LQWHUDFFLRQDQ SDUD GHQLU XQ IHQRWLSR GHWHUPLnado. La genmica funcional intenta resolver esta cuestin a travs del estudio de: - El transcriptoma: VH UHHUH DO HVWXGLR GH los SHUOHV GH H[SUHVLyQ GH WRGRV ORV genes presentes en el genoma. Para ello se extraen todos los $51P FRQWHQLGRV HQ XQD FpOXOD WHjido u rgano en un determinado momento de GHVDUUROOR R VLWXDFLyQ VLROyJLFD (O PpWRGR PiV XWLOL]DGR HV HO GH PLFURPDWULFHV GH $'1 que permite analizar simultneamente la expresin de miles de genes, pudindose disponer entre 5000-50.000 genes (67V $'1F oligonucletidos) sobre un portaobjetos utilizando un sistema robotizado. Sobre este chip GH $'1 VH UHDOL]DQ H[SHULPHQWRV GH KLEULGDcin con muestras marcadas radiactivamente R FRQ XRUyIRURV DSURSLDGRV \ ORV UHVXOWDGRV VH FXDQWLFDQ PHGLDQWH DQiOLVLV FRQ phosphorimager R PLFURVFRStD FRQIRFDO 'H HVWD PDQHUD VH SXHGHQ LGHQWLFDU GH IRUPD VLPXOWiQHD los patrones de expresin de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta D GLIHUHQWHV HVWtPXORV DPELHQWDOHV (O DQiOLVLV bioinformtico de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona informacin importante sobre la funcin de los mismos (Parte I, Cap. 8). - El proteoma: comprende el conjunto total de protenas expresadas por un genoma completo LQFOX\HQGR ODV PRGLFDGDV despus de la traduccin. El estudio del transcriptoma debe ser complementado con el anlisis GH ODV SURWHtQDV FRGLFDGDV por los transcriptos, puesto que estas macromolculas estn al QDO GH OD UXWD de expresin gnica. El mtodo ms utilizado para estudiar la abundancia relativa de FLHQWRV GH SURWHtQDV HV OD HOHFWURIRresis bidimensional en geles de poliacrilamida '3$*(  que permite separar con gran resolucin OD PD\RUtD GH ORV SROLSpSWLGRV FHOXODUHV combinando de forma secuencial diferencias en carga y en masa molecular. Utilizando sistemas computarizados de anlisis de imagen

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VH VHOHFFLRQDQ ODV SURWHtQDV FX\D DEXQGDQcia relativa cambia durante el desarrollo o en UHVSXHVWD D GLIHUHQWHV HVWtPXORV DPELHQWDOHV (Parte I, Cap.9). - El metaboloma: comprende el conjunto total de metabolitos de una clula. En plantas, el metabolismo secundario (reacciones que no son vitales para el individuo y que conducen a la produccin de compuestos que a veces ayudan a su supervivencia, como por ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, taumatina, vainillina, menta, etc.) produce una enorme variedad de compuestos diferentes. 6H KDQ LGHQWLFDGR PiV GH  \ VH HVWLma que an quedan por descubrir alrededor de 100.000. Los investigadores que trabajan en HVWH QXHYR FDPSR GH OD TXtPLFD DSOLFDGD D OD ELRORJtD PHWDEROyPLFD FRQVLGHUDQ TXH VyOR GH HVWD IRUPD VH SRGUtD GHQLU HQ WpUPLQRV moleculares, un fenotipo concreto. En metaEROyPLFD VH HPSOHDQ KHUUDPLHQWDV DQDOtWLFDV PX\ VHQVLEOHV WDOHV FRPR HVSHFWURPHWUtD GH PDVD FURPDWRJUDItD OtTXLGD R JDVHRVD \ UHsonancia magntica nuclear) para analizar los cambios metablicos provocados por mutaciones gnicas o por la expresin de transgenes. La metabolmica puede ser aplicada al monitoUHR GH HVWUHVHV LQGXFLGRV SDUD LGHQWLFDU SDsos metablicos limitantes, para el anlisis de mutantes y hasta para realizar la evaluacin de manejos agronmicos, tales como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo, etc. (Parte I, Cap. 10). - La bioinformtica intenta dar sentido a la informacin derivada de las tcnicas anteriormente descriptas. La importancia de esta ciencia resulta obvia cuando se considera que los genomas poseen miles de millones de pares de bases (Parte I, cap. 12). 5 Modelos El mapeo comparativo ha demostrado que la organizacin de los genes dentro de los genomas ha permanecido muy conservada a travs de la evolucin, existiendo estrechas relaciones de colinearidad entre los genoPDV GH FDVL WRGDV ODV JUDPtQHDV FXOWLYDGDV entre las solanceas, entre las brasicaceas FXOWLYDGDV \ $UDELGRSVLV HQWUH ORV SLQRV URViceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo

en cuenta la envergadura de un proyecto de secuenciado, los emprendimientos genmicos tomaron especies modelo, representativas de un genoma vegetal. El primer modelo vegetal fue una dicotilednea, Arabidopsis thaliana. Le sigui una monocotilednea, el arroz, cuyo JHQRPD HV VHLV YHFHV PHQRU TXH HO GHO PDt] y 37 veces menor que el del trigo. El estudio de estas dos especies permitir arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal. Arabidopsis thaliana es una dicotilednea que posee uno de los genomas vegetales ms pequeos. Carece de importancia econmica pero resulta ser un excelente organismo para la investigacin puesto que es fcil de transformar y su ciclo de vida tarda slo  VHPDQDV GH VHPLOOD D VHPLOOD $OUHGHGRU GH  FLHQWtFRV WUDEDMDQ FRRUGLQDGDPHQWH en esta pequea planta, conformando el ms DYDQ]DGR VLVWHPD GH H[SHULPHQWRV HQ ELRORJtD vegetal del mundo. Su secuencia gentica es GH OLEUH DFFHVR HQ HO VLWLR KWWSZZZDUDELGRSVLVRUJ (Q XQ DUWtFXOR SXEOLFDGR HQ 1DWXUH  VH DQDOL]D HO JHQRPD GH $UDELGRSVLV D partir de las 115.4 megabases secuenciadas (de un total de 125). Su evolucin involucr una duplicacin completa del genoma, seguida por una subsecuente prdida y duplicacin de genes, lo cual dio origen a un genoma dinmico, enriquecido por una transferencia lateral de genes de cianobacterias. Contiene 25.498 JHQHV TXH FRGLFDQ SDUD  IDPLOLDV GH SURWHtQDV FRQ XQD GLYHUVLGDG IXQFLRQDO VLPLODU a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditis elegans $UDELGRSVLV posee varias familias GH SURWHtQDV QXHYDV SHUR FDUHFH GH RWUDV FRmunes, indicando que los grupos proteicos en comn han experimentado una expansin y contraccin en estos tres grupos eucariotas. El genoma de arroz est compuesto por 19 bloques gnicos que, reordenados como bloques de Lego, permiten reconstruir el genoma de las Tritceas PDt] Setaria, caa de azcar y sorgo (Fig. 6). Considerados como una uniGDG JHQpWLFD UHSUHVHQWDUtDQ HO JHQRPD DQFHVWUDO GH ODV JUDPtQHDV HO FXDO WHQGUtD XQ ~QLFR par de cromosomas. /D IDPLOLD GH ODV JUDPtQHDV HV SUREDEOHmente la mejor caracterizada en este aspecto, contando con una buena cantidad de mapas

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Figura 6: El genoma de arroz est compuesto por 19 bloques gnicos que, reordenados como bloques de Lego, permiten reconstruir el genoma de las Tritceas PDt] Setaria, caa de azcar y sorgo. Estos EORTXHV FRQVLGHUDGRV FRPR XQD XQLGDG JHQpWLFD UHSUHVHQWDUtDQ HO JHQRPD DQFHVWUDO GH ODV JUDPtQHDV HO FXDO WHQGUtD XQ ~QLFR SDU GH FURPRVRPDV

genticos comparativos que demuestran las UHODFLRQHV LQWHUHVSHFtFDV (Fig. 7). En trmiQRV JHQpWLFRV ODV JUDPtQHDV UHSUHVHQWDQ XQD familia muy diversa. Se estima que el genoma de las mismas divergi hace alrededor de 65 millones de aos desde un antecesor comn. (O QLYHO GH SORLGtD \ HO Q~PHUR EiVLFR GH FURPRVRPDV VRQ PX\ YDULDEOHV DVt FRPR HO WDmao del genoma. 6 Algunas generalizaciones acerca de los genomas Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones. Una de ellas es que el nmero de genes no es la base de la complejidad. La mosca de la fruta tiene unos 13.000 genes, Caenorhabitis elegans  $UDELGRSVLV 26.000 y los humanos 30.000. Si el nmero de genes no es

muy diferente entre estas especies, cul es la base de la mayor complejidad en los humanos? /D H[SOLFDFLyQ HVWDUtD HQ HO SURWHRPD PiV TXH HQ HO JHQRPD /DV SURWHtQDV FRGLFDGDV por los genes pueden agruparse en familias en base a su similitud y muchas de estas familias proteicas son compartidas por todos los grupos mencionados, aunque el nmero de miembros por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en aquellos genes involucrados en el desarrollo. Los humanos tenemos 30 genes para factores de crecimiento del fribroblasto, mientras que Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2. /DV QXHYDV SURWHtQDV VXUJHQ D WUDYpV GH FRUWHV \ HPSDOPHV DOWHUQDWLYRV GH XQ PLVPR $51 mensajero (alternative splicing), lo que permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las

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Figura 7: $OLQHDPLHQWR GH FURPRVRPDV GH DUUR]   \ PDt]  

predicciones indican que el 60% de los genes humanos tiene dos o ms alternativas de empalme. En Caenorhabitis el 22%. Un elevado nmero de factores de transFULSFLyQ \ PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV tambin conducen a una mayor complejidad. (Q HO FDVR GH $UDELGRSVLV FHUFD GHO  GH los genes son factores de transcripcin (FT). Si se compara la proporcin con los genomas GH RWUDV HVSHFLHV VH REVHUYD TXH $UDELGRSVLV no slo tiene ms genes que algunos animales pequeos, sino que la proporcin de FT es ms alta que en cualquier clase de organismo HVWXGLDGR (VWR SDUHFH UHHMDU HO KHFKR GH que las plantas deben adaptarse a una amplia variedad de condiciones medioambientales, a diferencia de los animales, que pueden movilizarse y cambiar de lugar si este no les resulta propicio. En humanos, los genes ocupan una cuarta SDUWH GHO JHQRPD \ VyOR HO  FRGLFD SDUD SURWHtQDV /DV VHFXHQFLDV FRUUHVSRQGLHQWHV D

los exones (secuencias del mensajero que se HQFXHQWUDQ UHSUHVHQWDGDV HQ OD SURWHtQD ODV secuencias correspondientes a los intrones no lo estn) comprenden un porcentaje bajo del genoma, mientras que los intrones comprenden el 24%. Los genes no estn distribuidos en IRUPD SDUHMD $OJXQRV VH HQFXHQWUDQ DJUXSDdos en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. En la mosca, HO QHPDWRGR \ $UDELGRSVLV la disposicin de los genes es mucho ms regular. $SUR[LPDGDPHQWH la mitad del genoma humano consiste de secuencias repetitivas, VLHQGR OD PD\RUtD elementos transponibles que se propagan replicndose e insertando una copia GH Vt PLVPRV HQ RWUDV UHJLRQHV GHO genoma. En la actualidad solo dos tipos de elePHQWRV VRQ DFWLYRV $OX \ /,1( /D PD\RUtD de los mismos se encuentran en regiones ricas HQ $ \ 7 PLHQWUDV TXH ORV JHQHV VH encuentran en reas con elevado contenido de G y C. Fragmentos de estos elementos tambin

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se encontraron en las secuencias regulatorias que controlan la expresin de varios genes, por lo que se ha sugerido que, de alguna manera, SRGUtDQ DIHFWDU SRVLWLYDPHQWH su expresin y evolucin. Los genomas vegetales tambin estn plagados de secuencias repetitivas (transposones y retrotransposones), que constituyen un SRUFHQWDMH PX\ LPSRUWDQWH GHO $'1 QXFOHDU \ han contribuido, a lo largo de la evolucin, a OD H[SDQVLyQ GH ORV JHQRPDV (Q PDt] UHSUHsentan del 50 al 80% del genoma y en trigo el 80% (Fig. 8). De esta manera los genomas de los cereales pueden considerarse como islas de genes que se hallan dispersas en un mar de secuencias repetitivas.

7 Genmica y Agricultura Especialistas en varias disciplinas han llegado a la conclusin de que el alcance de la JHQyPLFD VHUi PD\RU HQ OR TXH VH UHHUH D OD HFRQRPtD \ OD FDOLGDG GH YLGD TXH HQ HO iPbito de la salud humana. Gracias al aporte de grupos de investigacin de todo el mundo se dispone de bases de datos pblicas con informacin genmica de utilidad para los mejoradores. El conocimiento de cmo actan los genes en una especie puede ayudar a los mejoradores a perfeccionar su funcin en otra. Las VHFXHQFLDV GH ORV JHQRPDV GH $UDELGRSVLV y de arroz proporcionan informacin relevante DFHUFD GH RWURV FXOWLYRV FRPR HO PDt] \ HO WULgo. Dado que estos tres cereales representan

Figura 8: D (OHPHQWRV UHSHWLWLYRV HQ XQ IUDJPHQWR FURPRVyPLFR GH PDt] E 'LDJUDPD TXH PXHVWUD FRPR ORV HOHPHQWRV WUDQVSRQLEOHV HQ JUDPtQHDV VRQ UHVSRQVDEOHV GHO LQFUHPHQWR HQ HO WDPDxR GHO JHQRPD (O DUUR] VRUJR FHEDGD \ PDt] GHULYDURQ GH XQ DQFHVWUR FRP~Q KDFH DSUR[LPDGDPHQWH  PLOORQHV GH aos. Desde entonces, los transposones y retrotransposones se han ido acumulando a diferentes niveles HQ ODV HVSHFLHV /RV FURPRVRPDV VRQ PiV ODUJRV HQ PDt] \ FHEDGD FX\RV JHQRPDV FRQWLHQHQ JUDQGHV cantidades de retros con LTR (long terminal repeats). En verde se sealan los elementos transponibles y en naranja los genes. 0RGLFDGD GH *ULIIWKV et al. (2000).

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ms de la mitad de la produccin alimentaria mundial y que el arroz es el alimento bsico de ms de la mitad de la poblacin del planeta, la trascendencia de la genmica en la agricultura es indiscutible. La similitud entre las especies de cereales tambin implica que cuando se trasladan genes de una especie a otra, tendern a funcioQDU ELHQ \ HQ OD PLVPD IRUPD FRQ XQD PtQLPD manipulacin gentica. $ WUDYpV GH HVIXHU]RV S~EOLFRV \ SULYDGRV VH WUDEDMD HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV DVRFLDGRV con caracteres como rendimiento, resistencia a OD VHTXtD FDOLGDG GH ORV DOLPHQWRV UHVLVWHQFLD a insectos y tolerancia a herbicidas. 'H HVWD PDQHUD VH KD DFHOHUDGR VLJQLFDtivamente el aporte de nuevas variedades al PHUFDGR \D VHD SRU PRGLFDFLyQ JHQpWLFD R por seleccin con marcadores moleculares o utilizando criterios de seleccin a partir de la informacin molecular.

La genmica comparativa, basada en el anlisis de ESTs de diferentes plantas tolerantes a estreses abiticos, ha permitido la LGHQWLFDFLyQ GH UHGHV GH JHQHV FRPXQHV DVRciados con estreses ambientales, tales como VDOLQLGDG VHTXtD EDMDV \ DOWDV WHPSHUDWXUDV El anlisis de especies tolerantes a situaciones H[WUHPDV KD LGHQWLFDGR JHQHV LQYROXFUDGRV en los mecanismos que las hacen tolerantes. Dichos genes podrn entonces ser transferidos a especies de cultivo. Como ejemplos pueden citarse Agrostis adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a salinidad, Microlaena stipoides, tolerante a aluminio y Deschampsia antarctica, tolerante a bajas WHPSHUDWXUDV OD ~QLFD JUDPtQHD que crece en OD $QWiUWLGD (Fig. 9). Tambin se ha mencionado que los factores GH WUDQVFULSFLyQ VHUtDQ ODV OODYHV SDUD GHVbloquear funciones gnicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejo-

Figura 9: Categorizacin funcional de ESTs de Deschampsia antarctica. El objetivo de este proyecto es HQFRQWUDU JHQHV LQYROXFUDGRV HQ OD UHVLVWHQFLD D EDMDV WHPSHUDWXUDV SDUD VHU WUDQVIHULGRV SRU WHFQRORJtD gnica, a especies de cultivo. Gentileza de G. Spangenberg.

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res cultivos. Estos son genes que virtualmente controlan todo carcter importante, desde el SXQWR GH YLVWD DJUtFROD HQ ODV SODQWDV LQFOXyendo rendimiento, resistencia a las enfermeGDGHV SURWHFFLyQ FRQWUD ODV KHODGDV \ VHTXtD SURGXFFLyQ GH TXtPLFRV SURWHtQDV XVDGDV HQ IDUPDFpXWLFD HWF /D PD\RUtD GH ORV FDUDFWHres vegetales a los que interesa aplicar la ingeQLHUtD JHQpWLFD VRQ PXOWLJpQLFRV HM WROHUDQFLD DO HVWUpV KtGULFR \ ORV JHQHV LQYROXFUDGRV VH expresan en cascadas de forma tal que genes primarios activan a genes secundarios que a su vez activan a genes terciarios. Los factores GH WUDQVFULSFLyQ VHUtDQ ORV UHVSRQVDEOHV GH KDcer funcionar a los genes primarios, obtenindose largas cascadas de expresin de genes por la manipulacin de un solo gen. Durante los ltimos aos se ha obtenido una gran coleccin de FT de plantas, funcionalPHQWH FDUDFWHUL]DGRV QR VyOR HQ $UDELGRSVLV, VLQR WDPELpQ HQ HVSHFLHV FRPR WRPDWH PDt] y soja. En total hay cerca de 1900 FT en $UDELGRSVLV pero en el contexto de la genmica funcional el inters recae en unas 60 familias que tienen funciones reconocidas. La herramienta primaria que se utiliza para conocer la funcin de los FT consiste en sobreexpresarlos y/o detener la expresin de algunos de ellos. Se puede, por ejemplo, medir el efecto GH FDGD )7 HQ OD FRPSRVLFLyQ GH ORV OtSLGRV HQ ODV VHPLOODV DFHLWHUDV \ OD FRPSRVLFLyQ GH OtSLdos en las hojas, la composicin de azcares, de esteroides, etc., estudiar procesos bsicos, a travs de la dilucidacin de sus efectos en el desarrollo vegetal y la resistencia a las enferPHGDGHV R WUDWDU GH LGHQWLFDU HO )7 TXH UHJXla el consumo de nitrgeno (N). El N es uno de los insumos ms costosos para la agricultura, SRU OR TXH LGHQWLFDU ORV JHQHV TXH FRQWURODQ \ PRGLFDQ OD UHVSXHVWD DO 1 VHUtD GH JUDQ YDORU Tambin existen proyectos genmicos relacionados con leguminosas y con sus simbiontes MDGRUHV GH QLWUyJHQR 5HFLHQWHPHQWH VH KDQ secuenciado los genomas de las especies de Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han producido cientos de miles de EST de Medicago truncatula, Lotus corniculatus y soja. En el caso de M. truncatula no slo se han disectado los pasos que controlan las seales entre la

EDFWHULD MDGRUD \ OD SODQWD VLQR WDPELpQ HQWUH la planta y otro simbionte, las micorrizas (asoFLDFLyQ GH XQ KRQJR FRQ OD UDt] GH XQD SODQWD VXSHULRU (VWD DVRFLDFLyQ QR HV HVSHFtFD GH especie como el caso de Rhizobium y las leguminosas. El hongo puede ser de varios gneros y aporta fsforo a la planta). Recientemente VH ORJUy OD LGHQWLFDFLyQ HQ DOIDOID GH XQ UHceptor requerido para el reconocimiento de seales bacterianas de nodulacin, los llamados factores NOD. Las plantas medicinales aportan el 25% de los compuestos activos utilizados actualmente por la industria farmacutica. Entre estos compuestos se encuentran los citocromos P450, TXH SDUWLFLSDQ HQ OD ELRVtQWHVLV GH PXFKRV FRPSXHVWRV DQWLFDQFHUtJHQRV DOFDORLGHV WRHVWHURLGHV DQWLR[LGDQWHV \ DQWLPLFURELDnos. Tambin tienen un rol muy importante en OD GHWR[LFDFLyQ GH [HQRELyWLFRV KHUELFLGDV \ SHVWLFLGDV  6H KDQ LGHQWLFDGR  FLWRFURmos P450 y el objetivo actual es, utilizando herramientas de metabolmica, determinar su IXQFLyQ ELRTXtPLFD SUHFLVD Otro de los objetivos de la metabolmica es HO HVWXGLR GH OD VtQWHVLV GH ODV HVHQFLDV TXH FRQHUHQ SHUIXPH D ODV RUHV \ HO PHMRUDPLHQto del sabor de algunas plantas utilizadas en alimentacin humana, como por ejemplo manGLRFD GRQGH HO REMHWLYR VHUtD OD HOLPLQDFLyQ GH ORV JOXFyVLGRV FLDQRJpQLFRV TXH OH FRQHUHQ sabor amargo. La devastacin de los bosques es motivo suFLHQWH SDUD LQYHUWLU HQ SUR\HFWRV GH JHQyPLFD WHQGLHQWHV D OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV LQYROXcrados en perennidad, desarrollo, interaccin FRQ KHUEtYRURV UHVSXHVWD D HVWUpV \ VtQWHVLV de metabolitos secundarios como lignina y celulosa. Se han generado ESTs de lamo, abedul, abeto, pino y eucaliptos. El lamo se utiliza como sistema modelo para el anlisis de los genes involucrados en la formacin de madera. Otro objetivo en este campo es la E~VTXHGD GH HVWUDWHJLDV SDUD LQGXFLU RUDFLyQ WHPSUDQD TXH HV XQ IDFWRU FUtWLFR HQ HO PHMRUDmiento de forestales. La secuenciacin de los genes y la diluciGDFLyQ GH ODV YtDV TXH FRQWURODQ OD RUDFLyQ HQ ORV FHUHDOHV TXH GLHUH HQ YDULRV DVSHFWRV FRQ ORV FRUUHVSRQGLHQWHV HQ $UDELGRSVLV KD VLGR

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otro de los logros de la genmica. Tambin se localizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, los genes VRN1 y VRN2, que son los genes FHQWUDOHV HQ OD YtD GH YHUQDOL]DFLyQ HQ WULJR cebada y otros cereales invernales. Este conocimiento es clave en agricultura, ya que perPLWLUtD SRWHQFLDOPHQWH FRQWURODU OD RUDFLyQ en cultivos de gran importancia econmica, como los cereales y los forrajes. 8 Aportes de la genmica al mejoramiento de cereales El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42; $$%%'' HV XQR GH ORV SULQFLSDOHV FXOWLYRV alimenticios ya que provee cerca del 55% de los carbohidratos consumidos por el hombre. La gentica de este cultivo resulta compleja, es de naturaleza hexaploide, con tres genoPDV KRPHyORJRV GHQRPLQDGRV $ % \ ' TXH aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Los genes redundantes son una norma, con sets KRPRDOpOLFRV WULSOLFDGRV HQ OD PD\RUtD GH HOORV El genoma del trigo hexaploide es el de mayRU WDPDxR  0ES WULJR  0ES PDt] 800 Mbp sorgo, 450 Mbp arroz). Ms del 80% del mismo est constituido por secuencias de $'1 DOWDPHQWH UHSHWLWLYR (O UHVWDQWH  HVWi compuesto por secuencias de bajo nmero de copias o copia nica, donde se encuentran la PD\RUtD GH ORV JHQHV 6L ELHQ ODV VHFXHQFLDV DOWDPHQWH UHSHWLWLYDV YDUtDQ GH HVSHFLH HQ HVpecie, las secuencias gnicas, en general, son FRQVHUYDGDV (VWD FDUDFWHUtVWLFD SHUPLWH HO XVR de sondas heterlogas (de otros genomas) en experimentos de hibridacin de tipo RFLP 3DUWH , &DS  SDUD LGHQWLFDU VHFXHQFLDV conservadas en especies diferentes dentro de una misma familia taxonmica (Devos y Gale, 2000). En 1989 se public el primer mapa gentico molecular de trigo, correspondiente a los cromosomas homelogos del grupo 7, observndose que el orden de los genes y marcadores se conserva en gran parte de los tres genomas de trigo hexaploide. Esta fue la primera SUXHED GH FROLQHDULGDG HQ JUDPtQHDV \ SRVLELOit el desarrollo de la gentica comparativa en cereales. En trabajos posteriores se comprob que largos segmentos de los cromosomas de

PDt] VRUJR DUUR] WULJR \ FHEDGD FRQVHUYDQ OD presencia y el orden de marcadores y genes, aunque en algunos casos la correspondencia FURPRVyPLFD IXH PRGLFDGD SRU GXSOLFDFLRnes, inversiones o translocaciones. De esta PDQHUD VH ORJUy FRQVHQVXDU XQ PDSD XQLFDGR GH JUDPtQHDV HQ HO TXH VH GHWDOODQ VHFXHQcias y genes conservados en diferentes genomas (Fig. 2). Utilizando estas herramientas fue posible transferir informacin proveniente de plantas de genomas pequeos (arroz, sorgo) a plantas de genomas ms complejos como el trigo. Esto ha facilitado la localizacin ms precisa de genes para tolerancia a estrs bitico y abitico (prebrotado, dormicin, vernalizacin, IUtR \ RWURV \ HO GHVDUUROOR GH PDUFDGRUHV ~WLOHV para el mejoramiento. Tambin ha conducido a OD REWHQFLyQ GH PDSDV FRQVHQVR HVSHFtFRV SDUD WULJR SDQ FDQGHDO PDt] \ FHEDGD Las nuevas tcnicas de genmica funcional, epigentica, mapeo por asociacin, TILLING \ ORV $51 LQWHUIHUHQWHV $51L  HQWUH RWUDV contribuirn a un mayor conocimiento del funcionamiento del genoma de este cereal. ([LVWHQ JHQRWHFDV GH %$&V%,%$&V SDUD WRdos los genomas de trigo. Estas representan un importante complemento para saturar los mapas. En los ltimos aos fueron confeccionado numerosos mapas genticos de trigo pan, candeal y cebada a partir de poblaciones de RILs OtQHDV UHFRPELQDQWHV HQGRFULDGDV R KDSORLdes duplicados, que resultan tiles en estudios GH LGHQWLFDFLyQ GH 47/ DVRFLDGRV D FDOLGDG y estreses biticos (enfermedades) y abiticos VHTXtD VDOLQLGDG  3DUD HOOR VH XWLOL]DURQ \ desarrollaron miles de marcadores moleculaUHV LQFOX\HQGR 5)/3V 665V $)/3V 613V \ PDUFDGRUHV '$U7 Diversity array technology), (estos ltimos basados en matrices de diversidad). La informacin generada posibilit el desarrollo de marcadores perfectos, a partir de la secuencia del gen a seleccionar, en lugar de marcadores genticamente ligados. Como ejemplo pueden citarse los genes de las enziPDV SROLIHQRO R[LGDVDV OLSR[LJHQDVDV \ WRHQR sintasa, entre otros. Tambin posibilit la confeccin de mapas consenso para trigo pan, candeal y cebada.

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El acceso a los principales genes que afectan OD FDOLGDG KD DELHUWR QXHYDV YtDV SDUD HO GHVDrrollo comercial de diferentes productos derivados del trigo. Es posible obtener variedades con diferente calidad de almidn, diferente textura de grano, diferente composicin de gluteninas, gliadinas y secalinas en funcin del uso industrial. El descubrimiento de genes valiosos de otros genomas y la posibilidad de incorporarlos al trigo por transgnesis permitirn resolver problemas del cultivo, como pueden ser limitantes debido a estreses biticos y abiticos o desarrollar nuevas generaciones de transgnicos en funcin de las necesidades del consumidor, con mayor contenido de aminocidos esenciales como la lisina, vitaminas, etc. La complejidad del genoma del trigo ha hecho aconsejable abordar los estudios genmicos a travs del transcriptoma. Para ello se han establecido consorcios internacionales como HO ,QWHUQDWLRQDO :KHDW *HQRPH 6HTXHQFLQJ &RQVRUWLXP ,:*6& R HO ,QWHUQDWLRQDO 7ULWLFHDH Mapping Initiative (ITMI), el cual coordina gruSRV GH LQYHVWLJDFLyQ GH GLVWLQWRV SDtVHV HQ OD construccin de mapas moleculares del genoma de trigo. Existe colaboracin internacional para otros cultivos como el arroz, donde el Internacional Rice Genome Sequencing Project ,5*63 FRRUGLQD HVIXHU]RV GH  SDtVHV \ FRPR resultado de esto, en 2002, fueron colocadas en bases de datos pblicas secuencias de alta calidad que representaban 366 Mbp del genoma de arroz. En el 2005 se lleg a 371 Mbp, que representan el 95% del mismo. Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la ltima dcada, de manera que en Septiembre de  KDEtD  PLOORQHV GH (67V GHSRVLWDGDV HQ el National Center for Biotechnology Information GE(67 GDWDEDVH KWWSZZZQFELQOPQLKJRY dbEST). Esto incluye cerca de 1.607.934 de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes ms cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum vulgare L.; especies diploides y tetraploides de Triticum, Secale cereale L. y Aegilops speltoides Tausch. Estas ESTs se utilizan para el desarrollo de marcadores funcionales, la preparacin de mapas de transcriptos y la construccin de PDWULFHV GH $'1F $FWXDOPHQWH HO HVWXGLR GH $51 LQWHUIHUHQWHV 7,//,1* \ OD JHQpWLFD GH H[presin lideran el mapeo de eQTL (Quantitative

Traits Loci de expresin) y han sido utilizados SDUD LGHQWLFDU IXQFLRQHV GH JHQHV LQGLYLGXDOHV Toda esta informacin permite inferir que la ELRWHFQRORJtD SXHGH FDPELDU HO HVFHQDULR GH ORV cereales en dos reas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses biticos y abiticos y  PRGLFDQGR HO FRQFHSWR GH SURGXFFLyQ GH commodities por el de produccin de specialities, por ejemplo para derivados de trigo con mayor valor agregado, como noodles (clase GH GHR PX\ XWLOL]DGR HQ $VLD  JDOOHWLWDV GXOFHV crackers (un tipo de galletita que se rompe fcilmente), masa congelada, pan de molde, pasta, almidones, plsticos biodegradables, etc. 6H KDQ LGHQWLFDGR FLQFR iUHDV GH LQYHVWLJDcin a desarrollar en los prximos aos para el mejoramiento de trigo, que pueden aplicarse a los cereales en general: (i) mapeo gentico, (ii) anlisis de QTL, (iii) mejoramiento molecular, (iv) mapeo por asociacin, y (v) desarrollo de VRIWZDUH 9 Genomas trabajadores La genmica aplicada a dilucidar los mecanismos por los cuales funcionan los microorganismos puede conducir al aislamiento de sus componentes para desarrollar nanoestructuras que lleven a cabo funciones complejas. Como ejemplos pueden citarse: Methanococcus jannaschii: es una bacteria que produce metano, una importante fuente de HQHUJtD &RQWLHQH HQ]LPDV TXH VRSRUWDQ WHPperaturas y presiones elevadas por lo que son SRWHQFLDOPHQWH ~WLOHV SDUD QHV LQGXVWULDOHV Deinococcus radiodurans: soporta niveles de radiacin extremadamente elevados por lo cual tiene un alto potencial para limpiar desechos radiactivos. Thalassiosira pseudonana: se trata de una diatomea marina que es la principal participante en el bombeado biolgico de carbono hacia las profundidades de los ocanos, por lo que posee un elevado potencial para mitigar los cambios climticos del planeta. 10 Proyectos de Genmica en Sudamrica En Sudamrica se han desarrollado y se encuentran en ejecucin algunos proyectos genmicos. Frente al estado del desarrollo de

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 117

estas reas en el mundo, existen en la regin serias carencias, tanto de recursos humanos entrenados como de infraestructura y equipamiento. En Brasil se estableci una red de cooperacin que secuenci completamente el genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ataFD D ORV FtWULFRV FDXVDQGR LPSRUWDQWHV SpUGLGDV econmicas. Tambin incursion en el estudio de genmica funcional de clulas cancerosas y de secuenciacin del genoma de caa de azcar, 6DFFKDUXP RFLQDOLV (Q $UJHQWLQD VH ha trabajado en la secuenciacin de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina. Investigadores argentinos participan tambin en proyectos de genmica en cooperaciones internacionales, como el consorcio involucrado en la secuenciacin del genoma de Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llev a la clonacin y caracterizacin de los genes de vernalizacin en trigo o el proyecto de bsqueda GH JHQHV GH WROHUDQFLD D IUtR HQ 'HVFKDPSVLD antarctica. En Chile se ha completado recientemente la secuenciacin de Piscirickettsia salmonis, patgeno intracelular de salmones que causa importantes prdidas en esta industria. Tambin se trabaja activamente en especies KRUWtFRODV SULQFLSDOPHQWH IUXWDOHV Otros ejemplos son el desarrollo de marcadores microsatlites (Parte I, Cap. 5) de diversas especies, como girasol (colaboracin de ,17$$UJHQWLQD FRQ HPSUHVDV VHPLOOHUDV locales), YLGHV ,1,$&KLOH FRPR SDUWH GH XQ consorcio internacional), alpacas y otros camOLGRV VXGDPHULFDQRV ,1,$&KLOH  SDVWR OORUyQ &(5=26 815 ,17$ &DVWHODU  HQWUH otros. El girasol es una especie de importancia econmiFD HQ OD $UJHQWLQD \ HV HO HMH GH YDULRV SUR\HFWRV JHQyPLFRV $OJXQRV GH ORV REMHWLYRV VRQ OD caracterizacin de la diversidad funcional del JLUDVRO \ OD LGHQWLFDFLyQ GH 613V DVRFLDGRV D caracteres agronmicos de importancia como la resistencia a estreses biticos y abiticos. Por otro lado, el desarrollo de marcadores microsatlites, ESTs y el mapeo gentico de las mismas es utilizado para asistir al mejoramienWR \ UHDOL]DU LGHQWLFDFLyQ YDULHWDO En Chile se ha desarrollado un programa de genmica funcional coordinado por diversos ministerios, destinado a enfrentar problemas de postcosecha y enfermedades en plantas de

LQWHUpV DJUtFROD 2WUR SUR\HFWR GH JHQyPLFD HQ HVWH PLVPR SDtV DSXQWD D GHVDUUROODU SODWDformas tecnolgicas en genmica forestal con el objeto de mejorar la posicin competitiva del sector forestal chileno. En el marco del Programa Cooperativo para HO 'HVDUUROOR 7HFQROyJLFR $JURDOLPHQWDULR \ $JURLQGXVWULDO GHO &RQR 6XU 352&,685  los Institutos Nacionales de Investigacin $JURSHFXDULD GH $UJHQWLQD %ROLYLD %UDVLO Chile, Paraguay y Uruguay han conformado una plataforma regional para enfrentar los deVDItRV TXH LPSRQH OD VHFXHQFLDFLyQ GHO JHQRma de la papa. Esta iniciativa es desarrollada a nivel mundial por el Consorcio Internacional de Secuenciacin del Genoma de la Papa, que liGHUD OD 8QLYHUVLGDG GH :DJHQLQJHQ GH +RODQGD y en la que estn comprometidos China, Estados Unidos, Holanda, India, Inglaterra, Irlanda, Nueva Zelanda, Polonia, Rusia y los VXGDPHULFDQRV &KLOH 3HU~ $UJHQWLQD \ %UDVLO Estos ltimos, en conjunto, secuenciarn el cromosoma 3 del genoma de la papa y en total se debern secuenciar los 12 cromosomas de la especie. (Q YDULRV SDtVHV VH KDQ VHFXHQFLDGR fragmentos de genomas de virus y viroides $UJHQWLQD &KLOH 8UXJXD\  (Q $UJHQWLQD VH esta realizando la caracterizacin biolgica \ PROHFXODU GHO YLUXV GHO PDO GH 5tR &XDUWR 05&9 FRQ HO Q GH HVWLPDU OD GLYHUVLGDG JHntica de las poblaciones del virus, detectar la existencia de razas y limitar la propagacin de HVWD HQIHUPHGDG GH LPSRUWDQFLD SDUD HO PDt] (Q HO DxR  OD $JHQFLD 1DFLRQDO GH 3URPRFLyQ &LHQWtFD \ 7HFQROyJLFD GH $UJHQWLQD $13&\7 ODQ]y XQD FRQYRFDWRULD SDUD 3UR\HFWRV GH UHD GH 9DFDQFLD 3$9  donde la genmica era una de las prioridades. En respuesta a esta convocatoria se form una Red de laboratorios dedicados al anlisis genmico funcional y comparativo en especies de inters agropecuario, forestal o ambiental 3$9  /RV REMHWLYRV IXHURQ JHQHUDU XQD LQfraestructura operativa y comunicacional adecuada y formar recursos humanos necesarios para apoyar el desarrollo de iniciativas e investigaciones en reas de genmica funcional y ELRLQIRUPiWLFD FUtWLFDV SDUD OD ELRORJtD DJURSHcuaria, forestal y ambiental. La red pudo capa-

118 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

citar recursos humanos orientados a la bsqueda, prospeccin y/o anlisis funcional de genes con inters bsico o aplicado. Se abordaron cinco reas de desarrollo e integracin: a) transcriptmica, b) protemica, interactmica y metabolmica, c) genmica comparativa, d) genmica evolutiva para la caracterizacin de la diversidad gentica y e) ecogenmica (aplicada a la evaluacin de impacto ambienWDO \ HSLGHPLRORJtD PROHFXODU (Q ORV GRV SULmeros subproyectos se encararon trabajos de prospeccin y caracterizacin funcional de regiones genmicas de inters en plantas superiores y bacterias zoonticas mediante el anOLVLV GH SHUOHV GH WUDQVFULSFLyQ LQWHUDFFLyQ GH SURWHtQDV \ SHUOHV PHWDEyOLFRV JLUDVRO FLWUXV soja, solanceas, Mycobacterium y otros). En el c) se caracterizaron molecularmente regioQHV JHQyPLFDV LQYROXFUDGDV HQ FDUDFWHUtVWLFDV reproductivas (apomixis) de especies forrajeras, de resistencia a estreses en especies FXOWLYDGDV DVt FRPR GH FDUDFWHUtVWLFDV SURductivas en girasol y caprinos. El rea d) sirvi para evaluar la diversidad gentica de recursos biolgicos naturales o cultivados, en particular en especies leguminosas y en forestales. La e) permiti estudiar la dinmica poblacional de variantes allicas en ecosistemas (impacto del FXOWLYR GH PDtFHV WUDQVJpQLFRV HQ SRWHQFLDOHV genes de resistencia en insectos plaga, cuantiFDFLyQ GH GLYHUVLGDG JHQpWLFD GH HVSHFLHV HQ peligro de extincin en ecosistemas naturales explotados por el hombre) y encarar la epidePLRORJtD PROHFXODU GH OD HEUH DIWRVD \ GH OD peste porcina clsica. (VWH SUR\HFWR DFDED GH QDOL]DU VHSWLHPEUH de 2008) y, si bien an no se ha realizado la HYDOXDFLyQ QDO GHO PLVPR YDULRV GH ORV REjetivos fueron cumplidos exitosamente, ya que se formaron varios doctores en el rea en disWLQWDV 8QLYHUVLGDGHV GHO SDtV HQWUHQDGRV SDUD trabajar en equipos multidisciplinarios, adems de lograr avances en el conocimiento en las mencionadas reas. (O ,1,$ 8UXJXD\ FXHQWD FRQ SUR\HFWRV GH desarrollo y validacin de herramientas bioinformticas para integrar informacin genmica HQ SURJUDPDV GH WRPHMRUDPLHQWR \ VHOHFFLyQ de germoplasma. Dentro de los proyectos de JHQyPLFD GH DUUR] HO (0%5$3$ %UDVLO  UHD-

liza el estudio de genes y sus productos, involucrados en los mecanismos moleculares de susceptibilidad y resistencia a estreses biticos, a travs de estudios de genmica funcional, utilizando ESTs y unigenes y micromatriFHV GH $'1F Los objetivos para programas de genmica VXGDPHULFDQRV GHEHUtDQ HQIRFDUVH KDFLD HO aumento de la productividad y la mejora de la calidad de los productos, desarrollando capaciGDGHV SDUD LGHQWLFDU JHQHV GHO JHUPRSODVPD regional, de manera de disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aisODGRV SRU SDtVHV GHO SULPHU PXQGR \ EXVFDU VRluciones para problemas propios de la regin, TXH GLItFLOPHQWH SXHGHQ VHU HQIUHQWDGRV SRU programas de mejoramiento gentico ajenos a la misma. 11 Lecturas / sitios recomendados
&HQFL $ &KDQWUHW 1 ;\ . *X < $QGHUVRQ 2' )DKLPD 7 'LVWHOIHOG $ < 'XEFRYVN\ -  Construction and characterization of a half milOLRQ FORQHV %DFWHULDO $UWLFLDO &KURPRVRPH %$& OLEUDU\ RI GXUXP ZKHDW 7KHRU $SSO *HQHW 107: 931-939. &HUYLJQL * 3DQLHJR 1 'tD] 0 6HOYD -3 =DSpacosta D., Zanazzi D., Landerreche I., Felitti 6 3HVVLQR 6 6SDQJHQEHUJ * $QG (FKHQLTXH V. 2008. Expressed sequence tag analysis and development of gene associated markers in a near-isogenic plant system of Eragrostis curvula. Plant Molecular Biology. 67: 1-10. 'HYRV .0 < *DOH 0' 2000. Genome relationship: the grass model in current research. Plant Cell 12: 637-646 (FKHQLTXH 9 6WDPRYD % :ROWHUV 3 /D]R * Carollo V. Y Dubcovsky J. 2002. Frequencies of Ty1-copia and Ty3-gypsy UHWURHOHPHQWV ZLWKLQ the Triticeae (67 GDWDEDVHV 7KHRU $SSO *HQHW 104: 840-844. *DOH 0 < 'HYRV . 1998. Plant comparative genetics after 10 years. Science, 282: 656-658. *LEVRQ '* %HQGHUV *$ $QGUHZV3IDQQNRFK & 'HQLVRYD ($ %DGHQ7LOOVRQ + =DYHUL - 6WRFNZHOO 7% %URZQOH\ $ 7KRPDV ': $OJLUH 0$ 0HUU\PDQ & <RXQJ / 1RVNRY 91 *ODVV -, 9HQWHU -& +XWFKLVRQ ,LL &$ < 6PLWK H.O. 2008. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome. Science, 319: 1215-1220. *ODVV -, $VVDG*DUFLD 1 $OSHURYLFK 1 <RRVHSK

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 119

6 /HZLV 05 0DUXI 0 +XWFKLVRQ ,LL &$ 6PLth H.O. Y Venter J.C. 2005. Essential genes of D PLQLPDO EDFWHULXP 3URF 1DW $FDG 6FL  425-430. *RII 6$ 5LFNH ' /DQ 7+ 3UHVWLQJ * :DQJ 5 'XQQ 0 *OD]HEURRN - 6HVVLRQV $ 2HOOHU P., Varma H. et al  $ GUDIW VHTXHQFH RI WKH rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 296: 92-100. *ULIWKV $ 0LOOHU - 6X]XNL ' /HZRQWLQ 5 < *HOEDUW :  $Q LQWURGXFWLRQ WR JHQHWLF DQDO\VLV 2FWDYD (GLFLyQ :+ )UHHPDQ 1<RUN 860 pp. *XSWD 3. 0LU 55 0RKDQ $ $QG .XPDU -  :KHDW JHQRPLFV 3UHVHQW VWDWXV DQG future prospects. International Journal of 3ODQW *HQRPLFV $UWLFOH ,'   SDJHV doi:10.1155/2008/896451 .XPDU $ < %HQQHW]HQ -/ 1999. Plant retrotransSRVRQ $QQX 5HY *HQHW   Lacadena J.R. 2000. Seris como dioses. Crtica 0DGULG , 874: 12-16. /DUWLJXH & *ODVV -, $OSHURYLFK 1 3LHSHU 5 3DUPDU 33 +XWFKLVRQ ,LL &$ 6PLWK +2 < 9HQWHU J.C. 2007. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. Science 317: 632-638.

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I CAPTULO 8 Transcriptmica
Silvina Felitti y Silvina Pessino El anlisis de los niveles de representacin GH $51 PHQVDMHURV SURSRUFLRQD LQIRUPDFLyQ importante sobre la actividad de un gen, evidenciando si est siendo copiado para posteULRUPHQWH GLULJLU OD VtQWHVLV GH OD SURWHtQD D OD FXDO FRGLFD (Q ORV ~OWLPRV DxRV ORV SURFHdimientos para la deteccin de los niveles de $51 PHQVDMHURV KDQ SURJUHVDGR YHOR]PHQWH GHVGH HO DQiOLVLV GH JHQHV ~QLFRV HVSHFtFRV (como el Northern, slot, y dot blotting, la RTPCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de proteccin de nucleasas) hacia otros HQIRFDGRV HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH P~OWLSOHV WUDQVFULSWRV TXH GLHUHQ HQ VX UHSUHVHQWDFLyQ entre las diversas muestras experimentales (como la hibridizacin substractiva, el display GLIHUHQFLDO HO $'1F$)/3V, la secuenciacin de etiquetas expresadas o ESTs, el anlisis seULDO GH OD H[SUHVLyQ GH JHQHV R 6$*( \ OD KLbridizacin de microarreglos). La organizacin posterior de las secuencias dentro de grupos IXQFLRQDOHV EDVDGD HQ ORV GDWRV GH KRPRORJtD proporciona un marco bsico para conducir QXHYRV HVWXGLRV GLULJLGRV D GHQLU HO URO ELROygico de cada producto gnico. Por otra parte, la aplicacin de tcnicas de PCR en tiempo real y de hibridizacin in situ de tejidos permiten una validacin ms precisa de los datos de expresin diferencial obtenidos por mtodos anteriormente citados. La capacidad tecnolgica creciente permite ahora capturar sectores de tejidos o incluso clulas aisladas y analizar su contenido de $51P OR TXH SURYHH LQIRUPDFLyQ HVSHFtFD sobre la representacin del transcriptoma para tipos celulares nicos. La asociacin de los datos provenientes de la secuenciacin genmica con aquellos originados en la transcriptmica y la protemica facilita la prediccin de la exisWHQFLD GH IUDJPHQWRV FRGLFDQWHV HQ VHFWRUHV acotados del genoma, y da informacin sobre la posible funcin de los candidatos en tejidos SDUWLFXODUHV $GHPiV OD DVRFLDFLyQ GH ORV GD-

tos de posicin (originados en el mapeo gentico) con los datos de expresin (originados en el anlisis del transcriptoma) posibilita la seleccin de candidatos responsables de disparar un determinado carcter de inters. (VWH FDStWXOR WLHQH FRPR REMHWLYR SUHVHQWDU HQ IRUPD DEUHYLDGD XQD VHULH GH PHWRGRORJtDV que son utilizadas habitualmente para el anlisis del transcriptoma de plantas. Debido al muy rpido cambio y perfeccionamiento en las tcnicas empleadas para abordar el estudio de la representacin de mensajeros tanto a nivel de mesada como bioinformtico, algunas de las PHWRGRORJtDV PHQFLRQDGDV DTXt \D KDQ VLGR reemplazadas y se usan actualmente en forma poco frecuente. Sin embargo hemos decidido incluirlas, dada su gran importancia histrica en relacin al cambio de abordaje conceptual que va desde el anlisis de la actividad de genes nicos al estudio integral de la expresin gnica. Comenzaremos describiendo las tcnicas en orden cronolgico de desarrollo. Hibridizacin substractiva Los mtodos de hibridizacin substractiva fueron creados a principios de los aos 80 con HO SURSyVLWR GH FRQVWUXLU ELEOLRWHFDV GH $'1F para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propsito GH LGHQWLFDU JHQHV UHJXODGRV SRVLWLYD R QHJDtivamente en una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de funcin relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de tcQLFDV FRPXQHV GH ELRORJtD PROHFXODU TXH QR requieren equipos especializados de deteccin y anlisis. El procedimiento general consiste HQ OD KLEULGL]DFLyQ GH XQ $'1F SURYHQLHQWH de una muestra prueba (tester) con un exceso GH $51P SURYHQLHQWH GH XQD PXHVWUD FRQWURO (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman molculas de $51P$'1F KtEULGDV PLHQWUDV TXH ODV VHFXHQFLD GH $'1F TXH HVWiQ SUHVHQWHV ~QLFDmente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las molculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatograItD HQ KLGUR[LODSDWLWD /RV $'1FV H[SUHVDGRV diferencialmente pueden entonces ser recu-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 121

perados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca. Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades GH $51P \ LL XQD WHQGHQFLD D XQD PHQRU HFLHQFLD HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH WUDQVFULSWRV SRFR abundantes. La hibridizacin substractiva es aplicable slo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de exSUHVLyQ $GHPiV QR JHQHUD XQD PHGLGD FXDQWLWDWLYD \ DXQTXH HV HFLHQWH HQ OD LGHQWLFDFLyQ de genes que estn completamente ausentes en el driver no revela fcilmente a aquellos que estn presentes en ambas muestras en distinta SURSRUFLyQ 6H UHDOL]DURQ PRGLFDFLRQHV SDUD mejorar el protocolo original que incluyen la SURGXFFLyQ GH $'1F FRQ PDUFDV GH ELRWLQD R ROLJR G7 OiWH[ GH PDQHUD GH UHQDU OD VHparacin de las molculas de cadena simple \ GREOH 7DPELpQ VH LQFRUSRUy OD DPSOLFDFLyQ GH $'1FV VHOHFWRV SRU 3&5 SDUD GLVPLQXLU OD FDQWLGDG LQLFLDO GH $51P UHTXHULGR \ DXPHQWDU OD HFLHQFLD GH FORQDGR GH ORV WUDQVFULSWRV seleccionados. Tambin se ha utilizado un protocolo ingenioso conocido como hibridizacin substractiva de supresin (SSH) que fue diseado para favorecer la deteccin de transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalizacin en la representacin de los transcriptos diferenciales basada en la LQKLELFLyQ GH OD DPSOLFDFLyQ GH DTXHOORV TXH son ms abundantes, eliminando tambin la necesidad de separar molculas de cadena doble y simple (ver Figura 1). Display diferencial y RAP-PCR Las tcnicas conocidas en general como KXHOODV GLJLWDOHV GH $51 $51 QJHUSULQWLQJ incluyen al display diferencial (DD) y la PCR GH $51 FHEDGD DUELWUDULDPHQWH 5$33&5  $PERV PpWRGRV HVWiQ EDVDGRV HQ XQD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH VXEJUXSRV DO D]DU GH transcriptos a partir de dos o ms muestras. La primera etapa de ambos procedimientos es FRP~Q \ FRQVLVWH HQ JHQHUDU $'1FV KDFLHQGR una transcripcin reversa de una fraccin de ODV PROpFXODV GH $51P GH XQD PXHVWUD (Q

el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripcin reversa a un poliT anclado con una o ms bases adicionales DO H[WUHPR  GHO $51 PHQVDMHUR SRU HMHPSOR (T)12$&  (VWRV ROLJRQXFOHyWLGRV VH MDQ DO $51 mensajero a travs de la unin de las bases adicionales, impidiendo que el poliT resbale VREUH GLVWLQWDV ]RQDV GHO SROL $ (O ~QLFR JUXSR GH $51PV TXH HV WUDQVFULSWR HQ IRUPD UHYHUVD es el integrado por las molculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adyaFHQWH DO SROL$ (Q FRQWUDVWH OD 5$33&5 XWLOL]D oligonucletidos de secuencia arbitraria para la transcripcin reversa. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias complementarias permitiendo IRUPDU XQD KHEUD GH $'1F GHVGH HVWH VLWLR (Q HVWH FDVR HO VXEJUXSR GH $51PV TXH VXfre transcripcin reversa estar integrado por aquellas molculas que presenten la secuencia complementaria a la del cebador orientada en el sentido adecuado. /XHJR GH KDEHUVH UHDOL]DGR OD VtQWHVLV GH OD SULPHU KHEUD GHO $'1F VH DPSOLFDQ VHJPHQtos de los transcriptos usando pares mltiples de cebadores de PCR. Tanto para el display GLIHUHQFLDO FRPR SDUD HO 5$33&5 HO FHEDGRU superior es un oligonucletido arbitrario de 10 pares de bases. El cebador inferior es el mismo oligonucletido poliT anclado (para el caso del display diferencial) o el decmero arbitrario SDUD HO FDVR GH 5$33&5 TXH VH XVDURQ DOWHUnativamente para hacer la transcripcin reversa. Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucletidos arbitrarios y 12 oligonucletidos anclaGRV UHSUHVHQWDQ HVWDGtVWLFDPHQWH D WRGRV ORV $51P RULJLQDOPHQWH SUHVHQWHV HQ OD PXHVWUD Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporacin de un nucletido radiactivo o de una molcula que pueda ser detectada a travs de su interaccin con un anticuerpo conjugado a un sistema de deteccin (por ejemplo digoxigenina). Tambin puede usarse un ceEDGRU XQLGR D XQ XRUyIRUR X RSWDUVH SRU QR PDUFDU ORV IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV \ XVDU OXHgo una tincin con nitrato de plata para revelar

122 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

cDNA driver (en exceso) cDNA tester con el adaptador 1 cDNA tester con el adaptador 2

Primera hibridizacin

a b c

Segunda hibridizacin: mezcado de muestras, agregado de driver desnaturalizado y anillado a, b, c, d + e Rellenado de los extremos a b

e Agregado de los cebadores Amplificacin por PCR a , d no hay amplificacin b b b no hay amplificacin c amplificacin lineal e amplificacin exponencial +

Figura 1.

los geles. La visualizacin de los productos de PCR se logra luego de la electroforesis en geles de poliacrilamida seguida de la apropiada generacin y deteccin de imgenes, que son evaluadas comparando la intensidad relativa de las bandas producidas a partir de diferentes muestras experimentales. Los fragmentos que estn presentes en una muestra y ausentes en

la otra, o aquellos que estn presentes con diferentes intensidades relativas en los distintos tratamientos experimentales, representan poWHQFLDOHV WUDQVFULSWRV GH $51P GH H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO 7tSLFDPHQWH ODV EDQGDV VRQ HYDOXDGDV VyOR VL DPSOLFDQ HQ IRUPD FRQVLVWHQWH en reacciones de PCR duplicadas para cada muestra (ver la Figura 2).

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 123

Muestra de RNA 1
A)A A) (n A A(n A AA AA
A)A( nAA A

Muestra de RNA 2
A) A(
A)A (n A AA

AA A

AAA(A)nA

A)A(n AA A

A)A( AA
n

AA ( nAA A)AAA A( A n)

AAA

(A) A
n

A A)A( nAA

AA
AAA(A)nA

)A (A

An )

A(A

Transcripcin reversa usando cebador ancla del tipo 5T(T)nTXY3 Muestra de cDNA 1
Muestra de cDNA 2

PCR usando el cebador ancla 5T(T)nTXY3 y un decmero al azar

Muestra 1

Muestra 2

Figura 2. /D IDVH QDO GHO GLVSOD\ GLIHUHQFLDO FRQVLVWH HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH OD VHFXHQFLD GHO WUDQVcripto representado por el producto de PCR y OD FRQUPDFLyQ GH TXH pVWH UHDOPHQWH VH H[presa en forma contrastante. Estas etapas se ORJUDQ ORFDOL]DQGR ItVLFDPHQWH \ HVFLQGLHQGR OD seccin del gel de poliacrilamida que contiene DO SURGXFWR GH LQWHUpV (Q OD PD\RUtD GH ORV casos debe realizarse un alineamiento de las LPiJHQHV GH ORV IUDJPHQWRV GH DPSOLFDFLyQ con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tincin con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la UHFXSHUDFLyQ GH OD EDQGD HV PXFKR PiV HFLHQWH /RV SURGXFWRV GH 3&5 VRQ SXULFDGRV GHO JHO \ UHDPSOLFDGRV 3DUD HOOR HO IUDJPHQWR

124 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

)n A

AA

)A (A

AA

AAA(A )n A

A(A

A)A

AA

AA

( nA

AA

A A ( AA n A )A n (A)A
AAA (A) A
n

AA

(A )A

de poliacrilamida se procesa en fragmentos peTXHxRV FRQ XQ EtVWXUt TXH VH WUDQVHUHQ D XQD solucin tampn adecuada para la elucin de los fragmentos. Luego de una centrifugacin, HO VREUHQDGDQWH VH SXULFD FRQ IHQROFORURIRUPR \ HO $'1 VH SUHFLSLWD FRQ HWDQRO VH GLOX\H HQ DJXD \ VH UHDPSOLFD SRU 3&5 Se han utilizado varias estrategias para FRQUPDU OD H[SUHVLyQ GLIHUHQFLDO GH ORV WUDQVcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para someterlos a anlisis de Northern inverso y el clonado y secuenciacin de los productos para disear ceEDGRUHV HVSHFtFRV TXH SHUPLWDQ UHDOL]DU 3&5 VHPLFXDQWLWDWLYDV DVt FRPR WDPELpQ OD KLEULGLzacin in situ de tejidos. Dos ventajas importantes de los mtodos GH QJHUSULQWLQJ GH $51 FRQ UHVSHFWR D ORV GH hibridizacin substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales mltiples HQ IRUPD VLPXOWiQHD \ OD GH LGHQWLFDU JHQHV que estn regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las RWUDV 6LQ HPEDUJR ORV PpWRGRV GH QJHUSULQWLQJ GH $51 FRPSDUWHQ FRQ HO 66+ OD OLPLWDFLyQ de que no son cuantitativos. Uno de los problemas que suelen atribuirse D GLVSOD\ GLIHUHQFLDO HV OD DPSOLFDFLyQ GH IDOsos positivos o sea fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son luego cosiderados artefactos de PCR porque no pueden validarse por Northern blot o PCR en tiempo real. Es necesario dar una mirada ms detallada a este punto. Es cierto TXH HV LPSUHVFLQGLEOH UHDOL]DU ODV DPSOLFDFLRnes de DD PCR por duplicado o triplicado para DVHJXUDUVH TXH OD DPSOLFDFLyQ HV UHSURGXFLble y no se trata de una banda espuria. Pero una vez superado este punto de la reproduciELOLGDG GH OD DPSOLFDFLyQ KD\ TXH FRQVLGHUDU que no siempre las diferencias detectadas con esta tcnica pueden ser validadas por Northern o por PCR en tiempo real. Por ejemplo, cuando existe expresin allica diferencial entre muestras, o cuando diferentes miembros de una misma familia gnica son expresados diferencialmente, es posible que se detecten polimorVPRV HQ ORV JHOHV GH '' FRPR FRQVHFXHQFLD de que los primers se unan a sitios variables

de la secuencia. Sin embargo, es probable que distintos alelos o incluso diferentes miembros de una familia gnica hibridicen en conjunto en el experimento de Northern, o que los diseos de cebadores para real time PCR no permitan diferenciarlos. Tambin puede ocurrir que en los experimentos de DD se detecte una hebra antisentido sobreexpresada en una de las muestras. Si la hebra sentido est expresada en la otra, los experimentos de real time no permitirn la deteccin de la expresin diferencial. Estos son slo algunos de los muchos casos posibles en los cuales el northern y la PCR en tiempo real no reproducirn los datos de DD, pero no precisamente porque el DD haya generado un falso positivo, sino simplemente porque estas tcnicas estn basadas en principios de deteccin diferentes. Muchos de los supuestos falsos positivos detectados por DD HQ HO SDVDGR FXDQGR QR VH WHQtD FRQFLHQFLD sobre la frecuencia de la expresin antisentido) pueden englobarse seguramente en estas FDWHJRUtDV Otro problema es que estas tcnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genticamenWH LGpQWLFRV SRU HMHPSOR LVROtQHDV  &XDQGR VH FRPSDUDQ ORV SHUOHV GH $51P GH LQGLYLduos diferentes genticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una DPSOLFDFLyQ GLIHUHQFLDO GHELGD D XQD YDULDcin en la secuencia de los transcriptos ms que a diferencias en su representacin. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias de anlisis de segregantes en grupo %6$ DSOLFDGDV DO HVWXGLR GH SHUOHV GH $51 Finalmente, la investigacin de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de ltima generacin y una inversin extensiva de WLHPSR \ WUDEDMR SDUD GHWHFWDU \ FRQUPDU OD expresin diferencial de cada uno de los genes individuales. 3ROLPRUVPRV HQ HO ODUJR GH ORV IUDJPHQWRV GH $'1F DPSOLFDGRV $'1F$)/3) /D WHFQRORJtD GH $)/3, generalmente utili]DGD SDUD SURGXFLU KXHOODV JHQpWLFDV GH '1$ genmico, puede ser aplicada tambin a pre-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 125

SDUDFLRQHV GH $'1F GH GREOH KHEUD SDUD REWHQHU XQ SHUO GHO WUDQVFULSWRPD /RV SDWURQHV obtenidos por esta tcnica son una herramienWD FRQDEOH \ HFLHQWH SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH $51PV H[SUHVDGRV GLIHUHQFLDOPHQWH /D WpFQLFD GH $'1F$)/3 detecta fragmentos de UHVWULFFLyQ GH '1$ SRU PHGLR GH DPSOLFDFLyQ por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) JHQHUDFLyQ GH $'1F LL UHVWULFFLyQ GHO $'1F FRQ GRV HQGRQXFOHDVDV HVSHFtFDV SUHIHULEOHmente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligacin
mRNA

de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos de restriccin, iv) ampliFDFLyQ GH XQ VXEJUXSR GH ORV IUDJPHQWRV GH restriccin usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3 v) electroforesis GH ORV IUDJPHQWRV GH UHVWULFFLyQ DPSOLFDGRV en geles de poliacrilamida, vi) visualizacin de las huellas digitales genticas mediante el uso GH DXWRUDGLRJUDItDV IRVIRLPiJHQHV \ RWURV Pptodos (ver Figura 3).
AAAAAAAAAAAAAn(A)A TTTTTTTTTTTTTT
Cebador Oligo dT

AAAAAAAAAAAAAn(A)A TTTTTTTTTTTTTT
Sntesis de cDNA

cDNA Digestin con las endonucleasas de restriccin

Ligacin de los adaptadores

Preamplificacin con los cebadores

Amplificacin selectiva de fragmentos

XY

YX XY YX

Huella digital (Fingerprint)

Figura 3.

126 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Las mayores ventaja del uso de la tecnoORJtD GH $'1F$)/3 son: i) no se requiere informacin previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fraccin muy grande de todos los genes expresados, iii) es una tcnica muy sensible que permite la deteccin de transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son exWUDtGRV IiFLOPHQWH GH ORV JHOHV \ ODV VHFXHQcias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos. Etiquetas de secuencia expresadas (Expressed sequence tags, ESTs) La secuenciacin exhaustiva de ESTs (Expressed Sequence Tags) es considerado principalmente un mtodo para la caracterizacin de la expresin gnica, a pesar de que la generacin de ESTs resulta tambin importante para deducir la presencia de genes no predichos en ausencia de datos genmicos. Las ESTs son obtenidas a gran escala por secuenFLDFLyQ GH XQD VROD KHEUD GH FORQHV GH $'1F (aproximadamente 500 pb) provenientes de bibliotecas que representan distintos tejidos o condiciones experimentales. Las ESTs representan descripciones parciales de las regiones que se transcriben de un genoma. Una cantidad creciente de centros de investigacin han FRQVWUXtGR \ VHFXHQFLDGR ELEOLRWHFDV GH $'1F HQ ORV ~OWLPRV DxRV (VWD WHQGHQFLD VH YH UHHjada en el nmero de ESTs depositadas en la base de datos del NCBI (ESTdb), el que al 6 de Junio de 2008 es de 2994249 provenientes de 261 especies de plantas. (Q WHRUtD OD DEXQGDQFLD GH XQD (67 HV GLrectamente proporcional a la representacin en nmero de copias de un transcripto en un tejido determinado. El proceso de generacin de ESTs es relativamente lento y costoso, lo que KDFH GLItFLO TXH VH ORJUH OD VDWXUDFLyQ GH XQD biblioteca. Tericamente, si se secuencia el nPHUR VXFLHQWH GH (67V HVWH PpWRGR SHUPLWH analizar incluso aquellos genes que presentan niveles de expresin bajos, pero si el nmero de secuencias obtenidas es limitado conviene UHFXUULU D WpFQLFDV GH DPSOLFDFLyQ FRPSOHPHQWDULDV $'1F$)/3 R '' SDUD GHWHFWDU transcriptos poco abundantes. Las secuencias ESTs a menudo se generan D SDUWLU GH ELEOLRWHFDV GH $'1F TXH KDQ VLGR

normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas ltimas pueden ser comparados para LGHQWLFDU WUDQVFULSWRV TXH VH H[SUHVDQ HQ XQD biblioteca y estn completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a biEOLRWHFDV GH $'1FV QR QRUPDOL]DGDV 7DPELpQ existen productos comerciales que permiten la construccion de bibliotecas donde los transcripWRV KDQ VLGR DPSOLFDGRV SHUR PDQWHQLHQGR OD proporcin relativa de unos respecto a otros, lo que facilita la comparacin cuantitativa entre muestras. Las ESTs requieren de varias etapas de procesamiento, ensamblado en grupos (contigs) y anotacin para que se pueda extraer informacin biolgica a partir de las mismas. Para esto, resulta muy importante el almacenamiento, la organizacin y la anotacin de estas secuencias utilizando distintas herramientas informticas (revisadas por Nagaraj et al., 2007). Anlisis serial de la expresin de genes (SAGE) El anlisis serial de la expresin de genes 6$*( FRQVLVWH HVHQFLDOPHQWH HQ XQD YHUVLyQ acelerada de la secuenciacin de ESTs. Est basada en el concepto de que una etiqueta FRUWD GH XQDV SRFDV EDVHV HV VXFLHQWH SDUD LGHQWLFDU LQHTXtYRFDPHQWH D XQ WUDQVFULSWR siempre y cuando est ubicada en una posicin GHQLGD GHQWUR GH OD VHFXHQFLD GHO PHQVDMHUR 8QD HWLTXHWD 6$*( FRQVLVWH WtSLFDPHQWH HQ 9-14 bases de secuencia ubicadas por debajo del ltimo sitio de reconocimiento de una enGRQXFOHDVD HVSHFtFD HQ HO WUDQVFULSWR EODQFR 0~OWLSOHV HWLTXHWDV 6$*( VH OLJDQ MXQWDV HQ XQ vector de clonado de manera que una reaccin de secuenciacin de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiemSR YHU )LJXUD   &RPR FDGD HWLTXHWD 6$*( UHSUHVHQWD XQ ~QLFR WUDQVFULSWR GH $51P HV posible obtener una visin general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresin de genes entre muestras experimentales pueden entonces VHU LGHQWLFDGDV FRPSDUDQGR OD DEXQGDQFLD

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 127

AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T

Corte con la enzima ancla (EA) Unin a esferas de estreptavidina


AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T

Divisin a la mitad y aadido de los adaptadores A y B

CATG GTAC

A A

CATG GTAC

AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T

CATG GTAC

B B

CATG GTAC

AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T AAA(A)nA TTT(T)n T

CATG GTAC

CATG GTAC

Corte con la enzima de etiquetado (ET)

Cebador A

GGATGCATGXXXXXXXXX CCTACGTACXXXXXXXXX
TE AE Etiqueta (tag)

GGATGCATGOOOOOOOOO Cebador B CCTACGTACOOOOOOOOO


TE AE Etiqueta (tag)

Ligacin y amplificacin con los cebadores A y B

Cebador A GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC Cebador B CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGG


Etiqueta doble (ditag)

Corte con la enzima ancla (ET), purificacin de las ditags, concatenado y clonado
CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC
AE Tag 1 Ditag Tag 2 AE Tag 3 Ditag Tag 4 AE

Figura 4.

UHODWLYD GH HWLTXHWDV 6$*( HVSHFtFDV HQ GLIHrentes bibliotecas. Los genes o las secuencias (67V UHSUHVHQWDGRV SRU ODV HWLTXHWDV 6$*( son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiTXHWD 6$*( HQ OD SRVLFLyQ DGHFXDGD (VWD WpFQLFD VH XWLOL]D SDUD LGHQWLFDU \ FXDQWLFDU WUDQVFULSWRV )XH GHVFULSWD SRU SULPHUD vez por Velculescu y colaboradores en 1995 YHU ELEOLRJUDItD UHFRPHQGDGD  %UHYHPHQWH se utiliza una enzima de restriccin tipo II (enzima de etiquetado) que libera fragmentos de HQWUH  \  SE D SDUWLU GH ORV $'1F SUHYLDmente digeridos con otra enzima de restriccin (la ms comnmente utilizada es NlaIII). Estos fragmentos son luego ligados entre si para formar un concatmero que es clonado y secuenciado. Los fragmentos detectados en una muestra representan a los transcriptos que los originaron y su frecuencia de deteccin indi-

FD VX DEXQGDQFLD HQ OD PXHVWUD HQ HVWXGLR $ diferencia de los microarreglos, la tcnica de 6$*( SHUPLWH GHWHFWDU WUDQVFULSWRV GH ORV FXDles no se conoce su secuencia previamente a la realizacin del experimento, es decir es una tcnica conocida como abierta (pueden reconocerse genes nuevos). $ SDUWLU GH XQ H[SHULPHQWR GH 6$*( VH SXHden obtener unos 50.000 a 100.000 fragmentos, los que representan de 20.000 a 40.000 genes nicos. Estos fragmentos brindan informacin cualitativa de los transcriptos detectados, mientras que el nmero de copias de cada uno de ellos brinda informacin cuantitativa y UHHMD OD DEXQGDQFLD GH ORV WUDQVFULSWRV HQ OD muestra. Generalmente se observa que alguQRV GH ORV IUDJPHQWRV GHWHFWDGRV SRU 6$*( presentan ms de 100 copias, otros entre 2 y  FRSLDV \ OD PD\RUtD GH HOORV  VH HQFXHQWUDQ HQ FRSLD ~QLFD (Q OD PD\RUtD GH

128 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

los casos se observa que entre el 50-70% de los fragmentos presentan similitud con genes o transcriptos de funcin conocida, mientras que entre 30-50% no son similares a ninguna secuencia conocida. Es esperable que estos porcentajes que son usuales actualmente se PRGLTXHQ HQ HO IXWXUR D PHGLGD TXH DXPHQWH el nmero de genes caracterizados y la cantidad de etiquetas promedio secuenciadas por proyecto. 6H KD REVHUYDGR XQD HVSHFLFLGDG UHODWLYDmente alta de un fragmento de entre 9 y 14 pb para su asociacin con transcriptos conocidos en el caso de genomas relativamente simples. 6LQ HPEDUJR OD HVSHFLFLGDG GLVPLQX\H FXDQdo se estudian genomas ms complejos. Se KDQ KHFKR LQWHQWRV SDUD PHMRUDU OD HVSHFLcidad aumentando el largo de los fragmentos. /RQJ6$*( DXPHQWD HO ODUJR GH ORV IUDJPHQWRV D  SE \ 6XSHU6$*( D  SE XWLOL]DQGR GLIHrentes enzimas de etiquetado. Esta estrategia PHMRUy OD HVSHFLFLGDG GH XQ GDGR IUDJPHQWR para representar a un transcripto nico (aunque no completamente) y tambin la probabilidad de que dicho fragmento se localice una nica vez en el genoma. Sin embargo, el hecho de trabajar con fragmentos ms largos aumenta los costos de secuenciacin de la tcnica. Por estos motivos, el usuario debe considerar cuidadosamente cul es la longitud de los fragmentos a utilizar para cada caso particular. /RV IUDJPHQWRV REWHQLGRV PHGLDQWH 6$*( no se pueden utilizar directamente en bsTXHGDV GH KRPRORJtD FRQ VHFXHQFLDV FRQWHQLdas en bases de datos debido a que son muy cortos. Para poder asignar un gen a un dado fragmento es necesario contar con una base de datos de referencia construida previamente. Esta base de datos contiene informacin de fragmentos obtenidas in silico a partir de secuencias conocidas de transcriptos o de genes de la especie en estudio. Si un fragmento aislaGR H[SHULPHQWDOPHQWH SUHVHQWD KRPRORJtD FRQ una secuencia presente en la base de datos 6$*( GH UHIHUHQFLD HQWRQFHV VH FRQVLGHUD que el transcripto que lo origin proviene del JHQ TXH KDEtD VLGR DVLJQDGR D HVD VHFXHQFLD /D FRQDELOLGDG GH OD DVLJQDFLyQ GH JHQHV XWLOL]DQGR HVWDV EDVHV GH GDWRV HVWi LQXHQFLDGD por factores biolgicos (por ejemplo, isoformas

del transcripto tales como las resultantes de splicing alternativo o SNPs presentes en la etiqueta pueden resultar en distintos fragmentos que en realidad se correspondan con un mismo gen), experimentales (artefactos introducidos en las secuencias como consecuencia de la tcnica utilizada) y por redundancia de transcriptos. Las bases de datos de referencia se construyen con secuencias que son altamente redundantes. Las mismas son agrupadas en IXQFLyQ GH OD KRPRORJtD GH VHFXHQFLDV OR TXH puede originar que se encuentren transcriptos que corresponden a un mismo gen en grupos distintos (como en el caso de que hubiera splicing alternativo) o que se agrupen transcriptos correspondientes a genes distintos porque preVHQWDQ XQ DOWR JUDGR GH KRPRORJtD GH VHFXHQcia. Es importante mencionar que las bases de datos de referencia pueden ser incompletas, debido a que comnmente se incluyen en las mismas secuencias de alta calidad y anotadas SDUD DXPHQWDU OD HVSHFLFLGDG 6LQ HPEDUJR esta estrategia disminuye en gran medida el nmero de transcriptos representados en la base de datos. Esto origina que muchos de ORV IUDJPHQWRV REWHQLGRV SRU 6$*( VHDQ FODVLFDGRV FRPR GHVFRQRFLGRV LQFOXVR FXDQGR sus transcriptos correspondientes hayan sido SUHYLDPHQWH LGHQWLFDGRV $GHPiV XQ PLVPR IUDJPHQWR SXHGH SUHVHQWDU KRPRORJtD FRQ PiV GH XQ JHQ OR TXH SUHVHQWD XQ GHVDItR DGLFLRQDO SDUD OD FODVLFDFLyQ GH ORV PLVPRV 3RU WRGRV HVWRV PRWLYRV HV QHFHVDULR YHULFDU OD DVLJQDcin de un fragmento mediante otras tcnicas. Entre las ms utilizadas se pueden mencionar HO 5$&( Rapid $PSOLFDWLRQ RI $'1F Ends) y GLGI (Generation of LRQJ $'1F IURP 6$*( tags for Gene IGHQWLFDWLRQ  /RV IUDJPHQWRV REWHQLGRV SRU 6$*( SXHGHQ organizarse en tres grupos: de alta, intermedia y baja abundancia. Sin embargo, no se ha analizado exhaustivamente an si el nmero de FRSLDV GH XQ IUDJPHQWR REWHQLGR SRU 6$*( UHHMD H[DFWDPHQWH HQ WRGRV ORV FDVRV OD FDQWLGDG GH $51PHQVDMHUR UHDO FRQWHQLGD HQ OD PXHVWUD 'DGR TXH HO 6$*( LQYROXFUD QXPHURVDV DPSOLFDFLRQHV SRU 3&5 SXHGHQ RULJLQDUVH HUURUHV HVSHFtFRV SDUD XQ GDGR IUDJPHQWR $GHPiV VH KD REVHUYDGR TXH ODV VHFXHQFLDV obtenidas por esta tcnica presentan un ma-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 129

yor contenido de G+C, lo que sugiere una preIHUHQFLD GH DPSOLFDFLyQ TXH FRPSURPHWH OD H[DFWLWXG GH OD FXDQWLFDFLyQ 'RV YHQWDMDV LPSRUWDQWHV GHO 6$*( VREUH la hibridizacin substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuanWLWDWLYRV \ DFXPXODWLYRV 6L VH JHQHUD OD VXciente cantidad de informacin de secuencia VH REWLHQHQ SHUOHV H[DFWRV GH OD H[SUHVLyQ GH los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una clula o tejido. Existe una base de datos pblica de expresin gnica que ha sido creada para el almacenamiento y anlisis de secuencias de 6$*( FX\R SRGHU FRQWLQXDUi FUHFLHQGR D PHdida que se contribuya con ms informacin. 2WUD FDUDFWHUtVWLFD GH ORV GDWRV GH 6$*( HV que pueden complementar otros de ESTs geQHUDGRV D SDUWLU GH ELEOLRWHFDV GH $'1F QRUPDOL]DGDV R VXEVWUDtGDV /RV (67V EULQGDQ LQIRUPDFLyQ GH VHFXHQFLD PLHQWUDV TXH HO 6$*( provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos. Finalmente, a SHVDU GH TXH HO 6$*( UHTXLHUH FDSDFLGDG GH secuenciacin de ltima generacin, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciacin EST. Hibridizacin de microarreglos Los microarreglos han revolucionado la bioORJtD PROHFXODU (VWD WpFQLFD XWLOL]D FLHQWRV D miles de sondas altamente organizadas sobre XQD VXSHUFLH VyOLGD SDUD LQWHUURJDU GH PDQHUD VLPXOWiQHD D WRGDV ODV PROpFXODV GH $51 GHQLGDV FRPR EODQFRV FRQWHQLGDV HQ XQD muestra biolgica. Las muestras a ser analizaGDV VH PDUFDQ XRUHVFHQWHPHQWH R UDGLDFWLYDmente y se aplican al microarreglo. Los cidos nucleicos marcados hibridan con las molculas GH $'1 FRPSOHPHQWDULDV TXH VH HQFXHQWUDQ inmovilizadas en el microarreglo. La fuerza de OD VHxDO XRUHVFHQWH R UDGLDFWLYD FDSWXUDGD SRU ODV VRQGDV GH $'1 HQ HO DUUHJOR HV GHWHFWDGD \ GLJLWDOL]DGD SDUD VX FXDQWLFDFLyQ Los microarreglos fueron originalmente disexDGRV SDUD LGHQWLFDU GLIHUHQFLDV GH H[SUHVLyQ gnica en dos muestras distintas basadas en las cantidades relativas de blancos unidos a una sonda determinada en el arreglo. La utili-

GDG GH OD WpFQLFD VH YH UHHMDGD HQ VX DPSOLD variedad de aplicaciones que abarca desde el anlisis de expresin gnica hasta estuGLRV GH $'1 JHQyPLFR FRPR Comparative Genomic Hybridization - CGH- y Chromatin ImmunopXULFDWLRQ PLFURDUUD\V  FRQRFLGRV como ChIP-chips). Sin embargo, en este caStWXOR VyOR GHVFULELUHPRV ORV PLFURDUUHJORV GH $'1F \ GH ROLJRQXFOHyWLGRV \D TXH VRQ ORV PiV utilizados para el anlisis del transcriptoma. /RV PLFURDUUHJORV GH $'1 SXHGHQ VHU FUHDGRV GH GRV PDQHUDV MDQGR ODV PROpFXODV GH iFLGRV QXFOHLFRV VREUH XQD VXSHUFLH VyOLGD R SRU VtQWHVLV in situ de oligonucletidos. En el SULPHU FDVR ODV PROpFXODV GH $'1 SXHGHQ VHU $'1FV DPSOLFDGRV SRU 3&5 ROLJRQXFOHyWLGRV R IUDJPHQWRV GH $'1 JHQyPLFRV FORQDGRV HQ %$&V %DFWHULDO $UWLFLDO &KURPRVRPHV  /D XWLOL]DFLyQ GH FORQHV GH $'1F DPSOLFDdos por PCR como sondas es el mtodo de eleccin cuando se interrogan muestras de organismos cuyo genoma no est secuenciado. Estos microarreglos son generalmente fabricados utilizando robots. Los mismos contienen un cabezal de puntas que es sumergido en VROXFLRQHV GH VRQGDV GH $'1 GLVXHOWDV HQ HO buffer correspondiente y que luego son depoVLWDGDV VREUH XQ VXVWUDWR GH YLGULR PRGLFDGR TXtPLFDPHQWH /DV SXQWDV VH FDUJDQ GH VRQGD SRU FDSLODULGDG \ OD WHQVLyQ VXSHUFLDO HQWUH HO buffer y el vidrio acta para descargar las sondas. Las perturbaciones en la estructura de las descargas son frecuentes y son una fuente sigQLFDWLYD GH YDULDFLyQ GH OD VHxDO 6L ELHQ H[LVten otras alternativas, la utilizacin de robots es la ms popular debido a su disponibilidad, DOWD H[LELOLGDG \ EDMRV FRVWRV /RV VXVWUDWRV inertes sobre los cuales se depositan las sondas son variados. Los portaobjetos de vidrio cubiertos con poli-L-lisina fueron gradualmente reemplazados por sustratos con aminosilano comerciales debido a su mayor consistencia HQ FXDQWR D OD PRUIRORJtD GH ODV GHVFDUJDV 3DUD HVWH WLSR GH TXtPLFDV ODV VRQGDV VRQ inicialmente unidas por atraccin electrosttiFD \ OXHJR MDGDV SRU OLJDFLyQ FUX]DGD FURVV linking) al sustrato mediante radiacin UV o calor. Posteriormente se introdujeron sustratos UHDFWLYRV \ VRQGDV PRGLFDGDV TXH SHUPLWHQ una mayor discriminacin de secuencia debido

130 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Muestra prueba

Muestra de referencia

Transcripcin reversa y marcaje con fluorforos

Clones de DNA

Impresin robtica

Hibridizacin al microarreglo

Excitacin
Laser 1

Laser 2

Emisin

Anlisis computacional

Figura 5. a que hay un nico punto de unin y una mayor retencin de la sonda al sustrato. Tambin se han desarrollado otros sustratos para producir seales ms intensas y que demanden menores cantidades de sondas. Para lograrlo se aument la cantidad de grupos reactivos sobre OD VXSHUFLH (VWR VH SXHGH ORJUDU FXEULHQGR ORV SRUWDREMHWRV FRQ GHQGUtPHURV PH]FODV GH HSR[LVLODQR \ DPLQRVLODQR R FRQ SROtPHURV TXH se auto-absorben. 2ULJLQDOPHQWH ODV VRQGDV GH $'1 HUDQ GLsueltas en soluciones con alto contenido de sales. Luego se introdujo la utilizacin de deWHUJHQWHV SDUD PHMRUDU OD PRUIRORJtD GH ODV descargas. Sin embargo, algunos investigadores informaron que la presencia de detergentes resulta en un mayor arrastre de la sonda y una mayor variabilidad entre una deposicin y la siguiente. La utilizacin de soluciones de descarga conteniendo agentes higroscpicos

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 131

permiti mejorar la estructura de los puntos y aumentar las intensidades de seal obtenidas. La desventaja de la utilizacin de aditivos higroscpicos es que producen aumentos en el rea ocupada por la sonda, sin embargo, este efecto se puede reducir disminuyendo la velocidad del robot o aplicando micro-vibraciones de las puntas. Disminuir la temperatura de la cmara del robot donde se generan los microarreglos y utilizar soluciones hidrofbicas contribuye tambin a reducir el tamao promedio de las descargas. La variedad de soluciones de descarga que existe sugiere que no hay un tipo de solucin que resulte ideal para todas las aplicaciones y que la eleccin de la misma depende en gran medida del tipo de microarreglo que se quiere construir. Las puntas de los cabezales que se utilizan son normalmente de acero inoxidable o de titanio y contienen un capilar generado mediante descargas elctricas o la utilizacin de un lser. Se observa una variacin sistemtica en la extensin de la descarga, porque sta es una funcin del formato de la punta, y existe variabilidad durante la fabricacin de las mismas. Se han deVDUUROODGR QXHYDV WHFQRORJtDV SDUD VROXFLRQDU este problema como por ejemplo la generacin de puntas de cermica ms uniformes. La evaporacin durante el proceso de impresin de los microarreglos es la principal causa de variabilidad. La evaporacin reduce el volumen de solvente en las microplacas de 384 pocillos y dentro del reservorio capilar de las puntas, lo que produce un aumento de concenWUDFLyQ GH ODV VRQGDV \ DOWHUD ODV FDUDFWHUtVticas de la solucin de descarga. Como consecuencia de esto, las propiedades del punto VHPEUDGR \ OD GLVWULEXFLyQ GH OD VRQGD GH $'1 GHQWUR GHO iUHD GHO PLVPR VH PRGLFDQ (VWH problema se puede solucionar en parte regulando las condiciones de humedad y temperatura dentro de la cmara del robot donde se realiza la impresin de los microarreglos. Dado que existen numerosas interacciones entre los distintos componentes del proceso, no es sencillo predecir en forma exacta cmo va a resultar la combinacin entre una solucin de siembra y un sustrato determinados. Sin embargo, se estn realizando constantemente estudios para examinar este proceso que, suma-

GRV DO GHVDUUROOR GH QXHYDV WHFQRORJtDV YDQ D permitir reducir los niveles de variabilidad sistemticos resultantes de la fabricacin de los microarreglos. /D PD\RUtD GH ORV ODERUDWRULRV HQVD\DQ OD calidad de sus microarreglos antes de realizar los experimentos de hibridacin con las muestras biolgicas de inters. Generalmente se controla la bondad de la impresin y se detectan errores tales como puntos que no estn bien formados, aquellos de tamaos mayores a los deseados o faltantes. Los puntos pueden VHU YLVXDOL]DGRV XWLOL]DQGR WLQWXUDV XRUHVFHQWHV GH XQLyQ D $'1 7DPELpQ VH SXHGHQ HPplear mtodos ms precisos como son la hibridacin con mezclas de oligonucletidos al D]DU GH PHU PDUFDGRV XRUHVFHQWHPHQWH R con oligonucletidos marcados que hibridizan con secuencias marcadoras cortas que estn SUHVHQWHV HQ WRGDV ODV VRQGDV GH $'1 GHO microarreglo. Para controlar la calidad de la produccin de microarreglos es recomendable desarrollar, documentar y emplear protocolos estndar (Standard Operating ProceduresSOPs). Se pueden encontrar ejemplos de los mismos en la pgina KWWSZZZ\FKLSRUJXN. Esta prctica no solamente aumenta la consistencia entre experimentos dentro de un laboratorio, sino que facilita la transferencia de informacin entre laboratorios. El segundo mtodo posible para la construcFLyQ GH PLFURDUUHJORV HV OD VtQWHVLV GH ROLJRnucletidos in situ, inicialmente desarrollada SRU $II\PHWUL[ $II\PHWUL[ 6DQWD &ODUD ((88  Este mtodo usa una conjuncin de fotolitograItD \ GH TXtPLFD FRPELQDWRULD TXH UHVXOWD HQ OD VtQWHVLV GH FKLSV GH $'1 GH DOWD GHQVLGDG Tambin NimbleGen (NimbleGen, Madison, ((88  ;HRWURQ ;HRWURQ +RXVWRQ ((88 \ )HELW )HELW 0DQQKHLP $OHPDQLD KDQ GHVDUUROODGR RWURV SURFHVRV SDUD ORJUDU OD VtQWHVLV de oligonucletidos in situ. Todos estos procesos se basan en la utilizacin de radiacin UV. En cambio Combimatrix (Combimatrix, 0XNLOWHR ((88 XVD HOHFWURTXtPLFD ORFDOL]DGD (Q HO FDVR GH $II\PHWUL[ VH ORJUD OD VtQWHVLV in situ mediante fotoactivacin y desproteccin de cidos nucleicos. Se utilizan fotomscaras para dirigir la radiacin UV a sectores espeFtFRV GHO PLFURDUUHJOR GH PRGR GH ORJUDU

132 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

OD VtQWHVLV HQ IRUPD VHOHFWLYD (Q HO FDVR GH 1LPEOH*HQ ;HRWURQ \ )HELW WRGRV HOORV XVDQ mtodos que no requieren la utilizacin de fotomscaras. En este caso, la radiacin UV es dirigida mediante miles de espejos regulables \ HO $'1 HV VLQWHWL]DGR XWLOL]DQGR QXFOHyWLGRV PRGLFDGRV FRQ IRVIRDPLGLWD (Q HO FDVR GH CombiMatrix, numerosos microelectrodos son utilizados para sintetizar distintas molculas de $'1 HQ SDUDOHOR /D UHDFFLyQ TXtPLFD SDUD OD VtQWHVLV GH ROLJRQXFOHyWLGRV RFXUUH HQ HO iUHD que rodea a cada microelectrodo a la que se VXHOH GHQRPLQDU YDVR YLUWXDO YLUWXDO DVN  Una estrategia para estudiar la expresin gnica de todo un genoma es la deteccin de la actividad transcripcional completa de los cromosomas usando arreglos solapados o en tejado (tiling arrays). En este caso, en lugar de XWLOL]DU VRQGDV HVSHFtFDV SDUD FDGD JHQ HO genoma completo incluyendo regiones intergQLFDV HVWi UHSUHVHQWDGR HQ HO DUUHJOR $GHPiV de detectar transcriptos estos chips permiten realizar hibridaciones comparativas de genoPDV SDUD GHWHFWDU GHOHFLRQHV \ SROLPRUVPRV HVWXGLDU ORV SHUOHV GH PHWLODFLyQ \ DQDOL]DU muestras de inmunoprecipitacin de cromatiQD $II\PHWUL[ GHVDUUROOy ORV SULPHURV DUUHJORV de este tipo para Arabidopsis. Los estudios realizados utilizando arreglos de tipo tejado SHUPLWHQ OD LGHQWLFDFLyQ GH QXPHURVRV VLWLRV WUDQVFULSFLRQDOPHQWH DFWLYRV TXH QR KDEtDQ sido detectados mediante algoritmos predictiYRV \R HQ FROHFFLRQHV GH $'1F 0XFKRV GH estos nuevos transcriptos son expresados a partir de la hebra complementaria y en antisentido con respecto a transcriptos anotados previamente. O sea, mientras que en determinados tejidos y/o condiciones se expresa la hebra sentido, en otros se transcribe la antisentido. Sumado a esto, tambin se demostr que las regiones centromricas presentan actividad transcripcional en ambos sentidos resultando esta observacin sorprendente, ya que hasta KDFH PX\ SRFR WLHPSR DWUiV VH VXSRQtD TXH HQ HVWDV UHJLRQHV QR KDEtD WUDQVFULSFLyQ DFWLYD (VWD PHWRGRORJtD SHUPLWH DVLPLVPR HO HVWXGLR GHO PHWLORPD GH ODV UHJLRQHV GH $'1 regulatorias, del procesamiento alternativo de $51 \ GHO GHVFXEULPLHQWR GH SROLPRUVPRV GH

secuencia. Por lo tanto, los estudios de expresin usando arreglos de tipo tejado permiten obtener una visin mucho ms completa del transcriptoma y de su relacin con el genoma. La necesidad de descripciones precisas de experimentos de microarreglos para permitir el almacenamiento de los datos experimentales y su anlisis posterior ha originado la creacin del Minimum Information $bout a Microarray E[SHULPHQW 0,$0( 6WDQGDUG 0,$0( 6WDQGDUG  $O LJXDO TXH FRQ ODV VHFXHQFLDV GH $'1 R FRQ ODV HVWUXFWXUDV GH SURWHtQDV HV cada vez ms comn el requerimiento de enviar los resultados a bases de datos de este tipo antes de su publicacin. Estos estndares son necesarios para permitir que la informacin est pblicamente disponible en un formato nico, y tambin para uniformar la nomenclatura empleada lo que hace posible la integracin y comparacin de resultados obtenidos de disWLQWDV IXHQWHV 0,$0( DGPLQLVWUD GHVFULSFLRnes tcnicas detalladas (plataforma utilizada, mtodos de marcacin e hibridacin, medicin de datos y diseo del arreglo), pero no provee LQIRUPDFLyQ UHOHYDQWH HVSHFtFD GHO RUJDQLVPR en estudio que es necesaria para comprender el experimento planteado. Por este motivo, se GLVHxy OD EDVH 0,$0(3ODQW OD TXH LQFOX\H GHtalles biolgicos para describir experimentos de microarreglos realizados en plantas. El anlisis de los datos originados en un microarreglo resulta mucho ms laborioso que su generacin. En el mismo se consideran la hiptesis de trabajo y los objetivos experimentales SDUD ORJUDU LGHQWLFDU D ORV JHQHV FDQGLGDWRV en las condiciones de estudio. El anlisis puede dividirse en dos fases: 1) el procesamiento de GDWRV \  OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV GH LQWHUpV y la interpretacin biolgica de los resultados. El procesamiento de los datos incluye la deWHUPLQDFLyQ GHO QLYHO GH UXLGR OD FXDQWLFDFLyQ GH ODV VHxDOHV XRUHVFHQWHV HO H[DPHQ GH OD calidad de los datos, la eliminacin de los errores tcnicos y la normalizacin de los datos. La LGHQWLFDFLyQ GH ORV JHQHV FDQGLGDWRV LQFOX\H la reduccin del volumen de la informacin a un nivel manejable y ms fcil de visualizar, el reconocimiento de patrones de expresin esSHFtFRV \ OD LQWHUSUHWDFLyQ GHO VLJQLFDGR ELRlgico de los mismos.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 133

Conclusiones /RV PpWRGRV GHVFULSWRV HQ HVWH FDStWXOR VRQ WHFQRORJtDV HFDFHV TXH H[SDQGHQ ORV HVWXdios de expresin desde los genes nicos hasta el nivel del transcriptoma completo. Ninguno de estos procedimientos per se es ptimo para todas las aplicaciones y la mejor estrategia SDUD VLWXDFLRQHV HVSHFtFDV SXHGH VHU FUHDU combinaciones de varios de ellos. El continuo UHQDPLHQWR GH ODV WpFQLFDV GH WUDQVFULSWyPLFD y de la bioinformtica relacionada proporcionar a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresin de la informacin hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre HO FRQWURO JHQpWLFR GH ORV SURFHVRV VLROyJLFRV Cada plataforma empleada actualmente para estudiar el transcriptoma tiene sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, los microarreglos son una tcnica de alto rendimiento pero slo se pueden aplicar a transcriptos de secuencia FRQRFLGD /RV PpWRGRV GH $'1F $)/3 \ '' son abiertos, es decir permiten detectar genes noveles y son especialmente tiles cuando se trabaja fuera de los modelos, pero son cualitativos o semicuantitativos y requieren de un complemento de PCR en tiempo real para YDOLGDU \ FXDQWLFDU ODV GLIHUHQFLDV GH H[SUH-

sin. Las colecciones de ESTs presentan alta HVSHFLFLGDG SDUD ORV WUDQVFULSWRV HQ HVWXGLR pero baja sensibilidad para aquellos de escaVD DEXQGDQFLD /D WpFQLFD GH 6$*( GLVPLQX\H el largo secuenciado por transcripto lo que aumenta la velocidad de relevamiento, pero esta simplicidad resulta en una alta sensibilidad SHUR D FRVWD GH XQD PHQRU HVSHFLFLGDG 8QD FRPSDUDFLyQ GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV GH FDGD tcnica se presenta en la Tabla 1. La combinacin de la informacin generada por la transcriptmica (nivel y localizacin espacio/temporal de la expresin gnica) y la de los proyectos de secuenciacin de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de H[SUHVLyQ \ KRPRORJtD HVWUXFWXUDO TXH HQ PXchos casos facilitan la inferencia de la posible IXQFLyQ GH ORV JHQHV LGHQWLFDGRV 3RU VXSXHVto esto constituye una instancia inicial en la GHQLFLyQ GH OD IXQFLyQ GH FDGD JHQ 3DUD GHterminar su rol preciso deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o DXPHQWDU VX H[SUHVLyQ SRU LQJHQLHUtD JHQpWLFD \ D PRGLFDU HVWUXFWXUDOPHQWH OD PROpFXOD GH manera de alterar la actividad de los diferentes GRPLQLRV GH OD SURWHtQD TXH FRGLFD

Tabla 1: Comparacin de los principales mtodos de relevamiento del transcriptoma.


Caractersticas
Detecta transcriptos conocidos Detecta transcriptos desconocidos Detecta transcriptos con splicing alternativo Detecta transcriptos antisentido Cuantificacin Sensibilidad Especificidad Reproducibilidad

SAGE/ESTs
S S S S Absoluta Alta Moderada Buena para transcriptos abundantes Buena para transcriptos abundantes Ms alto que el de microarreglos

Microarreglos
S No S o no S o no Relativa Moderada Alta Buena para datos obtenidos con la misma plataforma Buena para transcriptos abundantes 5-10 veces menor que el de SAGE

DD/cDNAAFLP
S S S S Relativa Alta Moderada Requiere realizacin de duplicados o triplicados Buena para transcriptos abundantes Muy bajo

Hibridizacin sustractiva
S S No S Relativa Alta Moderada Buena para transcriptos abundantes Buena para transcriptos abundantes Muy bajo

Comparable entre si

Costo

Adaptado de Wang 2006 understanding SAGE data, Trends in Genetics.

134 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Para maximizar el potencial de la transcriptmica es necesario un cambio de paradigma respecto a la interpretacin de los resultados obtenidos en este tipo de experimentos. Este cambio de paradigma implica comprender que los datos de expresin no estn libres de errores y aceptar que la variabilidad biolgica espacio-temporal es una parte inherente y cuanWLFDEOH GH HVWH WLSR GH H[SHULPHQWRV $ SHVDU de que los continuos cambios en la expresin de genes en tiempo y espacio colocan al investigador en un escenario de arenas movedizas, es mucha y muy relevante la informacin que puede obtenerse de este tipo de estudios. Esta transicin en la interpretacin de los resultados ser ms fcil si se delinea claramente la diferencia entre proponer una funcin biolgica a partir de simples datos de expresin y postular una hiptesis que debe luego validarse en base a datos experimentales concretos. Biblografa Recomendada
$GDPV 0 ' - 0 .HOOH\ - ' *RFD\QH 0 'XEQLFN 0 + 3RO\PHURSRXORV + ;LDR & 5 0HUULO $ :X % 2OGH 5 ) 0RUHQR  &RPSOHPHQWDU\ '1$ VHTXHQFLQJ H[SUHVVHG VHTXHQFH WDJV DQG KXPDQ JHQRPH SURMHFW 6FLHQFH :DVK DC) 252:16511666. $II\PHWUL[ KWWSZZZDII\PHWUL[FRP Combimatrix: KWWSZZZFRPELPDWUL[FRP 'DYLV 0 0 ' , &RKHQ ( $ 1LHOVHQ 0 6WHLQPHW] : ( 3DXO / +RRG  &HOOW\SHVSHFLF $'1F SUREHV DQG WKH PXULQH  UHJLRQ WKH ORFDOL]DWLRQ DQG RULHQWDWLRQ RI $G 3URF 1DWO $FDG 6FL 86$  'LDWFKHQNR / <) & /DX $ 3 &DPSEHOO $ Chenchik, F. Moqa-dam, B. Huang, S. Lukyanov, . 3XN\DQRY 1 *XUVND\D ( ' 6YHUGORY 3 ' Siebert. 1996. Suppression subtractive hybridi]DWLRQ $ PHWKRG IRU JHQHUDWLQJ GLIIHUHQWLDOO\ UHJXODWHG RU WLVVXHVSHFLF $'1F SUREHV DQG OLEUDULHV 3URF 1DWO $FDG 6FL 86$  Febit: KWWSZZZIHELWFRP Gregory B.D., Yazaki J. and Ecker J.R. 2008. UtilizLQJ WLOLQJ PLFURDUUD\V IRU ZKROHJHQRPH DQDO\VLV in plants. The Plant Journal, 53, 636-644. *XUVND\D 1 * / 'LDWFKHQNR $ &KHQFKLN 3 ' 6LHEHUW * / .KDVSHNRY . $ /XN\DQRY / / 9DJQHU 2 ' (UPRODHYD 6 $ /XN\DQRY ( ' 6YHUGORY  (TXDOL]LQJ $'1F subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell

transcripts induced by phytohem-aglutinin and SKRUERO P\ULVWDWH DFHWDWH $QDO %LRFKHP 240:9097. /LDQJ 3 $ % 3DUGHH  'LIIHUHQWLDO GLVSOD\ RI HXNDU\RWLF PHVVHQJHU $51 E\ PHDQV RI WKH SRO\PHUDVH FKDLQ UHDFWLRQ 6FLHQFH :DVK '& 257:967971. 0H\HUV %& *DOEUDLWK ': 1HOVRQ 7 DQG $JUDZDO 9  0HWKRGV IRU WUDQVFULSWLRQDO SUROLQJ in plants. Be fruitful and replicate. Plant Physiol., 135, 637-652. 0,$0( 6WDQGDUG KWWSZZZPJHGRUJ:RUkJURXSV0,$0(PLDPHKWPO Moody D. E. 2001. Genomics techniques: an overYLHZ RI PHWKRGV IRU WKH VWXG\ RI JHQH H[SUHVVLRQ - $QLP 6FL  ( 6XSSO  (( Nagaraj S.H., Gasser R.B. and Ranganathan S.  $ KLWFKKLNHUV JXLGH WR H[SUHVVHG VHquence tag (EST) analysis. Brief Bioinform., 8, 6-21. NimbleGen: KWWSZZZQLPEOHJHQFRP 2NXER . 1 +RUL 5 0DWRED 7 1L\DPD $ )XNXVKLPD < .RMLPD . 0DWVXEDUD  /DUJH VFDOH $'1F VHTXHQFLQJ IRU DQDO\VLV RI TXDQWLWDtive and qualitative aspects of gene expression. Nat. Genet. 2:173179. 5HQVLQN :$ DQG %XHOO &5  0LFURDUUD\ H[SUHVVLRQ SUROLQJ UHVRXUFHV IRU SODQW JHQRPLFV Trends in Plant Science, 10, 603-609. 6DUJHQW 7 ' , % 'DZLG  'LIIHUHQWLDO *HQH expression in the gastrula of Xenopus laevis. 6FLHQFH :DVK '&   6FKHQD 0 ' 6KDORQ 5 : 'DYLV 3 2 %URZQ 1995. Quantitative monitoring of gene expresVLRQ SDWWHUQV ZLWK D FRPSOHPHQWDU\ '1$ PLFURDUUD\ 6FLHQFH :DVK '&  9HOFXOHVFX 9 ( / =KDQJ % 9RJHOVWHLQ . : .LQ]OHU  6HULDO DQDO\VLV RI JHQH H[SUHVVLRQ 6FLHQFH :DVK '&  Venkatasubbarao S. 2004. Microarrays status and prospects. Trends in Biotechnology, 22, 630-637. :HOVK - . &KDGD 6 6 'DODO 5 &KHQJ ' 5DOSK 0 0F&OHOODQG  $UELWUDULO\ SULPHG 3&5 QJHUSULQWLQJ RI $51 1XFO $FLGV 5HV 20:49654970. ;HRWURQ KWWSZZZ[HRWURQFRP Zimmermann P., Schildknecht B., Craigon D., *DUFLD+HUQDQGH] 0 *UXLVVHP : 0D\ 6 0XNKHUMHH * 3DUNLQVRQ + 5KHH 6 :DJQHU 8 DQG +HQQLJ /  0,$0(3ODQW DGGLQJ value to plant microarray experiments. Plant methods, 2:1.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 135

I CAPTULO 9 Protemica
3DXOD &DVDWL \ 0DUtD ) 'ULQFRYLFK 1. Introduccin La protemica, entendida como el estudio del patrn proteico de una clula u rgano, se encuentra ya en su segunda dcada como campo de estudio. Durante la primera dcada, la mayor parte de los estudios se realizaron principalmente mediante el uso de geles en dos dimensiones seguidos de tcnicas de tincin convencionales. Si bien estos mtodos continan siendo utilizados de manera importante, durante esta segunda dcada otros mtodos ms sensibles y que adems presentan mayor reproducibilidad han comenzado a ser utilizaGRV (VWDV WpFQLFDV KDQ VLGR FODVLFDGDV FRPR protemica cualitativa. Muchos de estos mtodos estn siendo aplicados en experimentos GH ELRORJtD YHJHWDO 3RU HMHPSOR la electroforesis bidimensional DIGE (del ingls, differential gel electrophoresis) y el marcado isotpico de SURWHtQDV \ SpSWLGRV VRQ WpFQLFDV XWLOL]DGDV HQ la actualidad para el estudio de diversos proWHRPDV (Q HO SUHVHQWH FDStWXOR VH GHVFULEHQ primero los mtodos utilizados en protemica en la actualidad, seguido de una descripcin de las aplicaciones de estas tcnicas en la bioORJtD GH SODQWDV 2. Electroforesis en dos dimensiones El procedimiento ms utilizado para los estudios de protemica es la separacin electrofortica por isoelectroenfoque (IEF) de las SURWHtQDV VHJXLGR GH XQD VHJXQGD VHSDUDFLyQ en gel de poliacrilamida en presencia de SDS 6'63$*(  (VWD WpFQLFD VH GHQRPLQD FRmnmente electroforesis bidimensional (2D), GRQGH ODV SURWHtQDV VH VHSDUDQ HQ EDVH D VX carga y masa molecular. Los avances recientes en la resolucin del IEF gracias al uso de geles comerciales en tiras han aumentado la reproducibilidad y la resolucin de los geles 2D en protemica. En particular, la disponibilidad de tiras comerciales de diferentes tamaos y rangos de pH permiten un anlisis detallado del proteoma.

Luego de la separacin electrofortica, se lleva a cabo la tincin de los geles y el anlisis de las imgenes para visualizar y cuanWLFDU FDGD SURWHtQD /RV PpWRGRV GH WLQFLyQ utilizados van desde los ms convencionales, como la tincin con azul de Coomassie o nitrato de plata, hasta mtodos ms sensibles FRPR OD WLQFLyQ XRUHVFHQWH. Por otro lado han sido desarrollados recientemente varios comSXHVWRV XRUHVFHQWHV TXH SHUPLWHQ P~OWLSOHV tinciones de un mismo gel, tcnica que permite la tincin y visualizacin de diferentes grupos GH SURWHtQDV R GLIHUHQWHV VXESURWHRPDV SRU ejemplo, el fosfoproteoma o el glicoproteoma) de manera secuencial en un mismo gel. La separacin en geles bidimensionales puede dar lugar a un mapa proteico complejo, y algunas veces la reproducibilidad de estos geles puede ser problemtica debido a la naturaleza diversa GH ODV GLVWLQWDV SURWHtQDV VXPDGR D OD WDUHD GH LGHQWLFDU HO PLVPR SXQWR SURWHLFR HQ GLVWLQWRV geles. Esto se debe a que cuando se realizan estudios comparativos es necesario analizar mltiples geles que pueden contener 1000 SXQWRV SURWHLFRV FDGD XQR $Vt D SHVDU GHO XVR de programas avanzados para el anlisis de JHOHV ' VH UHTXLHUH XQD YDOLGDFLyQ PDQXDO nal. Existen distintos paquetes de computacin para el anlisis de las imgenes que permiten asistir con la substraccin del ruido de base, la deteccin de los puntos proteicos, el ajuste GH ODV LPiJHQHV OD GHWHFFLyQ H LGHQWLFDFLyQ GH SXQWRV HQWUH JHOHV \ OD FXDQWLFDFLyQ PHGLDQWH XQ DQiOLVLV HVWDGtVWLFR /RV JHOHV ELGLmensionales son una herramienta para la resolucin y visualizacin de isoformas proteicas, SURGXFWRV GH GHJUDGDFLyQ \ PRGLFDFLRQHV postraduccionales; adems de permitir el clFXOR HPStULFR GH OD PDVD PROHFXODU SXQWR LVRelctrico y niveles de expresin. Las limitaciones de la tcnica son la no automatizacin, la GLFXOWDG SDUD UHVROYHU SURWHtQDV GH PHPEUDQD \ SURWHtQDV PX\ EiVLFDV R iFLGDV Una tcnica que aumenta la sensibilidad y disminuye la variabilidad que existe entre distintos geles es la llamada electroforesis diferencial en gel o DIGE. En esta tcnica, las muestras proteicas se preincuban con compuestos XRUHVFHQWHV DFWLYRV TXH VH XQHQ D UHVLGXRV de Lys o Cys que pueden ser utilizados para

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FXDQWLFDU OD DEXQGDQFLD GH FDGD SURWHtQD HQ una poblacin. La mayor ventaja de esta tcnica es la posibilidad de correr dos muestras distintas en un mismo gel, siempre y cuando las muestras se hayan marcado con marcadoUHV XRUHVFHQWHV FRQ GLVWLQWRV HVSHFWURV GH emisin. Esto disminuye los problemas que se JHQHUDQ GXUDQWH OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV SXQWRV \ OD FXDQWLFDFLyQ (Q WHRUtD OD FDQWLGDG Pi[Lma de muestras que se pueden separar en un mismo gel se limita al nmero de compuestos XRUHVFHQWHV TXH VH HQFXHQWUHQ GLVSRQLEOHV y que no muestren espectros de emisin que se superpongan, aunque en general se utilizan slo tres: dos para el marcado de las muestras a comparar, y el tercero se utiliza para marcar un control interno. La imagen de los geles es JHQHUDGD XWLOL]DQGR XQ HVFiQHU GH XRUHVFHQcia capaz de adquirir las imgenes provenienWHV GH FDGD XQR GH ORV XRUHVFHQWHV XWLOL]DGRV Esta tcnica es muy sensible, ya que permite resolver alrededor de 1000 puntos proteicos FRQ VROR  J GH SURWHtQDV VHPEUDGDV SRU OR TXH HO OtPLWH GH GHWHFFLyQ HV GHO RUGHQ GH SLFR D IHPWRPRODU GH SURWHtQD HQ FDGD SXQWR Una ventaja de realizar estudios de protemica mediante separacin en geles bidimensionales es que estos experimentos pueden ser realizados utilizando muestras de cualquier especie vegetal, sin necesidad de que el genoma de la especie en estudio se encuentre VHFXHQFLDGD $GHPiV HVWD WpFQLFD HV LGHDO para experimentos en donde se observen pocos cambios en los patrones proteicos. Una alternativa a las separaciones 2D por ,()6'63$*( HV OD WpFQLFD GH VHSDUDFLyQ HQ electroforesis nativa en presencia de azul de &RRPDVVLH %13$*( GHO LQJOpV EOXHQDWLve). Esta tcnica es utilizada para la separaFLyQ GH SURWHtQDV KLGURIyELFDV \ SURWHtQDV HQ su estado nativo, ya que stas no se separan FRUUHFWDPHQWH HQ ORV JHOHV ,()6'63$*( Esta tcnica se basa en la integracin de una FDUJD QHWD QHJDWLYD HQ ODV SURWHtQDV \ FRPSOHjos proteicos por adicin del colorante azul de Coomassie, y permite la separacin en condiciones nativas en la primera dimensin. En la VHJXQGD GLPHQVLyQ VH UHDOL]D XQ 6'63$*( donde los complejos proteicos que migraron juntos en la primera dimensin se separan en

VXV VXEXQLGDGHV TXH VH REVHUYDQ HQ ODV YHUticales de puntos proteicos en los geles 2D. Esta tcnica complementa a los geles 2D IEF/ 6'63$*(  &XDQWLFDFLyQ SRU HVSHFWURPHWUtD GH masa (MS) /XHJR GH OD VHOHFFLyQ GH ODV SURWHtQDV de inters en un gel 2D, stas pueden ser LGHQWLFDGDV SRU HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV Bsicamente, luego de la digestin de las proWHtQDV FRUWDGDV GHO JHO FRQ XQD SURWHDVD WtSLcamente tripsina), la mezcla compleja de pptidos es analizada. Existen distintos tipos de HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV TXH XWLOL]DQ GLVWLQWRV mtodos para la ionizacin de las muestras. 3RU XQ ODGR OD HVSHFWURPHWUtD GH PDVD SRU desorcin por ionizacin mediante lser asistida por una matriz (del ingls matrix-assisted ODVHU GHVRUSWLRQ LRQLVDWLRQ 0$/', WLHPSR GH YXHOR WLPHRILJKW 72)  VH XWLOL]D SULQcipalmente para realizar huellas dactilares de SpSWLGRV \ SURWHtQDV 3RU RWUR ODGR OD HVSHFWURPHWUtD HQ WDQGHP SRU HOHFWURSXOYHUL]DGR (ESI), usualmente se acopla a una separacin SUHYLD HQ XQ VLVWHPD GH FURPDWRJUDItD GH DOWD presin (HPLC) y se utiliza para la elucidacin GH OD VHFXHQFLD H LGHQWLFDFLyQ GH OD SURWHtQD correspondiente (Figura 1). En estos momentos, existe una actualizacin constante en los distintos tipos de espectrmetros de masa que se encuentran disponibles en el mercado, y la sensibilidad, selectividad y precisin de los equipos son cada vez mayores. Los principios de esta tcnica pueden ser resumidos en cuatro funciones del equipo: 1-Ionizacin: la molcula de inters sufre un cambio en la carga neta, formndose un anin o un protn. Dependiendo del mtodo de ionizacin utilizado, es posible que se generen iones fragmentados. En el caso de usos en protemica, los mtodos de ionizacin utili]DGRV VRQ 0$/', \ HOHFWURVSUD\PLFURVSUD\ nanospray. 2-Separacin: las especies inicas son separadas de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z), 3-Medida de la masa: las masas son asignadas segn las medidas de algn parmetro ItVLFR

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)LJXUD  7pFQLFDV GH 06 SDUD LGHQWLFDFLyQ GH SURWHtQDV D SDUWLU GH JHOHV ELGLPHQVLRQDOHV Los SXQWRV GH LQWHUpV GHO JHO ' VRQ FRUWDGRV \ FRORFDGRV HQ WXERV /D SURWHtQD GHO EORTXH GH DFULODPLGD HV digerida con una proteasa, y los productos obtenidos son analizados por distintas tcnicas para su identiFDFLyQ $GDSWDGR GH 1HVDW\\ DQG 6XWHU  

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4-Medida de la abundancia: la medida de la abundancia de cada ion se realiza en base a la altura o rea del pico en el espectro, permiWLHQGR XQD VHPLFXDQWLFDFLyQ R FXDQWLFDFLyQ de cada ion. 3.1. MALDI-TOF y huella dactilar de pptidos: En esta tcnica, los pptidos generados luego de la digestin con tripsina son mezclados a una matriz en solucin, que est formada por una solucin concentrada o saturada de un compuesto de bajo peso molecular cido y que absorbe el UV. En el caso de pptidos, el compuesto ms utilizado es el cido D-cianoKLGUR[LFLQiPLFR $SUR[LPDGDPHQWH PL de la mezcla muestra/matriz es colocada en una SODFD SDUD 0$/', \ VH SHUPLWH FRFULVWDOL]DU HQ un nico punto. Como la matriz se coloca en exceso con respecto a la muestra y absorbe UV, cuando se irradia con un lser de UV esta HQHUJtD HV DEVRUELGD SRU OD PDWUL] \ SDVDGD D la muestra de manera que se ioniza pero no se fragmenta. Estos iones son luego acelerados por el espectrmetro de masa: los iones mas livianos viajan ms rpido que los pesados, por lo que el tiempo en el que llegan al detector puede ser utilizado para determinar la relacin masa/carga de cada ion, obtenindose un espectro que contiene todos los iones acelerados, y se obtiene una lista de las masas de los picos que presentan mayor intensidad. La lista de picos es enviado a una base de datos que compara las masas de los picos de los especWURV FRQ ORV WHyULFRV GH ODV SURWHtQDV GLJHULGDV y produce una lista de las posibles identidades utilizando un sistema de puntaje. 3.2. Espectrometra de masas en tandem por electropulverizado. Este proceso analiza los pptidos generados luego de la digestin con tripsina. En este caso, el espectrmetro de masas esta acoplado a un equipo de HPLC. Durante la ionizacin por electropulverizado, los pptidos se separan previamente por HPLC (usualmente son utilizadas columnas de C18) y luego entran a una fuente de ionizacin. Un voltaje alto es aplicado a una aguja por donde pasan las muestras que llegan como gotas, produciendo una carga en OD VXSHUFLH (Q OD JRWD VH JHQHUD XQD UHSXO-

sin electrosttica que hace que se liberen iones gaseosos que son acelerados en el espectrmetro de masas. Cuando los pptidos entran al espectrmetro de masa, algunos iones pepWtGLFRV VRQ VHOHFFLRQDGRV \ IUDJPHQWDGRV SRU colisin con un gas para producir un nmero de fragmentos inicos. Las relaciones m/z de estos fragmentos son registrados para dar el espectro de fragmentacin de ese pptido. Un pptido se puede considerar como una cadeQD DPLQRDFtGLFD TXH VH SXHGH IUDJPHQWDU HQ cualquier punto; sin embargo la fragmentacin ocurre preferencialmente entre la unin de N y C entre aminocidos, por lo que la secuencia de un pptido puede determinarse por el patrn de picos que se obtienen del espectro de fragmentacin. El espectrmetro de masa realiza el registro de todos los picos de fragmentacin, y luego de completada la separacin y especWURPHWUtD GH PDVD GH WRGRV ORV SpSWLGRV ORV espectros son enviados a una base de datos SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH OD SURWHtQD HQ HVWXGLR por comparacin al patrn de ionizacin terico GH ORV SpSWLGRV GH OD SURWHtQD  %DVHV GH GDWRV SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH protenas: Existen numerosas bases de datos para la LGHQWLFDFLyQ \ FDUDFWHUL]DFLyQ GH SURWHtQDV OXHJR GH OD HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV E~VTXHda de semejanzas, patrones de fragmentacin \ SHUOHV SUHGLFFLyQ GH VLWLRV GH PRGLFDFLyQ postraduccional, etc. Entre ellos se encuenWUDQ 0$6&27 3URWHLQ3URVSHFWRU ([3$6\ Proteomics. Muchos de estos sitios son accesibles luego de una suscripcin, mientras que RWURV HVWiQ GLVSRQLEOHV HQ OD ZHE D WRGRV ORV usuarios interesados. La tabla 1 muestra las pginas correspondientes de algunos de los sitios. 4. Alternativas a los geles bidimensionales $OJXQDV DOWHUQDWLYDV DO XVR GH JHOHV HQ GRV dimensiones son los mtodos basados en esSHFWURPHWUtD GH PDVD SDUD FRPSDUDU OD DEXQdancia de pptidos. Luego de la digestin de ODV SURWHtQDV VLQ TXH VH UHDOLFH QLQJXQD VHparacin previa), la mezcla compleja de ppWLGRV VH VHSDUD SRU FURPDWRJUDItD SUHYLR DO DQiOLVLV SRU 06 /D HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV

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Tabla 1.
Pginas disponibles correspondientes a bases de datos para identificacin de protenas para el anlisis posterior a la espectrometra de masas ExPASy Proteomics MASCOT Prosight PTM Protein Prospector GPM PROWL
http://us.expasy.org/tools http://www.matrixscience.com http://prosightptm.scs.uiuc.edu http://prospector.ucsf.edu http://thegpm.org http://prowl.rockefeller.edu

HO TXH OD PDUFD HV LQWURGXFLGD D OD SURWHtQD R D ORV SpSWLGRV \ FyPR VRQ H[WUDtGRV ORV GDWRV GH FXDQWLFDFLyQ $ FRQWLQXDFLyQ VH GHVFULEHQ brevemente los distintos tipos de marcado. 4.1. Marcado isotpico in vivo. Este es un mtodo comnmente utilizado en protemica comparativa. Para estos experimentos, una de las muestras se crece en una atmsfera de nitrgeno natural, mientras que la muestra a comparar se crece en presencia del istopo pesado. Esto puede hacerse por la introduccin de algn aminocido marcado en cultivos celulares o utilizando 15N como nica IXHQWH GH QLWUyJHQR WtSLFDPHQWH HQ OD IRUPD GH .15NO3. Como resultado, las masas de los pptidos de las poblaciones a comparar sern diferentes, permitiendo una comparacin directa de las intensidades de los iones de las dos mezclas. En principio, las dos muestras a comparar pueden ser mezcladas al comienzo del experimento, por lo que se eliminan virtualmente todas las potenciales variaciones tcnicas. Debido a que la diferencia isotpica de cada pptido es la misma entre los espectros de las dos muestras, el estudio del proteoma completo puede ser problemtico debido a la complejidad de los espectros, por lo que esta tcnica es recomendable para sub-proteomas, como por ejemplo el fosfoproteoma. 4.2. Marcado isotpico in vitro. Una alternativa es introducir la marca en los SpSWLGRV GH PDQHUD TXtPLFD GXUDQWH R OXHJR GH OD GLJHVWLyQ GH ODV SURWHtQDV 8QD YHQWDMD GH esta tcnica es que cualquier muestra proteica puede ser marcada, eliminando la limitacin que existe al querer introducir la marca en una clula viva. La mayor desventaja es el cuidado que hay que tener para no introducir variaciones tcnicas durante la obtencin de la muestra proteica (en especial si existe algn paso de fraccin subcelular). 4.2.1. Marcado con 18O durante la digestin con tripsina 'XUDQWH OD KLGUyOLVLV GH ODV SURWHtQDV FRQ WULSVLQD HO R[tJHQR GHO DJXD VH LQFRUSRUD DO & WHUPLQDO GHO SpSWLGR WUtSWLFR 3RU OR WDQWR VL la digestin de una muestra se realiza en presencia de H218O mientras que la de la muestra

puede ser corrida de manera independiente o bien acoplada a la separacin por HPLC. Los pptidos producidos por la digestin de las proWHtQDV WRWDOHV VRQ LRQL]DGRV SDUD DGTXLULU HO HVpectro de MS de todos los iones presentes en OD PH]FOD $OJXQRV SpSWLGRV VRQ VHOHFFLRQDGRV y son fragmentados individualmente para obtener un segundo espectro MS (MS/MS) que permite obtener la secuencia de aminocidos del pptido. La seal o integracin de los picos de los iones puede ser utilizada como tcnica GH FXDQWLFDFLyQ \D TXH HQ WHRUtD OD LQWHQVLdad de los picos es proporcional a la cantidad GH SURWHtQD GH OD FXDO SURYLHQH HO LRQ SHSWtGLco. Sin embargo, la variabilidad tcnica, tanto D QLYHO GH OD FURPDWRJUDItD OtTXLGD FRPR D QLYHO de los pasos de ionizacin, hacen que la comSDUDFLyQ GH ODV LQWHQVLGDGHV QR VHD FRQDEOH Por ello, se han desarrollado diferentes tcniFDV GH PDUFDGR GH ODV SURWHtQDV TXH SHUPLten una directa comparacin de los picos en un mismo espectro MS o MS/MS. La base de todas estas tcnicas es la misma: se introducen marcas inertes, estables e isotpicas a los pptidos de manera que los patrones de ioni]DFLyQ \ ODV SURSLHGDGHV FURPDWRJUiFDV GH los pptidos marcados sean similares a los de las muestras de origen, pero pueden ser diferenciados luego del anlisis por un leve corrimiento en el espectro de MS. De esta manera, las dos muestras a comparar pueden ser corridas de manera simultnea y analizadas a partir de un mismo experimento. Por ello, la separacin de los pptidos seguida de la cuanWLFDFLRQ GH ORV LRQHV UHHMD OD DEXQGDQFLD UHODWLYD GH FDGD SURWHtQD LQWDFWD GH OD FXDO GHULYD HO SpSWLGR FXDQWLFDGR /RV GLVWLQWRV PpWRGRV de marcado se diferencian en el momento en

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a comparar se realiza en un medio con H216O, HQ WHRUtD VH JHQHUDQ SpSWLGRV TXH GLHUHQ en cuatro unidades de masa en el espectro. Experimentalmente, sin embargo, la incorporacin es siempre incompleta, generndose espectros que se solapan. Por esta razn este mtodo no es tan elegido como otros, aunque presenta bajo costo comparado a los que se describen a continuacin.  0DUFDGR LVRWySLFR FRQ VRQGDV SRU DQLGDG ,&$7  Otro mtodo de marcado se basa en la moGLFDFLyQ FRYDOHQWH GH &\V FRQ FRPSXHVWRV TXtPLFRV ELRWLQLODGRV TXH VyOR GLHUHQ HQ OD inclusin de istopos pesados y livianos luego de la digestin. El uso de biotina permite el rpido enriquecimiento de los pptidos marcaGRV \ GHELGR D TXH OD PD\RUtD GH ODV SURWHtQDV contienen pocas Cys, slo algunos pptidos de FDGD SURWHtQD VRQ DQDOL]DGRV 3RU HOOR HVWH mtodo permite el anlisis de muestras complejas. Sin embargo, dado que una de cada VLHWH SURWHtQDV QR FRQWLHQH UHVLGXRV GH &\V existen limitaciones en el anlisis.  0DUFDV LVREiULFDV SDUD FXDQWLFDFLyQ UHODWLYD \ DEVROXWD L75$4  8Q PpWRGR DOWHUQDWLYR LQYROXFUD OD PRGLFDcin de aminas primarias con marcas isobriFDV (VWD WpFQLFD HV VLPLODU D ,&$7 HQ FXDQWR D que cada muestra es marcada con una marca GLIHUHQWH SHUR FRQ ORV UHDFWLYRV L75$4 WRGRV ORV SpSWLGRV WUtSWLFRV VRQ PDUFDGRV $GHPiV esta tcnica permite el anlisis de hasta 8 muestras de manera simultnea si se utilizan GLVWLQWRV UHDFWLYRV L75$4 SDUD PDUFDU ODV GLVtintas muestras.  &XDQWLFDFLyQ OLEUH GH PDUFD $ SHVDU GH ORV SUREOHPDV GH YDULDELOLGDG GHVFULSWRV DQWHULRUPHQWH HQ OD FXDQWLFDFLyQ GLUHFta de la intensidad de los picos de MS luego de OD FURPDWRJUDItD OtTXLGD GHELGR D OD DSDULFLyQ de espectrmetros de masa de ltima generacin y al aumento de la reproducibilidad de las VHSDUDFLRQHV HQ ODV FURPDWRJUDItDV JDVHRVDV esta tcnica ha comenzado a ser utilizada nuevamente. Para ello, varios programas de computacin han sido desarrollados para comparar

los pptidos de mltiples espectros de LC-MS/ 06 8QD YH] LGHQWLFDGR HO PLVPR SpSWLGR HQ distintos espectros, stos se comparan y se genera una relacin de expresin luego de un DQiOLVLV HVWDGtVWLFR  &XDQWLFDFLyQ DEVROXWD XWLOL]DQGR SpSWLdos AQUA Los mtodos descriptos anteriormente son capaces de determinar cantidades relativas GH SURWHtQDV R SpSWLGRV 3DUD FRQYHUWLU GDWRV relativos a absolutos se requiere la inclusin de estndares internos de concentraciones conocidas, que deben estar marcados para GLVWLQJXLUVH GH OD SURWHtQD QDWLYD 3DUD HOOR VH utiliza la tcnica de marcado isotpico estable, en la que pptidos sintticos son marcados con un aminocido pesado en una o ms posiFLRQHV OODPDGR SpSWLGR $48$  'HELGR D TXH ODV SURSLHGDGHV FURPDWRJUiFDV H LRQL]DQWHV GH ORV SpSWLGRV $48$ VRQ LGpQWLFDV D ODV GH los pptidos nativos, al analizar e integrar los cromatogramas de los iones del par isotpico, se obtiene una relacin entre el pptido nativo y el sinttico de concentracin conocida. Estos pptidos pueden ser sintetizados para P~OWLSOHV SURWHtQDV GH LQWHUpV \ XVDGRV SDUD determinar concentraciones absolutas en una PXHVWUD $GHPiV SXHGHQ VHU XWLOL]DGRV SDUD FXDQWLFDU PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV 5. Aplicaciones de la protemic El anlisis del proteoma de rganos o tejidos de plantas se ha llevado a cabo para analizar, por ejemplo, la respuesta a hormonas o PROpFXODV VHxDO OD UHVSXHVWD D HVWtPXORV GHO ambiente, cambios durante el desarrollo o tamELpQ SDUD DQDOL]DU ORV SDWURQHV SURWHLFRV GH Otneas con diferente base gentica. Proteomas subcelulares tambin han sido analizados en diversas especies y, ms recientemente, se ha utilizado este tipo de estudio para analizar LQWHUDFFLyQ GH SURWHtQDV R PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV $GHPiV VH KDQ DQDOL]DGR SRU esta tcnica la equivalencia y seguridad de aliPHQWRV GHULYDGRV GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV DVt como el estudio de la presencia de alergenos, HQWUH RWURV $Vt ORV FDPSRV GH DSOLFDFLyQ GH OD protemica en plantas ha ido en aumento en los ltimos aos (ver revisiones: Cnovas et al.

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 5RVVLJQRO HW DO  -DUUtQ HW DO  y a continuacin se detallarn algunos de los aspectos ms estudiados. La Tabla 2 resume las reas ms relevantes en las que se ha aplicado la protemica en plantas. 5.1. Anlisis de proteomas subcelulares de plantas El mayor avance en proteomas subcelulares se ha llevado a cabo en plastidios, mitocondrias y membranas. Estos estudios no slo han FRQWULEXLGR D OD ORFDOL]DFLyQ GH SURWHtQDV HVSHFtFDV VLQR WDPELpQ TXH KD EULQGDGR LQIRUPDcin relevante sobre transporte, metabolismo, YtDV GH VHFUHFLyQ GLIHUHQFLDFLyQ \ UHVSXHVWD D HVWUpV $ SHVDU GH TXH OD SXULFDFLyQ GH SODVtidios es una tcnica fcil y que brinda fracciones de alta pureza, el aislamiento de otras organelas o fracciones subcelulares es tcniFDPHQWH PiV GLFXOWRVD (Q WRGRV ORV FDVRV siempre se debe estimar el nivel de contaminaFLyQ GH OD IUDFFLyQ SXULFDGD XWLOL]DQGR PDUFD-

GRUHV HVSHFtFRV &DEH GHVWDFDU TXH PXFKDV GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV HQ ORV GLYHUVRV compartimentos provienen de anotaciones de genes con funcin desconocida, por lo cual el FRQRFLPLHQWR GH OD ORFDOL]DFLyQ GH OD SURWHtQD TXH FRGLFDQ SHUPLWH FRPHQ]DU D LGHQWLFDU OD funcin de dichos genes. El anlisis de proteomas de plastidios, especialmente de cloroplastos, ha brindado inIRUPDFLyQ VREUH QXHYDV SURWHtQDV ORFDOL]DGDV en membrana externa y en tilacoides. Estos estudios, llevados a cabo fundamentalmente en arabidopsis y espinaca, han evidenciado diversos procesos de procesamiento y transORFDFLyQ \ PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV GH SURWHtQDV *UDFLDV DO XVR GH H[WUDFFLRQHV FRQ GLYHUVRV VROYHQWHV VH KDQ LGHQWLFDGRV QXHYDV SURWHtQDV FDQGLGDWDV D VHU WUDQVSRUWDdores de membrana. La tcnica de electroforesis nativa en presencia de azul de Coomassie %13$*(  VHJXLGD SRU VHJXQGD GLPHQVLyQ H

Tabla 2 Aplicaciones de la protemica en plantas: Especies analizadas, tipos de proteomas estudiados, procesos biolgicos y aspectos prcticos donde se ha analizado el proteoma.
Especies analizadas Proteomas Sistemas modelos Arabidopsis thaliana Medicago truncatula Cereales Maz Arroz Trigo Leguminosas Alfalfa Arveja Soja Lenteja Otros Papa Tabaco Tomate Vid Espinaca Individuales Genotipos Mutantes Trangnicas Procesos Biolgicos Aspectos prcticos Identidad de marcadores moleculares Caracterizacin del genotipo Equivalencia de OGM Identificacin alergenos

Desarrollo Germinacin Maduracin polen Embriognesis Respuesta a hormonas Fracciones subcelulares Muerte celular programada Cloroplasto Estrs abitico Mitocondria Sequa Plastidio Osmtico Citosol Temperatura Pared celular Anoxia Membrana Deficiencia nutricional Vacuola Metales pesados rganos y Tejidos UV-B Races Estrs bitico Semillas Patgenos Coleoptiles Herbvoros Haces vasculares Estrs oxidativo Hojas Tricomas Polen Estados de desarrollo Germinacin Plantas maduras Plantas jvenes

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LGHQWLFDFLyQ GH ODV SURWHtQDV SRU 06 WpFQLFD ampliamente utilizada para el estudio de complejos mitocondriales, tambin ha sido utilizada para el estudio de la composicin de los complejos proteicos de la membrana tilacoidal. El estudio del proteoma mitocondrial se ha GLYLGLGR HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH SURWHtQDV VROXEOHV SURWHtQDV SHULIpULFDV \ SURWHtQDV LQWHgrales de membrana. En este caso, el uso de %13$*( VHJXLGR SRU '( H LGHQWLFDFLyQ GH ODV SURWHtQDV VH KD XWLOL]DGR SDUD DQDOL]DU OD composicin de los diversos complejos respiUDWRULRV LGHQWLFiQGRVH QXHYRV FRPSRQHQWHV y diferencias con complejos respiratorios de otros organismos. (O DQiOLVLV GH SURWHtQDV GH PHPEUDQD HV XQR GH ORV GHVDItRV PiV GLItFLOHV GHELGR D SUREOHPDV GH PHWRGRORJtD SRU OD EDMD DEXQGDQFLD GH ODV SURWHtQDV \ VXV FDUDFWHUtVWLFDV KLGURIyELFDV VLHQGR PXFKDV GH HOODV SURWHtQDV WUDQVmembrana. Para el anlisis de este tipo de proWHtQDV VH KDQ HPSOHDGR SDUWLFLyQ GH SURWHtQDV en distintas fases de solventes seguido de fraccionamiento teniendo en cuenta las propiedaGHV VLFRTXtPLFDV GH ODV SURWHtQDV 3RU HMHPplo, el proteoma de la membrana plasmtica de arabidopsis fue analizado, siendo uno de los primeros que, adems, se someti a anOLVLV GH SURWHtQDV IRVIRULODGDV LGHQWLFiQGRVH ms de 300 sitios de fosforilacin. El proteoma vacuolar de arabidopsis, tanto de la membraQD FRPR GH ODV SURWHtQDV VROXEOHV WDPELpQ KD VLGR DQDOL]DGR FRQUPiQGRVH GLFKD ORFDOL]DFLyQ VXEFHOXODU SDUD DOJXQDV GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV SRU RWUDV WpFQLFDV $GHPiV VH KDQ OOHYDGR D FDER HVWXGLRV SDUD LGHQWLFDU SURWHtQDV GH SDUHG FHOXODU \ H[WUDFHOXODUHV LGHQWLFiQGRVH OD SUHVHQFLD GH YDULDV SURWHDVDV SURWHtQDV QXFOHDUHV PX\ GLItFLO GHELGR D VX EDMD FDQWLGDG \ D VXV DVRFLDFLyQ FRQ HO 5HWtFXOR (QGRSODVPiWLFR \ SURWHRPDV PL[WRV GHO DSDUDWR GH *ROJL \ GHO 5HWtFXOR endoplasmtico. 5.2. Proteomas durante el desarrollo de rganos Uno de los primeros objetivos de la protemica en plantas fue generar mapas de reIHUHQFLD GH SURWHtQDV VROXEOHV GH XQ yUJDQR en un determinado estado de desarrollo. En

los ltimos aos un gran nmero de trabajos VH KDQ UHDOL]DGR FRQ HO REMHWLYR GH LGHQWLFDU los cambios proteicos que ocurren asociados DO FUHFLPLHQWR \ GHVDUUROOR FRQ OD QDOLGDG GH LGHQWLFDU ODV SURWHtQDV FODYHV LPSOLFDGDV HQ GLFKRV SURFHVRV $Vt VH KDQ GHVFULWR ORV FDPbios en el proteoma asociados al crecimiento o GHVDUUROOR GHO JUDQR GH SROHQ VHPLOODV UDtFHV haces vasculares, entre otros. Muchos son los estudios que demuestran que los anlisis de protemica pueden generar informacin relevante para dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en procesos de desarrollo. Por ejemplo, estudios llevados D FDER HQ UDtFHV GH PDt] KDQ LQGLFDGR TXH GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV OXHJR GH GtDV de germinacin, slo el 28% permanece en las ~OWLPDV HWDSDV GHO GHVDUUROOR LGHQWLFiQGRVH DGHPiV SURWHtQDV DVRFLDGDV D OD IRUPDFLyQ GH UDtFHV ODWHUDOHV 3URFHVRV FRPR OD HPEULRJpnesis somtica tambin han sido analizados en GLYHUVDV HVSHFLHV SRU SURWHyPLFD LGHQWLFiQGRVH SURWHtQDV GH PHPEUDQD QXFOHDUHV DVt FRPR SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ PHWDEROLVPR \ SURGXFFLyQ GH HQHUJtD HQ GLYHUVDV HWDSDV GH este proceso. En muchos casos, se han idenWLFDGR SURWHtQDV FX\RV $51P QR IXHURQ LGHQWLFDGRV SRU HVWXGLRV GH WUDQVFULSWRPD FRPR es el caso del anlisis del grano de polen en arabidopsis, entre otros. 5.3. Proteomas en respuesta a estrs abitico El estudio de la interaccin de las plantas con el ambiente ha sido clsicamente abordaGR PHGLDQWH HVWXGLRV ELRTXtPLFRV JHQpWLFRV \ ms recientemente, a nivel de transcriptoma, mediante PCR en tiempo real (qRT-PCR), microarreglos, entre otros. Sin embargo, la protemica, desde su aplicacin en este tipo de situaciones, ha comenzado a brindar contribuciones relevantes en cuanto a los elementos involucrados tanto en la percepcin de la situacin ambiental como en la traduccin de dicha seal en la planta. Los tipos de estrs analizaGRV PHGLDQWH SURWHyPLFD KDQ VLGR VHTXtD HVtrs salino, alta temperatura, alta luz, radiacin 89% GHFLHQFLD QXWULFLRQDO QLYHOHV HOHYDGRV de CO2, anoxia, metales pesados y herbicidas.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 143

Este tipo de aplicacin de la protemica inFOX\H WtSLFDPHQWH DQiOLVLV GH '(06 SDUD estudiar variaciones proteicas entre especies sensibles y resistentes frente a una determinada situacin de estrs. Se analizan las difeUHQFLDV FXDQWLWDWLYDV \ FXDOLWDWLYDV GH SURWHtQDV FRQ OD QDOLGDG GH FRUUHODFLRQDU HVWRV FDPELRV FRQ ODV GLIHUHQFLDV IHQRWtSLFDV 6H HVWXGLDQ tambin plantas mutantes o transgnicas, donGH XQD OtQHD HV UHVLVWHQWH \ RWUD VHQVLEOH $Vt ODV SURWHtQDV GLIHUHQFLDOHV VH VHOHFFLRQDQ FRQWUDVWDQGR ORV SURWHRPDV HQWUH OtQHDV UHVLVWHQtes versus VXVFHSWLEOHV R HQWUH OtQHDV FUHFLGDV en condiciones ptimas versus estresadas. 5.4. Proteomas en respuesta a estrs bitico En los ltimos aos, muchos estudios se han llevado a cabo para analizar la respuesta de los proteomas de diversos rganos frente al ataque por hongos, virus o bacterias. 7tSLFDPHQWH H[WUDFWRV FUXGRV GH KRMDV VHPLOODV UDtFHV R FXOWLYRV FHOXODUHV VH DQDOL]DQ D distintos tiempos luego del tratamiento y se separan organelas o subfracciones para el anOLVLV GH ORV FDPELRV HQ HO SURWHRPD $GHPiV se analiza el efecto de elicitores o molculas claves de la sealizacin (como cido saliFtOLFR SHUy[LGR GH KLGUyJHQR X y[LGR QtWULFR sobre el proteoma. Por otro lado, se estudian los proteomas de especies tolerantes o resistentes versus el de sensibles. Estos estudios, junto con el estudio del proteoma de diversos compartimentos celulares (apoplasto, tricoma, VDS GH RHPD R [LOHPD HQWUH RWURV  KDQ HYLGHQFLDGR TXH YDULDV SURWHtQDV UHODFLRQDGDV D la defensa frente al ataque de patgenos estn presentes incluso en ausencia del mismo y que ODV PLVPDV SURWHtQDV UHVSRQGHQ D WLSRV YDULDGRV GH HVWUpV $GHPiV PXFKDV SURWHtQDV GHrivadas de genes de funcin desconocida, han sido encontradas en estos estudios. (Q JHQHUDO OD PD\RUtD GH ODV SURWHtQDV LGHQWLFDGDV HQ ORV HVWXGLRV GH SURWHRPDV de genotipos resistentes comparadas con los de sensibles, han mostrado dos tipos geneUDOHV GH SURWHtQDV SURWHtQDV UHODFLRQDGDV D la defensa y enzimas asociadas al metabolismo del carbono o nitrgeno y al metabolismo secundario. Dentro del primer grupo, se han HQFRQWUDGR SURWHtQDV 35 FRPR JOXFDQDVDV

quitinasas, proteasa, inhibidores de proteasas), antioxidantes (catalasas, SODs, peroxiGDVDV  FKDSHURQDV +63V SURWHtQDV /($ (Q el segundo grupo, varias enzimas asociadas D PHWDEROLVPR FRPR OD JOXFyOLVLV IRWRVtQWHVLV FLFOR GH .UHEV DVLPLODFLyQ GHO QLWUyJHQR R implicadas en metabolismos secundarios han sido encontradas. Es notable que los estudios basados en anlisis del transcriptoma han analizado en mucha mayor medida el primer grupo que el segundo. Sin embargo, la presencia de PD\RU FRQFHQWUDFLyQ GH SURWHtQDV LPSOLFDGDV en metabolismo primario en genotipos resistentes versus VHQVLEOHV SRGUtD LQGLFDU XQD YHQtaja gentica para defenderse frente al ataque. 5.5. Protemica para el estudio de simbiosis en plantas La protemica se ha aplicado tambin para HO HVWXGLR GH ODV SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ OD formacin de ndulos en especies leguminoVDV 0DSDV GH SURWHtQDV GH UDtFHV GH HVSHFLHV hospedadoras, ndulos, cultivos de bacteroides fueron generados y comparados, con el REMHWLYR GH LGHQWLFDU SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ OD VLPELRVLV $GHPiV VH DQDOL]DURQ ODV SURWHtQDV LQYROXFUDGDV HQ GLVWLQWDV HWDSDV GH OD nodulacin.  0RGLFDFLyQ SRVWUDGXFFLRQDO H LQWHUDFcin de protenas 8QD GH ODV PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV GH SURWHtQDV HVWXGLDGDV PHGLDQWH SURWHymica es la fosforilacin. En estos estudios, VH KDQ LGHQWLFDGR ORV FDPELRV FXDQWLWDWLYRV \ FXDOLWDWLYRV GH ODV SURWHtQDV IRVIRULODGDV HQ UHVSXHVWD D GLYHUVDV VHxDOHV $GHPiV VH KDQ DQDOL]DGR ODV SURWHtQDV PRGLFDGDV HQ VX HVWDGR UHGR[ HQ GLIHUHQWHV VLVWHPDV LGHQWLFiQGRse muchos candidatos putativos de ser blanco de reduccin por tioredoxinas. Recientemente, se ha comenzado a analizar el patrn de proWHtQDV VXMHWDV D XELTXLWLQDFLyQ HQ SODQWDV PHdiante estudios de protemica. En cuanto al estudio de interaccin de proWHtQDV PHGLDQWH SURWHyPLFD ORV HVWXGLRV OOHYDGRV D FDER HQ SODQWDV VRQ WRGDYtD PX\ SRcos comparados con los llevados a cabo en RWURV VLVWHPDV FRPR PDPtIHURV \ OHYDGXUDV $OJXQRV HMHPSORV LQFOX\HQ HVWXGLRV GH FRP-

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SOHMRV IRUPDGRV SRU YLUXV GH SODQWDV \ SURWHtnas del husped, anlisis de inmunoprecipitaGRV GH SURWHtQDV TXH LQWHUDFFLRQDQ FRQ WRFURPRV DVt FRPR SURWHtQDV TXH LQWHUDFFLRQDQ FRQ cobre. 6. Perspectivas Los resultados obtenidos mediante estudios de protemica en sus distintas aplicaciones han indicado que los estudios de genmica \ WUDQVFULSWRPD QR VRQ VXFLHQWHV GDGR TXH la protemica generalmente evidencia procesos no detectados por los otros estudios mencionados. Esto se debe fundamentalmente a que las SURWHtQDV VRQ ItVLFD \ TXtPLFDPHQWH PiV GLYHUVDV TXH ORV iFLGRV QXFOHLFRV $GHPiV GHELGR DO SURFHVDPLHQWR GHO $51 \ D ODV PRGLFDFLRQHV SRVWUDGXFFLRQDOHV ODV SURWHtQDV GH XQ dado organismo exceden en nmero la cantidad de genes. Otro nivel de complejidad se presenta si se tienen en cuenta la interaccin GH SURWHtQDSURWHtQD OR FXDO PRGLFD ODV SURSLHGDGHV GH ODV SURWHtQDV LQGLYLGXDOHV De esta manera, el estudio del proteoma, en paralelo con el del transcriptoma, llevado a cabo sobre el mismo sistema, podr dilucidar los mecanismos de control de expresin de SURWHtQDV \ HYLGHQFLDUi ORV SURFHVRV ELROyJLFRV llevados a cabo en una determinada situacin. 7. Bibliografa
Cnovas F. M., Dumas-Gaudot E., Recorbet G., Jorrin J., Mock H-P and Rossignol M. 2005. Plant 3URWHRPH $QDO\VLV 3URWHRPLFV 4, 285-298 &KHQ 6 DQG +DUPRQ $ &  $GYDQFHV LQ SODQW proteomics. Proteomics, 6, 55045516. -RUUtQ - 9 0DOGRQDGR $ 0 DQG &DVWLOOHMR 0 $  3ODQW SURWHRPH DQDO\VLV $  XSGDWH Proteomics, 7, 2947-2962 Nesatyy V. J. and Suter M. J-F. 2007. Environmental Science & Technology, 41, 6891-6900. 1HZWRQ 5 3 %UHQWRQ $ * 6PLWK & - DQG 'XGley E. 2004. Plant proteome analysis by mass spectrometry: principles, problems, pitfalls and recent developments. Phytochemistry, 65, 14491485. Thelen J.J. and Peck S.C. 2007. Quantitative ProWHRPLFV LQ 3ODQWV &KRLFHV LQ $EXQGDQFH 3ODQW Cell, 19, 33393346.

5RVVLJQRO 0 3HOWLHU -% 0RFN +3 0DWURV $ 0DOGRQDGR $ 0 DQG -DUUtQ - 9  3ODQW SURWHRPH DQDO\VLV $  XSGDWH 3URteomics, 6, 5529-5548.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 145

I CAPTULO 10 Metabolmica
Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, /XFLDQR $ $EULDWD $OHMDQGUR - 9LOD \ Estela M. Valle. 'HQLFLyQ GH PHWDERORPD Se conoce como metabolismo al conjunto GH UHDFFLRQHV TXtPLFDV TXH RFXUUHQ HQ ODV Fplulas vivas, tejidos u organismos, mediante el cual estos participan del intercambio de mateULD \ HQHUJtD FRQ VX HQWRUQR (O RULJHQ GH OD palabra metabolismo procede del griego metabol TXH VLJQLFD FDPELR WUDQVIRUPDFLyQ En los sistemas biolgicos los metabolismos se encuentran interconectados formando reGHV ELRTXtPLFDV (Q ORV ~OWLPRV DxRV \ HQ HVWD era post-genmica, se ha acuado el trmino metaboloma, para indicar la totalidad de los metabolitos que actan en las redes metablicas de un sistema biolgico. Es decir, el metaERORPD LPSOLFD OD LGHQWLFDFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ simultneas de todos los metabolitos del material investigado. El metaboloma est conformado por dos tipos de compuestos: los metabolitos primarios y los secundarios. Los metabolitos primarios son compuestos que estn involucrados en funciones bsicas de la clula, como la respiracin o la ELRVtQWHVLV GH DPLQRiFLGRV 7RGRV ORV RUJDQLVmos comparten bsicamente los mismos tipos de metabolitos primarios y en trminos generales se puede decir que se trata de molculas simples y de bajo peso molecular. En cambio, ORV PHWDEROLWRV VHFXQGDULRV VRQ HVSHFtFRV GH la especie y muchos de ellos estn implicados en la defensa de la planta contra estrs bitico (siendo los terpenos los ms abundantes), en SURFHVRV GH GHVDUUROOR HVSHFtFRV GH OD HVSHcie (hormonas) y en estrategias de atraccin GH SROLQL]DGRUHV SLJPHQWRV GH ODV RUHV  (Q las plantas, se estima que el nmero total de metabolitos supera los 200.000. El anlisis del metaboloma de un sistema biolgico dado es conocido como metabolmica. Este trmino no VLHPSUH WLHQH HO PLVPR VLJQLFDGR \D TXH OD metabolmica es multifuncional y depende del diseo experimental y del objeto de estudio. En

general, la metabolmica indica la totalidad de los patrones metablicos de los sistemas bioOyJLFRV WDPELpQ FRQRFLGRV FRPR SHUOHV PHtablicos. Como los metabolitos son el producto de reacciones enzimticas, ellos brindarn informacin importante sobre las propiedades UHJXODWRULDV R FDWDOtWLFDV GH XQ SURGXFWR JpQLFR dado. Los metabolitos presentes en un sistema ELROyJLFR EDMR FRQGLFLRQHV HVSHFtFDV HVWDGtRV GH GHVDUUROOR FRQGLFLRQHV DPELHQWDOHV PRGLFDFLRQHV JHQpWLFDV VH SXHGHQ DQDOL]DU PHGLDQWH HO XVR GH WpFQLFDV FURPDWRJUiFDV GH VHSDUDFLyQ HQ GLVWLQWDV IDVHV JDVHRVD OtTXLGD GH DOWD SUHVLyQ HWF \ GH LGHQWLFDFLyQ PHGLDQWH HVSHFWURPHWUtD GH DOWD UHVROXFLyQ que han comenzado a establecerse recientePHQWH HQ $UJHQWLQD FRPR OD HVSHFWURPHWUtD GH PDVD 06 JDVHRVD R OtTXLGD \ WpFQLFDV HVpectroscpicas como la resonancia magntica QXFOHDU 501  $ VX YH] HO DFRSODPLHQWR GH los sistemas de separacin con los de identiFDFLyQ PHQFLRQDGRV PiV DUULED SHUPLWH OD REWHQFLyQ GH SHUOHV PHWDEyOLFRV GH PXHVWUDV complejas como por ejemplo, extractos crudos obtenidos de rganos fotosintticos de plantas. Diseo experimental, tcnicas, entrenaPLHQWR 0pWRGRV FURPDWRJUiFRV IDVH JDseosa y lquida). El anlisis de los metabolitos presentes en muestras complejas (como las que pueden obtenerse a partir de extractos crudos de plantas) puede realizarse en primer lugar a partir de la separacin de las molculas que las componen. Existen diversos mtodos de separacin con distintos grados de resolucin y sensibiliGDG /D FURPDWRJUDItD HQ IDVH JDVHRVD *& ha sido extensamente usada justamente por su alta resolucin y sensibilidad. Consiste en la separacin de las molculas por su capacidad mvil en una fase gaseosa impulsada por un gas usualmente inerte (por ejemplo Helio -He-) de modo de evitar reacciones con la matriz a analizar. Luego de su obtencin y acondicionamiento, los extractos son inyectados en una cmara de vaporizacin a alta presin y temperatura, donde la muestra es volatilizada para luego ser transportada a una columna bajo un XMR FRQVWDQWH GH JDV ([LVWHQ GLIHUHQWHV SURtocolos en cuanto a las condiciones y tiempos

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de corrida y se utilizan columnas diferentes en funcin del tipo de muestras y molculas a analizar. Las molculas se separan de acuerdo D VXV SURSLHGDGHV ItVLFDV \ TXtPLFDV \ DO QDO de la columna, un detector emite una seal que es registrada como una serie de picos los que FRQVWLWX\HQ HO FURPDWRJUDPD (Q OD JXUD  VH observa un cromatograma obtenido luego de aproximadamente 40 minutos de corrida de una muestra de extractos de frutos de tomate. El pice de un pico dado representa el momento de mayor intensidad registrado y se lo conoce como el tiempo de retencin (RT) de ese grupo de molculas. El RT es una propiedad de ODV PROpFXODV TXH SHUPLWH OD LGHQWLFDFLyQ GH las mismas en el cromatograma. Sin embargo, dada la necesidad de volatilizar los extractos, es necesario un tratamiento SUHYLR GH ORV PLVPRV D Q GH WUDQVIRUPDU ODV molculas en compuestos menos polares y ms voltiles. Este paso, denominado derivaWL]DFLyQ FRQVLVWH HQ OD DGLFLyQ GH JUXSRV TXtmicos (tales como sililo -Si(CH3)3- y metoxi) a las molculas que componen la muestra com-

pleja. Si bien se han desarrollado diferentes mtodos de derivatizacin, esta etapa constituye la principal desventaja de la cromatograItD JDVHRVD GDGD OD GLYHUVLGDG GH SURSLHGDGHV VLFRTXtPLFDV GH ODV PLOHV GH PROpFXODV TXH componen un extracto crudo. La principal diFXOWDG UDGLFD HQ OD H[DFWD LGHQWLFDFLyQ GH los fragmentos obtenidos luego de la ionizacin de las distintas molculas (ver siguiente VHFFLyQ (VSHFWURPHWUtD GH PDVDV 3ULQFLSLRV bsicos). En este sentido, la aplicacin de la cromatoJUDItD HQ IDVH OtTXLGD /& FRQVWLWX\H XQ FRPplemento importante a la gaseosa y contribuye a expandir el rango de aplicaciones de las WpFQLFDV FURPDWRJUiFDV HQ PHWDEROyPLFD 6L bien la resolucin de sta es menor que la gaseosa, permite la separacin de compuestos de mayor peso molecular y polaridad sin la necesidad del paso de derivatizacin previamente mencionado. No obstante los avances en el conocimiento HQ FXDQWR D OD VHSDUDFLyQ H LGHQWLFDFLyQ GH FRPSXHVWRV RUJiQLFRV OD FURPDWRJUDItD QR KD

Figura 1. Cromatograma obtenido luego de aproximadamente 40 minutos de corrida de un extracto crudo de fruto de tomate. Sobre las abscisas se observan los tiempos de retencin para grupo de molculas en XQD FROXPQD HQ IDVH JDVHRVD 6REUH ODV RUGHQDGDV VH JUDFDQ ODV LQWHQVLGDGHV UHODWLYDV GH FDGD JUXSR GH PROpFXODV VHSDUDGR %DMR FRQGLFLRQHV H[SHULPHQWDOHV GHQLGDV HVWDV LQWHQVLGDGHV VRQ SURSRUFLRQDOHV a la cantidad de la molcula en anlisis presente en una muestra dada.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 147

UHVXHOWR D~Q OD H[DFWD LGHQWLFDFLyQ GH PROpculas individuales presentes en una muestra compleja. El empleo de sistemas de cromatoJUDItD DFRSODGRV D HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV UHVXOWD GH JUDQ XWLOLGDG HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH molculas que se encuentran en trazas en una muestra compleja con un grado de exactitud de hasta 3-4 decimales. Espectrometra de masas. Principios bsicos. /D HVSHFWURPHWUtD GH PDVDV HV XQ PpWRGR TXH SHUPLWH OD LGHQWLFDFLyQ GH PROpFXODV D partir del patrn de fragmentos que se generan OXHJR GH OD LRQL]DFLyQ GH ODV PLVPDV $ HVWH SDtrn se lo denomina espectro de masas y constituye la huella digital de una molcula dada. Esta es una de las funciones primarias de los espectrmetros de masas. Existen varias mtodos para la ionizacin de molculas: ionizaFLyQ TXtPLFD &,  SRU LPSDFWR GH HOHFWURQHV (,  ERPEDUGHR UiSLGR GH iWRPRV )$%  SRU campo elctrico (FI), por lser (LIMS), desorFLyQ DVLVWLGD SRU OiVHU 0$/', H LRQL]DFLyQ SRU electrospray (ESI). Este ltimo mtodo es uno de los ms utilizados para la generacin de los espectros de masas de molculas orgnicas el cual consiste en un impacto con electrones de DOWD HQHUJtD DSOLFDGR VREUH XQD FRUULHQWH GH PROpFXODV HQ IDVH OtTXLGD (VWR SURGXFH OD QHbulizacin y fragmentacin de las molculas y mediante cambios rpidos de temperatura se

produce luego una corriente gaseosa que conduce a los iones obtenidos hacia los detectores del espectrmetro. Durante esta corriente los iones generados son separados de acuerdo a su masa y carga que al impactar sobre los detectores generan una seal elctrica que es registrada de acuerdo a su intensidad. La maQHUD JUiFD GH UHSUHVHQWDU HVWDV VHxDOHV HV lo que se conoce como espectro de masas de XQD PROpFXOD (Q OD JXUD  VH REVHUYD XQ HVpectro de masas del aminocido fenilalanina. Preparacin de muestras. Extraccin y derivatizacin. La obtencin de muestras biolgicas para el DQiOLVLV GH VXV SHUOHV PHWDEyOLFRV FRPR FXDOTXLHU RWUD WpFQLFD TXH LQYROXFUH OD LGHQWLFDFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ GH PHWDEROLWRV UHTXLHUH OD LQmediata inactivacin del metabolismo de modo de evitar efectos de su manipulacin sobre el mismo. La inhibicin rpida del metabolismo se logra mediante la disminucin brusca de temperatura (d -60C) por inmersin de las muestras en N2 OtTXLGR $ VX YH] ORV SURFHGLPLHQWRV posteriores de extraccin requieren el uso de materiales (tales como tubos plsticos o de vidrio) de alta calidad y pureza de modo de prevenir fuentes de eventuales contaminaciones. $ VX YH] GDGR TXH XQD GH ODV DSOLFDFLRQHV comunes de estas tcnicas es la comparacin del estado metablico de organismos frente a perturbaciones ambientales (por ejemplo de

Figura 2. Espectro de masas del aminocido fenilalanina. Sobre las abscisas se observan las relaciones masa/carga (m/z) de los diferentes fragmentos obtenidos luego de la ionizacin de la molcula. Sobre las RUGHQDGDV VH JUDFDQ ODV LQWHQVLGDGHV UHODWLYDV GH FDGD IUDJPHQWR REWHQLGR %DMR FRQGLFLRQHV H[SHULPHQWDOHV GHQLGDV HVWDV LQWHQVLGDGHV VRQ SURSRUFLRQDOHV D OD FDQWLGDG GH OD PROpFXOD HQ DQiOLVLV SUHVHQWH en una muestra dada. Fuente: adaptado de The Golm Metabolome databases.

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plantas de cultivo en ambientes extremos) y/o a cambios en la constitucin gentica de los mismos (por ejemplo de plantas transgnicas TXH H[SUHVHQ GLIHUHQFLDOPHQWH XQD SURWHtQD involucrada en sealizacin por azcares) una necesidad bsica es las consideraciones de controles tanto de los materiales per se como de las condiciones en las que las muestras son H[WUDtGDV \ SURFHVDGDV $ VX YH] OD DSOLFDFLyQ GH DOJRULWPRV HVWDGtVWLFRV D ORV GDWRV REWHQLdos requiere la determinacin del grado de variacin dentro de la poblacin de muestras a ser analizadas. $ HIHFWRV H[SOLFDWLYRV HQ HVWH FDStWXOR QRV concentraremos en un ejemplo de muestreo, acondicionamiento y extraccin de muestras de hojas de plantas (de tomate, papa, tabaco o Arabidopsis) en condiciones ambientales controladas (22-24C, 250 mol fotones.m-2.s-1 y 16 h de luz/8 h de oscuridad). El momento del GtD SDUD HO PXHVWUHR GHEH VHU FXLGDGRVDPHQte controlado. Como regla general, la mitad del periodo de luz es el ms indicado debido a que numerosos reportes en la literatura dan cuenta de los ritmos diurnos en los cambios en la composicin metablica de plantas. El otro punto importante a tener en cuenta es el estado fenolgico de las plantas y los rganos a muestrear. La posicin de las hojas en la planta y el rea de las mismas tambin debe ser teQLGR HQ FXHQWD $GHPiV XQD YH] TXH ODV SRUciones de hojas fueron cortadas de la planta, se debe registrar la masa exacta de la muestra y congelarlas inmediatamente. Las muestras deben mantenerse a la temperatura indicada durante todo el proceso de extraccin. Para ello es conveniente enfriar todos los instrumentos necesarios para la toma de muestras, tales como tijeras, pinzas, sacabocados, tubos, etc. Para el ejemplo mencionado, la cantidad de tejido necesario puede variar entre 100-150 mg (peso fresco). La muestra debe ser homogenizada en N2 OtTXLGR ODV HQ]LPDV LQDFWLYDGDV mediante el agregado de metanol y al mismo tiempo deben agregarse estndares internos (en concentraciones conocidas) no presentes en la muestra a analizar. La extraccin se realiza luego calentando la muestra a 70C con agitacin constante. Si bien este protocolo puede aplicarse a la obtencin tanto de la fase polar

como apolar, a los efectos de este ejemplo, los pasos siguientes se concentran en la obtencin de la fase polar. Mediante un paso de H[WUDFFLyQ FRQ FORURIRUPRDJXD ODV DOtFXRWDV GH OD IDVH SRODU VRQ FRQFHQWUDGDV \ OLROL]DGDV para su posterior derivatizacin. Tal como se mencion previamente, la deULYDWL]DFLyQ FRQVLVWH HQ OD PRGLFDFLyQ GH ODV PROpFXODV D Q GH GLVPLQXLU VX SRODULGDG \ SHUmitir la volatilizacin de las mismas. Existen varios mtodos y reactivos derivatizantes. Entre ORV PiV XVDGRV SDUD HVWD DSOLFDFLyQ HO 067)$ 1PHWLO1WULPHWLOVLOLOWULXRURDFHWDPLGD KD GHmostrado ser uno de los ms reactivos en reemplazar los hidrgenos lbiles de un amplio rango de compuestos polares por grupos sililos y el hidroxicloruro de metoxiamina es usado en XQ VHJXQGR SDVR GH GHULYDWL]DFLyQ D Q GH SURWHJHU JUXSRV DOGHKtGRV \ FHWRQDV GH ODV PROpculas presentes en la matriz. /RV H[WUDFWRV DVt SUHSDUDGRV VRQ LQPHGLDtamente inyectados en el cromatgrafo acoplado al espectrmetro de masas. Tanto las condiciones de corrida (tiempo, rampa de temperaturas, frecuencia de captura de datos, HWF FRPR ODV HVSHFLFDFLRQHV GH XMR GH JDV \ FROXPQDV FURPDWRJUiFDV GHEHQ VHU SXHVtas a punto para cada aplicacin particular. En este sentido, en los ltimos aos se dispone de programas de computacin especialmente diseados por los fabricantes de espectrmetros que controlan toda la operacin y posterior SURFHVDPLHQWR GH GDWRV $ VX YH] OD GLVSRQLbilidad de colecciones de espectros de masas en bases de datos de acceso pblico (ver sitios recomendados) permite la rpida evaluacin de los datos adquiridos. Resonancia magntica nuclear. Principios bsicos La resonancia magntica nuclear es un mtodo de anlisis espectroscpico no destrucWLYR TXH VH EDVD HQ OD DEVRUFLyQ GH HQHUJtD en la zona de radiofrecuencia por parte de los ncleos de algunos tomos, en presencia de un campo magntico. La MS es la tcnica ms utilizada en metabolmica. Sin embargo, la tcnica de RMN est ganando terreno en este sector, como una tcnica que brinda informaFLyQ FRPSOHPHQWDULD \D TXH DPSOtD HO UDQJR

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de metabolitos detectados y provee informacin estructural detallada de las molculas SUHVHQWHV 0iV D~Q OD 501 SHUPLWH LGHQWLFDU sustancias previamente no halladas en muestras similares. La RMN explota una propiedad de los ncleos atmicos, el spin nuclear. El spin nuclear posee un momento magntico, es decir que se comporta como un pequeo imn. Normalmente, estos momentos magnticos estn orientados al azar y WLHQHQ OD PLVPD HQHUJtD JXUD   6L VH DSOLFD XQ FDPSR PDJQpWLFR MR %0) con una dada direccin, estos momentos magnticos quedarn alineados a favor o en contra del campo magntico externo JXUD   6HJ~Q VX RULHQWDFLyQ FRQ UHVSHFWR DO campo Bo, los ncleos tendrn ahora distinta enerJtD /D GLIHUHQFLD GH HQHUJtD ( HQWUH HVWRV GRV niveles est en el orden de las ondas de radio, es decir con frecuencias de MHz. Si ahora aplicamos al sistema orientado la frecuencia correspondienWH D HVD ( 0), se inducir una transicin entre

estos niveles, que es el fenmeno de Resonancia JXUD   /D IUHFXHQFLD GH DEVRUFLyQ 0 depende del campo aplicado (B0  HO FXDO HVWi MR SDUD FDGD HTXLSR \ OD FRQVWDQWH JLURPDJQpWLFD QXFOHDU TXH HV FDUDFWHUtVWLFD GH FDGD Q~FOHR JXUD   (V GHFLU TXH cada ncleo tendr una frecuencia de absorcin FDUDFWHUtVWLFD (V LPSRUWDQWH WHQHU HQ FXHQWD TXH como se trata de una propiedad del ncleo atmiFR GDGR XQ HOHPHQWR TXtPLFR ORV GLVWLQWRV LVyWRpos del mismo presentarn distintas propiedades PDJQpWLFDV $OJXQRV LVyWRSRV GHSHQGLHQGR GH VX composicin) pueden carecer de spin, y por lo tanto no sern activos en RMN y este es el caso de 12 C, 16O y 326 3RU VLPSOLFLGDG HQ HVWH FDStWXOR VH considerarn slo los ncleos con spin , que son los de inters biolgico. Dentro de los ncleos de spin se encuentran los ncleos de 1H, 13C, 15N y 31 P, que pueden ser estudiados por RMN. Cada ncleo posee una sensibilidad determinada, que est determinada por su constante giromagntica. El or-

Figura 3. (VTXHPD HQ GRQGH VH PXHVWUD ORV QLYHOHV GH HQHUJtD GH ORV Q~FOHRV HQ SUHVHQFLD R DXVHQFLD GH un campo magntico externo (B0 \ ODV WUDQVLFLRQHV GH ORV Q~FOHRV HQWUH XQ QLYHO GH HQHUJtD \ RWUR VXSHULRU al absorber una frecuencia (X0) FRUUHVSRQGLHQWH D OD GLIHUHQFLD GH HQHUJtD ( 

150 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

den de sensibilidad de estos ncleos es: 1H > 31P > 13 C > 15N. La deteccin de 1H o 31P, adems de su alta sensibilidad, est favorecida por la alta abundancia natural de estos istopos (99,9% y 100%, respectivamente). En cambio, los istopos de 13C y 15N poseen una abundancia de 1,1% y 0,4%, lo FXDO GLFXOWD PiV D~Q VX GHWHFFLyQ (VWH LQFRQYHniente se puede sortear enriqueciendo la muestra con el istopo activo de inters. Cabe destacar que ninguno de estos istopos es radioactivo, lo que facilita la manipulacin de las muestras. Todos los elementos con istopos magnticos detectables por la tcnica RMN pueden ser usados SDUD LGHQWLFDU PHWDEROLWRV HQ WHMLGRV GH SODQWDV \ sus extractos. El 1H es el istopo magntico ms XWLOL]DGR GHELGR D VX DOWD VHQVLELOLGDG LQWUtQVHFD \ VX DEXQGDQFLD QDWXUDO /D FRQFHQWUDFLyQ OtPLWH para poder detectar un metabolito por RMN de 1H en un extracto es alrededor de 10 M. Para una muestra dada, la sensibilidad aumenta con el campo magntico del instrumento utilizado. Los metabolitos fosforilados pueden ser idenWLFDGRV \ FXDQWLFDGRV SRU 501 XWLOL]DQGR HO istopo magntico 31P. De esta manera se pueden estudiar un nmero pequeo de molculas abundantes y de gran importancia metablica

como es el fosfato inorgnico, nuclesidos trifosfatos, fosfomonosteres, etc. Desplazamiento qumico La frecuencia de absorcin de cada ncleo GHSHQGH GH VX FRQVWDQWH JLURPDJQpWLFD D XQ campo dado. Por ejemplo, a un campo de 9,4 T, los 1H absorben a 400 MHz, los 13C a 100,6 MHz y los 15N a 40 MHz. Sin embargo, no todos los 1 H ni todos los 13C absorben a la misma frecuencia. La frecuencia de absorcin de cada protn depende de la ubicacin del ncleo en las molFXODV HV GHFLU GH VX DPELHQWH TXtPLFR /DV GLVtintas posiciones de los ncleos en un espectro VH FXDQWLFDQ FRQ XQ SDUiPHWUR OODPDGR desplazamiento qumico  FX\R YDORU QR VyOR LQIRUPD la frecuencia precisa de absorcin, sino que nos permite distinguir el tipo de protn (por ejemplo DOLIiWLFR DURPiWLFR DPtGLFR HWF  /D LQWHQVLGDG de una seal de resonancia, o sea el rea bajo cada pico, es proporcional al nmero de ncleos GH HVH WLSR JXUD   Espectrmetro de RMN Cada equipo de RMN trabaja a un camSR PDJQpWLFR MR (Q JHQHUDO HV FRQYHQLHQWH

Figura 4. Dependencia ubicacin del ncleo en las molculas y su frecuencia de absorcin.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 151

trabajar con un campo magntico alto porque esto trae aparejado una mayor sensibilidad y resolucin. Cada equipo se suele denominar no por la magnitud del campo (por ejemplo, 16 Tesla), sino por la frecuencia de absorcin del 1 H a ese campo (para el caso mencionado, 600 0+]  /D PD\RUtD GH ORV DQiOLVLV PHWDEyOLFRV se realizan con instrumentos que operan en el rango de 300 a 900 MHz para 1H. El campo magntico est generado por +HOLR OtTXLGR D EDMDV WHPSHUDWXUDV  .  TXH es superconductor, y se encuentra en un termo que rodea la muestra, que constituye el imn o magneto. Los pulsos de excitacin de radiofrecuencia se generan mediante bobinas que estn alrededor del tubo donde se encuentra la muestra, complementadas con un conjunto de bobinas que permiten la deteccin de la seal resultante. Preparacin de las muestras Se pueden obtener espectros de RMN a partir de una amplia variedad de materiales: extractos vegetales (por ejemplo: jugo de tomate), suspensiones celulares e inclusive plntulas intactas. En el caso de realizar RMN de 1H, es conYHQLHQWH OLROL]DU ODV PXHVWUDV SDUD HOLPLQDU HO DJXD (VWR VH UHDOL]D FRQ HO Q GH UHGXFLU OD seal correspondiente al solvente, que (por su DOWD LQWHQVLGDG GLFXOWD OD GHWHFFLyQ GH VHxDles de los metabolitos. Luego se resuspende OD PXHVWUD OLROL]DGD HQ DJXD GHXWHUDGD '2O). La adicin de D2O a la muestra har que no se puedan detectar las seales de protones intercambiables con el solvente, como los de grupos amida o alcohol. En caso de que sea necesario SRGHU LGHQWLFDU ORV PLVPRV GHEHQ UHDOL]DUse experimentos que permitan la eliminacin selectiva de la seal del solvente. En caso de que se deseen extraer algunos componentes HVSHFtFRV WDPELpQ SXHGHQ XWLOL]DUVH VROYHQtes orgnicos, de preferencia deuterados (que se venden comercialmente). Conviene utilizar VROYHQWHV TXtPLFDPHQWH LQHUWHV \ YROiWLOHV OR que permite eliminar el solvente en caso de que la muestra deba ser analizada por otra tcnica. Esto es posible debido a que la tcnica de RMN es no destructiva. Las muestras se colocan en tubos de vidrio borosilicato puro y el

volumen de extracto utilizado es dependiente GHO HQVD\R SHUR YDUtD HQWUH  \  O Utilizacin de la tcnica RMN en metabolmica ,GHQWLFDFLyQ \ FXDQWLFDFLyQ GH PHtabolitos en tejidos vegetales: ventajas y desventajas Existen diversas ventajas de la tcnica de 501 SDUD HO DQiOLVLV GH SHUOHV PHWDEyOLFRV Las mayores ventajas con respecto a otras tcnicas son: (1) no se requiere tratamiento previo de la muestras (pudindose utilizar extractos crudos); (2) es un mtodo no destructivo, lo cual permite el anlisis subsiguiente de la muestra con otros mtodos; (3) se puede obtener informacin sobre una amplia variedad de metabolitos en un nico experimento; (4) no existen restricciones en cuanto a la volatilidad, polaridad de los compuestos, o la presencia GH GHWHUPLQDGRV FURPyIRURV TXH LQWHUHUDQ \ (5) la tcnica puede ser aplicada con escaso conocimiento previo de la composicin de la muestra. Otra gran ventaja de sta tcnica para el anlisis cualitativo de metabolitos es que no requiere del conocimiento de ningn parmeWUR HTXLYDOHQWH D ORV FRHFLHQWHV GH H[WLQFLyQ QHFHVDULRV SDUD FXDQWLFDU PXHVWUDV PHGLDQWH tcnicas espectrofotomtricas. Esto se debe a que la magnitud de la seal de resonancia de un istopo es directamente proporcional al nmero de ncleos que contribuyen a dicha seal. Lo anterior implica que, por una parte, no se requieren curvas de calibracin para efectuar el anlisis cuantitativo, y por otro lado no es necesario conocer el espectro de un compuesto puro ya que por lo general basta con LGHQWLFDU VHxDOHV GHELGDV D XQD SRUFLyQ GDGD de la molcula para obtener la informacin deseada. La informacin cuantitativa se obtiene a partir del rea integrada bajo la curva. Ejemplo 1: caracterizacin de extractos de frutos de tomate /D )LJXUD $ PXHVWUD XQ HVSHFWUR GH 501 de 1H en una muestra de jugo de tomate. En la regin de campo alto (3,1-0,3 ppm) del espectro de protones contiene la resonancia de los grupos alifticos de los aminocidos y ci-

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dos orgnicos pertenecientes al metabolismo GH ORV iFLGRV WULFDUER[tOLFRV (Q SDUWLFXODU ODV seales provenientes de treonina, alanina, gluWDPDWR JOXWDPLQD *$%$ DVSDUWDWR FLWUDWR \ PDODWR IXHURQ LGHQWLFDGDV FODUDPHQWH /DV UHsonancias encontradas en la regin del espectro de campo intermedio (desde 3,2 a 5,3 ppm) FRUUHVSRQGHQ HQ VX PD\RUtD D VDFiULGRV GH los cuales D-glucosa y D-fructosa son los componentes principales. En la regin de campo bajo (5,5-9,4 ppm) del espectro se encuentran las seales correspondientes a aminocidos aromticos y compuestos fenlicos. Debido a la baja intensidad de la seal, las asignaciones se realizaron parcialmente. Estos resultados muestran que la tcnica RMN puede ser una herramienta til para ser usada en la caracterizacin de tomates. La principal desventaja de la tcnica de RMN es su baja sensibilidad. El advenimiento de instrumentos de RMN de alto campo, de tcnicas especiales de deteccin y el diseo de criosondas (de mucha mayor sensibilidad) ha mejorado este aspecto. De todas formas, rara vez se usa RMN para el anlisis de un componente que se encuentra en trazas. Generalmente, el problema de la baja relacin seal-a-ruido en los espectros de RMN (que sucede principalmente con istopos poco abundantes) puede ser superado haciendo varios espectros de manera automtica, y sumndolos. Esto redunda en mayor tiempo de adquisicin del experimento. Sin embargo, si se tiene en cuenta que cada experimento permite seguir muchos metabolitos a la vez, este aspecto negativo se ve compensado. La tcnica de RMN aplicada a heteroncleos (tales como 13C, 15N o 31P) es til debido al hecho de que estos ncleos presentan una gran dispersin en sus seales, dado que el rango GH GHVSOD]DPLHQWRV TXtPLFRV GH ORV PLVPRV es mayor que el de 1H. En el caso particular de 13 C o 15N, como ya se mencion, los ncleos son menos sensibles y abundantes, por lo cual es conveniente realizar una marca isotpica. Generalmente, se utiliza la estrategia de marcado isotpico selectivo (no uniforme) para el DQiOLVLV GH XMRV PHWDEyOLFRV PiV TXH SDUD UHDOL]DU SHUOHV PHWDEyOLFRV Otra de las desventajas de la tcnica es el solapamiento de las seales obtenidas en 1H

501 $ Q GH PLQLPL]DU HVWR VH SXHGH FRPELnar esta tcnica con una de separacin cromaWRJUiFD GH PDQHUD TXH HO H[WUDFWR VH IUDFFLRne, disminuyendo la complejidad de la muestra y por ende del espectro de RMN. Esto es anlogo a lo que se realiza cuando se acopla OD FURPDWRJUDItD JDVHRVD D XQ HVSHFWUyPHWUR de masa. La segunda opcin para incrementar la resolucin espectral es adquirir espectros bidimensionales, distribuyendo las seales a lo largo de dos ejes de frecuencia. Estos mtodos bidimensionales pueden adems utilizarse para incrementar la sensibilidad de istopos menos abundantes como 13C, y establecen conexiones entre las seales de 1H y 13C lo cual HV ~WLO SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH ORV PHWDEROLWRV

Figura 5. 3HUO PHWDEyOLFR FRUUHVSRQGLHQWH D XQD PXHVWUD GH MXJR GH WRPDWH $ HVSHFWUR GH 1H RMN en una dimensin y (B) en dos dimensiones (COSY) de la zona de azcares y alifticos

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 153

La gran cantidad de informacin que se puede extraer de estos espectros bidimensionales compensa el hecho del mayor tiempo que lleva realizarlos. Estos experimentos explotan las interacciones entre los distintos istopos detectables por RMN en una molcula y resultan en lo que se denomina correlacin homonuclear, donde los dos ejes de frecuencia corresponden al mismo ncleo, por lo general 1 H, o correlacin heteronuclear en donde uno de los ejes de frecuencia corresponde al 1H y el otro a 13C, 15N y menos frecuentemente 31P. Los experimentos de correlacin homonuclear VRQ SDUWLFXODUPHQWH ~WLOHV SDUD UHDOL]DU SHUOHV metablicos, permitiendo que subgrupos de picos que se encuentran juntos en el espectro GH XQD GLPHQVLyQ SXHGDQ VHU LGHQWLFDGRV \ asignados a compuestos particulares. La correlacin heteronuclear tambin es til cuando los extractos derivan de tejidos que han sido marcados con 13C o 15N. Con el objeto de realizar una asignacin completa de las seales resonantes a comSXHVWRV HVSHFtFRV SUHVHQWHV HQ HO MXJR GH tomate, se realizaron diversos experimentos de RMN bidimensionales. La Figura 5B corresponde a un COSY de la zona de azcares y alifticos. Usando la informacin de conectividad y aprovechando la mayor separacin de las seales en la dimensin adicional, muchas de las seales fueron asignadas sin ambigedad. En los casos en donde la asignacin fue dudosa, se adicionaron los compuestos puros DO H[WUDFWR SDUD FRUURERUDU DVt OD LGHQWLGDG GHO metabolito analizado. Se utilizaron las tablas GH GHVSOD]DPLHQWRV TXtPLFRV H[LVWHQWHV HQ OD OLWHUDWXUD FRPR JXtD SDUD DVLJQDU FRUUHFWDPHQte las seales. Ejemplo 2: caracterizacin de plantas transgnicas El desarrollo de tcnicas para la generacin de plantas transgnicas ha revolucionado el iUHD GH OD ELRORJtD GH SODQWDV (VWDV SODQWDV transgnicas pueden tener perturbaciones en las rutas metablicas debido a la introduccin del transgen en el genoma de la planta. La tcnica de RMN permite tener un pantallazo general del estado metablico de las plantas lo FXDO HV GH VXPD XWLOLGDG SDUD JHQHUDU OtQHDV

GH SODQWDV TXH SRVHDQ HVSHFtFDPHQWH DOJXna ruta metablica alterada. Un ejemplo de esto es el anlisis de plantas de tabaco que SURGXFHQ FRQVWLWXWLYDPHQWH HO iFLGR VDOLFtOLFR las cuales son ms resistentes a infecciones. /RV SHUOHV PHWDEyOLFRV TXH VH REWXYLHURQ SRU RMN mostraron que las plantas transgnicas WHQtDQ DOWHUDGRV ORV QLYHOHV GH GLVWLQWRV FRPSXHVWRV FRPR DYRQRLGHV D]~FDUHV DPLQRicidos, etc. Este ejemplo muestra claramente la potencialidad de utilizar la tcnica de RMN para estudiar cambios metablicos. 2-Mapas de distribucin espacial de metabolitos en tejidos vegetales La tcnica 1H RMN puede ser utilizada in vivo para obtener informacin acerca de la distribucin espacial de un nmero limitado de metabolitos. Este mtodo se utiliza generalmente para el H2O ya que es la seal ms fuerte detectada in vivo. Las imgenes brindan informaFLyQ DFHUFD GH OD DQDWRPtD GHO WHMLGR \ HO PRYLmiento del H2O dentro del mismo. Tambin se puede obtener informacin acerca de la distribucin espacial de ciertos metabolitos menos abundantes que el H2O como ser aminocidos y carbohidratos. Debido a que es una tcnica no destructiva y no invasiva, se pueden monitorear cambios temporales en ciertos metabolitos. Es posible a partir de la misma muestra grabar una serie de espectros in vivo y luego analizar en el tiempo cmo es la respuesta meWDEyOLFD IUHQWH D FDPELRV HQ HO HVWDGR VLROyJLco del tejido vegetal. RMN versus MS /D HVSHFWURPHWUtD GH PDVD DFRSODGD D FURPDWRJUDItD JDVHRVD *&06 HV OD WpFQLFD ms utilizada en metabolmica. Sin embargo, la tcnica de RMN est siendo utilizada como una tcnica que brinda informacin complementaria a la que se obtiene con GC-MS. La sensibilidad es tal vez el requisito ms imSRUWDQWH TXH GHEH FXPSOLU XQD WpFQLFD DQDOtWLFD para ser utilizada en metabolmica, ya que una alta sensibilidad favorece el anlisis rpido de una fraccin mayor del metaboloma. La tcnica 1 + 501  TXH WLHQH XQ OtPLWH GH GHWHFFLyQ GH 5 nmoles, es varios rdenes de magnitud meQRV VHQVLEOH TXH OD WpFQLFD *&06 FX\R OtPLWH

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de deteccin es de 10-12 mol. Esta diferencia se incrementa an ms si se tiene en cuenta la tcnica de RMN con otros istopos menos abundantes. Se estima que con la tcnica de GC-MS se SXHGH LGHQWLFDU PHQRV GHO  GH ORV PHWDERlitos de una clula vegetal si bien todo el metaboloma es potencialmente detectable. Este argumento ignora cualquier diferencia que pudieVH H[LVWLU HQ OD HFLHQFLD GH H[WUDFFLyQ \ GHULYDWL]DFLyQ GH PHWDEROLWRV FX\DV FDUDFWHUtVWLFDV son muy diversas. Otro obstculo que impide un anlisis completo tanto en RMN como en *&06 HV OD GLFXOWDG GH GHWHFWDU FRPSRQHQtes minoritarios en presencia de seales ms intensas. ([LVWHQ RWURV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ OD eleccin de una tcnica o la otra. Uno de ellos es el procesamiento de las muestras. Como se HMHPSOLFR PDV DUULED HQ HO FDVR GH *&06 es necesario realizar una extraccin con solventes y adems derivatizar los compuestos por lo que la preparacin de las muestras es ms laboriosa y adems es ms probable que en la muestra no estn representados todos los metabolitos que existen en el tejido de parWLGD (VWH QR VHUtD HO FDVR GH ODV PXHVWUDV TXH son analizadas por RMN, en donde se pueden obtener espectros a partir de una amplia variedad de materiales sin necesidad de realizar extracciones con solventes. La tcnica de RMN tiene una ventaja para el anlisis cuantitativo y es el hecho de que los espectrmetros modernos son muy estables en comparacin con los GC-MS en donde es necesario realizar calibraciones frecuentes y la variabilidad en los tiempos de retencin pueGHQ FRPSOLFDU VLJQLFDWLYDPHQWH HO DQiOLVLV FXDQWLWDWLYR $PEDV WpFQLFDV JHQHUDQ XVXDOmente mltiples seales lo cual es una ventaja SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH PHWDEROLWRV SHUR D OD vez representa una desventaja en trminos de complejidad espectral. Sin embargo, en MS, algunas de estas multiplicidades se deben al fraccionamiento de la molcula ionizada, complicando el anlisis cuantitativo. En cambio, para el caso de RMN, las seales mltiples provienen de la misma molcula, lo cual perPLWH XQD YHULFDFLyQ FUX]DGD GH ORV GDWRV GH FXDQWLFDFLyQ GH ORV PHWDEROLWRV

Resumiendo, una comparacin entre RMN y GC-MS muestra que esta ltima tcnica es ms sensible aunque el procesamiento de las PXHVWUDV HV PiV ODERULRVR \ OD HFLHQFLD GH H[WUDFFLyQ \ GHULYDWL]DFLyQ QR VHUtD KRPRJHnea para todos los metabolitos. Por otro lado, la facilidad con la que se generan los especWURV \ VH FXDQWLFDQ ORV PHWDEROLWRV \ OD LQIRUmacin complementaria (como ser estructural) que suministra hacen de la tcnica RMN una herramienta de gran utilidad para los estudios metabolmicos. Lectura y sitios recomendados
)LHKQ 2 0HWDERORPLFV WKH OLQN EHWZHHQ JHQRtypes and phenotypes. Plant Molecular Biology 48:155-171 .|FNHQEHUJHU : 1XFOHDU PDJQHWLF UHVRQDQFH PLcro-imaging in the investigation of plant cell metabolism. Journal of Experimental Botany. 2001, 52(356): 641-656. .ULVKQDQ 3 .UXJHU 1- \ 5DWFOLIIH 5* 0HWDEROLWH QJHUSULQWLQJ DQG SUROLQJ LQ SODQWV XVLQJ 105 Journal of Experimental Botany. 2005, 56(410): 255-265. /LVHF - 6FKDXHU 1 .RSND - :LOOPLW]HU / \ )HUQLH $5 *DV FKURPDWRJUDSK\ PDVV VSHFWURPHWU\ EDVHG PHWDEROLWH SUROLQJ LQ SODQWV 1DWXUH SURtocol. 2006, 1(1): 387-396. Ratcliffe RG y Hill YS. Probing plant metabolism ZLWK 105 $QQX 5HY 3ODQW 3K\VLRO 3ODQW 0RO Biol. 2001, 52: 499-526. 6LOYHUVWHLQ 50 \ :HEVWHU ); 3URWRQ PDJQHWLF UHVRQDQFH VSHFWURPHWU\ (Q 6SHFWURPHWULF LGHQWLcation of organics compounds, 1998, 6 edicin, :LOH\ 6RQV 6REROHY $3 6HJUH $ /DPDQQD 5 3URWRQ KLJKHOG NMR study of tomato juice. Magnetic Resonance in Chemistry, 2003, 41: 237-245. 9HUSRRUWH 5 &KRL <+ .LP +. 105EDVHG PHWDERORPLFV DW ZRUN LQ SK\WRFKHPLVWU\ 3K\WRFKHP Rev. 2007, 6:314. :HFNZHUWK : 0HWDERORPLFV 0HWKRGV DQG 3URWRcols. Methods in Molecular Biology Series 358. Humana Press 2007. ZZZPHWDERORPLFVVRFLHW\RUJ 6RFLHGDG GH 0HWDbolmica). Z Z Z V S U L Q J H U R Q O L Q H  F R P  V J Z  F G D  I U R Q W S D ge/0,11855,5-40109-70-34409863-0,00.html (SiWLR ZHE GH OD UHYLVWD FLHQWtFD 0HWDERORPLFV UHYLVWD RFLDO GH OD OD 6RFLHGDG GH 0HWDEROyPLFD  ZZZPHWDERORPLFVQUSRUJXN 1RUZLFK 5HVHDUFK Park Metabolomics and plants).

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 155

ZZZPHWDERORPLFVEEVUFDFXN 5RWKDPVWHG 7KH National Centre for Plant and Microbial Metabolomics). http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/gmd. html (Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology / The Golm Metabolome databases consortium). ZZZQREOHRUJ 1REOH )RXQGDWLRQ  3ODQW %LRORJ\  The Sumner group). ZZZLQIRPHWUL[FRP 'LYHUVRV SDTXHWHV LQIRUPiWLFRV SDUD DOLQHDPLHQWR GH GDWRV FURPDWRJUicos y espectroscpicos y anlisis multivariados: 3&$ 6,0&$ HWF 

ZZZPHWDOLJQQO 6RIWZDUH SDUD SUHWUDWDPLHQWR suavizado, estimacin del ruido, correccin de la OtQHD EDVH DOLQHDPLHQWR HWF GH GDWRV GH *& \ LC) http://metacyc.org (La base de datos MetaCyc incluye informacin sobre las rutas metablicas, sustratos, reacciones, enzimas, etc de ms de 150 organismos diferentes).

156 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

I CAPTULO 11 Metagenmica
2 0DULR $JXLODU1 y Daniel H. Grasso2 Introduccin (QFDUDPRV HVWH FDStWXOR UHFRQRFLHQGR HO protagonismo de los microorganismos en la vida de nuestro planeta, desde su origen ms remoto. Tenemos el caso de nuestra atmsIHUD ULFD HQ R[tJHQR UHVXOWDQWH GH OD DFWLYLdad fotosinttica de los primeros organismos microbianos, y an hoy los microorganismos aportan la mayor capacidad fotosinttica del planeta. Cada proceso en la bisfera hace uso de la casi ilimitada potencialidad de los microorganismos para transformar el medio que los rodea. El resto de los organismos vivos dependemos en gran parte de ellos gracias a su capacidad de transformar compuestos en nutrientes asimilables, accesibles y requeridos para nuestra forma de vida. En este sentido mencionemos los siguientes ejemplos: La capacidad de transformar el nitrgeno molecular atmosfrico en una forma asimilable por las diferentes formas de vida se encuentra restringida a los microorganismos. Miles de millones de microbios benignos que habitan el intestino nos ayudan a digerir los alimentos, degradar potenciales toxinas y combatir otros microorgaQLVPRV SDWyJHQRV 7DPELpQ QRV EHQHFLDPRV de aquellos microorganismos que son capaces de mantener el medio ambiente libre de contaminantes y xenobiticos. La capacidad de adaptacin de los procariotas, que les permite prosperar y poblar cada ambiente, an aquellos de condiciones extremas tales como los respiraderos hidrotermales del fondo del ocano y los drenajes cidos GH ODV PLQDV \ HXHQWHV LQGXVWULDOHV HV FRQsecuencia de su gran diversidad metablica \ VLROyJLFD $GHPiV GH VX LPSRUWDQFLD GHELdo a su rol esencial en la bisfera, los microorganismos han sido objeto del desarrollo de QXPHURVDV WHFQRORJtDV TXH KDQ FRQWULEXLGR D mejorar la calidad de vida. Son empleados inGXVWULDOPHQWH SDUD SURGXFLU OD PD\RUtD GH ORV DQWLELyWLFRV \ PXFKDV RWUDV GURJDV GH XVR FOtQLco, tambin como agentes de remediacin de

suelos y agua, mejoramiento de la produccin DJUtFROD SURGXFFLyQ GH ELRFRPEXVWLEOHV IHUmentar alimentos para el hombre, etc. $OUHGHGRU GH OD GpFDGD GH  ORV PLFURbilogos disfrutaban la percepcin de haber logrado un conocimiento satisfactorio de los miFURRUJDQLVPRV GHO VXHOR $Vt HQ HO DxR  HO PLFURELyORJR :DNVPDQ TXLHQ FRQWULEX\y VLJQLFDWLYDPHQWH DO FRQRFLPLHQWR GH PLFURRUJDQLVmos del suelo productores de antibiticos, conFOXtD GLVSRQHPRV GH XQD EXHQD LQIRUPDcin que nos da un panorama claro del mundo PLFURVFySLFR GHO VXHOR 6LQ HPEDUJR RWURV investigadores con iniciativas aisladas y disSHUVDV SHUVLVWtDQ HQ VX DIiQ SRU GHPRVWUDU OD existencia de otras poblaciones microbianas ignoradas, recogiendo evidencias experimentales que cuestionaban esa aparente tranquiOLGDG FLHQWtFD (Q  6WDOH\ \ .RQRSND D partir de la revisin de los datos relacionados a la capacidad de cultivo de microorganismos de muestras ambientales, concluyen en la llamaGD JUDQ DQRPDOtD GHO FRQWHR HQ SODFD (VWD DQRPDOtD HV OD GLVFUHSDQFLD HQWUH ORV YDORUHV de recuento de clulas obtenidos mediante miFURVFRStD \ ORV YDORUHV GH UHFXHQWRV HQ SODFD La conclusin latente, de un conocimiento limitado de los microorganismos del suelo, restringida esencialmente a aquellos que los microELyORJRV KDEtDQ VLGR FDSDFHV GH FXOWLYDU in vitro en sus laboratorios, ha sido tanto abundante como slidamente documentada durante la ltima dcada. El concepto de organismo viable pero no cultivable se hizo evidente con Vibrio cholerae, el cual es viable y virulento cuando se DtVOD GH XQ PHGLR DFXiWLFR SHUR FUHFH HQ FXOWLvo hasta despus de su pasaje por el intestino humano o de ratn. Este tipo de evidencias comenzaron a redirigir la atencin hacia el mundo de los organismos no cultivables, entre las cuales destacamos dos descubrimientos que han tenido una gran relevancia en esta rea. En el primero de ellos se describi mediante curvas GH UHDVRFLDFLyQ '1$'1$ OD GLYHUVLGDG GH ODV bacterias del suelo, encontrndose que era al menos 100 veces mayor que la que puede ser estimada mediante tcnicas dependientes de cultivo. El segundo descubrimiento fue la demostracin de Helicobacter pylori como agente etiolgico de lceras y cncer gstrico. Pese a

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que hace ms de un siglo que esta bacteria ha sido observada en la mucosa gstrica, hasta que no fue cultivada no se acept su rol en la enfermedad. /D HFRORJtD PLFURELDQD KD H[SHULPHQWDdo una gran transformacin en los ltimos 25 DxRV GHELGR D OD LQWURGXFFLyQ GH OD ORJHQptica, revolucionando la forma de ver a los microorganismos. El primer hito fue el trabajo de &DUO :RHVH TXLHQ SURSXVR D ORV JHQHV U$51 FRPR FURQyPHWURV HYROXWLYRV :RHVH   Posteriormente, Pace y colaboradores utilizaron el anlisis de las secuencias de 5S y 16S U$51 SDUD GHVFULELU OD GLYHUVLGDG GH ORV PLFURorganismos (cultivables y no cultivables) presentes en muestras ambientales (Pace, 1997). Estos primeros trabajos se realizaron secuenFLDQGR GLUHFWDPHQWH HO $51 R VXV UHVSHFWLYDV FRSLDV GH F$'1 (O GHVDUUROOR GH OD WHFQRORJtD GH 3&5 \ HO GLVHxR GH ORV FHEDGRUHV TXH SHUPLWHQ DPSOLFDU HO JHQ FRPSOHWR SHUPLWLy un acceso mayor a este procedimiento por una FRPXQLGDG FLHQWtFD PiV DPSOLD \ D XQD PD\RU diversidad de nichos ecolgicos. La aplicacin GH OD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 GH ORV JHQHV 6 U$51 D SDUWLU GHO $'1 WRWDO GH XQD FRPXQLGDG seguido del clonado y secuenciacin, ha geneUDGR XQD JUDQ FDQWLGDG GH GDWRV \ KD UHGHQLGR la diversidad procariota. Si la muestra ambiental contiene varios tipos diferentes de organismos, se espera entonces encontrar diferentes VHFXHQFLDV GH U$51 FX\D GLYHUVLGDG VHUi XQD medida de la complejidad de la comunidad y HQ HO FRQWH[WR GH XQ iUERO ORJHQpWLFR QRV GLUi quienes son sus miembros. Se ha empleado SDUD FDUDFWHUL]DU HO SHUO SREODFLRQDO GH GLYHUVRV DPELHQWHV QDWXUDOHV $Vt PHGLDQWH HVWH tipo de anlisis se ha demostrado que el suelo es el hbitat de la Tierra ms rico en diversidad procariota, an cuando los mtodos basados en el cultivo in vitro QR SRQHQ GH PDQLHVWR HVD alta diversidad. (O DGYHQLPLHQWR GH QXHYDV WHFQRORJtDV \ procedimientos de anlisis de muestras amELHQWDOHV PHWRGRORJtDV LQGHSHQGLHQWHV GHO cultivo de los microorganismos, con potencialidades distintas para revelar componentes de la comunidad microbiana, impuls un nuevo enfoque de estudio ampliando los horizontes del conocimiento. Se ha denominado con el

trmino metagenmica al anlisis del genoma de comunidades independientemente de las tareas de aislamiento y cultivacin. El conjunto de mtodos desarrollados para acceder al coQRFLPLHQWR VLROyJLFR \ JHQpWLFR GH FRPXQLGDGHV FRPSUHQGH OD H[WUDFFLyQ GLUHFWD GH $'1 de muestras ambientales, clonado de fragmenWRV GH $'1 HQ JHQHUDO R UHVXOWDQWH GH OD DPSOLFDFLyQ GH VHFXHQFLDV GHO JHQ 6 U51$ R genes asociados a funciones tales como metabolismo nitrogenado, antibiosis, etc. (Figura 1). El avance y los logros ya alcanzadas por la metagenmica estn asociados al desarrollo de capacidades tcnicas de secuenciacin de

Figura 1. Bibliotecas metagenmicas. Esquema del proceso de obtencin y anlisis de bibliotecas consWUXLGDV FRQ $'1 H[WUDtGR GLUHFWDPHQWH GH PXHVWUDV ambientales.

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$'1 FRQ DOWD HFLHQFLD GH JHQHUDFLyQ GH GDWRV primarios y a la bioinformtica que ha desarrollado herramientas tiles para el procesamiento y anlisis de datos. Los microbilogos encontraron la oportunidad para dirigir sus esfuerzos a una descripFLyQ DPSOLD GH OD GLYHUVLGDG ORJHQpWLFD GH DPbientes comunes y exticos tales como aguas RFHiQLFDV GH VXSHUFLH \ SURIXQGLGDG UXPHQ GH DQLPDOHV VXSHUFLH GH UHGHV \ FDxHUtDV GH agua, aguas termales surgentes y suelo. Ms all de permitirles realizar una descripcin de la comunidad microbiana, con un nivel de resolucin taxonmico preciso, promovi la aceptacin y difusin del concepto ecolgico de consorcio microbiano para lo cual el estudio de microorganismos aislados y cultivados in vitro UHVXOWD LQVXFLHQWH SDUD H[SOLFDU OD IXQFLRQDOLdad y dinmica poblacional. Mirar ms all de los microorganismos que se pueden aislar, alcanzando al metagonoma permitir responder no slo la pegunta cules son los componentes de una determinada comunidad sino an ms importante qu hacen R VHUtDQ FDSDFHV GH KDFHU (Q HO GHVDUUROOR GH HVWH FDStWXOR VH GHVFULELrn las potencialidades de la metagenmica en general, haciendo nfasis en el suelo. El suelo: Un hbitat complejo El suelo constituye un soporte para la vida IRUPDGR SRU SDUWtFXODV PLQHUDOHV GH GLIHUHQWHV IRUPDV WDPDxRV \ FRPSRVLFLyQ TXtPLFD compuestos orgnicos en distintas etapas de degradacin, e inmersos en este medio enconWUDPRV D OD ELRWD $ QLYHO PDFURVFySLFR VH GHtectan complejos de arcilla, materia orgnica, SDUWtFXODV GH DUHQD WRGR HQ VX FRQMXQWR IRUmando agregados que constituyen una matriz. Los procariotes son los componentes predominantes de la biomasa del suelo, los cuales se HQFXHQWUDQ DGKHULGRV R DGVRUELGRV D ODV SDUWtculas del suelo. Dada la heterogeneidad de la matriz del suelo, los microorganismos pueden FRQVWLWXLU PLFURDPELHQWHV VREUH OD VXSHUFLH y en los poros que se forman. La persistencia y el metabolismo de los microorganismos del suelo dependen de la disponibilidad de agua y nutrientes. El suelo es un ambiente que experimenta cambios drsticos en sus niveles

de humedad, pasando desde una saturacin por persistentes lluvias o defectos de drenaje KDVWD SHUtRGRV GH DULGH] (VWR VXJLHUH TXH OD composicin de la comunidad microbiana experimenta ajustes peridicos en respuesta a esos cambios ambientales, aunque se ignora la manera cuali y cuantitativa del impacto de esos efectores. El suelo es un reservorio muy importante de carbono, y son los microorganismos quienes desempean roles protagnicos en el reciclado GHO FDUERQR $VLPLVPR IXQFLRQHV LPSRUWDQWHV tales como la captacin del nitrgeno molecular, la movilizacin de fsforo inorgnico, y la formacin de nitratos residen en actividades microbianas, los cuales impactan en la fertilidad de los suelos (Daniel, 2005). 7HQLHQGR HQ FXHQWD OD FRPSOHMLGDG VLFRTXtPLFD GHO VXHOR \ OD GLYHUVLGDG GH IXQFLRQHV que transcurren en el mismo, es posible imaginar al suelo como un cuerpo orgnico con capacidades metablicas asociadas a poblaciones microbianas diversas, que su vez se FRPSOHPHQWDQ HQWUH Vt HQ IRUPD VHPHMDQWH D lo encontrado entre los rganos de un cuerpo. Coincidentemente con este paralelismo, se ha renovado el enfoque del estudio de los genomas dirigido a la consideracin global de las interacciones mutuas y la coordinacin de la complejidad del sistema, que se lo conoce FRPR ELRORJtD GH VLVWHPDV V\VWHP ELRORJ\  $FWXDOPHQWH HO HVWXGLR GHO WDPDxR \ OD GLYHUsidad de las comunidades del suelo, es un deVDItR SDUD ORV PLFURELyORJRV GH VXHOR TXH VH proyecta en aspectos aplicados tales como la fertilidad de los suelos y su sustentabilidad. Se ha estimado que un gramo de suelo contiene aproximadamente 4 x 107 clulas procariotas. El estudio de esta diversidad puede encararse aplicando mtodos de cultivo directo o mtodos moleculares de metagenmica. Los mtodos tradicionales de aislamiento y cultivos en medios nutritivos y condiciones de laboraWRULR VRQ DSURSLDGRV SHUR LQVXFLHQWHV 6H KD estimado que solamente entre 0.1% y 1.0% de las bacterias de suelo son cultivables, lo cual remarca la magnitud de la comunidad an no examinada. Estos nmeros dan una idea de la magnitud de la complejidad, y del tamao de la caja negra que representa descubrir los

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elementos de esa biodiversidad presentes en una pizca de suelo. Es importante tener en cuenta que la metagenmica es aplicable no slo a examinar la diversidad microbiana de un ambiente natural con el objetivo ltimo de lograr el ensamble de genomas a partir de datos fragmentados (meta anlisis), sino tambin revelar un espectro amplio de productos gnicos con potencialidades biotecnolgicas. Mtodos de anlisis El anlisis metagenmico implica el aislaPLHQWR GHO $'1 GH OD PXHVWUD FORQDGR GH IUDJPHQWRV GH $'1 XVDQGR YHFWRUHV SODVPtGLFRV y transformacin en alguna cepa apropiada de la bacteria E. coli )LJXUD   $SDUHQWHPHQWH el procedimiento es experimentalmente muy directo sin embargo el metagenoma comprende a numerosos genomas individuales que contribuyen, con distintos grados de representatividad, al tamao y la complejidad del mismo. Esto impacta en el tamao de la muestra a examinar. La etapa siguiente al clonado molecular constituye la oportunidad de aplicar estrategias alternativas y en general exigen la creatividad del investigador a los efectos de maximizar las posibilidades de alcanzar resultados deseables e interesantes. En trminos generales, los procedimientos de anlisis de clones interesantes se pueden agrupar en aquellos basados en seFXHQFLDFLyQ PDVLYD GH $'1 \ HQ DTXHOORV RWURV basados en la expresin heterloga de funcioQHV EXVFDGDV $GRSWDUHPRV HQ HVWH WH[WR HO anglicismo screening para referirnos a la etapa H[SHULPHQWDO GH DQiOLVLV GH FORQHV H LGHQWLFDcin de genes y secuencias de inters. Para lograr una idea de la envergadura de la tarea de screening hagamos la siguiente referencia a algunas estimaciones numricas soEUH HO WDPDxR GHO $'1 PHWDJHQyPLFR - Es muy probable que el nmero de genoPDV GLVWLQWRV SUHVHQWHV HQ HO VXHOR UHHMH HO WLSR \ FDUDFWHUtVWLFDV GHO PLVPR DTXHOORV GHdicados a la agricultura con un buen nivel de materia orgnica y humedad presentarn una diversidad ms amplia que un suelo oligotrpiFR \ FDUDFWHUtVWLFDV H[WUHPDV GH S+ KXPHGDG \R VDOLQLGDG $ SDUWLU GH  JUDPR GH VXHOR VH SXHGH REWHQHU HQWUH  XJ GH $'1 VHJ~Q

el protocolo de extraccin aplicado y la naturaleza del suelo. Por otro lado y aplicando un procedimiento basado en cintica de reasociacin GH $'1 VH KD HVWLPDGR TXH  JUDPR GH VXHOR FRPSUHQGHUtD HQWUH  \  JHQRPDV - Segn el vector usado para el clonado del $'1 PHWDJHQyPLFR GH VXHOR VH HVWLPD UHFRmendable examinar ms de 10 7 clones plasPtGLFRV R 6 FORQHV %$&V  FRQ LQVHUWRV GH un tamao de 5 kb y 100 kb, respectivamente. 3DUD ORJUDU UHSUHVHQWDFLyQ VLJQLFDWLYD GH ORV genomas de miembros raros de la comunidad (menos del 1%) se ha calculado necesario seFXHQFLDU  *E GHO $'1 H[WUDtGR GH VXHOR Por otro lado, se ha estimado en 1013 genes en un gramo de suelo provinentes de al menos 103 HVSHFLHV OR TXH LQGLFDUtD TXH KD\ DO PHQRV 6 genes nuevos en 1 gramo de suelo (Schloss y Handelsman, 2006). El objetivo de establecer el metagenoma teniendo en cuenta estos nmeros adquiere un valor relativo cuando se los pone en el contexto de los recursos tecnolgiFRV \ QDQFLHURV QHFHVDULRV SDUD VX DERUGDMH $FWXDOPHQWH FRQ HO GHVDUUROOR GH WHFQRORJtDV de secuenciacin de alta generacin de datos, basadas en el denominado procedimiento de pirosecuenciacin que no requiere de la construccin de bibliotecas metagenmicas, el tiempo requerido para la resolucin de un metagenoma adquiere una dimensin real. Sin embargo, la limitacin de estos procedimientos consistente en generar lecturas relativamente cortas aproximadamente entre 100 y 200 nucletidos- complica la tarea posterior de ensamble de secuencias parciales en un genoma completo. No obstante, y an haciendo uso de la tecnoORJtD SUHFHGHQWH EDVDGD HQ HO SURFHGLPLHQWR de Sanger, el costo de secuenciacin masiva es caro en general, y ms an para nuesWUR SDtV 6LQ HPEDUJR \ FRPR VH WUDWD HQ ODV VHFFLRQHV VLJXLHQWHV GH HVWH FDStWXOR H[LVWHQ estrategias alternativas a la secuenciacin de bibliotecas metagenmicas, que asisten la bsqueda y resultan tiles para revelar diversidad y descubrir nuevos genes. Screening basado en el anlisis del gen 16S rARN Este mtodo est basado en el anlisis de la

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VHFXHQFLD GHO JHQ TXH FRGLFD SDUD HO JHQ TXH FRGLFD OD VXEXQLGDG 6 U $51 GH ORV ULERsomas procariticos. Todos los microorganisPRV SRVHHQ HVWH $51 TXH SUHVHQWD XQD DOWD VLPLOLWXG HQWUH HOORV SHUR FRQ GLIHUHQFLDV VXcientes para su uso como medida de distancias evolutivas. Existe una amplia base de datos de VHFXHQFLDV GHO 6 U$51 GH RUJDQLVPRV GLYHUVRV TXH KD SHUPLWLGR HODERUDU XQ iUERO ORJHntico llamado rbol de la vida. Esto permite XVDU ORV GDWRV PHWDJHQyPLFRV GH 6 U$'1 generado a partir de una determinada muestra DPELHQWDO SDUD SRVLFLRQDU ORJHQpWLFDPHQWH D las distintas secuencias, y eventualmente inIHULU OD ELRORJtD \ HFRORJtD GH ORV PLVPRV (O DQiOLVLV GHO ORV JHQ HV 6 U$51 HV HFRQymicamente accesible a los laboratorios y es til para evaluar diversidad microbiana. En particular, ha sido efectivo para revelar la abundancia de especies, y la estructura poblacional de PXHVWUDV GH VXHOR $JXLODU HW DO   /D DPSOLFDFLyQ PHGLDQWH OD 3&5 XVDQGR oligonucletidos cebadores que hibridan las UHJLRQHV FRQVHUYDGDV GH ORV JHQHV 6 U$51 de bacterias y arqueas, genera fragmentos que pueden ser clonados y secuenciados. El WDPDxR GHO $'1 UHVXOWDQWH GH OD DPSOLFDFLyQ GH DSUR[LPDGDPHQWH  .E VH LQVHUWD HQ XQ SOiVPLGR YHFWRU WLSR 7$ VHJXLGR GH WUDQVIRUmacin de E. coli (O $'1 XVDGR FRPR PROGH SXHGH VHU HO $'1 PHWDJHQyPLFR R WDPELpQ el proveniente de una biblioteca metagenmica (Furlong et al., 2002). Los datos primarios pueden ser examinados con programas computacionales apropiados que permiten evaluar la predominancia de especies (DOTOUR), y el grado de similitud entre los miembros de dos FRPXQLGDGHV 6216 /,%6+8)) KWWSZZZ libshuff.mib.uga.edu). El mtodo tiene sus limitaciones. Por ejemSOR D SURYHH XQ PDUFR ORJHQpWLFR GH OD FRmunidad pero da informacin escasa sobre la funcionalidad de la misma; b- como todo procedimiento basado en PCR, no todos los geQHV U$51 DPSOLFDQ LJXDOPHQWH UHVXOWDQGR HQ la sub-estimacin de especies, y c los genes 6 U$51 SXHGHQ H[LVWLU HQ P~OWLSOHV FRSLDV no idnticas. Es claro entonces que el anlisis gentico HPSOHDQGR 6 U$51 SURYHH YDOLRVD LQIRUPD-

cin acerca de la diversidad y de la evolucin de poblaciones microbiana, sin embargo el gen 16S representa aproximadamente el 0.05% de un genoma procariota. Se ha demostrado que microorganismos que poseen secuencias GH 6 U$'1 LGpQWLFDV SXHGHQ SRVHHU JHQRPDV PX\ GLVWLQWRV \ SUHVHQWDU GLIHUHQWHV VLRORJtDV \ WHPSHUDWXUDV ySWLPDV GH FUHFLPLHQWR Los miembros de una comunidad microbiana pueden diferir enormemente en sus actividaGHV ELRTXtPLFDV H LQWHUDFFLRQHV QR VyOR HQWUH especies sino dentro de una misma especie. 3RU HQGH OD ORJHQpWLFD QRV GLFH HQ HO PHMRU de los casos quines son los miembros de la comunidad pero muy poco acerca de qu es lo que hace cada miembro. Uno de los prinFLSDOHV REMHWLYRV GH OD HFRORJtD PLFURELDQD HV el poder asociar la identidad de los diferentes microorganismos dentro de un hbitat con los procesos que ellos llevan a cabo en ese ambiente. Los mtodos metagenmicos, que sern discutidos ms adelante, comienzan a dar respuestas a esta segunda cuestin. Construccin de bibliotecas genmicas ambientales Muchos de los mtodos corrientemente utilizados en la construccin de bibliotecas ambientales, son adaptaciones de las tcnicas empleadas para la construccin de bibliotecas de insertos grandes de organismos eucariotas, WDOHV FRPR FORQDGR HQ FURPRVRPDV DUWLFLDOHV %$&V \ OtVLV FHOXODU HQ WDFRV GH DJDURVD 6LQ embargo, en la construccin de genotecas ambientales se encuentran obstculos que no se presentan en la construccin de bibliotecas de organismos aislados. La diversidad de nichos HFROyJLFRV SODQWHD GHVDItRV LQWHUHVDQWHV D OD hora de disear una estrategia adecuada para OD REWHQFLyQ GH XQ $'1 GH FDOLGDG DSURSLDda y que el mismo represente la poblacin de microorganismos presentes en ese ambiente. En la actualidad se han preparado diversas bibliotecas metagenmicas de variados ambientes, en esta seccin discutiremos algunos de ORV DVSHFWRV FUtWLFRV D WHQHU HQ FXHQWD HQ VX preparacin. La primera biblioteca ambiental se constru\y D SDUWLU GH $'1 GH PLFURRUJDQLVPRV RFHinicos, los que fueron concentrados a partir de

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DJXD GH PDU DQWHV GH OD H[WUDFFLyQ GH $'1 Sin embargo en el caso de otros habitat tales como el suelo, existen procedimientos alternativos, cada uno con sus ventajas y desventajas. La construccin de una biblioteca metagenmica de suelo se inicia con la toma de muestra. Como las muestras de suelo son heterogneas, ORV GDWRV VLFRTXtPLFRV WDOHV FRPR WDPDxR GH SDUWtFXOD WLSR GH VXHOR FRQWHQLGR GH DJXD S+ temperatura y las plantas que lo cubren son tiles para la evaluacin y comparacin de los resultados obtenidos en estos estudios. Dado que las poblaciones microbianas son grandes, los volmenes de muestras pueden ser pequeos. Durante la toma de muestra necesariamente se generan perturbaciones que pueden PRGLFDU OD FRPSRVLFLyQ GH ODV FRPXQLGDGHV microbianas del suelo, por lo que es importante GLVPLQXLU DO PtQLPR HO WLHPSR GH WUDQVSRUWH \ almacenamiento de la misma. /RV PpWRGRV GH H[WUDFFLyQ GH $'1 VH SXHGHQ GLYLGLU HQ GRV FDWHJRUtDV D OLVLV GLUHFWD GH las clulas contenidas en la matriz de la muesWUD VHJXLGR GH OD VHSDUDFLyQ GHO $'1 GH OD PDtriz y los desechos celulares, o b) la separacin de las clulas de la matriz del suelo seguido por OLVLV FHOXODU (O $'1 FUXGR UHFXSHUDGR SRU DPERV PpWRGRV VH SXULFD SRU ORV SURFHGLPLHQWRV KDELWXDOHV /D UHFXSHUDFLyQ GH $'1 DLVODGR GH diferentes tipos de suelo utilizando ambos tipos de protocolos van desde menos de aproximaGDPHQWH  J D  J GH $'1 SRU JUDPR GH suelo, sin embargo el rendimiento es entre 10 y 100 veces mayor por lisis directa cuando se compara para una misma muestra. Para lograr la lisis celular directa, se utilizan una combinacin de tratamientos enzimticos, detergente y DOWDV WHPSHUDWXUDV $GHPiV GHO $'1 GH ODV Fplulas procariotas lisadas, tambin se recupera $'1 H[WUDFHOXODU \ HXFDULRWD /RV PpWRGRV GH H[WUDFFLyQ GH $'1 EDVDdos en la separacin de clulas como una etapa previa a la lisis de las mismas, aunque PHQRV HFLHQWHV HQ WpUPLQRV GH FDQWLGDG GH $'1 UHFXSHUDGR VRQ PHQRV GDxLQRV SDUD OD integridad del mismo. La separacin de los microorganismos de la matriz del suelo se logra mediante suaves fuerzas mecnicas como los procedimientos de mezcla, la rotacin del piln HQ PRUWHUR R TXtPLFRV WDOHV FRPR OD DGLFLyQ

de resinas de intercambio catinico, seguido de gradiente de densidad o centrifugacin difeUHQFLDO (Q HVWH FDVR HO $'1 REWHQLGR HV FDVL H[FOXVLYDPHQWH SURFDULyWLFR $GHPiV HO $'1 recuperado por este mtodo parece ser menos contaminado con compuestos de la matriz compuestos, entre ellos sustancias hmicas. $GHPiV HO WDPDxR PHGLR GH ORV $'1 DLVODGRV es mayor que el que suele obtenerse mediante lisis directa y, por lo tanto, es ms adecuado para la generacin de bibliotecas de insertos grandes. Como los diferentes microorganismos del suelo tienen diferentes susceptibilidades a los mtodos de lisis celular, las secuencias preVHQWHV HQ HO $'1 DLVODGR \ HQ ODV ELEOLRWHFDV dependen del mtodo de extraccin. No se ha estudiado cul es el sesgo que se introduce en las bibliotecas debido al mtodo de extraccin, VLQ HPEDUJR HV GH SUHVXPLU TXH HO $'1 DLVODdo por lisis directa represente mejor la diversidad microbiana de una muestra de suelo, ya que este no incluye el paso de separacin de las clulas, por lo tanto sern lisados an los microorganismos que se adhieren fuertemente D ODV SDUWtFXODV El anlisis metagenmico puede requerir de bibliotecas con insertos de tamao grande o pequeo. Las bibliotecas de insertos pequeos VRQ VXFLHQWHV HQ HO FDVR HQ TXH HO DQiOLVLV LQvolucre el estudio de un nico gen o un pequeo grupo de genes. Por el contrario, se requieren insertos mayores para el estudio de rutas metablicas completas, procesos complejos u organizacin genmica. Independientemente del tamao de inserto requerido, la preparaFLyQ GH $'1 HV FUtWLFD SDUD HO p[LWR GHO DQiOLVLV En el caso de emplear digestiones parciales de $'1 SDUD OD FRQVWUXFFLyQ GH OD ELEOLRWHFD VH UHTXLHUH SDUWLU GH XQ $'1 GH XQ WDPDxR SURPHdio 3 veces mayor al de los insertos deseados. Por ende si se desea un inserto de 100 kb se GHEHUi SDUWLU GH XQ $'1 GH WDPDxR SURPHGLR !  NE 8Q $'1 GH HVWH WDPDxR HV PX\ YXOQHrable a las fuerzas de cizalla que se producen en el manipuleo de las soluciones, centrifugaciones, congelado-descongelado, etc. Por ello en estos casos la lisis de las clulas para la OLEHUDFLyQ GHO $'1 \ VX SRVWHULRU GLJHVWLyQ SDUcial con enzimas de restriccin, se realiza en tapones de agarosa.

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Dependiendo del tamao promedio de los insertos, las bibliotecas se construyen empleanGR GLIHUHQWHV WLSRV GH YHFWRUHV $Vt ODV GH LQsertos pequeos (menores a 15 kb) emplean YHFWRUHV SODVPtGLFRV HQ WDQWR TXH ODV GH LQsertos de hasta 40 kb hacen uso de csmidos o IyVPLGRV \ %$&V SDUD PiV GH  NE /RV YHFWRUHV WLSR %$&V FRQ Q~PHUR GH FRSLD LQGXFLEOH son particularmente tiles, dado que permiten un mantenimiento en la clula husped a bajo nmero de copia, pero permiten el incremento del nmero de copias para facilitar el estudio de expresin. Si bien el husped de eleccin para la construccin y mantenimiento de todas las bibliotecas publicadas es E.coli, es fcil de notar que la bsqueda de fenotipos interesantes se ver restringida a aquellos que nos permita expresar este husped. Se han construido vectores FRVPtGLFRV \ %$&V TXH SHUPLWHQ OD WUDQVIHUHQcia de bibliotecas producidas en E. coli a otros especies huspedes tales como Streptomyces o Pseudomonas 0DUWtQH] HW DO  :H[OHU et al., 2005). Screening basado en la expresin funcional Otra forma de acceder al metagenoma, particularmente cuando se trata de ambientes complejos en cuanto a su diversidad poblacional y a su alta densidad de microorganismos diferentes, es la bsqueda de genes que geQHUHQ SURGXFWRV GHQLGRV H LGHQWLFDEOHV R asociados a determinadas actividades que se pueden evaluar in vitro aplicando bio-ensayos. La ventaja ms importante de este abordaje es el desarrollo de un proyecto acotado de menor envergadura que el anlisis alternativo dirigido a la secuenciacin masiva del metagenoma. Este criterio de screening comprende varias estrategias agrupadas dentro de la llaPDGR PHWDJHQyPLFD IXQFLRQDO $ FRQWLQXDFLyQ se describirn algunas estrategias que ilustran formas ingeniosas de abordar el conocimiento del metagenoma con un propsito directo de GHVFXEULPLHQWR \ XVR GH SURSLHGDGHV HVSHFtFDV FRGLFDGDV SRU HO PHWDJHQRPD El usufructo exitoso de actividades microELDQDV R YtDV PHWDEyOLFDV UHTXLHUH GHO ORJUR GH YDULDV HWDSDV FUtWLFDV (Q SULPHU OXJDU HO

$'1 DPELHQWDO GHEH FRQWHQHU HOORV JHQ HV TXH FRGLFDQ ODV IXQFLRQHV EXVFDGDV \ HV deseable que las secuencias correspondientes se encuentren representadas en una freFXHQFLD DOWD HQ HO $'1 DPELHQWDO VHJXQGR ORV SURFHGLPLHQWRV GH SUHSDUDFLyQ GHO $'1 metagenmico y de clonado molecular deben permitir la recuperacin e integridad de genes \ RSHURQHV \ QDOPHQWH ORV JHQHV GHEHQ VHU GHWHFWDEOHV JHQpWLFDPHQWH R IHQRWtSLFDPHQWH Resulta obvio al encarar un proyecto de este tipo, que la correcta seleccin del ambiente apropiado, constituya una de las etapas funGDPHQWDOHV SDUD GDUOH XQD EDVH SUREDELOtVWLFD razonable de xito a nuestro diseo experimental. Por ejemplo, en un trabajo publicado por Rhee et al., (2005), cuyo objetivo fue el DLVODPLHQWR GH JHQHV QXHYRV FRGLFDQWHV GH enzimas termoestables con actividad esterasa, se realiz la bsqueda sobre el metagenoma de muestras de suelo de sitios con aguas termales cuyas temperaturas fueron entre 65 y 90 o C (Rhee et al., 2005). Esta consideracin da cierta certeza sobre la presencia de las funciones buscadas en la muestra pero, no asegura que la representacin de los genes buscados HQ HO PHWDJHQRPD VHD VXFLHQWHPHQWH DOWD para lograr su recuperacin. Por ejemplo, la E~VTXHGD GH FORQHV FRQ DFWLYLGDG OLSROtWLFD HQ XQD ELEOLRWHFD SURYHQLHQWH GH $'1 GH VXHOR UHVXOWy HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH XQ FORQ HQWUH 730.000 clones examinados. Con el propsito de aumentar la probabilidad de deteccin de genes de inters se ha recurrido a la inclusin en el diseo experimental de etapas de enriquecimiento previas a la construccin de las ELEOLRWHFDV JpQLFDV (Q OD PD\RUtD GH HVWRV estudios, las fuentes de carbono y/o nitrgeno han sido los criterios selectivos de especies microbianas con genes deseados que son requeridos para su desarrollo en esas condiciones de incubacin. El anlisis metagenmico de cultivos enriquecidos ha demostrado su potencialidad para el aislamiento de genes determiQDQWHV GH IXQFLRQHV FDWDOtWLFDV GHJUDGDWLYDV y nuevos antibiticos a partir de suelo y otros ambientes (Entcheva et al., 2001; Gupta et al.,  .QLHWVFK HW DO  'DQLHO HW DO  Mori et al., 2008). Sin embargo, se deben considerar sus limitaciones: Las poblaciones mi-

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crobianas que contienen los genes deseados QR UHVSRQGHQ HFLHQWHPHQWH D ODV FRQGLFLRQHV de enriquecimiento, su crecimiento lento determina baja representacin en la muestra previa D OD H[WUDFFLyQ GH $'1 Los mtodos de screening funcional son potencialmente tiles para descubrir nuevas vaULDQWHV GH IXQFLRQHV LQWHUHVDQWHV 6X HFLHQFLD usando bibliotecas metagenmicas, depende a VX YH] GH OD HFLHQFLD \ VHQVLELOLGDG GHO HQVDyo in vitro y tambin de la compatibilidad del sistema de trascripcin y traduccin de la clula hospedadora para transcribir y traducir el/ los gen(es) contenidos en el clon transgnico. $XQTXH OD ELEOLRJUDItD GHPXHVWUD TXH HO KRVSHdador ms usado es Escherichia coli, el rango de hospedadores se ha ampliado en los ltimos aos a otras microorganismos tales como Streptomyces lividans, Pseudomona putida, y Rhizobium leguminosarum 0DUWtQH] HW DO  /L HW DO  H LQFOXVR HXFDULRWHV $O Hasani et al., 2003). Esto permitir un mayor acceso hacia la expresin de un amplio rango de actividades gnicas del medio ambiente. El anlisis metagenmico basado en identiFDFLyQ GH FORQHV TXH H[SUHVDQ XQD GHWHUPLnada funcin ha sido exitoso cuando se lo ha combinado al uso de mutantes de E. coli. Por ejemplo, Daniel y su grupo usaron mutantes de E. coli GHFLHQWHV HQ VXV VLVWHPDV DQWLSRUWHU Na+ (Li+)/H+ para descubrir dos antiporters nuevos a partir del screening de una biblioteca de aproximadamente 1,5 x 106 clones. El procedimiento experimental consisti en transferir los clones a E. coli, y evaluar el crecimiento de los transformantes en cajas de petri conteniendo un medio de cultivo con 7,5 mM LiCl (Majernik HW DO   $SOLFDQGR XQ SURFHGLPLHQWR VLPLODU VH LGHQWLFDURQ JHQHV SDUWLFLSDQWHV HQ OD ELRVtQWHVLV GH ELRWLQD D SDUWLU GH $'1 GH VXHOR (Entcheva et al., 2001). Por otro lado, la seleccin por resistencia a antibiticos ha conducido al aislamiento de nuevas formas de resistencia a tetraciclina y a aminoglicsidos a partir de muestras de la biota de la boca humana, y de suelo, respectivamente. El descubrimiento de resistencia a aminoglicsidos es un buen ejemplo del uso del VFUHHQLQJ IXQFLRQDO 6H LGHQWLFDURQ  FORQHV GH ORV FXDOHV  FRGLFDQ SDUD DFHWLOWUDQVIH-

rasas que forman un grupo nuevo. Estos genes resultaron del anlisis de una biblioteca FRQVLVWHQWH HQ  *E GH $'1 HTXLYDOHQWH D 6 genes, sugiriendo la obvia y baja representacin de dichos genes en la biblioteca. El uso del procedimiento experimental de seleccin positiva hizo posible su deteccin que de otra manera por ejemplo mediante secuenciacinhubiera resultado una tarea casi imposible. No obstante, el nmero de clones/muestras individuales de una biblioteca que son necesarios examinar, sigue siendo experimentalmente un nmero grande. Con el objetivo de encontrar resultados en tiempo real y examinar un universo grande, se han diseado estrategias de alta productividad (en Ingls son referidas como high-throughput screen), las cuales incorporan sistemas automatizados y robotizados con DOWD WHFQRORJtD LQVWUXPHQWDO Otro enfoque es el estudio de antibiticos nuevos en metagenoma de suelo el cual ha expandido nuestra visin de las comunicaciones entre comunidades microbianas. Se ha encontrado que concentraciones sub-inhibidoras de crecimiento inducen respuesta del tipo qurum sensing, an cuando los compuestos no muestran similitud con las conocidas homoserina lactonas que han sido descritas como inductores naturales en bacterias. Esto sugiere la existencia de un dilogo comunicativo entre microorganismos que activan funciones en el HQWRUQR $GHPiV HVWH KDOOD]JR KD VLGR DGRStado para el screening de molculas que funcionan como inductoras de qurum sensing y eventualmente tambin como antibiticos. Esta oportunidad condujo al diseo de un procediPLHQWR GH VFUHHQLQJ FRQ DOWD HFLHQFLD FXDQWLWDWLYD GH DQiOLVLV GH FORQHV H LGHQWLFDFLyQ GH compuestos que funcionan como inductores de genes que se encuentran bajo el control de un promotor sensible a qurum sensing. Este sensor consiste en el promotor del gen luxR fusionado al gen reportero gfp, residente en un plsmido replicativo en una variante de E. coli que no induce qurum sensing. En el caso que HO $'1 PHWDJHQyPLFR H[SUHVH XQ LQGXFWRU GHO promotor luxR, se sintetizar la proteina GFP UHYHOiQGRVH XRUHVFHQFLD (VWH SURFHGLPLHQWR acoplado a cell sorting DFWLYDGD SRU XRUHVFHQcia, permite capturar aquellos clones potencial-

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mente productores de compuestos de quorum sensing (Figura 2) (Lynn et al., 2005; Uchiyama et al., 2005). Otro mtodo de enriquecimiento se basa en el uso de istopos estables, en el cual se administra -como nica fuente de carbono- un sustrato marcado con 13C a una comunidad de miFURRUJDQLVPRV SURYHQLHQWHV GH VXHOR $TXHOOD comunidad bacteriana capaz de utilizar ese sustrato incorporar 13C en sus macromolFXODV SDUWLFXODUPHQWH HQ $'1 GHWHUPLQDQGR TXH HO $'1 VHUi PiV GHQVR TXH HO $'1 QRUPDO de la bacteria. El procedimiento contina con OD XOWUDFHQWULIXJDFLyQ GHO $'1 HQ JUDGLHQWHV GH GHQVLGDG GH &V&O SDUD VHSDUDU HO $'1 PDUFDGR GHO $'1 QRUPDO R QR PDUFDGR (VWH $'1 puede separarse de la columna de gradiente, someterse a dilisis y posteriormente concenWUDUVH SRU SUHFLSLWDFLyQ HWDQyOLFD (O $'1 VH IUDJPHQWD \ FORQD HQ YHFWRUHV SODVPtGLFRV /D biblioteca resultante puede analizarse mediante un screening funcional, o haciendo uso de sondas dirigidas a revelar un determinado gen. El mtodo tiene potencialidad para fraccionar

las poblaciones provenientes del suelo concentrando aquellas asociadas a una funcin (por ejemplo degradacin de un compuesto hidrocarburo que es asimilado). Sin embargo, el mtodo tiene sus limitaciones principalmente generadas por el llamado cross feeding, en el cual bacterias carentes de esa propiedad pueden desarrollar en el medio a expensas de metabolitos provistos por otras bacterias 5DGDMHZDVNL HW DO  Lo no cultivable se vuelve cultivable (O HVWXGLR PHWDJHQyPLFR GHO ELROP TXH se forma sobre las aguas que drenan de una mina de hierro abandonada, ubicada en la Iron Mountain en Richmond, California ha permitido establecer la estructura de la comunidad y las IXQFLRQHV PHWDEyOLFDV \ ELRJHRTXtPLFDV (VD agua de drenaje constituye un medio extremadamente adverso, su acidez es de pH 1.0 y posee un alto contenido en metales. Tambin es rica en pirita (FeS2). No hay fuentes asimilables de carbono o nitrgeno ms all de las que pueden derivar del aire. Tyson et al. (2004)

Figura 2 $LVODPLHQWR GH FORQHV SURYHQLHQWHV GH XQ ELEOLRWHFD PHWDJHQyPLFD TXH H[SUHVDQ SURGXFWRV gnicos inductores/activadores de qurum sensing. LuxR es un producto gnico que interacciona con molculas efectoras producidas por microorganismos, activador de un promotor sensible fusionado al gen UHSRUWHUR SDUD *)3 JUHHQ XRUHVFHQW SURWHLQ IDFLOLWDQGR VX GHWHFFLyQ

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secuenciaron una biblioteca construida con $'1 H[WUDtGR GHO ELROP \ ORJUDURQ HQVDPblar a partir de datos metagenmicos los genomas de miembros del grupo Leptospirillum y Ferroplasma tipo II, tambin una sustanciosa informacin de otros miembros de la comunidad. El anlisis de estos resultados fue muy VXJHVWLYR /RV DXWRUHV QRWDURQ TXH QR KDEtDQ detectado la presencia de Leptospirillum ferrooxidants, OD HVSHFLH MDGRUD GH 12. Por el contrario, el genoma de la comunidad revel la presencia de miembros pertenecientes a los grupos II y III de Leptospirillum. El gnero Leptospirillum ha sido sub-dividido en 3 gruSRV GH ORV FXDOHV D~Q QR VH KDEtD ORJUDGR FXOtivar a representativos del grupo III. El estudio tambin revel la presencia de genes nif (geQHV GH MDFLyQ ELROyJLFD GH QLWUyJHQR TXH ORV autores asociaron al genoma de Leptospirillum grupo III. Estos datos permitieron concluir que la contribucin de esta poblacin al consorcio GHO ELROP GH OD PLQD iFLGD HV HO DSRUWH GH nitrgeno asimilable, y adems, el conocimiento de las capacidades metablicas inferidas de los datos metagenmicos gui los pasos siguientes dirigidos a lograr la cultivacin en el laboratorio de Leptospirillum grupo III y a la GHQLFLyQ GH OD HVSHFLH L. ferrodiazotrophum (Tyson et al., 2005). De la misma manera, estudiando los datos resultantes, se ha especulado que Ferroplasma y Leptospirillum VS GHULYDUtDQ OD HQHUJtD D SDUWLU GH OD R[LGDFLyQ GHO KLHUUR $GHPiV VH HQFRQWUy TXH WRGRV ORV JHQRPDV muestran genes asociados con la remocin de elementos potencialmente txicos, tales como VLVWHPDV GH XMR GH SURWRQHV \ ERPEDV GH H[clusin de metales (Tyson et al., 2004). El estudio de las comunidades en el drenaje de aguas de la mina cida de Richmond, es un modelo de complementariedad de funciones asignables a miembros del consorcio microbiano. Es posible imaginar que la proyeccin de este modelo de estudio a otros sistemas ambientales no resulte fcil. La extrema adversidad de la mina cida limita la diversidad de genomas en la comunidad y facilit el anlisis El mensaje intrnseco de este descubrimiento de componentes importantes de las comunidades del suelo, aplicando un anlisis metagenmico, es su uso como gua en

la formulacin del medio de cultivo y logro de su cultivacin in vitro. Potencialidades de la metagenmica Las posibilidades que este nuevo campo ofrece son alucinantes. Descifrar la enorme gama de procesos e interacciones que caracterizan las comunidades microbianas en la Tierra puede conducir a avances en la salud humana, la mejora de la comprensin a gran escala de los cambios climticos y atmosfricos, los mtodos para obtener cultivos ms fuertes y nutritivos, nuevos enfoques para la limpieza de la contaminacin ambiental, y el GHVDUUROOR GH QXHYDV IXHQWHV GH HQHUJtD UHQRvable. Estos son slo algunos ejemplos de las muchas posibles aplicaciones prcticas de la metagenmica. El ser humano siempre vivi en un mundo dominado por los microbios, y la estrecha relacin entre los microbios y los seres humanos es un tema antiguo. Las clulas microbianas que viven en el cuerpo humano adulto son diez veces ms numerosos que las clulas humanas. Los genomas microbianos de las comunidades que viven dentro y en el cuerpo humano (el microbioma humano) contiene muchos ms genes que el genoma humano. Estudiar el microbioma humano puede dar lugar a valiosas nuevas herramientas en nutricin humana y animal, el descubrimiento de medicamentos, y en medicina preventiva. Este estudio tambin puede ampliar mucho la profundidad de nuestra comprensin de enfermedades complejas tales como obesidad, el cncer y ciertas enfermedades inmunolgicas, como el asma (Turnbaugh et al., 2006). /D LQPHQVD PD\RUtD GH QXHVWURV PLFURRUJDnismos asociados viven en el intestino. Estos 10 a 100 billones microorganismos desempean funciones tales como la extraccin de nuWULHQWHV \ FDORUtDV GH FRPSRQHQWHV GH QXHVWUDV GLHWDV \ OD VtQWHVLV GH YLWDPLQDV HVHQFLDOHV \ aminocidos. Las bacterias intestinales tamELpQ D\XGDQ D GHWR[LFDU SURGXFWRV TXtPLFRV potencialmente nocivos que pueden estar preVHQWHV HQ OR TXH FRPHPRV $OJXQRV GH ORV PLcrobios que viven en y sobre el cuerpo humano desempean un papel fundamental en la defensa contra agentes patgenos. Esta relacin PXWXDPHQWH EHQHFLRVD QRV D\XGD D SURWH-

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gernos de enfermedades al tiempo que se da a los microbios un lugar para vivir. El uso de metagenmica para obtener un conocimiento ms profundo de las comunidades microbianas HQ HO FXHUSR KXPDQR SRGUtD VHU LQPHQVDPHQWH valioso en la comprensin tanto de microbios GDxLQRV FRPR GH EHQHFLRVRV \ SXHGH FRQducir a formas ms efectivas de diagnosticar, tratar y prevenir enfermedades. El enfoque metagenmico ofrece la posibiOLGDG QR VyOR GH DQDOL]DU OD GLYHUVLGDG ORJHQpWLFD GH GLYHUVRV DPELHQWHV \ ELROPV VLQR tambin de localizar los genes y operones que FRGLFDQ SURSLHGDGHV GH LQWHUpV ELRWHFQROygico. La metagenmica ha dado lugar al descubrimiento y caracterizacin de una amplia gama de biocatalizadores, que revela mucho acerca de la diversidad natural de las enzimas \ ORV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ VXV IXQFLRQHV Uno de los principales enfoques para la deteccin de nuevos biocatalizadores implica la deteccin funcional lo que requiere la expresin de genes heterlogos generalmente en Escherichia coli. Mediante el enfoque metagenmico se estudian hbitats tan diversos como intestinos de termitas, el rumen de rumiantes como ciervos o vacas, las muestras de suelo GH ORV GHVLHUWRV \ JODFLDUHV DVt FRPR KiELWDWV extremos como giseres, mar abierto de agua o chimeneas hidrotermales de aguas profundas. Es de esperar que la composicin genmica de las poblaciones microbianas en estos hbitats se diferencien unos de otros, y con ella los biocatalizadores y biomolculas que componen las respectivas bibliotecas metagenmicas. La metagenmica industrial se centra principalmente en procariotes, ya que sus genomas puede ser objeto fcilmente de las herramientas de seleccin funcional disponibles en la actualidad, y porque se supone que la mayor diversidad se encuentra entre estos microorganismos. Las enzimas se utilizan en una amplia gama de aplicaciones e industrias. Su versatilidad permite su uso tanto en los proFHVRV SDUD GHJUDGDU SROtPHURV QDWXUDOHV HQWUH HOORV DOPLGyQ FHOXORVD \ SURWHtQDV DVt FRPR SDUD ODV VtQWHVLV HQDQWLRVHOHFWLYD DVLPpWULFD GH SURGXFWRV TXtPLFRV DXQTXH KD\ PXFKDV PiV aplicaciones. En el ao 2000 Rondon y col. publican las primeras bibliotecas de suelos clonados en

YHFWRUHV GH WLSR %$& 6H JHQHUDURQ GRV ELEOLRtecas metagenmicas una con un tamao de inserto promedio de 27 kb y otra de 44.5 kb. Pese a que el tamao de inserto no es mayor al de una biblioteca convencional construida con vectores de tipo csmido o fago lambda, es la primera publicacin en la que se informa el clonado de fragmentos de ese tamao a partir de ODV SREODFLRQHV PLFURELDQDV GH VXHOR $ SDUWLU GH HVWDV ELEOLRWHFDV ORJUDQ LGHQWLFDU FORQHV que expresan fenotipos tales como, lipasas y amilasas. De igual modo Brady y col, recupeUDURQ D SDUWLU GH XQD ELEOLRWHFD FRVPtGLFD GH $'1 GH VXHOR HO FRQMXQWR GH JHQHV QHFHVDULRV SDUD OD VtQWHVLV GH YLRODFHtQD XQ DQWLELyWLFR GH amplio espectro,. $XQTXH ODV ELEOLRWHFDV PHWDJHQyPLFDV constituyen en la actualidad la herramienta ms poderosa para evaluar la diversidad funcional de comunidades microbianas naturales, no cubren los genomas de baja abundancia en ambientes complejos como los suelos. Como resultado, la frecuencia de clones con un fenotipo deseado en una biblioteca puede ser muy baja. Esto implica la bsqueda y seleccin en PLOHV GH FORQHV OR TXH VLJQLFD XQD WDUHD ODUJD y tediosa. En la actualidad se dispone de equiSRV FRQ WHFQRORJtDV TXH IDFLOLWDQ OD UHFROHFFLyQ de colonias, y la inoculacin en placas de numerosos clones al mismo tiempo. Mientras que la industria de alimentos y de detergentes se concentran en un nmero limitado de reacciones enzimticas y sustratos, las LQGXVWULDV TXtPLFD \ IDUPDFpXWLFD WUDEDMDQ FRQ PLOHV GH PROpFXODV TXtPLFD \ HVWUXFWXUDOPHQWH diversas, y la produccin de cada uno de estos requiere soluciones enzimticas individuales. En consecuencia, debido a la riqueza de biocatalizadores potencialmente tiles, el uso de recursos microbianos es cada vez ms difunGLGR HQ ODV LQGXVWULDV TXtPLFDV \ VRQ FRQVLGHUDGRV LQGLVSHQVDEOHV SDUD OD TXtPLFD RUJiQLFD moderna. Es obvio que existe una amplia demanda de nuevos enzimas y biocatalizadores, y la metagenmica aparece como una de las WHFQRORJtDV FRQ PD\RU SRWHQFLDOLGDG SDUD SURveer de las molculas necesarias. Es creciente la conciencia y la percepcin global de que la disponibilidad de combusti-

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bles fsiles no renovables no es sostenible en el futuro prximo, y se deber superar esa GHSHQGHQFLD HQHUJpWLFD $GHPiV ODV HPLVLRnes de gases de invernadero como resultado de la quema de combustibles fsiles son una de las causas principales del calentamiento global. Estos factores determinan la bsqueda de combustibles renovables, y amigables para el medio ambiente sea una de las principales prioridades para el mundo. Una fuente de enerJtD HPHUJHQWH HV HO HWDQRO DOFRKRO GH JUDQR  un biocombustible de alto octanaje de derivado GH PDt] FDxD GH D]~FDU R GH RWUR WLSR GH IXHQWHV DJUtFRODV (O HWDQRO FHOXOyVLFR VH IDEULFD D partir de la celulosa que se encuentra en el coP~Q GH ORV GHVHFKRV DJUtFRODV WDOHV FRPR OD EUD GH PDt] WDOORV GH PDt] SDMD GH WULJR \ otras como la biomasa derivada del mijo y el miscanthus. Pero el proceso que convierte la FHOXORVD D SDUWLU GH UHVLGXRV DJUtFRODV D HWDnol utilizable depende de un ingrediente esencial: las comunidades microbianas. En primer lugar, varios tipos de microorganismos deben trabajar en conjunto para transformar la celuloVD D SDUWLU GH GHVHFKRV DJUtFRODV HQ D]~FDUHV Luego, los azcares son fermentados-tambin por los microbios- para producir etanol. Las vacas, con la ayuda de las bacterias, VRQ FDSDFHV GH FRQYHUWLU ODV EUDV YHJHWDOHV FHOXORVD HQ HQHUJtD SHUR HVWH HV XQ SURFHVR complejo para mimetizarlo para la produccin de biocombustibles. La enzima que permite que una vaca digiera ORV SDVWRV \ RWUDV EUDV YHJHWDOHV SXHGH VHU XVDGD SDUD FRQYHUWLU RWUDV EUDV YHJHWDOHV HQ D]~FDUHV VLPSOHV 7UDQVIRUPDU ODV EUDV YHgetales en azcar requiere de tres enzimas. Estas tres enzimas han sido recientemente inWURGXFLGDV HQ XQD YDULHGDG GH PDt] GHQRPLnada Spartan III, que deriva de dos versiones anteriores. La primera versin contiene una enzima que procede de un microbio que vive en agua manantial caliente, y que es capaz de WUDQVIRUPDU HO JUDQ SROtPHUR GH FHOXORVD HQ fragmentos de menor tamao. La segunda versin contiene un gen de un hongo natural que FRGLFD SDUD XQD HQ]LPD FDSD] GH FOLYDU HVWRV fragmentos de celulosa en disacridos. En la ~OWLPD YHUVLyQ VH LQWURGXMR HO JHQ FRGLFDQWH de una enzima capaz de catalizar la hidrlisis

de los disacridos en azcares simples. Este gen fue aislado a partir de microbios presenWHV HQ HO UXPHQ GH YDFD 0HGLDQWH LQJHQLHUtD JHQpWLFD HVWH JHQ KD VLGR PRGLFDGR GH IRUPD tal de dirigir el producto de su expresin hacia vacuolas, de esta forma las enzimas digestivas permanecen almacenadas hasta su cosecha (Sticken, 2008). Estos son algunos ejemplos TXH SRQHQ GH PDQLHVWR OD SRWHQFLDOLGDG GH los enfoques metagenmicos tanto en su propsito biotecnolgico como en el anlisis de ODV FRPXQLGDGHV DPELHQWDOHV (Q GHQLWLYD OD metagenmica surge hoy como una disciplina nueva que nos permitir ampliar nuestro conoFLPLHQWR GH OD PLFURELRORJtD KDVWD GLPHQVLRnes an inimaginables. Lecturas recomendadas
$JXLODU 20 0 9 /ySH]  0 'RQDWR % 0RUyQ 0 ( 6RULD'LD] & 0DWHRV $ *LO6HUUDQR & 6RXVD DQG 0 0HJtDV  3K\ORJHQ\ DQG nodulation signal molecule of rhizobial populations able to nodulate common beans -other than the predominant species Rhizobium etli- present LQ VRLOV IURP WKH 1RUWKZHVW RI $UJHQWLQD 6RLO %LRlogy and Biochemistry 38:573-586. $O+DVDQL . 6LPSIHQGRUIHU . :DUGHQ + 9DGRODV - =DLEDN ) 9LOODLQ 5 DQG ,RDQQRX 3$  'HYHORSPHQW RI D QRYHO EDFWHULDO DUWLFLDO chromosome cloning system for functional studies. Plasmid 49:184-187. Brady SF, Chao CJ, Handelsman J, Clardy J. 2001. Cloning and heterologous expression of a natuUDO SURGXFW ELRV\QWKHWLF JHQH FOXVWHU IURP F'1$. Org Lett 3:1981-1984. Daniel, R. 2005. The metagenomics of soil. Nature 3:470-478. (QWFKHYD 3 /LHEO : -RKDQQ $ +DUWVFK 7 DQG 6WUHLW :5  'LUHFW FORQLQJ IURP HQULFKPHQW cultures, a reliable strategy for isolation of complete operons and genes from microbial consorWLD $SSO (QYLURQ 0LFURELRO  Environmental Microbiology ZZZEODFNZHOOV\QHUgy.com/toc/emi/7/12 )XUORQJ 0$ 6LQJOHWRQ '5 &ROHPDQ '& DQG :KLWPDQ :%  0ROHFXODU DQG &XOWXUH%DVHG $QDO\VHV RI 3URNDU\RWLF &RPPXQLWLHV IURP DQ $JULFXOWXUDO 6RLO DQG WKH %XUURZV DQG &DVWV RI WKH (DUWKZRUP /XPEULFXV UXEHOOXV $SSO (Qviron. Microbiol. 68:1265-1279. .QLHWVFK $ %RZLHQ 6 :KLWHG * *RWWVFKDON * and Daniel, R. 2003. ,GHQWLFDWLRQ DQG &KDUDF-

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terization of Coenzyme B12-Dependent Glycerol Dehydratase- and Diol Dehydratase-Encoding *HQHV IURP 0HWDJHQRPLF '1$ /LEUDULHV 'HULYHG IURP (QULFKPHQW &XOWXUHV $SSO (QYLURQ Microbiol. 69:3048-3060. /\QQ / :LOOLDPVRQ %5 %RUOHH 5 6FKORVV 3' *XDQ & $OOHQ +. DQG +DQGHOVPDQ -  Intracellular screen to identify metagenomic clones that induce or inhibit a quorum sensing ELRVHQVRU $SSO (QYLURQP 0LFURELRO  6344. 0DMHUQLN $ *RWWVFKDON * 'DQLHO 5  ScreeQLQJ RI (QYLURQPHQWDO '1$ /LEUDULHV IRU WKH Presence of Genes Conferring Na super(+)(Li VXSHU  + VXSHU  $QWLSRUWHU $FWLYLW\ RQ Escherichia coli: Characterization of the Recovered Genes and the Corresponding Gene Products . J. Bacteriol. 183:6645-6653. 0DUWtQH] $ .ROYHN 6- <LS &/< +RSNH - %URZQ .$ 0DF1HLO ,$ DQG 2VERXUQH 06  *HQHWLFDOO\ PRGLHG EDFWHULDO VWUDLQV DQG QRYHO EDFWHULDO DUWLFLDO FKURPRVRPH VKXWWOH YHFtors for constructing environmental libraries and detecting heterologous natural products in mltiSOH H[SUHVLyQ KRVWV $SSO (QYLURQP 0LFURELRO 70:2452-2463. 0RUL 7 0L]XWD 6 6XHQDJD + $QG 0L\D]DNL . 2008. Metagenomic Screening for Bleomycin 5HVLVWDQFH *HQHV $SSO (QYLURQP 0LFURELRO 74:6803-6805. 3DFH 15  $ PROHFXODU YLHZ RI PLFURELDO GLversity and the biosphere. Science 276:734-740. 5DGDMHZVNL 6 ,QHVRQ 3 3DUHNK 15 DQG 0Xrrell, J.C. 2000. Stable isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature 403:646-649. 5KHH -. $KQ '* .LP <* DQG 2K -:  1HZ 7KHUPRSKLOLF DQG 7KHUPRVWDEOH (VWHUDVH ZLWK 6HTXHQFH 6LPLODULW\ WR WKH +RUPRQH6HQVLtive Lipase Family, Cloned from a Metagenomic /LEUDU\ $SSO (QYLURQP 0LFURELRO  5RQGRQ 05 $XJXVW 35 %HWWHUPDQQ $' %UDG\ 6) *URVVPDQ 7+ /LOHV 05 /RLDFRQR .$ /\QFK %$ 0DF1HLO ,$ 0LQRU & et al.. 2000. Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Appl Environ Microbiol 66:25412547. 6WDOH\ -7 DQG .RQRSND $  0HDVXUHPHQW RI in situ activity of nonphotosynthetic microorgaQLVPV LQ DTXDWLF DQG WHUUHVWULDO KDELWDWV $QQX Rev. Microbiol. 39:321-346. Sticklen, M.B. 2008. Plant genetic engineering for ELRIXHO SURGXFWLRQ WRZDUGV DIIRUGDEOH FHOOXORVLF HWKDQRO 1DWXUH 5HYLHZV *HQHWLFV   7XUQEDXJK 3- /H\ 5( 0DKRZDOG 0$ 0D-

grini, V., Mardis, E.R., and Gordon, J.I. 2006. $Q REHVLW\DVVRFLDWHG JXW PLFURELRPH ZLWK LQcreased capacity for energy harvest. Nature 444:1027-1031. 7\VRQ *: &KDSPDQ - +XJHQKROW] 3 $OOHQ E.E., Ram, R.J., Richardson, P.M., Solovyev, 99 5XELQ (0 5RNVKDU '6 DQG %DQHOG J.F. 2004. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature 428:399-428. 7\VRQ *: /R , %DNHU %- $OOHQ (( +XJHQKROW] 3 DQG %DQHOG -)  *HQRPH 'LUHFWHG ,VRODWLRQ RI WKH .H\ 1LWURJHQ )L[HU Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from DQ $FLGRSKLOLF 0LFURELDO &RPPXQLW\ $SSO (QYLronm. Microbiol. 71:6319-6324. 8FKL\DPD 7 $EH 7 ,NHPXUD 7 DQG :DWDQDEH .  6XEVWUDWHLQGXFHG JHQHH[SUHVVLRQ RI environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nature 23:88-93. :DNVPDQ 6$ DQG 6WDUNH\ 5/  7KH VRLO DQG WKH PLFUREH -RKQ :LOH\ 1HZ <RUN 1< :H[OHU 0 %RQG 3/ 5LFKDUGVRQ '- DQG $QGUHZ : % -RKQVWRQ  $ ZLGH KRVWUDQJH PHWDJHQRPLF OLEUDU\ IURP D ZDVWH (QYLURQPHQtal Microbiology 7:19171926 :RHVH &5  %DFWHULDO HYROXWLRQ 0LFURELRO Rev. 51:221271.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 169

I. CAPTULO 12 Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal


N Paniego; R Heinz; P Fernndez; V Lia; C Fusari Introduccin /D %LRLQIRUPiWLFD HV XQD GLVFLSOLQD FLHQWtFD que ha evolucionado rpidamente en los ltimos aos respondiendo al avance y a las necesidades de procesamiento, almacenamiento y anlisis de datos biolgicos derivados de las WHFQRORJtDV DVRFLDGDV D ODV micas, para generar nueva informacin y conocimientos en HO iUHD GH OD ELRORJtD (O FDPSR GH OD ELRLQIRUmtica es multidisciplinario abarcando el desarrollo de bases de datos, el alineamiento de secuencias, la prediccin de estructuras proteiFDV OD FRQVWUXFFLyQ GH iUEROHV ORJHQpWLFRV HQWUH RWURV (Q HVWH FDStWXOR QRV GHGLFDUHPRV HVSHFtFDPHQWH D OD ELRLQIRUPiWLFD DSOLFDGD D OD ELRWHFQRORJtD YHJHWDO SDUWLFXODUPHQWH D cultivos agronmicos y plantas modelo, con el propsito de guiar al estudiante de un curVR LQLFLDO GH ELRWHFQRORJtD YHJHWDO R GH ELRORJtD PROHFXODU GH SODQWDV HQ OD DSOLFDFLyQ GH los conceptos y las herramientas bsicas de la bioinformtica, complementando los conceptos introducidos en la primera edicin de este libro. Este material no pretende cubrir la totalidad de los recursos existentes para la materia, el objetivo es motivar el inters de los estudiantes en la exploracin y el uso de recursos y mtodos computacionales bsicos para el desarrollo de VX DFWLYLGDG FLHQWtFD R SURIHVLRQDO IXWXUD 3DUD ello, describiremos en primer lugar algunas baVHV GH GDWRV HVSHFtFDV GH LQLFLDWLYDV JHQymicas de plantas e introduciremos el concepto de anotacin de datos genmicos. La segunda SDUWH GHO FDStWXOR HVWD GHGLFDGD D OD ELRLQIRUmtica aplicada a estudios de expresin, la bsqueda de marcadores moleculares funcionales y el anlisis de su variabilidad gentica. %DVHV GH GDWRV JHQHUDOHV \ HVSHFtFDV de especie (O XVR GH WHFQRORJtDV GH EDVHV GH GDWRV KD

VLGR DGRSWDGR SRU OD FRPXQLGDG FLHQWtFD GHVde el inicio de las iniciativas genmicas para facilitar la organizacin y la difusin de los datos. (VWR KDFH TXH VH GLVWLQJDQ GLVWLQWDV FDWHJRUtDV de bases de datos, entre las principales estn aquellas que son repositorios pblicos a gran HVFDOD \ EDVHV GH GDWRV HVSHFtFDV GH LQLFLDWLvas comunitarias Los repositorios pblicos a gran escala son bases de datos estables, generalmente mantenidas por agencias gubernamentales, que archivan principalmente informacin esttica, XQ HMHPSOR WtSLFR HV *HQEDQN /D LQIRUPDFLyQ disponible en esa base de datos en particular puede ser accedida a travs de ENTREZ, un buscador que combina la interrogacin simultnea de 35 bases de datos disponibles en HO VLWLR 1&%, $OJXQDV GH pVWDV VRQ EDVHV GH datos secundarias que agregan informacin a ORV GDWRV SULPDULRV VHFXHQFLDV QXFOHRWtGLFDV  entre las cuales podemos mencionar Gene, UniGene, HomoloGen o RefSeq. Dentro de las bases de datos comunitarias estn aquellas que almacenan datos derivados de estudios sobre especies modelo, generalmente focalizando en una especie o en un grupo de especies relacionadas. La primera EDVH GH GDWRV GH HVWD FDWHJRUtD HVWDEOHFLGD SDUD HVSHFLHV YHJHWDOHV HV 7KH $UDELGRSVLV ,QIRUPDWLRQ 5HVRXUFH 7$,5  TXH UH~QH OD informacin asociada a esta especie modelo HQ UHODFLyQ D VHFXHQFLDV JHQHV \ SURWHtQDV PDUFDGRUHV DOHORV PDSDV YtDV PHWDEyOLFDV OLWHUDWXUD SURWRFRORV PLFURDUUHJORV RQWRORJtD de genes, anotaciones, disponibilidad de germoplasma/semillas y herramientas de anlisis. En los ltimos aos, ha surgido una nueva generacin de bases de datos que integran la informacin de muchas especies para permitir la comparacin de genomas, entre ellas est Gramene que integra recursos para la compaUDFLyQ GH PDSDV JHQpWLFRV \ ItVLFRV GH DUUR] \ RWUDV HVSHFLHV GH JUDPtQHDV /,6 SHUPLWH la comparacin genmica y de transcriptos de GLVWLQWDV HVSHFLHV GH OHJXPLQRVDV QDOPHQWH 3K\WR]RPH KWWSZZZSK\WR]RPHQHW 7RRO IRU green plant comparative genomics) rene la informacin competa de 14 genomas vegetales, agrupamientos de genes ortlogos, parlogos y familias de genes y herramientas de anlisis

170 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

FRPR %/$67 SDUD KDFHU FRPSDUDFLRQHV FRQtra los proteomas de cada una de las especies representadas en la base de datos. La Tabla 1 condensa un nmero importante de bases de GDWRV HVSHFtFDV MXQWR FRQ VXV DFFHVRV :HE para facilitar la exploracin de las mismas. $VLPLVPR H[LVWHQ EDVHV GH GDWRV HVSHFtcas de patgenos que afectan cultivos agronmicamente importantes. Estas bases aportan informacin sobre la secuencia del genoma de los patgenos, la cual puede ser asociada a la informacin derivada de estudios funcionales de transcriptos inducidos durante la interaccin con la planta husped, permitiendo el diseo de estrategias de mejoramiento de los cultivos para lograr resistencia. Entre estas bases de datos se pueden mencionar a: Phytophthora Functional Genomics Database y PathoPlant. Anotacin funcional de los datos genmicos El proceso de anotacin de los datos genPLFRV D QLYHO GH SURWHtQDV FRQVLVWH HQ WUDWDU GH deducir a partir de los datos de secuenciacin QXFOHRWtGLFD ODV FDUDFWHUtVWLFDV IXQFLRQDOHV GHO genoma de un organismo, explorando y describiendo los niveles intermedios de organizacin como funciones y procesos moleculares, ceOXODUHV VLROyJLFRV FRPSDUWLPHQWDOL]DFLyQ GH las funciones, etc. Este proceso de anotacin demanda una gran integracin de los datos e informacin disponible para la especie o para especies relacionadas, haciendo uso de herramientas de la bioinformtica para la comparacin y la extraccin de datos y de las bases GH GDWRV JHQHUDOHV \ HVSHFtFDV GHO FRQRFLmiento biolgico acumulado en publicaciones y de los anlisis transcriptmicos o genmicos disponibles. Una de las primeras etapas en este proceso es la de tratar de asignar una funcin molecuODU D OD PD\RUtD GH ODV VHFXHQFLDV LQFyJQLWDV mediante la comparacin con genes de funcin conocida. La forma ms precisa para hacer esta comparacin es a nivel de productos de genes, o sea, trabajando con las secuencias de aminocidos obtenidas a partir de la traGXFFLyQ GH ODV VHFXHQFLDV QXFOHRWtGLFDV D ORV seis marcos de lectura posibles. Este mtodo de comparacin de secuencias, que es central

en el proceso de anotacin funcional, se basa HQ OD FDUDFWHUtVWLFD TXH WLHQHQ ODV SURWHtQDV KRmologas de conservar la misma funcin y se sustenta con bases de datos de secuencias de SURWHtQDV FXUDGDV FXLGDGRVDPHQWH FRPR SRU HMHPSOR 6ZLVV3URW R 3,5 No obstante, puede asumirse en general que ODV EDVHV GH GDWRV GH SURWHtQDV DVRFLDGDV D organismos modelo se encuentran correctamente anotadas y pueden usarse como referencia para inferir posibles funciones moleculares. Sin embargo, para que los procesos de anotacin dentro y entre especies en organisPRV QRPRGHOR VHDQ OR PiV HFLHQWH \ FRPSDrable posible, lo ptimo es referir la anotacin asignada a vocabularios estructurados u ontoORJtDV ([LVWHQ GLIHUHQWHV LQLFLDWLYDV SDUD HVtablecer vocabularios controlados, una de las PiV IUHFXHQWHPHQWH XVDGDV HV OD 2QWRORJtD de genes (Gene Ontology, GO), que establece WUHV FDWHJRUtDV R MHUDUTXtDV  ODV IXQFLRQHV moleculares, (2) los procesos biolgicos y (3) la localizacin sub-celular o componente celular. El proceso de anotacin es un proceso continuo que debe ser constantemente actualizado FRQ HO Q GH DJUHJDU QXHYD LQIRUPDFLyQ \ UHnar la informacin existente. Anotacin de secuencias en especies de plantas no-modelo $FRUGH D OR PHQFLRQDGR OD DQRWDFLyQ JHQyPLFD OOHYDGD D FDER HQ OD PD\RUtD GH ORV SURyectos y en especial en los proyectos de pequea envergadura dedicados a la caracterizacin de transcriptos o ESTs, se basan en el uso del DOJRULWPR %/$67 /D FDOLGDG GH ORV UHVXOWDGRV en todos los casos depende de los parmetros GHQLGRV SDUD UHFXSHUDU VHFXHQFLDV VLPLODUHV HQ OD FRPSDUDFLyQ XVDQGR %/$67; R %/$673 recomendndose como parmetros ptimos E valores menores de e-10, identidades mayores a 30% y coberturas mayores o iguales a 50%. Las bases de datos contra las cuales se realizan las comparaciones juegan tambin un rol importante en relacin al nmero y calidad de ORV KLWV UHFXSHUDGRV $OJXQDV GH ODV EDVHV GH GDWRV GH QXFOHyWLGRV \ SURWHtQDV PiV XWLOL]DGDV para la anotacin de secuencias de plantas son los ndice de Genes (DFCI: http://compbio.dfci. harvard.edu/tgi/), Unigenes (NCBI) y PlantGDB

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 171

KWWSZZZSODQWJGERUJ  /DV EDVHV GH GDWRV GH SURWHtQDV TXH VH XWLOL]DQ HQ JHQHUDO VRQ 15 6ZLVV3URW 7UHPEO 8QLSURW 8QLSURWVZ 8QLSURWWU 8QLUHI \ EDVHV GH SURWHtQDV GH SUR\HFWRV HVSHFtFRV 7DEOD   En base al mejor valor de similitud obtenido en la comparacin, se asigna una funcin gnica probable a cada secuencia analizada. Posteriormente, dicha anotacin se mapea contra una base de datos de Gene Ontology SDUD QDOPHQWH DQRWDU ORV SURGXFWRV GH JHnes acorde a las normas del Consorcio de 2QWRORJtD *pQLFD *2  2WURV YRFDEXODULRV controlados complementarios a GO, son la Comisin de Enzimas (Enzyme Comisin, EC)

que adjudica una numeracin basada en una FODVLFDFLyQ HVTXHPiWLFD GH HQ]LPDV VHJ~Q OD reaccin que se encuentran catalizando y el &RQVRUFLR .(** 7KH .\RWR (QF\FORSHGLD RI Genes and Genomes) que genera anotacin GH YtDV PHWDEyOLFDV SDUD DTXHOODV HVSHFLHV que presentan su genoma secuenciado o en YtDV QDOL]DFLyQ /D DQRWDFLyQ IXQFLRQDO EDVDGD HQ RQWRORJtDV SXHGH UHDOL]DUVH XVDQGR VRIWZDUH OLEUH SRU HMHPSOR %ODVW*2 R *2WFKD Expresin de Genes El anlisis de patrones de expresin consisWH HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH WRGRV ORV WUDQVFULStos presentes en una determinada muestra

Tabla 1: %DVHV GH GDWRV JHQyPLFDV HVSHFtFDV GH HVSHFLH


Bases de datos generales NCBI Plant Genomes Central PlantGDB: plant genome database MIPS plants databases Bases de datos multiespecie para genmica comparativa Phytozome: comparative genomics of plants Gramene: a Resource for Comparative Grass Genomics LIS: Legume Information System SALAD: Surveyed Alignment and Associating Dendrogram SGN: Solanaceas genomic network Bases de datos de genomas de iniciativas genmicas completas y parciales TAIR: The Arabidopsis Information Resource Rice Annotation Project Database (RAP -DB) Grain Genes 2.0: a Database for Triticeae and Avena MaizeDB Medicago truncatula: a model for legume research Lotus japonicus genome Wheat Applied Genomics SoyBase and the Soybean Breeder's Toolbox SoyMap: An integrated map of soybean for resolution and dissection of multiple Brassica rapa genome Compositae genomics projec t Cotton Marker Database Dendrome: a collection of forest tree genome databases and other forest genetic International Grape Genome Project Popu lus Genome Integrative Explorer Bases de datos de diversidad PanZea: Molecular and Functional Diversity of the Maize Genome ToL: Tree of Life Web Project www.panzea.org www.tolweb.org www.arabidopsis.org rapdb.dna.affrc.go.jp wheat. pw.usda.gov/GG2/index.shtml www.maizegdb.org www.medicago.org www.kazusa.or.jp/lotus masw heat.ucdavis.edu soybase.org www.soymap.org/ www.brassica -rapa.org/BRGP/index.jsp compgenomics.ucdavis.edu/compositae_index.php www.cottonmarker.org dendrome.ucdavis.edu www.vitaceae.org www.popgenie.db.umu.se www.phytozome.net www.gra mene.org www.comparative -legumes.org salad.dna.affrc.go.jp/salad www.sgn.cornell.edu URL www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html www.plantgdb.org mips.gsf.de/proj/plant/jsf/genomes.jsp

172 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

GH WHMLGR (O GHVDUUROOR GH WHFQRORJtDV GH DOWR procesamiento de datos ha permitido abordar estudios de expresin gnica en forma concertada para miles de genes a partir de distintos genotipos en determinados rganos, tejidos, y condiciones de crecimiento. El diseo de los H[SHULPHQWRV GH H[SUHVLyQ DVt FRPR ODV KHrramientas de anlisis de la informacin generada constituyen factores claves para obtener LQIRUPDFLyQ FRQ VLJQLFDGR ELROyJLFR Las distintas estrategias que permiten evaOXDU SHUOHV WUDQVFULSFLRQDOHV SXHGHQ GLYLGLUVH en dos grupos. Un primer grupo corresponde a estrategias en las que la estimacin del nivel de la expresin se basa en la intensidad relativa de una seal de hibridacin e incluye los tradicionales experimentos de northern blot \ ORV PLFURDUUHJORV GH $'1F HQ ORV FXDOHV VH toma la intensidad relativa de la seal como medida de la trascripcin. El otro grupo de estrategias se basa en una cuenta directa del nmero de cada transcripto presente en una muestra, incluyendo la secuenciacin de secuencias expresadas o Expressed Sequence Tags (ESTs), el anlisis de la expresin gnica HQ VHULH R 6HULDO $QDO\VLV RI *HQH ([SUHVLyQ 6$*( \ OD VHFXHQFLDFLyQ PDVLYD HQ SDUDOHOR o Massively Parallel Signature Sequencing 0366  (Q HVWH FDStWXOR VH GLVFXWLUiQ ODV HVtrategias de anlisis de expresin que permiten la evaluacin concertada de un gran nmero de genes en forma procesiva. Expressed Sequence Tags (ESTs): /D VHFXHQFLDFLyQ GH PROpFXODV GH $'1 FRPSOHPHQWDULR $'1F VLQWHWL]DGDV D SDUWLU GH $51 PHQVDMHURV REWHQLGRV GH PXHVWUD ELRlgica en particular, realizada a travs de una nica lectura, da origen a un conjunto de secuencias denominadas ESTs, que representan secuencias parciales de las colecciones origiQDOHV GH $'1F $FWXDOPHQWH OD GLYLVLyQ (67 GH *HQ%DQN cuenta con un total aproximado de 6.000.000 secuencias y se encuentran representadas ms de 100 especies de plantas. /D VHFXHQFLDFLyQ GH $'1F FRQVWLWX\y XQD herramienta alternativa de los proyectos genmicos para el descubrimiento de nuevos genes para distintas especies, cuando la secuenciacin de genomas complejos no contaba con

las actuales tcnicas de secuenciacin masiva que prometen en un futuro cercano capacidad de procesamiento elevada a costos accesibles D OD FRPXQLGDG HQ JHQHUDO $~Q FRQ HO DGYHQLmiento de proyectos genmicos de gran escaOD OD VHFXHQFLDFLyQ GH (67V SHUPLWH OD LGHQWLcacin de genes que se expresan en pocos tejidos y/o su expresin es muy baja, mediante la FRQVWUXFFLyQ GH FROHFFLRQHV GH $'1F QRUPDOLzadas o enriquecidas en determinados transcriptos como las colecciones derivadas de tcnicas de hibridacin sustractiva o Suppressed 6XEWUDFWHG +\EULGL]DWLRQ $VLPLVPR HO DJUXpamiento de ESTs derivados de distintas coOHFFLRQHV GH $'1F SDUD XQD GDGD HVSHFLH HQ grupos o clusters de secuencias no redundantes, utilizando rutinas de anlisis como las esquematizadas en la Figura 1 permite estimar el nmero de genes de una especie. Respecto al anlisis de expresin gnica, los ESTs contribuyen a estos estudios a travs GH GRV YtDV  OD SURSRUFLyQ GH (67V FRUUHVpondientes a un determinado gen respecto a un conjunto de ESTs generados en distintas FRQGLFLRQHV H[SHULPHQWDOHV UHHMD HO QLYHO GH expresin del mismo; y 2) en segundo lugar las bases de ESTs se utilizan para el diseo de oligonucletidos en experimentos de microarreJORV GH $'1F SDUD HYDOXDU H[SUHVLyQ JpQLFD Los experimentos de microarreglos representan una de las herramientas ms frecuentes para aproximarse a los anlisis de expresin de genes a gran escala. Una vez que se obtienen los resultados surgen interrogantes como Cules son los genes sobre o sub-expresados en el experimento?, Cules son los SHUOHV GH H[SUHVLyQ TXH SXHGHQ UHYHODUVH HQ general a partir de este experimento? En esta VHFFLyQ HMHPSOLFDUHPRV XQ FDVR GH HVWXGLR para ilustrar el proceso de anlisis utilizando programas de libre distribucin basados en el OHQJXDMH HVWDGtVWLFR 5 %LRFRQGXFWRU  (Q HO ,QVWLWXWR GH %LRWHFQRORJtD GH ,17$ Castelar (IB) se dise un microarreglo de $'1F FRQWHQLHQGR  VHFXHQFLDV GH WLSR ESTs previamente desarrollados en base a VHFXHQFLDV yUJDQRHVSHFtFDV GH XQD OtQHD GH girasol cultivado). Para la impresin de los miFURDUUHJORV GH $'1F VREUH VRSRUWH GH YLGULR VH DPSOLFDURQ SRU 3&5 ORV IUDJPHQWRV UH-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 173

)LJXUD  H%LRSLSHOLQH $ YLVWD HVTXHPiWLFD % SiJLQD LQLFLDO PHQ~ GH SURJUDPDFLyQ \ VDOLGDV del programa.

presentativos de los unigenes anotados en las bibliotecas previamente caracterizadas. Estos PLFURDUUHJORV IXHURQ KLEULGDGRV FRQ $51 WRWDO de plantas crecidas en invernculo y sometidas a dos condiciones de estrs abitico difeUHQFLDOHV IUtR \ VDOLQLGDG 8QD YH] LPSUHVRV los vidrios fueron escaneados (usando canaOHV SDUD DPERV XRUyIRURV D WUHV LQWHQVLGDGHV GLIHUHQWHV XVDQGR HO OHFWRU GH XRUHVFHQFLD 9HUV$UUD\ &KLS 5HDGHU %LR5DG  /DV LPiJHnes obtenidas fueron analizadas utilizando el SURJUDPD GH DFFHVR OLEUH 6SRWQGHU ZZZ WPRUJVSRWQGHUKWPO  FXDQWLFiQGRVH OD LQtensidad de seal para cada spot. Luego, se realiz una integracin de los datos de las imgenes escaneadas (Figura 2). Preprocesamiento de los datos La imagen obtenida a partir de un microarreglo corresponde a la informacin cruda de un H[SHULPHQWR GH HVWDV FDUDFWHUtVWLFDV (V DVt que los algoritmos computacionales convierten la imagen en informacin numrica que cuanWLFD GLFKD H[SUHVLyQ HVWH HV HO SULPHU SDVR en un anlisis de datos de microarreglos, y es fundamental la calidad y la rigurosidad obteni-

da de la misma para la posterior interpretacin que se obtendr como resultado. Normalizacin La normalizacin es un trmino genrico que VH UHHUH D OD UHVROXFLyQ GH HUURUHV VLVWHPiWLFRV \ GHVYtRV SURGXFLGRV HQ XQ PLFURDUUHJOR debido a condiciones experimentales inevitables y propias de la plataforma utilizada. La normalizacin y el anlisis de expresin global se realizaron en este caso a travs de programas generados utilizando el programa R 8QLYHUVLW\ RI $XFNODQG D WUDYpV GH VX YHUVLyQ 5  KWWSZZZUSURMHFWRUJ  /RV GDWRV GH cada vidrio fueron normalizados corrigendo la dependencia por intensidad mediante la utilizaFLyQ GHO VXDYL]DGRU QR SDUDPpWULFR /2:(66 (regresin local ponderada). Se realiz una integracin de los datos de las rplicas tcnicas dentro de cada soporte (cada spot fue impreso 4 veces) y las rplicas tcnicas entre soporWHV LQWHUFDPELR GH XRUyIRURV R dye-swap). Luego de este paso el producto obtenido es una matriz de expresin gnica cuyo anlisis VH IRFDOL]D HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV FRQ expresiones diferenciales.

174 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Figura 2: Imagen de una micromatriz de dos canales (Bello y col. 2006)

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Limpieza de datos y transformacin Una vez obtenida la matriz de expresin gnica, existe una serie de pasos que se llevan a cabo para asegurar una alta calidad en el anlisis. Ellos son: la remocin de spots dudosos o FRQLFWLYRV DJJHG IHDWXUHV), que se resuelve ya sea eliminando los spots con error aparente (con el consiguiente riesgo de prdida de datos valiosos), o marcndolos para luego referirlos a la imagen original en el momento de su anlisis; la correccin y/o sustraccin del ruido de fondo (correccin o sustraccin de background). La seal de fondo es indicadora de XQD KLEULGDFLyQ LQHVSHFtFD VLHPSUH \ FXDQGR la intensidad del spot de inters sea mayor que la intensidad del ruido de fondo. Si ocurre al revs, existe la posibilidad que est representando un problema local en el microarreglo y la intensidad del spot se convierta en informacin QR FRQDEOH \ SRU ~OWLPR OD WUDQVIRUPDFLyQ ORJDUtWPLFD GH ORV YDORUHV SDUD KDFHU FRQVWDQWH la variabilidad a todos los niveles de intensidad detectados. Anlisis estadstico de los datos Evaluacin de consistencia en las repeticiones Para evaluar las diferencias asociadas a las repeticiones biolgicas de este experimento se obtuvo una ordenacin de las mismas en un plano de ordenacin generado mediante anlisis de componentes principales aplicado a la matriz de expresiones gnicas. Esta aproximacin tuvo en cuenta la informacin de todos los genes simultneamente y permiti establecer VL XQD UHSHWLFLyQ VH FRPSRUWDED GH PDQHUD DWtpica o no. ,GHQWLFDFLyQ GH JUXSRV GH JHQHV FRQ H[SUHsin diferencial. El anlisis de la matriz de expresin gnica VH IRFDOL]y HQ OD LGHQWLFDFLyQ GH JHQHV FRQ H[presiones diferenciales. Existen diversas estrategias para obtener un listado de genes candidatos. La estrategia ms sencilla es aplicar una prueba de hiptesis tradicional gen a gen. Esta aproximacin tiene el inconveniente de generar un gran nmero de falsos positivos. Los mtodos correctivos, basados en el control de

la tasa de falsos positivos, presentan a su vez OD GLFXOWDG GH JHQHUDU XQD DOWD WDVD GH IDOVRV QHJDWLYRV 3RU FRQVLJXLHQWH OD PHWRGRORJtD utilizada en este trabajo consisti en complementar las tcnicas de inferencia clsicas con un criterio de seleccin basado en el ordenamiento de genes y tratamientos en el espacio generado por los dos primeros ejes principales obtenidos de un anlisis de componentes principales de la matriz de expresin gnica. Posteriormente, y dentro del conjunto de genes seleccionados en el paso anterior, se realiz el UHFRQRFLPLHQWR GH JUXSRV GH JHQHV FRQ SHUOHV de expresin similar mediante la aplicacin de XQ DOJRULWPR GH FODVLFDFLyQ QR VXSHUYLVDGD k-centroides para nuestro caso de estudio. El anlisis transcripcional mediante la aplicacin de k-centroides permiti detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresin. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostr variacin en sus niveles medios a travs de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenci sobre-expresin respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrs SRU IUtR R SRU VDOLQLGDG  'H PDQHUD DQiORJD 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observ una sub-expresin respecto del control en ambos tratamientos. Obtencin de la lista de genes diferencialmente expresados Para combinar esta aproximacin, basada HQ OD RUGHQDFLyQ GH JHQHV SRU $&3 \ HO FULWHULR clsico de prueba de hiptesis para igualdad de medias, se consideraron slo aquellos genes que para la prueba clsica de anlisis de la varianza tuvieran un p-valor menor o igual a 0,05 y que estuvieran a un distancia del origen en la Figura 3 mayor que 9 (correspondiente, aproximadamente al percentil 70 de la distribucin de distancias al origen). Este criterio de corte se seleccion teniendo en cuenta el gen 7 *HQEDQN $1 %8  TXH KDEtD VLGR previamente validado experimentalmente. Para cada uno de los 80 genes seleccioQDGRV FRPR JHQHV FDQGLGDWRV VH JUDFy HO SHUO GH H[SUHVLyQ VHJ~Q VX FRPSRUWDPLHQWR HQ FDGD WUDWDPLHQWR D WUDYpV GH XQ JUiFR GH colores de expresin diferencial (heatmap) de

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Figura 3. Bi-plot que muestra genes con p-valor para un test F< 0,05 y con una distancia al origen < perFHQWLOR  GH OD GLVWDQFLD DO RULJHQ GH OD GLVWULEXFLyQ FtUFXORV UHOOHQRV 

modo de analizar cualitativamente el gradiente diferencial por tratamiento y por gen mediante XQ JUiFR GH SHUOHV GH H[SUHVLyQ LQGLYLGXDles. De estos resultados surgieron genes candidatos de inters para su anlisis de expresin diferencial, de los cuales 15 fueron seleccionados para validar mediante la tcnica de PCR cuantitativa (qPCR). Este ltimo paso de validacin es de una herramienta indispensable en el anlisis de microarreglos ya que por todo lo expuesto anteriormente podemos inferir que los genes obtenidos son producto de transformaciones numricas y una evaluacin subjetiva al criteULR HVWDGtVWLFR DSOLFDGR (V DVt TXH SRGHPRV FRQFOXLU TXH OD YDOLGDFLyQ H[SHULPHQWDO FRQHre rigurosidad biolgica a un conjunto de supuestos genes candidatos obtenidos a partir de una lista de genes diferencialmente expresa-

dos para las condiciones evaluadas, producto QDO GH XQ DQiOLVLV GH PLFURDUUHJORV Bsqueda de marcadores funcionales en bases de datos genmicos Como mencionamos anteriormente, la secuenciacin completa de los genomas de especies modelo o parcial de especies de inters ha generado una rpida acumulacin de informacin biolgica que es depositada en bases de datos genmicas y es fcilmente accesible a travs de Internet. Esta informacin, que deriva en muchos casos de la caracterizacin de OtQHDV HOLWH GH XQD PLVPD HVSHFLH GH HVSHFLHV de un mismo gnero o de distintas fuentes relacionadas, constituye el recurso que permite sistematizar el desarrollo de marcadores moleculares potencialmente asociados a la variaFLyQ IHQRWtSLFD SDUD FDUDFWHUHV GH LQWHUpV (O

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potencial de descubrir marcadores moleculares funcionales analizando las secuencias depositadas en las bases de datos generales, fundamentalmente de ESTs, ha permitido superar una de las limitaciones ms importantes GH ORV PDUFDGRUHV PROHFXODUHV ORFXVHVSHFtco que es el costo inicial de desarrollo. ,GHQWLFDFLyQ LQ silico de SNPs /RV SROLPRUVPRV GH QXFOHyWLGR VLPSOH (SNPs) o los generados por pequeas inserciones/deleciones (Indels) se han convertido en una de las herramientas ms utilizadas para la caracterizacin gentica tanto de plantas como de animales debido a su baja tasa de mutacin y a su gran abundancia, ubicuidad y dispersin en los genomas. Su uso se ha extendido a aplicaciones tales como la construccin de mapas genticos de alta resolucin, mapeo de asociacin, estudios de diversidad JHQpWLFD \ FRQVHUYDFLyQ LGHQWLFDFLyQ \ DQiOLsis de la estabilidad de cultivares, delimitacin \ DVLJQDFLyQ GH JUXSRV KHWHUyWLFRV DQiOLVLV logenticos, seleccin asistida por marcadores y caracterizacin de recursos genticos. Un SNP representa una diferencia en una EDVH QXFOHRWtGLFD HQWUH  VHFXHQFLDV GH $'1 y puede ser categorizada como transicin (C/T RU *$ R WUDQVYHUVLyQ &* $7 &$ R 7* GH DFXHUGR D OD VXVWLWXFLyQ QXFOHRWtGLFD REVHUYDda. El uso de marcadores SNP para cualquiera de las aplicaciones mencionadas requiere de una primera etapa de deteccin y desarrollo que puede ser abordada a partir de una estrategia de laboratorio (ej. secuenciacin y comparacin de genes o regiones candidatas en un conjunto de materiales de inters) o bien estar basada en aproximaciones in silico que hacen uso de la informacin de secuencia disponible en las bases de datos biolgicas. En este ltimo caso, el procedimiento de bsqueda generalmente involucra un protocolo de pocos SDVRV 3ULPHUR VH LGHQWLFDQ VHFXHQFLDV FRQ alta similitud entre mltiples individuos a partir de una o varias bases de datos previamente seleccionadas en funcin del organismo o tipo de carcter que se desee estudiar, utilizando habitualmente los algoritmos de bsqueda de VLPLOLWXG GH VHFXHQFLDV GH WLSR %/$67 %DVLF /RFDO $OLJQPHQW 6HDUFK 7RRO  3RVWHULRUPHQWH

se realizan los alineamientos base a base para cada uno de los grupos de secuencias y los mismos son analizados para detectar las difeUHQFLDV QXFOHRWtGLFDV R 613V /D ULJXURVLGDG \ detallada evaluacin de esta instancia es fundamental para encontrar verdaderas variantes allicas dentro de los diferentes grupos. Es por ello que se encuentran disponibles diverVDV KHUUDPLHQWDV HVWDGtVWLFDV TXH SHUPLWHQ GLferenciar los errores de secuenciacin de las verdaderas variantes allicas basndose en el valor de calidad de la base secuenciada y en medidas de exactitud de la secuencia. Los programas desarrollados para la deteccin de SNPs, tanto para uso acadmico (PolyBayes y PolyPhred) como aquellos sujetos a licencias comerciales (Sequencher, Gene Codes Corporation) utilizan los datos de calidad de secuencia para eliminar los falsos positivos o incorporan el concepto de velocidad de mutaciones esperadas para distinguir los verdadeURV 613V $VLPLVPR HVWRV SURJUDPDV RIUHFHQ OD YHQWDMD GH SUHVHQWDU XQD LQWHUIDVH JUiFD y pueden ser usados tanto para comparacin de secuencias cortas como para estimar SNPs dentro de largas regiones genmicas. Muchos grupos han explorado adems mtodos alternativos de deteccin de SNPs basados en el XVR GH PLFURDUUHJORV GH $'1 GH DOWD GHQVLGDG ,GHQWLFDFLyQ LQ silico de SSRs Los microsatlites (repeticiones en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucletidos) son herramientas muy tiles como marcadores JHQRWtSLFRV GHELGR D TXH VRQ UHODWLYDPHQWH abundantes, multiallicos (hipervariables con respecto al nmero de repeticiones), heredados en forma estable y codominantes (se distinguen los alelos de un locus), permitiendo distinguir materiales estrechamente relacionados. Desde el punto de vista metodolgico, son fciles de detectar mediante PCR, requiriendo SRFD FDQWLGDG GH $'1 SDUD HO DQiOLVLV \ SRFR equipamiento. /D LGHQWLFDFLyQ in silico de SSRs a partir de la abundancia de secuencias genmicas disponibles para genomas vegetales, al igual que para los SNPs, se ha convertido en la alternativa ms econmica de desarrollar este tipo de marcadores haciendo uso de herramientas

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FRPSXWDFLRQDOHV HFLHQWHV $VLPLVPR HV PX\ frecuente poder asociar una funcin molecular determinada por similitud a la secuencia que alberga la repeticin convirtindolo en un marcador funcional. Existen distintas herramientas computaFLRQDOHV EDVDGDV HQ OD ZHE SDUD HO GHVFXEULmiento de SSRs y el diseo de iniciadores esSHFtFRV SDUD OD DPSOLFDFLyQ GH ORV PLVPRV Se pueden mencionar como ejemplos el programa SSRPoly accesible desde el sitio http:// acpfg.imb.uq.edu.au/ssrpoly.php, que permite OD LGHQWLFDFLyQ GH 665 SROLPyUFRV TXH VH GLVWLQJXHQ GH ODV YDULDQWHV PRQRPyUFDV SRU la representacin de tamaos variables del miFURVDWpOLWH LGHQWLFDGR HQ DOLQHDPLHQWRV P~OWLples de secuencias representadas en la bases de datos. Otra herramienta valiosa disponible HQ OD ZHE HV &8*, 665 6HUYHU KWWSZZZJHQRPHFOHPVRQHGXFJLELQFXJLBVVU). Anlisis de la variabilidad gentica Finalizada la etapa de desarrollo de marcadores moleculares, la fase siguiente generalPHQWH FRQVLVWH HQ OD JHQRWLSLFDFLyQ GH JUDQGHV FDQWLGDGHV GH LQGLYLGXRV D Q GH GHWHUPLQDU las variantes allicas presentes en cada uno de ellos para cada uno de los marcadores detecWDGRV /D HOHFFLyQ GH OD PHWRGRORJtD PDV DSURpiada depender de los recursos disponibles y del nivel de procesamiento que se desee alcanzar. Entre las ms utilizadas para el caso de los SNPs pueden mencionarse: secuenciacin GLUHFWD DPSOLFDFLyQ DOHORHVSHFLFD SRU UHDFcin en cadena de la polimerasa (PCR), mtodos de digestin enzimtica, hibridacin con ROLJRQXFOHyWLGRV DOHORHVSHFtFRV \ SRU ~OWLPR las plataformas de microarreglos GoldenGate H ,QQLXP GHVDUUROODGDV SRU ,OOXPLQD ,OOXPLQD 6DQ 'LHJR &$ 86$  /D WHFQRORJtD GH 613V SUHVHQWD XQ JUDQ SRWHQFLDO SDUD OD LGHQWLFDFLyQ GH ODV IRUPDV DOpOLcas que controlan procesos biolgicos complejos, como la resistencia a los estreses biticos y abiticos que afectan la productividad de los cultivos. Sin embargo, para ser aprovechado en su totalidad, este potencial debe ser comELQDGR FRQ PHWRGRORJtDV DQDOtWLFDV DSURSLDGDV (Q ORV ~OWLPRV DxRV ODV PHWRGRORJtDV GH mapeo por asociacin han surgido como com-

plemento de las aproximaciones convencionales (ej. Mapeo de QTLs) y han ido cobrando cada vez ms importancia como herramientas para alcanzar un mayor grado de resolucin. En pocas palabras, el razonamiento subyacente al mapeo de asociacin consiste en utilizar eventos de recombinacin histricos a lo largo de un linaje, y no solamente aquellos ocurridos en una determinada poblacin de mapeo, para establecer posibles relaciones entre genotipo \ IHQRWLSR /RV SROLPRUVPRV UHVSRQVDEOHV GH OD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD QR VRQ REVHUYDGRV HQ forma directa, si no que surgen a partir de inIHUHQFLD HVWDGtVWLFD /D EDVH SDUD OD GHWHFFLyQ de tales correlaciones es la asociacin no aleaWRULD HQWUH XQ SROLPRUVPR GDGR \ OD YDULDFLyQ IHQRWtSLFD SDUD FLHUWR UDVJR GH LQWHUpV HV GHFLU OD LGHQWLFDFLyQ GH GHVHTXLOLEULR GH OLJDPLHQWR (DL) entre las variantes genticas causales de OD YDULDFLyQ GHO FDUiFWHU \ ORV SROLPRUVPRV analizados. Previo a cualquier estudio de mapeo por asociacin, y para realizar un diseo experimental apropiado, es necesario conocer el grado y la estructura genmica del DL en la especie a evaluar, ya que ste es variable tanto entre especies como para las diferentes regiones de un mismo genoma. Las dos medidas preferiGDV HQ OD OLWHUDWXUD SDUD FXDQWLFDU '/ VRQ HO FRHFLHQWH GH GHVHTXLOLEULR HVWDQGDUL]DGR ' y la correlacin de frecuencias allicas al cuadrado (r2). La estimacin del DL generalmente involucra grandes cantidades de marcadores, razn por la cual suelen resultar tiles las heUUDPLHQWDV GH VRIWZDUH TXH SHUPLWHQ VLVWHPDWLzar el clculo de ambas medidas y representar JUiFDPHQWH ODV DVRFLDFLRQHV KDOODGDV SRU HM '1$VS $UOHTXLQ *ROG *ROG6XUIHU  El desarrollo de un estudio de mapeo por DVRFLDFLyQ LQYROXFUD OD HYDOXDFLyQ IHQRWtSLFD del carcter agronmico de inters (ej. peso GHO JUDQR FRQWHQLGR GH DFHLWH GtDV D RUDFLyQ $8'3& HWF \ OD JHQRWLSLFDFLyQ GH XQ conjunto apropiado de SNPs para cada una de ODV HQWLGDGHV D FRPSDUDU OtQHDV YDULHGDGHV HWF  (O Q~PHUR \ QDWXUDOH]D GH ORV SROLPRUVmos a caracterizar depender de la estrategia de anlisis que se haya seleccionado. Si se GHVHD H[SORUDU WRGR HO JHQRPD JHQRPHZLGH analysis) el nmero de SNPs ser mucho ma-

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yor (entre 10.000 y 100.000) que el requerido VL VyOR VH HVWXGLDQ ORV SROLPRUVPRV FRUUHVpondientes a un grupo de genes candidatos. Sin embargo, en este ltimo caso es necesario un conocimiento previo de la base gentica del FDUiFWHU IHQRWtSLFR HQ HVWXGLR 2WUR DVSHFWR importante del diseo experimental es la seleccin de individuos. En humanos generalmente HV OD XWLOL]DFLyQ GH PHWRGRORJtDV EDVDGDV HQ poblaciones de enfermos vs. controles sanos (case-control) o aquellas que involucran individuos relacionados o familias en donde algn individuo es enfermo (Transmission disequilibrium tests). En plantas, los individuos de la poblacin en estudio usualmente incluyen gerPRSODVPD GH GLVWLQWR RULJHQ JHRJUiFR FRQ HO objeto de abarcar la mayor cantidad posible de YDULDFLyQ JHQpWLFD \ IHQRWtSLFD /DV LQIHUHQFLDV HVWDGtVWLFDV GHO PDSHR SRU asociacin para rasgos continuos son generalmente realizadas a travs de anlisis de regresin lineal, si bien tambin son aplicables otras aproximaciones. Dado que existen diversos factores que pueden llevar al establecimiento de asociaciones espurias, se han desarrollaGR PRGHORV HVSHFtFRV HQ GRQGH HV SRVLEOH incorporar las distintas variables intervinientes y controlar su efecto en la deteccin de asociaciones. Entre los procesos que pueden interferir en el anlisis se encuentran: la subestructuracin de las poblaciones estudiadas, las interacciones epistticas y pleiotrpicas, las interacciones entre genotipo y ambiente, el tamao muestral pequeo, la complejidad del carcter en estudio y la calidad de los registros IHQRWtSLFRV (O VRIWZDUH 7DVVHOO HV XQR GH ORV paquetes ms utilizados para los estudios de asociacin en plantas ya que incluye metodoloJtDV TXH SHUPLWHQ WHQHU HQ FXHQWD OD HVWUXFWXUD poblacional y el grado de parentesco entre los individuos analizados. En conclusin, el mapeo por asociacin constituye una poderosa herramienta para la diseccin gentica de caracteres complejos, siendo los SNPs marcadores ideales para la implementacin de tales estudios dada su alta frecuencia y ubicuidad en los genomas.

Lecturas recomendadas
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PARTE II Mtodos para generar y analizar diversidad

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II CAPTULO 1 Polinizacin y fertilizacin in vitro


Susana Cardone, Gladys Prez Camargo, Aurora Picca 1 Introduccin Durante la reproduccin sexual de las Angiospermas los procesos de polinizacin y fecundacin conducen a la unin de las gametas masculina y femenina para formar el embrin, que junto con el endosperma darn origen a la semilla, que generar una nueva planta. La fecundacin contribuye a la diversidad gentica y proporciona la base sobre la que se trabajar HQ WRPHMRUDPLHQWR El hecho ms notable de la fertilizacin in vivo de las Angiospermas es el de la doble fecundacin, que es un fenmeno muy complejo en comparacin con lo que acontece en todos los dems seres vivos. Para que la polinizacin se produzca, durante el desarrollo in vivo, deben ocurrir una serie de interacciones y seales entre el grano de polen y los diferentes tejidos del pistilo. El grano de polen hace contacto con las clulas receptivas del pistilo

(clulas papilares del estigma) que permiten su adhesin, hidratacin y germinacin, extendiendo su intina y generando un tubo polnico, cuya funcin es transportar las clulas espermticas hacia el vulo. En ese momento se desorganiza el ncleo vegetativo mientras que la clula generativa dar lugar a las dos clulas espermticas que se vuelcan en una de las sinrgidas, sta se desorganiza y uno de los ncleos espermticos se fusiona con la osfera para dar el cigoto, que luego producir el embrin. El otro ncleo masculino se reunir con dos ncleos femeninos para dar la clula madre del endosperma que es, por lo tanto, triploide (Fig 1). Durante la evolucin de las plantas superiores, surgieron diferentes barreras de cruzamiento que controlan la transferencia de genes de una especie a otra o dentro de la misma especie. A veces, el polen no puede germinar sobre el HVWLJPD GH OD RU DXQTXH pVWH VH KDOOH UHFHStivo. Este hecho puede deberse a limitaciones JHQpWLFDV R VLROyJLFDV (VWDV EDUUHUDV VH GHnominan de prefertilizacin o precigticas y pueden ser eludidas mediante las tcnicas de polinizacin in vitro.

Figura 1. Corte longitudinal de un vulo mostrando la doble fecundacin en Angiosperma

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Otras veces, a pesar de la ocurrencia de la polinizacin, la fecundacin no puede llevarse a cabo, por diversos motivos. El trmino fertilizacin in vitro se utiliza para aquellos casos donde la fusin de las gametas aisladas se logra por distintos mtodos como la electrofusin, altas concentraciones de calcio o elevado pH. En este captulo se utilizarn indistintamente los trminos fecundacin y fertilizacin FRPR VLQyQLPRV UHULpQGRVH D OD XQLyQ GH ODV gametas masculina y femenina para originar un nuevo individuo. En ocasiones, la fecundacin ocurre normalmente pero el embrin aborta en forma precoz. Esto es lo que se conoce como barreras posfertilizacin o poscigticas, que pueden contrarrestarse con tcnicas de rescate embrionario. Frente a todas estas limitaciones, las tcnicas de cultivo in vitro y manipulacin de clulas aisladas resultan apropiadas para lograr el proceso completo de desarrollo del embrin y del endosperma y la obtencin de semillas normales. Una de esas tcnicas, desarrollada por Kanta y colaboradores (1962), demostr que en algunas especies de Papaverceas los granos de polen tenan la capacidad de germinar in vitro, directamente sobre los vulos en cultivo. A partir de la misma, surgen una serie de metodologas que se conocen en general como tcnicas de polinizacin in vitro. Las tcnicas de micromanipulacin desarrolladas durante los aos 80 permitieron el aislamiento y la fusin in vitro de gametas de Angiospermas. La combinacin de estas tcnicas con mtodos de cultivo de clulas nicas, posibilitaron la fertilizacin in vitro. Se pudo entonces concretar el desarrollo de cigotos y de endospermas en forma individual, in vitro, demostrando que son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del tejido materno. Tanto los cigotos obtenidos in vitro como los que son aislados despus de la polinizacin in vivo desarrollan en embriones normales y posteriormente en plantas frtiles. Los sistemas de polinizacin y fertilizacin in vitro pretenden salvar las barreras pre y postfertilizacin para obtener plantas frtiles. Los recientes progresos relacionados con estas metodologas, conjuntamente con los

proyectos de genmica, posibilitarn una mejor comprensin de los procesos de reconocimiento gamtico, fusin y activacin de seales intracelulares que participan en los eventos tempranos de desarrollo del huevo y formacin del cigoto. Estos conocimientos permitirn una DSOLFDFLyQ PiV HFLHQWH GH HVWDV WpFQLFDV HQ ORV SURJUDPDV GH WRPHMRUDPLHQWR 2 Polinizacin in vitro En algunas especies, las barreras de prefertilizacin impiden la autofecundacin o el cruzamiento, por diferentes mecanismos genticos o bioqumicos. La incapacidad del polen de germinar en estigmas propios o extraos se denomina incompatibilidad. Esta puede deberse a varias razones: por ejemplo que el tubo polnico se deshaga en el estilo, o a la incapacidad del tubo polnico para alcanzar el vulo debido a una lenta velocidad de crecimiento, o a una excesiva longitud del estilo. En estos casos, el ovario aborta antes de que el tubo polnico alcance la base del estilo. Las barreras que obstaculizan los cruzaPLHQWRV LQWHUHVSHFtFRV QR VRQ GHPDVLDGR FRnocidas, aunque es evidente la existencia de interacciones en el proceso de reconocimiento polen-pistilo. Los mecanismos que originan la imposibilidad de los cruzamientos intraespecFRV VRQ PXFKR PiV FRQRFLGRV 3RU HMHPSOR el de la autoincompatibilidad, que involucra interacciones polen-pistilo que determinan la inhabilidad de una planta hermafrodita para producir cigotos, a travs de la autopolinizacin. En este sistema, el intercambio de informacin entre el polen y el tubo polnico permite al estigma y al estilo discriminar el polen de plantas idnticas del proveniente de otros miembros de la misma especie. Existen dos grandes sistemas de autoincompatibilidad, que se diferencian en sus estrategias moleculares y genticas: a) autoincompatilidad esporiftica, en ella, el resultado de la polinizacin est deteminado por el genotipo de la planta en la que se ha formado el grano de polen. En este tipo de incompatibilidad, presente en la familia de las Brasicceas, protenas de bajo peso molecular provenientes del polen, difunden desde la

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exina e interactan de manera allica con un receptor quinasa, localizado en las clulas del estigma. Dicha interaccin estimula la actividad fosforilante del receptor y se produce el EORTXHR GH OD KLGUDWDFLyQ HVSHFtFD GHO JUDQR de polen, impidiendo su germinacin. b) autoincompatibilidad gametoftica en la cual, la ocurrencia de la polinizacin est determinada por el genotipo haploide del polen. Bajo este sistema se encuentran dos mecanismos diferentes: Uno es tpico de las Papaverceas. En este, las seales de autoincompatibilidad se traducen por medio de protenas, FRGLFDGDV SRU XQ JHQ HVSHFtFR TXH generan la movilizacin del calcio, fosforilando protenas del polen que desencadenan la muerte celular del tubo polnico. En el otro mecanismo, presente en SolaQiFHDV XQ ORFXV HVSHFtFR HO ORFXV 6 FRGLFD SDUD 51$VDV TXH DFW~DQ VREUH ORV WXERV SROtQLFRV GHJUDGDQGR DO $51 GHO polen propio, inhibiendo su crecimiento.

El injerto del estilo, en la cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta madre que se desea fertilizar. La polinizacin de vulos aislados que se cultivan directamente sobre el medio de cultivo. En esta tcnica los vulos son separados de su placenta; por esta causa es un procedimiento mucho ms complicado, que ha sido empleado con xito slo en pocas especies de plantas. La polinizacin placental, tcnica en la cual los vulos se ponen en contacto con el polen por remocin de la pared del ovario o a travs de un corte en la parte superior del mismo. En esta metodologa los porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los vulos no resultan daados durante las manipulaciones involucradas en su aislamiento. El cultivo del vulo junto con la placenta incrementa, en general, las posibilidades de un rpido desarrollo embrionario.

Para sortear estas incompatibilidades surgieron tcnicas de polinizacin in vitro. La primera, desarrollada en Papaver somniferum, ha sido tambin empleada exitosamente en 14 familias de Angiospermas, resultando ms adecuada su aplicacin en aquellas especies que poseen ovarios grandes y que contienen muchos vulos. Dentro de las especies de plantas en las que se abord la tcnica se pueden citar Dianthus caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica, Argemone mexicana, Eschechlozia californica, Petunia violacea, Antirrhinum majus y Dicranostigma franchetianum. Bajo el nombre de polinizacin in vitro se suele englobar a varias metodologas que VXUJLHURQ D SDUWLU GH PRGLFDFLRQHV GHO SURFHdimiento inicial, que si bien poseen puntos en FRP~Q GLHUHQ HQ RWURV (QWUH HVWDV PHWRGRlogas se encuentran: La polinizacin estigmtica, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el polen sobre el estigma.

La polinizacin placental in vitro se ha utilizado con xito para salvar las barreras de incompatibilidad precigticas (autoincompatiELOLGDG H LQFRPSDWLELOLGDG LQWHUHVSHFtFD  HQ varias especies, inclusive cuando, experimentalmente, se intent el cruzamiento a partir de vulos de Angiospermas con polen proveniente de Gimnospermas. En este caso, al realizarse el anlisis embriolgico de los vulos de la especie Melandrium album, MDGRV WUHV GtDV despus de la polinizacin con polen de Pinus wallihiana, se observ la presencia de remanentes de tubos polnicos y embriones bicelulares en los sacos embrionarios. La polinizacin con polen mentor Se ha utilizado, en muchas especies de plantas, una estrategia para salvar las barreras de incompatibilidad, involucrando mezclas de polen no compatible con polen compatible muerto (denominado mentor). El rol del polen mentor es proveer alguna funcin, por ejemplo, a travs del aporte de sustancias proteicas,

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las que facilitan la polinizacin del polen incompatible. Alguna de las especies en las que se ha utilizado son: Populus, Malus, Petunia y Nicotiana. Finalmente, en todos los casos, la gameta femenina es fecundada por clulas espermticas, liberadas por el tubo polnico, en forma casi idntica a la va natural, con la consiguiente formacin de semilla normal en un medio de cultivo apropiado. En general, todos los medios de cultivo para germinacin de los granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de cido brico. 1R REVWDQWH SDUD TXH ORV SURFHGLPLHQWRV anteriormente citados sean exitosos es crucial realizar el aislamiento de los vulos y del polen HQ HO HVWDGR VLROyJLFR DGHFXDGR SRU OR TXH es indispensable llevar a cabo la determinacin de la duracin de los distintos estadios del desarrollo de ambos, como por ejemplo: a) Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y polinizacin, b) Precisar el momento en que el estigma est receptivo, c) (VSHFLFDU HO LQVWDQWH RSRUWXQR SDUD OD SRlinizacin y d) Establecer el tiempo adecuado para recoger el polen. 3 Fertilizacin in vitro 'XUDQWH DxRV ORV FLHQWtFRV LQWHQWDURQ LPLWDU los mecanismos de fecundacin que acontecen in vivo, utilizando tcnicas de fertilizacin in vitro de gametas aisladas; esta aplicacin fue ms sencilla en animales y en plantas inferiores pero no pudieron ser aplicadas a las plantas superiores hasta comienzos de la dcada de los noventa. Esto se debi a que la fertilizacin in vivo en las plantas superiores es un proceso muy diferente al que ocurre en los sistemas animales y de plantas inferiores, donde las gametas son de vida libre. El primer aislamiento de clulas espermticas vivas fue reportado por Cass en 1973, en el cul se aislaron gametos masculinos de cebada por ruptura de granos de polen en una solucin de sacarosa al 20%. A partir de este aislamiento se pudieron describir las caractersticas celulares de ese gameto. Esto se

repiti luego con xito en varias especies de Angiospermas. Para el aislamiento de gametas femeninas existe un mtodo que se emplea a menudo y que consiste en un tratamiento con enzimas diludas para disolver las paredes celulares, acompaado de la micromanipulacin para separar las otras clulas del saco embrionario. En 1991, Kranz y col. reportaron la primera fusin de gametas de maz in vitro, pudiendo reproducirse actualmente en esta especie el ciclo de vida completo, comenzando con la electrofusin de la clula espermtica con la ovoclula, dando como resultado un cigoto, un emEULyQ \ QDOPHQWH XQD SODQWD 3HVH D TXH VH KD tomado al maz como sistema vegetal modelo, en el cual estudiar los procesos de fusin de gametas y posterior embriognesis, tambin se han realizado trabajos exitosos de fusin de gametas en trigo, donde Kovacs (1995) logr la fusin de gametas in vitro, obteniendo como resultado estructuras multicelulares y en algunos casos del tipo de microcallos. En los ~OWLPRV DxRV VH KD ORJUDGR QDOPHQWH OD IXVLyQ de gametas en Nicotiana tabacum, la que pudiendo ser una especie modelo en dicotiledneas para estudiar la fertilizacin in vitro, dada su capacidad para la regeneracin de plantas, presenta sin embargo el inconveniente de que las gametas no se fusionan fcilmente. Tradicionalmente, se consider que todas las clulas espermticas tenan igual posibilidad de fusionarse con la clula huevo. Sin embargo, actualmente se sabe que existen mecanismos de fusin preferencial a nivel gamtico, donde un determinado morfotipo de clula espermtica es reconocido. Cuando est presenWH HVWH PHFDQLVPR KD\ XQD LGHQWLFDFLyQ GH las dos clulas espermticas, candidatas para la fusin celular y una eleccin de la que se fusionar con la ovoclula. La discriminacin se basa en las diferencias de las clulas espermWLFDV UHVSHFWR GH VX KHWHURPRUVPR FLWRSODVPiWLFR HQ WDPDxR IRUPD YROXPHQ VXSHUFLH contenido de organelas y asociacin fsica con el ncleo vegetativo. Por otro lado, el contacto del polen con el gameto femenino parece estimular la maduracin del mismo, incluyendo la acumulacin de calcio necesaria, la organizacin de la clula huevo, la migracin nuclear,

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y la progresin del ciclo celular. Este ltimo factor parecera ser crtico en la combinacin exitosa de gametas. Adems, hay seales, suministradas por el saco embrionario, que permiten estimular el crecimiento y la maduracin del tubo polnico. Para que la fertilizacin tenga lugar, in vitro, no slo deben aislarse las gametas femeninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse, en ausencia de las clulas asociadas. Para obtener un embrin in vitro, los pasos a seguir son los siguientes: Aislamiento y seleccin de las gametas Se han desarrollado mtodos de aislamiento y seleccin de gametas para una amplia variedad de especies vegetales, entre ellas: maz (Zea mays), trigo (Triticum aestivum), cebada (Hordeum vulgare), raygrass (Lolium perenne) \ DOJXQDV EUDVLFiFHDV $ Q GH UHDOL]DU HFLHQtemente este paso se debe: &RQRFHU H[KDXVWLYDPHQWH OD PRUIRORJtD Rral de la especie a utilizar, con el objetivo de ubicar el saco embrionario y sus clulas constituyentes. b) Aislar las gametas masculinas, a partir de los granos de polen mediante choque elctrico, osmtico y/o de pH. c) Aislar el saco embrionario y las gametas femeninas mediante microdiseccin individual en asociacin con maceracin enzimtica. Este paso es crtico y limitante ya que pueden obtenerse pocas gametas femeninas y el proceso de manipulacin es muy delicado. El tratamiento de las espigas, previo a la polinizacin con 2,4-D, que induce a la expansin del ovario, facilita el proceso resultando en ovarios ms grandes y vulos ms blandos, incremenWDQGR OD HFLHQFLD HQ HO DLVODPLHQWR GH ODV RYRclulas. Fertilizacin in vitro propiamente dicha Puede realizarse mediante la microinyeccin de clulas espermticas o ncleos espermticos aislados, en clulas individuales obtenidas de los sacos embrionarios, o por electrofusin. En este ltimo caso las gametas se ponen en contacto en una cmara de electrofusin por alineacin dielectrofortica y se fusionan mediante pulsos elctricos (Fig. 2). Los productos de fusin pueden ser entonces cultivados en

Figura 2. Fertilizacin in vitro mediante electrofusin

una solucin con clulas nodrizas y algunos de ellos desarrollarn en proembriones. Fusin de las gametas. En maz, la secuenFLD GH HYHQWRV SDUD TXH VH YHULTXH OD IXVLyQ in vitro es la siguiente: las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco sometidos a un shock de pH en una solucin 0,5 M de manitol. Las ovoclulas y los protoplastos de las clulas centrales del saco embrionario se aislan de los vulos por tratamiento con enzimas celulolticas y microdiseccin manual. Las dos gametas aisladas se colocan de a pares, bajo condiciones de esterilidad, en un medio de fusin simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl2). Para realizar este procedimiento se utilizan microagujas de vidrio que permiten poner en contacto las gametas IHPHQLQDV \ PDVFXOLQDV D Q GH IDFLOLWDU \ GLrigir la fusin. La adhesin y posterior fusin de las gametas es rpida (aproximadamente 10 segundos). A los 20 minutos de realizada la fusin, deja de visualizarse el ncleo masculino y 20 horas despus es posible observar mediante microscopio ptico, con contraste de

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fases la presencia de dos ncleos, de manera similar a lo que se observa in vivo. La formacin del endosperma ocurre cuando se fusiona el ncleo de la clula espermtica con los dos ncleos polares. Los estudios in vitro, sobre los primeros eventos despus de la fusin de las clulas y ncleos, indican que las primeras clulas del endosperma resultante desarrollan un tejido caracterstico capaz de auto-organizarse en forma separada del tejido materno. Este proceso se completa, en esta especie, aproximadamente dos horas despus de la fusin in vitro de las clulas que forman el embrin. 4 Cultivo de vulos y embriones in vitro El cultivo de vulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulacin del material es difcil. El vulo es una estructura delicada, muy pequea, altamente hidratada, que puede ser daada con suma facilidad. Es imprescindible realizar la microciruga con rapidez para evitar que los tejidos sufran deVHFDFLyQ GXUDQWH HO SURFHVR 3HVH D ODV GLFXOtades de la tcnica, en algunos cruzamientos LQWHUHVSHFtFRV FRPR ORV UHDOL]DGRV HQ SDSD algodn y Hevea brasiliensis, se comprob que el cultivo de vulos completos es ms exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados. El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los vulos de una planta y cultivarlos en un medio estril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal. Esta tcnica es relativamente fcil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de xito son muy EXHQDV /DV GLFXOWDGHV VH LQFUHPHQWDQ FXDQto ms inmaduro sea el embrin a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son ms HVSHFtFRV HQ ODV HWDSDV WHPSUDQDV GH GHVDrrollo del embrin. Factores externos que condicionan el cultivo de vulos y embriones Entre los factores externos ms importantes que afectan el cultivo de vulos y de embriones se citan: el medio de cultivo, la osmolaridad y los reguladores de crecimiento.

El vulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, que varan con el estadio de desarrollo del mismo y que es neceVDULR LGHQWLFDU SDUD FDGD HVSHFLH HQ SDUWLFXlar. Por consiguiente un aspecto fundamental a tener en cuenta en el rescate de embriones es la seleccin correcta del medio de cultivo adecuado para cumplir con los requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario, siendo necesario a veces la transferencia de los embriones de un medio de cultivo a otro para garantizar un ptimo crecimiento. Se pueden reconocer dos fases en el desarrollo embrionario con respecto a la nutricin: OD IDVH KHWHURWUyFD en la que el embrin es dependiente del endosperma y dems tejidos maternos que lo rodean, y OD IDVH DXWRWUyFD, en la cual el embrin es capaz de sintetizar las sustancias requeridas para su crecimiento a partir de sales minerales y azcares. La etapa crtica de pasaje de una fase a otra vara con las especies.

La introduccin de agua de coco y extractos de endospermas en el medio de cultivo han sido muy tiles ya que activan el crecimiento y desarrollo de los embriones en el cultivo de vulos de algunas especies vegetales. Por otro lado, no existe demasiada evidencia acerca de la absoluta necesidad de los reguladores de crecimiento para el desarrollo de los embriones extrados, sean inmaduros o maduros, excepto en el rol que cumplen en la ruptura de la dormicin. La concentracin osmtica es un factor importante en el desarrollo de vulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en los medios de cultivo no slo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento sino que adems mantiene la osmolaridad requerida para cada etapa del desarrollo. Est demostrado que una presin osmtica elevada previene la germinacin precoz de los embriones inmaduros, evitando as la ocurrencia de malformaciones estructurales. A medida que van creciendo, los embriones necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa.

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5HVSHFWR GH ORV UHTXHULPLHQWRV GH WHPSHUDtura, los embriones de la mayora de las especies presentan un buen crecimiento en un rango de temperaturas que va de los 25 C a los 30 C. Aunque algunos estudios indican que la luz no es crtica para el crecimiento de los embriones, se demostr que en el caso de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinacin precoz en los embriones inmaduros. Entre los medios de cultivo ms difundidos para el cultivo de vulos y embriones se pueden citar el de Murashige y Skoog (1962), MonQLHU   5DQGROSK \ &R[   *DPERUJ y col. (1976), Liu y col. (1993). 5 Aplicaciones de las Tcnicas de Fertilizacin in vitro 5.1 Aplicaciones en el Mejoramiento Gentico Vegetal Las tcnicas antes mencionadas han sido utilizadas para salvar algunos obstculos que se le presentan al mejorador de plantas cuando desea realizar cruzamientos, para el logro de ciertos objetivos de mejoramiento. A continuacin se mencionan ejemplos de aplicacin de las metodologas de polinizacin y fertilizacin in vitro: En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinizacin placental in vitro permiti que se superen las barreras de incompatibilidad precigtica, obtenindose embriones hbridos y an plantas hbridas, imposibles de obtener mediante tcnicas convencionales. As se realizaron los cruzamientos de las siguientes especies: Zea mays x Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N. amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta. La polinizacin in vitro se emple tambin como va para la obtencin de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes condiciones de estrs, acelerando as la obtencin de plantas resistentes. Esta estrategia se desarroll en maz, con polen cosechado de plantas creciendo a temperaturas elevadas y condujo a la obtencin de plantas tolerantes a estrs por calor. En Brassica rapa, la seleccin de polen a baja tempe-

ratura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en condiciones de fro, logrando acumular ms peso seco que en progenies obtenidas sin la seleccin previa del polen. El cultivo de vulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea: rescatar embriones abortivos deULYDGRV GH OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD R LQWHUgenrica, superar problemas de abscisin precoz del fruto, recuperar embriones de cruzas LQWHUHVSHFtFDV TXH FRQGXFHQ D OD REWHQFLyQ de haploides y acortar el perodo de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse, en el endosperma o en la cubierta de la misma, inhibidores del desarrollo del embrin. Los siguientes ejemplos ilustran las diversas aplicaciones: Durante la produccin comercial del triticaOH HVSHFLH REWHQLGD DUWLFLDOPHQWH PHGLDQWH el cruzamiento de trigo y centeno, el cultivo o rescate de embriones se utiliz para superar el alto grado de incompatibilidad del cruzamiento inicial, ya que los embriones abortaban en estadios tempranos del desarrollo debido a una incompatibilidad con el endosperma. Esta tcnica y la aplicacin de colchicina en plantas hbridas, fueron de fundamental importancia para salvar los problemas que se presentaron en el cruzamiento inicial y la marcada esterilidad que posea la F1. El perfeccionamiento de estas dos metodologas fue decisiva para la produccin de un gran nmero de triticales hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, ORJUDQGR QDOPHQWH XQ DOWR JUDGR GH IHUWLOLGDG Las tcnicas de rescate de embrionario son necesarias como complemento en la producFLyQ DUWLFLDO GH KDSORLGHV (Q HOODV VH FXOWLYDQ embriones que se forman por partenognesis o por eliminacin de cromosomas luego de la KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD R LQWHUJHQpULFD (Q algunos casos los embriones haploides se distinguen morfolgicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro, en medios y condiciones adecuados (ver en este libro Parte IV-Captulo 1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploida. Esta tcnica se ha utilizado con xito en cebada, trigo y tabaco.

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Tambin se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se desarrolla normalmente, como sucede en los cruzamientos de cultivares diploides y tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se desintegra despus de la fecundacin, como en Oenothera biennis x O. muricata o O.biennis x O. lamarckiana. Esta tcnica tambin es de utilidad para sortear barreras de dormicin o en casos donde la viabilidad de la semilla es baja, como en yuca y otras especies del gnero Manihot. El cultivo in vitro de embriones es tambin una alternativa para el intercambio de semilla a travs de fronteras internacionales. En un proyecto de mapeo de genes con resistencia al virus del mosaico, en yuca, desarrollado entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Colombia) y IITA (Instituto Internacional de Agricultura Tropical, con sede HQ 1LJHULD IXH QHFHVDULR WUDVODGDU VWRFNV GH semillas desde Sudamrica al continente africano, el cultivo de embriones result ser un excelente mtodo para transferir germoplasma FRQ PtQLPRV ULHVJRV WRVDQLWDULRV El cultivo de embriones ha ayudado tambin al mejoramiento gentico de especies lexRVDV TXH WLHQHQ GLFXOWDG HQ OD JHUPLQDFLyQ de sus semillas, como en Taxus mairei, o con escasa produccin de semillas como es el caso de Pseudotsuga macrolepis. El cultivo de embriones inmaduros puede ser aplicado para disminuir el tiempo necesario en la obtencin de un nuevo cultivar. Por ejemplo en soja se requieren unos diez aos SDUD HVWH Q 6L VH FRQVLJXHQ UHDOL]DU YDULDV generaciones por ao, en contraestacin, se acelera el proceso. El cultivo de embriones inmaduros ahorrara, adems, el tiempo de maduracin de la semilla. En este y en cada caso en particular, se debe realizar la evaluacin del EHQHFLR HFRQyPLFR SDUD GHFLGLU OD XWLOL]DFLyQ de estas tcnicas. Cultivo de nucelas En las plantas leosas, los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneracin, se ha inducido entonces con xito la embriognesis somtica

a partir de nucelas de vulos jvenes. Este es el caso de Citrus sp, Vitis vinifera, Malus domesticus, Psidium guajava y Pyrus serotina. La tcnica de rescate de vulos fecundados se utiliza tambin en aquellos cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario como en el cruzamiento Trifolium repens x T. hybridum. Las tcnicas de fertilizacin in vitro pueden complementar, adems, las metodologas de transformacin de plantas. Por ejemplo, a travs de la obtencin de un embrin a partir de cigotos transgnicos que han sido manipulados, utilizando un protocolo que involucra la microinyeccin de genes en el cigoto. Esta tcnica evitara la utilizacin de antibiticos y genes de resistencia a herbicidas, como marcadores, durante el proceso de seleccin de las clulas transformadas. Otra ventaja de la fertilizacin in vitro es la posibilidad de realizar cruzamientos entre planWDV TXH VRQ ORJHQpWLFDPHQWH GLVWDQWHV IXVLRnando in vitro sus respectivas gametas para producir cigotos hbridos. Se evitan as los inconvenientes que frecuentemente se observan en la hibridacin somtica, como por ejemplo la ocurrencia de inestabilidad del hbrido respecto GHO Q~PHUR GH FURPRVRPDV R ODV GLFXOWDGHV ncleo e inter-citoplasmticas (ya que en este caso es la clula huevo la que contribuye con el citoplasma del cigoto hbrido. Adems, en la fusin gamtica, el desarrollo temprano del cigoto est regulado por genes pertenecientes a la clula huevo, los que brindan seales celulares propias, haciendo que progrese el ciclo celular en forma exitosa con el resultado de proembriones producto de las sucesivas divisiones celulares. Pese a la potencialidad de la tcnica de hibridacin distante a partir de gametos, es importante la eleccin de especies parentales DGHFXDGDV SDUD PLQLPL]DU ODV GLFXOWDGHV TXH VXUJHQ SURGXFWR GH ODV GLIHUHQFLDV ORJHQpWLFRV VLROyJLFDV \ GHO FLFOR FHOXODU 5.2 Aplicaciones para dilucidar aspectos bsicos del desarrollo en plantas /DV GLFXOWDGHV HQ HO DLVODPLHQWR GH ORV JD-

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metos de las plantas superiores ha obstaculizado durante mucho tiempo la comprensin GH OD VLRORJtD JDPpWLFD \ GH ORV PHFDQLVPRV que desencadenan la embriognesis; los embriones cigticos en su medio natural ofrecen GLFXOWDGHV GHELGR D VX WDPDxR SHTXHxR \ DO hecho de estar inmersos en el tejido materno. A partir del aislamiento de clulas espermticas, clulas huevo y cigotas, se han podido realizar estudios moleculares de las clulas germinales, evitando las interferencias que resultan de la interaccin con el tejido somtico. Asimismo se ha facilitado el anlisis de los efectos genticos, epigenticos e interacciones ncleo-citoplasmticas inherentes a los gametos como tambin el estudio del desarrollo del embrin y el endosperma. De este modo, la fertilizacin in vitro de las plantas superiores se ha convertido en un rea de investigacin importante, resultando actualmente uno de los campos principales de la biologa vegetal.

Los estudios sobre la embriognesis somtica WDPELpQ KDQ SHUPLWLGR LGHQWLFDU SDWURQHV de expresin gnica relacionados con este proceso, que se desencadena a travs del cultivo de tejidos. El sistema mejor estudiado, en relacin con la embriognesis somtica, es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus carota). En este sistema, la remocin del 2,4-D (cido 2, 4-diclorofenoxiactico) del medio de cultivo, genera una respuesta embriognica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen, de a millares, en un medio lquido (ver en este libro Parte II-Captulo 1). Los embriones somticos constituyen una excelente herramienta para estudiar los procesos de desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. Las plantas parecen poseer un programa embriognico preestablecido que se desenFDGHQD HQ UHVSXHVWD D FRQGLFLRQHV HVSHFtcas. El proceso de fertilizacin dispara la em-

Tabla 1 5HVXPHQ GH ORV DYDQFHV PHWRGROyJLFRV SRVLELOLWDGRV SRU ODV WpFQLFDV GH fertilizacin in vitro SDUD HO HVWXGLR GHO SURFHVR GH OD GREOH IHFXQGDFLyQ GH ODV $QJLRVSHUPDV 0RGLFDGR GH :DQJ \ FRO 2006).

Cultivo in vitro de cigotos y embriones

Fusin in vitro de gametas

Aislamiento de clulas generativas

Cada una de estas tcnicas ha posibilitado:

Investigar los requerimientos del embrin durante su desarrollo Investigar los aspectos moleculares de la embriognesis Determinar la rec eptividad del cigoto para la transformacin

Investigar los mecanismos de activacin del cigoto

Estudiar la ultraestructura de las clulas generativas

Hibridar especies distantes Investigar las diferencias entre las clulas del saco embrionario Obtener bibliotecas de ADNc de cigotas Realizar electroforesis de productos de clulas generativas Construir bibliotecas de ADNc de clulas generativas

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briognesis cigtica, cuyos estadios normales de desarrollo se muestran en la Fig. 3. Una serie de investigaciones han demostrado que hay requerimientos para que los gametos se fusionen in vivo, por ejemplo la presencia de calcio, elemento que posee una actividad altamente fusognica y que adems activara el desarrollo del cigoto. Adems, al estudiar la ultraestructura celular se han encontrado diferencias en la arquitectura de los microtbulos entre la clula huevo no fertilizada y el cigoto, demostrando que este cambio est inducido por la fertilizacin. El cultivo in vitro y las tecnologas diseadas para estudiar la expresin gnica han permitido analizar por separado la funcin de genes SUHVHQWHV GH PDQHUD HVSHFtFD HQ ODV FpOXODV que participan en el proceso de fertilizacin. Con la utilizacin de tcnicas de especiales de electroforesis bidimensional se han podido LGHQWLFDU SURWHtQDV GH FpOXODV JDPpWLFDV \ FLgticas, encontrndose pocas diferencias entre los patrones proteicos de embriones somWLFRV \ FLJyWLFRV 1LQJ \ FRODERUDGRUHV 

Figura 3. Estados de la embriognesis en Arabidopsis thaliana

estudiaron la contribucin de los genes de las clulas espermticas, la clula huevo y la cigota y obtuvieron evidencias de que hay clusters de genes que estn presentes en la clula huevo y espermticas, que persisten en el cigoto, mientras que hay una gran cantidad de genes que son propios del cigoto, produciendo en ste nuevos transcriptos. En el caso particular de la gameta masculina, se sabe que cada una de las funciones para las cuales est destinada (reconocimiento, fusin y adhesin con la gameta femenina), est controlada por la activacin de genes. Por ejemSOR ;X \ FRODERUDGRUHV  LGHQWLFDURQ \ caracterizaron dos genes de histonas gcH2A y gcH3 que actan durante la maduracin de la clula espermtica y tambin el gen LGC1 que se expresa exclusivamente en las clulas gamticas masculinas. El producto de este ltimo gen (una protena) fue localizado en la superFLH GH ODV FpOXODV JDPpWLFDV PDVFXOLQDV VXgiriendo un posible rol en la interaccin clula espermtica-clula huevo, en el momento del reconocimiento o sealizacin. Adems, este mismo grupo de investigacin aisl, a partir de XQD ELEOLRWHFD GH $'1F GRV JHQHV 1W6 \ 1W6 TXH FRGLFDQ SDUD XQD SROLJDODFWXURQDVD HQ]LPD TXH WHQGUtD OD IXQFLyQ GH PRGLFDU la pared celular durante la diferenciacin de las clulas espermticas. 3HVH D ODV GLFXOWDGHV TXH SUHVHQWD HO DLVODmiento de las gametas femeninas (hay menor HFLHQFLD HQ OD REWHQFLyQ GH FpOXODV TXH HQ las masculinas), tambin se han logrado progresos en el esclarecimiento de sus funciones. Por ejemplo, recientes investigaciones han esclarecido detalles acerca de la expresin de genes involucrados en el gameto femenino que determinan la gua del tubo polnico y la maduracin de las anteras, como por ejemplo el gen ZmEA1, en maz, que posee una funcin en la atraccin del tubo polnico a la micrpila. Cuando este gen est regulado negativamente, la seal direccional del tubo polnico a OD PLFUySLOD HV LQVXFLHQWH \ QR VH SURGXFH OD fertilizacin. En relacin a la expresin de genes en la HPEULRJpQHVLV GHO PDt] VH KDQ LGHQWLFDGR DOgunos diferencialmente expresados en la clula basal y apical del embrin bicelular. En esta

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misma especie la clula huevo mostr un incremento en la abundancia de transcriptos que involucran funciones como la comunicacin celular, el crecimiento y la divisin celular, la sntesis GH $'1 \ IDFWRUHV UHODFLRQDGRV FRQ HVWUHVHV \ transduccin de seales. Por otro lado, las clulas centrales del saco embrionario muestran una abundancia de transcriptos involucrados con los procesos relacionados con el metabolismo de la energa y la sntesis proteica. En cada caso, esWRV SURGXFWRV SDUHFHUtDQ UHHMDU FDWHJRUtDV IXQcionales representadas en el futuro desarrollo del embrin y el endosperma. Como en el caso ya citado de la clula espermtica, se han idenWLFDGR WDPELpQ HQ OD FpOXOD KXHYR \ OD FLJRWD genes de histonas que podran representar un mecanismo regulatorio de varios genes. El nmero de herramientas disponibles en la actualidad para manipular las gametas de las plantas superiores provee numerosas oportuQLGDGHV SDUD UHDOL]DU SURJUHVRV FLHQWtFRV \ tecnolgicos. La investigacin en el rea de la biologa reproductiva de las Angiospermas ha entrado en una nueva fase, donde los mtodos de la biologa molecular permiten responder muchas preguntas acerca de los mecanismos fundamentales de la fecundacin y activacin del desarrollo embriognico temprano. Un resumen de las tcnicas de fertilizacin in vitro que han permitido el acceso a nuevas investigaciones en el rea molecular de este tema, se muestran en la Tabla 1. El desarrollo de sistemas experimentales en varias especies, particularmente en dicotiledQHDV VRQ QHFHVDULRV SDUD FRQUPDU ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV HQ JUDPtQHDV D Q GH FRPSOHmentar la informacin molecular acerca del proceso de fertilizacin y mejorar los mtodos para la produccin de plantas regeneradas frtiles, con combinaciones genticas estables y de alta HFLHQFLD 6 Lecturas recomendadas
&$66 '  $Q XOWUDVWUXFWXUDO DQG 1RPDUVNL interference study of the sperms of barley. Can J Bot 51:601-605. &+(1 6 <$1* < /,$2 - .8$1* $ 7,$1 +. 2008. Isolation of egg cells and zygotes of Torenia fournieri L. and determination of their surface

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Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 195

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196 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

II CAPTULO 2 Hibridacin Somtica


Pablo Polci y Pablo Friedrich 1 Introduccin La mejora gentica de las plantas cultivadas en procura de incrementar la produccin viene siendo practicada por el ser humano desde hace miles de aos, seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello, el homEUH KD HPSOHDGR ORV FUX]DPLHQWRV FRQ HO Q de incrementar la variabilidad gentica, paso inicial en el proceso de mejoramiento. De esta manera la hibridacin entre especies diferentes SHUPLWLy DXPHQWDU GH PRGR VLJQLFDWLYR OD SURductividad de diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos esta estrategia no result exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad gentica. La hibridacin somtica, es decir, la obtencin de plantas hbridas a partir de la fusin de clulas o de protoplastos derivados de clulas somticas, surgi hace unos 30 aos como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigtica.. Esta tcnica, si bien presenta algunas limitaciones, como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos casos, demostr ser til en la mejora gentica de plantas, principalmente por permitir la introgresin limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses. Tambin permite la obtencin de citoplasmas hbridos (cbridos). La hibridacin asimtrica y cibridizacin sirve como puente para la transferencia de genes individuales La tcnica de fusin de protoplastos se desarroll en la dcada de 1950-60, a partir de la observacin de que ciertos virus pueden inducir la fusin de clulas animales. Sin embargo, recin en la dcada de 1980-90 tuvo un mayor auge debido a la aparicin de mtodos qumicos y elctricos ms apropiados para la fusin de clulas vegetales. La pared presente en estas clulas representa una barrera que normalmente impide la fusin entre ellas. Por

ello, la obtencin de plantas hbridas somticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestin enzimtica de las paredes celulares, para luego proceder a la fusin de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y posterior regeneracin de plantas a partir de los productos de fusin. La hibridacin somtica en plantas comenz a desarrollarse a principios de 1970 con la aplicacin de mtodos qumicos de fusin, y se extendi en los 80 con el empleo de mtodos de electrofusin. (V UHOHYDQWH GHVWDFDU TXH D ORV QHV GHO mejoramiento gentico, el sistema de protoplastos no slo se emplea para la obtencin de hbridos somticos, sino que tambin constituye un material apropiado para la incorporacin GH $'1 H[yJHQR $VLPLVPR OD IXVLyQ GH SURWRplastos tiene un uso mucho ms amplio que el estrictamente de inters agronmico; en tal sentido, es de gran utilidad en estudios de biologa celular as como para otras aplicaciones biotecnolgicas, por ejemplo, la produccin de anticuerpos monoclonales. 2 Hibridacin somtica vs. hibridacin sexual En relacin a su potencialidad para producir hbridos, existen diferencias importantes entre la fusin de protoplastos somticos y el cruzamiento sexual: La hibridacin sexual entre organismos de diferentes especies est limitada por barreras de incompatibilidad. En algunos casos estas barreras son precigticas, es decir, no permiten que se produzca la fecundacin. Tal limitante no existe en la fusin de protoplastos, dado que este SURFHVR HV QRHVSHFtFR SHUPLWLHQGR OD fusin de clulas de orgenes muy diversos, incluso de organismos muy distanFLDGRV ORJHQpWLFDPHQWH SRU HMHPSOR clulas animales y vegetales). Ello no VLJQLFD TXH SXHGD UHJHQHUDUVH XQ RUganismo viable y frtil a partir de cualquier tipo de combinacin entre clulas. De hecho, la bsqueda de hbridos de inters agronmico ha demostrado que el principal aporte de esta metodologa es

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 197

la introgresin, en los cultivos, de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas. La hibridacin sexual ocurre normalmente por fusin de clulas haploides (n + n), mientras que en la hibridacin somtica se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno de ellos conteniendo slo parte de su genoma. Otra diferencia est dada por la herencia de los genes extranucleares, esto es, plastdicos y mitocondriales. Mientras que en la reproduccin sexual el genoma citoplasmtico es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridacin somtica se combinan organelas de ambos progenitores, produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmticos.

tencia horizontal a enfermedades y otros son polignicos, por lo que su transferencia es factible por hibridacin somtica pero no por transformacin gentica. Sin embargo, en la actualidad, con las nuevas herramientas aportadas por la genmica se est avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vas metablicas. Estos podran ser transferidos en conjunto va transgnesis. 4 Tipos de hbridos somticos Cuando se realiza la fusin de protoplastos se obtienen clulas con el aporte de cromosomas de dos o ms ncleos. Si los protoplastos involucrados en la fusin proceden de distintos tipos parentales se originan heterocariones, y si proceden del mismo tipo parental se originan homocariones. Cuando en el heterocarin ocurre la fusin de los ncleos (cariogamia), se forma una clula hbrida. A partir de una clula hbrida, que contiene dos genomas completos, se puede regenerar una planta que, segn cual haya sido el destino del material gentico nuclear durante las divisiones celulares que siguen a la fusin, puede ser de tres tipos: 1. Hbrido simtrico, que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental. 2. Hbrido asimtrico, que tiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales y slo una parte del genoma nuclear del otro parental. 3. Cbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales, reteniendo slo material gentico extranuclear del otro parental. Es usual que en el proceso de regeneracin de plantas hbridas ocurra una eliminacin gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales, producindose de este modo hbridos asimtricos o cbridos. La prctica de la hibridacin somtica en plantas demostr que, en general, los hbridos asimtricos y cbridos son ms valiosos que los simtricos producidos HQWUH SODQWDV DOHMDGDV ORJHQpWLFDPHQWH 3RU esta razn se han desarrollado mtodos para

3 Hibridacin somtica vs. transformacin gentica La preponderancia que han tomado las tcnicas de transformacin gentica ha relegado a la hibridacin somtica a un papel de menor VLJQLFDFLyQ FRPR KHUUDPLHQWD ELRWHFQROyJLFD aplicada al mejoramiento de los cultivos. Comparando ambas metodologas, podemos destacar las siguientes diferencias: En la transformacin gentica se incorporan uno o pocos genes exgenos en una planta, mientras que en la hibridacin somtica el nmero de genes introGXFLGRV HV PD\RU GDGR TXH VH WUDQVHren cromosomas de una especie a otra o se combinan dos genomas completos. La hibridacin somtica permite transferir caracteres sin necesidad de contar con un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresin de dichos caracteres. Por el contrario, la transformacin genWLFD UHTXLHUH OD SUHYLD LGHQWLFDFLyQ \ DLVlamiento de los genes que determinan la expresin del carcter de inters. Caracteres tales como productividad, tolerancia a ciertos tipos de estrs, resis-

198 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

inducir la hibridacin asimtrica o cibridacin, alterando el genoma de uno de los protoplastos parentales. En este caso se dice que se WUDQVHUH SDUWH GHO JHQRPD GH XQ SURWRSODVWR donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusin, pueden producirse tres tipos de clulas hbridas: 1. Clulas hbridas simtricas, por fusin de dos protoplastos con sus genomas completos. 2. Clula hbrida asimtrica, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su ncleo inviable o slo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma, lo que provoca la fragmentacin de los cromosomas. Una vez producida la fusin, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo un hbrido asimtrico. El tratamiento de irradiacin parece no tener efectos deletreos o mutagnicos sobre los genomas de organelas, probablemente debido a que cada clula posee varias copias de ellas. Tambin puede producirse una clula hbrida asimtrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno o pocos cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formacin de microncleos por tratamientos con agentes antimicrotbulos. 3. Cbridos, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo con un protoplasto enucleado o con su ncleo inviable. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmtico. Asimismo, el mtodo de irradiacin con rayos X o Gamma puede generar cbridos en casos en que se produzca la eliminacin total de los fragmentos cromosmicos. Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo (receptores), pueden ser tratados pre-

viamente con inhibidores metablicos. En este caso slo pueden sobrevivir, por complementacin metablica, los heterocariones conteniendo el ncleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado. La segregacin de los plstidos y mitocondrias de los dos tipos parentales tambin constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneracin de plantas hbridas. Es frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello es poco comn entre plstidos. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras, la regla es que al cabo de pocas divisiones mitticas las clulas formadas contengan plstidos provenientes de uno u otro tipo parental. As, una clula hbrida origina una colonia de clulas que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmticos, pero con una mayor frecuencia de clulas que poseen mitocondrias recombinantes y plstidos de uno u otro tipo parental. El destino que sufre el material gentico nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir de una poblacin de clulas hbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes nucleares, plastdicos y mitocondriales. La Figura 1 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridacin somtica, las cuales son tratadas a continuacin. 5 Aislamiento de protoplastos El desarrollo de mtodos enzimticos de aislamiento a partir de 1960 brind la posibilidad de obtener grandes cantidades de protoplasWRV YHJHWDOHV (OOR WXYR JUDQ LQXHQFLD HQ GLferentes reas de la biologa y la biotecnologa de plantas, dada la utilidad de los protoplastos FRPR VLVWHPD H[SHULPHQWDO SDUD HVWXGLRV VLRlgicos, bioqumicos y moleculares, as como para su aplicacin al mejoramiento gentico. Los protocolos de aislamiento emplean enzimas fngicas con actividad celulasa y pectinasa, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 199

Aislamiento de protoplastos

Protoplastos parentales 1 ?

Protoplastos parentales 2 ?

Modificaciones genmicas para produccin de hbridos simtricos/cbridos y/o pretratamiento para posterior seleccin (opcionales)

Protoplastos parentales 1 (originales o modificados) ? ? ? ? ?

Protoplastos parentales 2 (originales o modificados)

Fusin de protoplastos

? Mezcla de protoplastos parentales y productos de fusin ? ?

Seleccin de clulas hbridas


Protoplastos hbridos ?

Cultivo de protoplastos hbridos y regeneracin de plantas

Cultivo de la mezcla de protoplastos en medio selectivo (opcional) y regeneracin de plantas

Figura 1: Materiales y procesos involucrados en la hibridacin somtica.

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tanto que las pectinasas digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las clulas. El uso de enzimas disponibles comercialmente posibilit el aislamiento de protoplastos de prcticamente cualquier tejido vegetal, siempre TXH HO PLVPR QR HVWp OLJQLFDGR 6H KD SRGLGR aislar protoplastos de una gran cantidad de especies vegetales y regenerar plantas a partir de los mismos, permitiendo el uso de este sisWHPD SDUD OD SURSDJDFLyQ FORQDO \ OD PRGLFDcin gentica de plantas. El nmero de protoplastos aislados, su viabilidad y la pureza de la suspensin obtenida dependen de varios factores, debiendo establecerse en forma emprica las condiciones ptimas para un sistema determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a continuacin: 1. Seleccin del material de partida. InX\H HQ HO UHVXOWDGR GHO DLVODPLHQWR DVt como en el proceso de regeneracin posterior. Generalmente se emplean hojas y clulas en cultivo lquido o slido. Cuando se emplean hojas, la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. Se obtienen mejores resultados con hojas jvenes totalmente expandidas que con hojas viejas (Fig. 2A). Para facilitar el contacto de las enzimas con las clulas, las hojas suelen cortarse HQ WUR]RV SHTXHxRV PX\ QRV HQ HO FDVR de las monocotiledoneas. Algunas veces se extrae la epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solucin enzimtica, como sucede con las dicotiledoneas. Cuando se emplean clulas en suspensin, se obtienen mejores resultados si se encuentran en la fase exponencial de crecimiento. 2. Tratamiento enzimtico. La concentracin de la enzima y el tiempo de incubacin requeridos para lograr la liberacin de los protoplastos dependen del producto comercial utilizado. El pH generalmente se ajusta en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura entre 25 y 30 C. La duracin del tratamiento enzimtico y la relacin volumen de solucin/cantiGDG GH WHMLGR LQX\HQ HQ HO UHQGLPLHQWR

Durante el aislamiento se produce la lisis de algunas clulas, que liberan enzimas hidrolticas y compuestos oxidantes que pueden daar los protoplastos, por lo que se suelen agregar inhibidores de proteasas y antioxidantes tales como el Polivinilpirrolidona-10. El agregado de un estabilizador osmtico a la solucin enzimtica es esencial para evitar la ruptura de los protoplastos a medida que son liberados, siendo ms estables si la solucin es ligeramente hipertnica. Para ello se utilizan solutos osmticamente activos, comnmente manitol o sorbitol, en concentraciones que varan entre 0,3 a 0,8 M segn el tipo de protoplasto. La solucin enzimtica es generalmente suplementada con sales, comnmente CaCl2, que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. 2B). 3. /LPSLH]D \ SXULFDFLyQ GH ORV SURWRplastos. Una vez lograda la liberacin de los protoplastos, se procede a la remocin de las enzimas y de los restos de tejido y de clulas rotas. La suspensin VH SDVD SRU XQ OWUR GH Q\ORQ R PHWiOL-

Figura 2: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A. Eliminacin de las nervaduras centrales y seccionado de la hoja en trozos pequeos. B. Digestin enzimtica de las paredes celulares. C. Centrifugacin y obtencin de protoplastos libres de restos de tejidos vegetales.

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co con un dimetro de poro (30-100 Pm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos de clulas no digeridas. Posteriormente, se efectan 3 4 lavados centrifugando la suspensin por 5 minutos a baja velocidad (50-100 g). Finalmente, los protoplastos sedimentados se resuspenden en una solucin salina que contenga un estabilizador osmtico. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. Para lograr una mayor pureza de la suspensin es conveniente centrifugarla en un gradiente de densidad (Fig. 2C). Para el recuento de protoplastos se emplea un hemocitmetro. La viabilidad se determina generalmente empleando colorantes que son incorporados (rojo neutro, diaFHWDWR GH XRUHVFHtQD R H[FOXtGRV D]XO de Evan) por las clulas viables; tambin pueden evaluarse la actividad fotosinttiFD HPLVLyQ GH XRUHVFHQFLD \ OD UHVSLratoria (consumo de O2). 6 Mtodos de fusin 6.1 Mtodos qumicos Los primeros casos informados de fusin controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de regeneracin de hbridos somticos se produjeron a principios de la dcada de 1970, empleando nitrato de sodio como agente fusgeno. La frecuencia de formacin de heterocariones en tales casos era muy baja. Posteriormente, se lograron mejores resultados fusionando protoplastos de clulas del mesOR GH Nicotiana en un medio conteniendo alta concentracin de Ca++ (50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo, el fusgeno que alcanz mayor aceptacin es el polietilnglicol (PEG) debido a que, en comparacin con los otros agentes qumicos, produce mayor proporcin de heterocariones y, para muchos tipos celulares, resulta menos txico. Adems, el tratamiento con PEG genera una mayor proporcin de heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones entre ms de dos protoplastos. El procedimiento de fusin con PEG ms ampliamente utilizado es esencialmente una

combinacin del mtodo original del PEG y el de Ca++ y pH elevados. Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solucin conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubacin ptima para inducir la fusin es de 35 a 37 C pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C. La densidad de protoplastos adecuada para la formacin de heterocariones es de 4 a 5 % (volumen de protoplastos/volumen de suspensin). La remocin del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. Para ello, la suspensin se somete a sucesivos lavados con una solucin alcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo progresivamente la concentracin de PEG con cada lavado. En la fusin de los protoplastos ocurren, en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1) las membranas plasmticas de protoplastos adyacentes entran en ntimo contacto, (2) se producen alteraciones en sitios localizados de las mismas, formndose puentes citoplasmticos entre protoplastos vecinos, y (3) las interconexiones citoplasmticas se expanden, provocando la fusin. La carga negativa neta de la VXSHUFLH GH ODV PHPEUDQDV SURGXFH OD UHSXOsin entre ellas; el tratamiento con Ca++ y pH HOHYDGRV QHXWUDOL]D ODV FDUJDV VXSHUFLDOHV favoreciendo el contacto entre protoplastos. El PEG actuara como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmticas que promueven la adhesin y formacin de puentes citoplasmticos entre protoplastos YHFLQRV SURGXFLpQGRVH QDOPHQWH OD IXVLyQ 6.2 Electrofusin En 1973 se descubri que pulsos de elevado potencial elctrico en un rango muy estrecho de intensidad y duracin conducen a un incremento reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de la membrana celular. Este efecto se denomin ruptura elctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales perturbaciones. El voltaje mnimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formacin de poros disminuye a mayor duracin del pulso elctrico.

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Este fenmeno de ruptura reversible tambin es aplicado en la tcnica de electroporacin, con la que se pueden introducir en las clulas FRQVWUXFFLRQHV GH $'1 \ RWUDV PROpFXODV GH alto peso molecular. El mtodo de electrofusin en esencia involucra dos pasos: Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo elctrico no uniforme. Las cargas se separan dentro de las clulas formando un dipolo y generando, por lo tanto, un potencial de membrana. La fuerza del campo a ambos lados de una clula es diferente (campo no uniforme), dando origen a una fuerza neta que la empuja a una regin de mayor intensidad de campo (hacia uno de los electrodos). Este proceso se denomina dielectroforesis. La polaridad de la clula incrementa el campo local no uniforme, atrayendo a las clulas vecinas. Luego, los protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las lneas de campo aplicadas (Fig. 3A). La fuerza ejercida sobre la clula bajo condiciones dielectroforticas depende (1) de la intensidad de campo elctrico, (2) del gradiente del campo, (3) del volumen del protoplasto, y (4) de la diferencia entre las constantes dielctricas de la clula y su ambiente (as como la correspondiente diferencia entre sus conductividades). El segundo paso consiste en la aplicacin de uno o ms pulsos cortos de corriente directa de 15 a 100 seg. con una intensidad de campo HOHYDGD  D  .YFP  VXFLHQWH SDUD FDXVDU la ruptura reversible de la membrana. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crtico de membrana sea alcanzado en cuestin de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces la fusin de las dos clulas cuyas membranas estn en estrecho contacto (1 a 2 nanmetros de distancia). El proceso de resellado es principalmente atribudo a las molcuODV OLStGLFDV GHELGR D TXH VX FRHFLHQWH GH GLfusin es dos rdenes de magnitud mayor que el de las protenas. Durante este proceso pue-

den formarse puentes lipdicos entre las membranas de las dos clulas. En otras palabras, las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la zona de contacto. Los puentes formados de esta manera, con continuidad citoplasmtica entre las dos clulas, conducen a un radio de curvatura muy pequeo y a altas WHQVLRQHV VXSHUFLDOHV &RPR FRQVHFXHQFLD se forma una nueva clula esfrica, ya que el proceso es favorecido energticamente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversible si el nmero y tamao de los poros es pequeo en relacin al WRWDO GH OD VXSHUFLH GH OD PHPEUDQD )XHU]DV de campo supracrticas, as como largos perodos de exposicin, rompen reas mayores de membrana y pueden producir la destruccin total de la clula.

Figura 3: (OHFWURIXVLyQ GH SURWRSODVWRV GH PHVyOR de pasto llorn. A. Dielectroforesis de clulas. Las diferencias en intensidad de campo elctrico hacen que las clulas se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B. Aplicacin de pulsos cortos de corriente directa, que inducen la formacin de poros en la membrana, generando puentes entre las membranas de las clulas adyacentes. C. Los puentes con continuidad citoplasmtica poseen un radio de curvatura muy pequeo. Las altas tensiones superFLDOHV JHQHUDGDV HQ HVH VHFWRU FRQGXFHQ D OD IRUmacin de una nueva clula esfrica.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 203

La frecuencia de fusin depende de varios factores: El genotipo. La procedencia de los protoplastos dentro del mismo genotipo. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuencias de fusin diferentes, an cuando provengan del mismo genotipo. En general, los protoplastos obtenidos a partir de hojas se fusionan ms fcilmente que los provenientes de raz o de cultivos celulares. El tamao de los protoplastos. Los ms grandes se fusionan ms facilmente. La densidad de los protoplastos. El nmero, la duracin y la fuerza de los pulsos de corriente directa. La duracin del pulso elctrico es de 15 a 50 seg. El tiempo requerido para la fusin que sigue a la aplicacin de un pulso vara desde pocos segundos a varios minuntos. Esto probablemente est relacionaGR D OD GLIHUHQFLD GH XLGH] GH OD PHPbrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la clula. El medio de fusin. Un factor limitante en la agregacin dielectrofortica de las clulas es la conductividad elctrica del medio; si sta es muy alta, hay mucho XMR GH FRUULHQWH HQ OD VROXFLyQ \ VH SURducen calentamientos y turbulencias que impiden la formacin de cadenas. El potencial osmtico del medio de fusin. La inclusin de iones en el medio puede incrementar el porcentaje de fusin. Sin embargo, existe la limitacin de que la dielectroforesis debe realizarse en un medio de baja conductividad; el medio de fusin usualmente consiste en manitol (cuya concentracin se ajusta segn los protoplastos empleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos de presin osmtica en el medio de suspensin de los protoplastos puede favorecer el proceso de fusin. La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la dielectroforesis, que adems depende de factores como la densidad de protoplastos, fuerza del

campo elctrico y tiempo durante el cual es aplicado. Cadenas ms largas darn mayor frecuencia de fusin que las cadenas cortas. Pulsos de corriente ms largos y de mayor voltaje producen un aumento de los eventos de fusin mltiple; obviamente, pulsos muy largos y voltajes muy elevados pueden matar a los protoplastos. La composicin y propiedades de la membrana plasmtica pueden ser afectadas por la actividad metablica de los protoplastos y por el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento, inX\HQGR HQ FRQVHFXHQFLD HQ HO SURFHVR de fusin.

Las condiciones experimentales deben ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusin posible (nmero de protoplastos fusionados sobre el total de protoplastos), intentando maximizar la proporcin de heterocariones (productos de la fusin de protoplastos diferentes) formados por sobre la de homocariones (productos de la fusin de protoplastos del mismo tipo parental), y minimizando la ocurrencia de eventos de fusin mltiple (fusin de ms de dos protoplastos). La proporcin de cada uno de los dos tipos de protoplastos en la VXVSHQVLyQ SXHGH MDUVH D Q GH LQFUHPHQWDU la formacin de heterocariones por sobre la de homocariones. El tipo de protoplasto con mayor tendencia a fusionar se mezcla con el de menor tendencia a fusionar en una relacin de 1:5 a 1:10. As, durante la formacin de cadenas, los protoplastos ms fusionables estarn mayoritariamente en contacto con los menos fusionables, y stos a su vez estarn ligados entre ellos mismos. Seleccionando las condiciones -duracin y voltaje de los pulsos- que promuevan slo la fusin de los protoplastos ms fusionables, los productos sern mayormente heterocariones. Sin embargo, an cuando las condiciones de IXVLyQ SXHGDQ MDUVH GH PRGR GH LQFUHPHQWDU la frecuencia de fusin y la proporcin de heterocariones formados, la fusin de protoplastos a gran escala (macrofusin), tanto por mtodos qumicos como elctricos, resultar en una

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mezcla de protoplastos parentales, homocariones y heterocariones. Esto conlleva la necesidad de emplear mtodos de seleccin de lo hbridos somticos obtenidos. Una tcnica alternativa que ofrece la ventaja de no requerir una posterior seleccin de heterocariones, aunque demanda mayor manipulacin, es la microfusin o electrofusin de pares de protoplastos. Esta tcnica se basa en los mismos principios que la electrofusin a gran escala pero est diseada para inducir la fusin en pares seleccionados de protoplastos. Este sisWHPD HPSOHD PLFURHOHFWURGRV GH SODWLQR MDGRV a un soporte montado debajo del condensador de un microscopio invertido. Los pares de protoplastos seleccionados se colocan en microgotas de medio de fusin sobre un soporte, recubiertas por aceite mineral. En cada evento de fusin, los microelectrodos se posicionan a cada lado de una microgota conteniendo un par de protoplastos, y se aplican los pulsos elctricos. Despus de la fusin, los heterocariones resultantes son transferidos a gotas con medio de cultivo para la posterior regeneracin de plantas hbridas. La tasa de fusin es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de cultivo por hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fusin cercanas al 50 %. Ventajas de la electrofusin: 1. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los hbridos pueGHQ VHU IDFLOPHQWH LGHQWLFDGRV \ WUDQVferidos a un medio nutritivo o selectivo. 2. Puede preseleccionarse el nmero de clulas a ser fusionadas. Las formaciones de dos clulas son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos. Para obtener productos de multifusin deben emplearse elevadas densidades. 3. El proceso de fusin es sincrnico, ya que el pulso provoca la fusin de todas las clulas expuestas al campo. 4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80 100 %) y cariogamia. 5. La viabilidad de las clulas fusionadas es muy buena. 6. Este mtodo ofrece ventajas sobre otros

como el del PEG, que: - requiere condiFLRQHV QR VLROyJLFDV  ODV IUHFXHQFLDV de formacin heterocariones binucleados son bajas y variables, - resultan txicos para diversos tipos celulares, - el fusgeno debe ser removido antes del cultivo de los protoplastos y - bajo rendimiento de clulas fusionadas. 7 Seleccin de heterocariones La fusin de protoplastos a gran escala produce una mezcla de tipos parentales y productos de fusin. Si no se efecta una previa seleccin de las clulas hbridas, la regeneracin GH SODQWDV \ OD SRVWHULRU LGHQWLFDFLyQ GH ORV hbridos demandar mucho trabajo y recursos. Dicha seleccin es particularmente necesaria cuando se emplean mtodos qumicos, que producen una baja proporcin (<10%) de clulas hbridas. Por el contrario, los mtodos elctricos no requieren necesariamente del posterior proceso de seleccin dado que normalmente producen frecuencias de fusin muy elevadas o porque, en el caso de la microfusin, no se generan mezclas heterogneas de protoplastos debido a que se fusionan dos clulas por vez. Cualquiera sea el caso, la conGLFLyQ GH KtEULGR GHEH YHULFDUVH HQ OD SODQWD regenerada mediante diferentes anlisis que se explican ms adelante. La seleccin de clulas hbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes mtodos: Seleccin en base a caracteres morfoVLROyJLFRV. En ciertos casos es posible diferenciar los callos hbridos de los parentales. Por ejemplo, en algunos cruzamientos, los callos hbridos poseen un color intermedio al de los parentales. Cuando se produce un cruzamiento entre un parental con capacidad para regenerar planta con uno recalcitrante, los hbridos somticos normalmente regeneran plantas, ya que este carcter se comporta como dominante. Si los protoplatos del genotipo respondedor son tratados con inhibidores metablicos irreversibles (iodoacetamida, dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirn, y solamente podrn regenerarse los hbridos.

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Seleccin por complementacin. La seleccin se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el crecimiento de los parentales pero no para el de los hbridos. La complementacin puede lograrse por las siguientes vas: a) Empleando dos parentales con defectos metablicos o genticos no allicos. Si dichos caracteres son recesivos, la fusin produce una clula hbrida en la que los defectos se anulan por complementacin. Por ejemplo, la fusin de dos variedades albinas no allicas (nucleares) de tabaco, permiti obtener plantas verdes. AAbb (albina) x aaBB (albina)

AaaaBBbb (verde) Asimismo, a partir de dos lneas mutantes no DOpOLFDV GH WDEDFR GHFLHQWHV HQ QLWUDWR UHGXFtasa, se obtuvieron colonias capaces de crecer en un medio conteniendo nitrato como nica fuente de nitrgeno. b) Fusionando parentales que expresan caracteres dominantes tales como resistencia a antibiticos o herbicidas. Para ello se emplea una lnea resistente a cierta droga, y otra resistente a una segunda droga, efectundose la seleccin de las clulas hbridas en un medio conteniendo ambas drogas a concentraciones que resultan letales para las lneas parentales. c) Una lnea que presente una mutacin auWRWUyFD SRU HMHPSOR DOELQLVPR GHFLHQFLD D nitrato reductasa) y un carcter dominante (por ejemplo resistencia a antibiticos o herbicidas) es de gran utilidad para la seleccin. Los hbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier genotipo silvestre pueden ser seleccionados en medio mnimo suplementado con el antibitico o herbicida, que no permite el crecimiento de los parentales. Seleccin por aislamiento de los heterocariones o clulas hbridas. Es el VLVWHPD PiV FRQDEOH \ GH PiV DPSOLR espectro de aplicacin. El aislamiento puede realizarse de dos maneras: a) Seleccin mecnica directa utilizando tc-

nicas de micromanipulacin con micropipeta. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales presentan rasgos que los distinguen al microscopio, permitiendo reconocer las clulas hbridas. Por ejemplo al fusionar protoplastos GHO PHVyOR YHUGHV FRQ SURWRSODVWRV GH VXVpensiones celulares (incoloros). Tambin pueden colorearse las clulas de ambos progenitores con diferentes colorantes vitales, como el rojo neutro y azul brillante de cresilo. E &LWRPHWUtD GH XMR /RV SURWRSODVWRV SDrentales se marcan con diferentes colorantes XRUHVFHQWHV SRU HMHPSOR URGDPLQD URMR \ XRUHVFHtQD YHUGH DPDULOOHQWR  (O DLVODPLHQto de los heterocariones marcados con ambos colorantes se realiza utilizando un citmetro de XMR )$&6 XRUHVFHQFHDFWLYDWHG FHOO VRUWHU  que es preciso y muy rpido. El equipo posee IRWRFpOXODV TXH GHWHFWDQ XRUHVFHQFLD SXGLHQdo separar los protoplastos marcados con un VROR XRURFURPR SDUHQWDOHV GH DTXHOORV GRblemente marcados (hbridos). 8 Cultivo de protoplastos La habilidad para regenerar plantas a partir de clulas y tejidos en cultivo es un componente esencial en la biotecnologa para la manipulacin gentica y el mejoramiento vegetal. Esto resulta relativamente fcil para las dicotiledneas herbceas, pero ha sido bastante difcil para las monocotiledneas, particularmente las gramneas. Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio lquido o semislido, rico en compuestos orgnicos e inorgnicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmtico. Suelen ser cultivaGRV HQ FDMDV GH 3HWUL FRQ PHGLR DJDULFDGR donde se mezcla la solucin de protoplastos con un medio de cultivo lquido a 40C conteniendo 1,2% de agar, perferentemente agarosa (Fig. 4A). Los protoplastos quedan, as, atrapados en el medio semislido y, luego de varios das, se ven las colonias formadas (Fig. 4B). Sin embargo, el medio lquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies solo pueden dividirse en medio lquido, (b) la presin osmtica del medio puede ser fcilmente reducida a los pocos das en cultivo, (c) la densidad celular puede

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VHU PRGLFDGD DJUHJDQGR PHGLR GH FXOWLYR R las clulas con especial inters pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degradacin de algunos componentes del medio por la poblacin de protoplastos puede producir algunas sustancias citotxicas, cuya concentracin alrededor de las clulas ser menor en HO PHGLR OtTXLGR 8QD WpFQLFD PX\ HFLHQWH TXH combina medio slido y lquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los bloquecitos con los protoplastos inmovilizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio lquido, donde se cultivan en contnua agitacin. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro das en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una divisin regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una clula, que dos semanas despus se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. 4). Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son:

Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de clulas y tejidos, pero en general son enriquecidos con vitaminas, azcares, aminocidos, reguladores de crecimiento y tambin con aditivos inesSHFtFRV FRPR OHFKH GH FRFR KLGUROL]Ddo de casena, extracto de levadura, etc. El potencial osmtico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de proteccin osmtica antes de regenerar la SDUHG FHOXODU 1RUPDOPHQWH VH DMXVWD con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos vara de 104 5 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos con altas densidades producirn, a partir de cada protoplasto, colonias que debern separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto, la densidad inicial GHEH VHU EDMD GH   SURWRSODVWRV ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas

Figura 4: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. 3URWRSODVWRV GH PHVyOR B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa suspendidas en medio lquido. C. Detalle de la formacin de callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneracin. F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. Planta regenerada.

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densidades de cultivo. Para estos casos se desarroll la tcnica de cultivo con clulas nodrizas o alimentadoras. Esta tcnica consiste en exponer una suspensin de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la divisin celular pero que quedan metabolicamente activas. Estas FpOXODV VH SODTXHDQ HQ XQ PHGLR DJDULcado, y luego se colocan por sobre stas los protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarn las colonias. Tambin suele XWLOL]DUVH SDSHO GH OWUR SDUD VHSDUDUODV de las clulas nodrizas. Otra tcnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 l de medio de cultivo, logrando densidaGHV GH   [ 3 protoplastos/ml. Con ayuda de un micromanipulador se coloca la clula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratacin del medio. Los tratamientos fsicos: tratamientos de choque elctrico y trmico estimulan la divisin de los protoplastos.. Las condiciones de cultivo: en general los protoplastos son sensibles a la luz, por lo cual durante el cultivo se los mantiene en oscuridad o bajo luz muy tenue. El origen de los protoplastos: el estado VLROyJLFR GHO WHMLGR GHO FXDO SURYLHQHQ y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada HFLHQFLD HQ OD UHVSXHVWD DO FXOWLYR

 ,GHQWLFDFLyQ GH ODV SODQWDV KtEULGDV /D FRQGLFLyQ GH KtEULGR GHEH YHULFDUVH en la planta regenerada an cuando se haya efectuado algn tipo de seleccin para el culWLYR GH ODV FpOXODV KtEULGDV $ WDO Q HV FRQYHniente efectuar diferentes evaluaciones, lo que permite una mejor caracterizacin del hbrido. Comnmente se llevan a cabo los siguientes estudios: 1. Morfolgicos. Los hbridos somticos pueden presentar rasgos morfolgicos caractersticos. Los mismos pueden ser intermedios a los de los parentales, la suma de ellos, u otros completamente nuevos. 2. Citolgicos. El anlisis del complemen-

to cromosmico permite revelar si el hbrido posee el total de cromosomas de cada parental, si se han fusionado ms de dos protoplastos, el grado de aneuploida y posibles translocaciones intergenmicas. Mediante hibridacin in situ HPSOHDQGR VRQGDV GH $'1 UHSHWLWLYR HVSHFtFR GH HVSHFLH SXHGH HYDOXDUVH con ms profundidad la contribucin de los genomas parentales y reestructuraciones cromosmicas en el hbrido. 3. Isoenzimticos. El patrn de bandas isoenzimticas del hbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimticas. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato transaminasas, esterasas, peroxidasas y fosfatasas cidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el anlisis se deben emplear los mismos tejidos u rganos, y en el mismo estado fenolgico. 4. A nivel de ADN. La demostracin de la SUHVHQFLD GH $'1 GH DPERV SDUHQWDOHV es la prueba ms directa de la hibridaFLyQ (O DQiOLVLV GH $'1 HV LQGHSHQGLHQte del tejido empleado y de la edad de la SODQWD 3XHGH OOHYDUVH D FDER SRU 5)/3 SROLPRUVPRV HQ OD ORQJLWXG GH ORV IUDJPHQWRV GH UHVWULFFLyQ  5$3' SROLPRUVPRV HQ HO $'1 DPSOLFDGR DO D]DU o Southern blot, empleando sondas de $'1 UHSHWLWLYR HVSHFtFR GH HVSHFLH R GH JHQHV GH $51 ULERVRPDO 10 Logros y tendencias de la hibridacin somtica La hibridacin somtica ha permitido producir hbridos que no se haban podido obtener por cruzamientos sexuales, incrementando DVt HO XMR GH JHQHV HQ ORV FXOWLYRV /D WDEOD  muestra algunos ejemplos de hbridos somticos que presentan algunas ventajas agronmicas. En sus inicios, algunos esperaban que la hibridacin somtica permitiera producir nuevas

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Tabla 1: Ejemplos de hbridos somticos que exhiben algn carcter de inters agronmico

Hbrido Hbridos simtricos


Solanum tuberosum x S. brevidens

Carcter

S. tuberosum x S. circaeifolium S. tuberosum x S. phureja S. melongena x S. integrifolium/S. saintwongseis

Resistencia al virus del enrollamiento de la hoja de papa (PLRV), al hongo Phytophtora infenstans y a la bacteria Erwinia cartovora. Resistencia a P. infenstans y al nemtodo Globodera pallida. Mayor productividad de tubrculo. Resistencia a la bacteria Pseudomonas solanacearum .

Hbridos asimtricos
Brassica oleracea x B. campestris B. napus x B. carinata/B. juncea Nicotiana tabacum x N. Repanda/N. glutinosa Resistencia al hongo Phoma lingam . Resistencia a P. lingam . Hipersensibilidad al virus del mosaico del tabaco (TMV).

Cbridos
B.campestris (silvestre) x B.napus/B. campestris (cultivar) Resistencia al herbicida atrazina y esterilidad masculina citoplasmtica (CMS).

especies que expresaran las caractersticas deseadas de ambos progenitores. Por ejemplo, por hibridacin entre tomate y papa, se busc producir plantas que desarrollaran tomates en la parte area y tubrculos en la raz (pomato). La experiencia mostr que difcilmente puedan lograrse estos hbridos espectaculares, debindose ms bien dirigir la tcnica hacia la introgresin de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridacin asimtrica o cibridacin, manteniendo las caractersticas generales del cultivo. 8QR GH ORV IDFWRUHV TXH GLFXOWD OD REWHQFLyQ de hbridos simtricos es la progresiva prdida de cromosomas de uno de los parentales que normalmente ocurre durante la regeneracin. Si bien la fusin de protoplastos permite sortear las barreras precigticas, siguen existiendo barreras genmicas que resultan en la eliminacin espontnea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo que determina la eliminacin de cromosomas no est bien comprendido, pero generalmente se retienen los cromosomas del parental que tiene el ciclo celular ms corto. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad ge-

nmica es el estado de diferenciacin de los tipos celulares involucrados en la fusin. Por ejemplo, cuando se fusionan clulas en fase GH FUHFLPLHQWR DFWLYR FRQ FpOXODV GHO PHVyOR que no se dividen, generalmente se pierden los cromosomas de estas ltimas. Los hbridos somticos o sexuales entre especies silvestres y cultivadas contienen muchas caractersticas no deseadas de la primera, adems de aqullas deseadas. El retrocruzamiento con la especie cultivada es requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre, pero ello no siempre es posible debido a que los hbridos suelen ser estriles. La hibridacin asimtrica y la cibridacin tienen la ventaja de incorporar slo uno o pocos caracteres provenientes del parental silvestre en la especie cultivada, y producir plantas con mayor fertilidad.. $OJXQRV FDUDFWHUHV GHVHDEOHV HVWiQ FRGLcados por el genoma extranuclear, tales como la androesterilidad citoplasmtica y ciertos tipos de resistencia a enfermedades y a herbicidas. Para estos casos es de particular utilidad la cibridacin dado que es un mtodo simple para transferir estos genes.

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11 Algunos ejemplos Se han obtenido hbridos intergenricos de Panicum maximum (+) Pennisetum americanum (Ozias-Atkins et al., 1986), Saccharum RIFLQDOLV (+) Pennisteum americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa oryzicola, Triticum monococcum (+) Pennisetum americanum, Festuca arundinacea (+) /ROLXP PXOWLRUXP. El primer caso de regeneracin de plantas maduras de hbridos intergenricos (simtricos y asimtricos) en gramneas fue el Festulolium. A pesar de los esfuerzos realizados, la aplicacin de esta estrategia no ha conducido a la obtencin de nuevos hbridos de especies importantes, fundamentalmente debido a problemas de baja o nula fertilidad. Los mtodos actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el inters en la hibridacin somtica. Sin embargo son una excelente herramienta para estudiar las interacciones ncleocitoplasmticas entre genomas.

12 Lecturas recomendadas
%KRMZDQL 66 5D]GDQ 0.  3URWRSODVW LVRlation and culture. Somatic hybridization and cybridization. En: Plant Tissue Culture: Theory and 3UDFWLFH &DSLWXORV  \  66 %KRMZDQL \ 0. 5D]GDQ HGV (OVHYLHU $PVWHUGDP SS Lindsey y Jones, 1992. Biologa celular de la ingeniera gentica. En: Biotecnologa vegetal agrcola, &DStWXOR  (GLWRULDO $&5,%,$ 6$ =DUDJR]D Pp.105-142. Matsumoto, K. 2001. Hbridos somticos. Biotecnologa Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: 26-28. Zimmermann,U. 1983. Electrofusion of cells: principles and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5:149-156.

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II CAPTULO 3 Epigentica y evolucin


5: 0DVXHOL \ &) 0DUl 1. Introduccin Uno de los principios bsicos de la biologa es que la variabilidad gentica es un pilar fundamental de la evolucin. Sin variabilidad la seleccin natural no podra actuar y la uniformidad gentica conducira a la poblacin o especie a un callejn sin salida en el proceso evolutivo. Este concepto propuesto por CharOHV 'DUZLQ HQ  IXH FRUURERUDGR SRU HO UHdescubrimiento de las leyes de Mendel y por trabajos de genetistas un siglo despus. Sin embargo, la nocin de que la variabilidad gentica se encuentra asentada nicamente en la secuencia de nucletidos ha sido puesta en tela de juicio en los ltimos aos. Trabajos recientes especialmente en el rea de la Gentica Molecular muestran que la variabilidad heredable tambin se explica por cambios que no necesariamente implican alteraciones en las VHFXHQFLDV GH EDVHV GHO $'1 9DULDFLRQHV KHredables en los patrones de expresin gnica se pueden producir debido a mecanismos epigenticos con total ausencia de variabilidad JHQpWLFD (O WpUPLQR HSLJHQpWLFD VH UHHUH D cambios heredables en el fenotipo, y por lo tanto en la regulacin gnica, que no son causaGRV SRU DOWHUDFLRQHV HQ OD VHFXHQFLD GHO $'1 6H KDQ GHVFULWR WUHV PHFDQLVPRV GH FRGLFDcin de la informacin que no estn basados HQ OD VHFXHQFLD GH $'1 (VWRV VRQ D 0HWLODFLyQ GHO $'1 IXQGDPHQWDOPHQWH GH FLWRVLQDV E 0RGLFDFLRQHV SRVWWUDGXFFLRQDOHV GH KLVWRnas (acetilacin, fosforilacin, metilacin, etc) \ F 0HFDQLVPRV EDVDGRV HQ HO $51 $ VX YH] estos tres mecanismos actan en forma conjunta para mantener el grado de compactacin de la cromatina. En esta seccin nos referirePRV HVSHFtFDPHQWH D FRPR OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ OD SROLSORLGtD LQGXFHQ FDPELRV en los patrones de metilacin y dan lugar a nuevas fuentes de variabilidad. 2. La metilacin del ADN Uno de los mecanismos epigenticos ms estudiados en eucariotas es la incorporacin al

$'1 GH XQ JUXSR PHWLOR HQ OD SRVLFLyQ  GHO anillo de citosina (5mC) (Figura 1a). En plantas la 5mC se distribuye en sitios donde se encuentran dinucletidos del tipo CG o trinucletidos &1* GRQGH 1 HV FXDOTXLHUD GH ORV FXDWUR QXFOHyWLGRV  $ VX YH] OD PHWLODFLyQ GHO $'1 SXHde dividirse en metilacin de sitios simtricos y asimtricos. En el primer caso la metilacin VH SURGXFH HQ VLWLRV &* \ &1* GRQGH ODV FLtosinas metilables se encuentran de a pares ubicadas en hebras opuestas, mientras que la metilacin en sitios asimtricos se produce en citosina ubicadas en un contexto diferente en HO $'1 /D PHWLODFLyQ VLPpWULFD HV OD PiV FRmn y permite que los patrones de metilacin VH PDQWHQJDQ D WUDYpV GH OD HQ]LPD $'1 PHtiltransferasa que cataliza la transferencia de un grupo metilo de la S-adenosil metionina a ODV FLWRVLQDV GHO $'1 (Q Arabidopsis thaliana los genes CMT3 y MET1 FRGLFDQ SDUD ODV HQzimas Cromometiltransferasa 3 y Metiltransferasa 1, respectivamente, la primera metila los JUXSRV &1* \ OD VHJXQGD ORV VLWLRV &* 'HVSXpV GH OD UHSOLFDFLyQ GHO $'1 VyOR OD KHEUD

Figura 1. A. Agregado del grupo metilo al carbono 5 de la citosina. B. Mantenimiento de los patrones GH PHWLODFLyQ GHO $'1 SRU ODV HQ]LPDV $'1 PHWLOWUDQVIHUDVDV GXUDQWH OD UHSOLFDFLyQ GHO $'1

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molde mantiene el patrn de metilacin origiQDO /DV HQ]LPDV $'1 PHWLOWUDQVIHUDVDV VH HQcargan de metilar la hebra nueva de acuerdo al patrn de metilacin de la hebra molde en los VLWLRV &* \ &1* )LJXUD E  (VWH PHFDQLVPR permite que se hereden los patrones de metilacin tanto entre clulas (mitticamente) como entre generaciones (meiticamente). La protena DDM1, la cual es un factor remodelador de la cromatina, tambin participa en el manteniPLHQWR GH SDWURQHV GH PHWLODFLyQ HVSHFtFRV a lo largo del genoma. Los mutantes de Arabidopsis ddm1 ('HFLHQW LQ '1$ 0HWK\ODWLRQ) tienen una reduccin del 70% en los niveles de 5mC, lo cual provoca una amplia variedad de defectos en el desarrollo de las plantas al inducir cambios heredables en otros loci. Si bien los patrones de metilacin son heredables, se ha demostrado que no son estticos y que el estado de desarrollo de la planta y condiciones ambientales alteran estos patrones. Por otro lado, la metilacin est asociada a cambios en la expresin gnica. En general el incremento en la metilacin (hipermetilacin) de un locus no solo produce la reduccin en la expresin o el total silenciamiento del mismo, sino que tambin reprime transcripcionalmente e inactiva transposones capaces de movilizarse a travs del genoma. Se demostr que anulando (knock out) los genes CMT3 y MET1 se desmetila el genoma activndose elementos transponibles y genes que se encontraban silenciados. Estos estudios mostraron que la prdida de metilacin produce aberraciones tales como cambios PRUIROyJLFRV HQ KRMDV \ RUHV FRPR DVt WDPELpQ HQ HO WLHPSR GH RUDFLyQ 3. Mtodos para analizar la variacin epigentica Los mtodos comnmente utilizados para analizar la variabilidad gentica, tales como AFLP ($PSOLHG )UDJPHQW /HQJKW 3RO\PRUphism  5)/3 Restriction Fragment Length Polymorphism  613 Single Nucleotide Polymorphism R 665 0LFURVDWpOLWHV QR VRQ adecuados para medir la variabilidad epigenWLFD 8QD PRGLFDFLyQ GH OD WpFQLFD GH $)/3 llamada MSAP (Methylation Sensitive AmSOLHG 3RO\PRUSKLVP), en la que se reemplaza la enzima de corte frecuente MseI por los

isoesquizmeros HpaII y MspI, sensibles a la metilacin, que permiten detectar la metilacin externa o interna de las citosinas en el sitio de reconocimiento 5-CCGG- 3 de las enzimas (Figura 2). Otro mtodo desarrollado que permite analizar la metilacin es la secuenciacin SUHYLR WUDWDPLHQWR GHO $'1 FRQ ELVXOWR TXH convierte las citosinas no metiladas en uracilo quedando las citosinas metiladas intactas. /XHJR OD VHFXHQFLD WUDWDGD VH DPSOLFD SRU 3&5 UHHPSOD]DQGR ORV XUDFLORV SRU WLPLQDV para su posterior secuenciacin. A travs de estos mtodos es posible analizar el estado de metilacin de secuencias aleatorias (MSAP) o VHFXHQFLDV HVSHFtFDV VHFXHQFLDFLyQ SRU ELVXOWR \ GHWHUPLQDU OD YDULDFLyQ HSLJHQpWLFD HQ poblaciones naturales.

Figura 2. Esquema que representa el anlisis de PHWLODFLyQ GHO $'1 D WUDYpV GH OD WpFQLFD GH 06$3 (0HWK\ODWLRQ 6HQVLWLYH $PSOLHG 3RO\PRUSKLVP). El $'1 VH FRUWD FRQ ODV HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ Eco5, \ HpaII/Msp, OXHJR VH OLJDQ DGDSWDGRUHV HVSHFtFRV SDUD ODV HQ]LPDV \ VH DPSOLFDQ ORV IUDJPHQWRV FRQ primers que reconocen la secuencia de los adaptadores. Si las citosinas del sitio de reconocimiento de HpaII (CCGG) se encuentran metiladas, esquema de la derecha, la enzima no corta y por lo tanto no VH DPSOLFD HO IUDJPHQWR JHQHUDQGR SROLPRUVPR

4. Epigentica y variacin natural El grado de metilacin de genes puede variar entre plantas produciendo cambios en la expresin y nuevos fenotipos que son heredaEOHV $ ODV VHFXHQFLDV JpQLFDV TXH GLHUHQ HQ

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el grado de metilacin se les llama alelos epigenticos o epialelos. Se han descrito varios ejemplos de epialelos que ocurren naturalmente. Un ejemplo clsico es el gen CYCLOIDEA en Linaria vulgaris TXH FRGLFD SDUD XQ DFWLvador de la transcripcin cuyo efecto es la preVHQFLD GH XQ IHQRWLSR RUDO GH VLPHWUtD UDGLDO y otro de simetra bilateral. A travs del anlisis molecular de este gen se demostr que en la naturaleza existan dos epialelos, uno ms metilado que produce la simetra radial y otro con menor metilacin asociado a la simetra bilateral. Mediciones de los patrones de metilacin entre introducciones de Arabidopsis thaliana muestran variaciones en los patrones de metilacin de ms del 34% siendo menores al 1% las variaciones en metilacin entre plantas dentro de una misma introduccin. En una poblacin natural de la especie silvestre de papa Solanum ruiz-lealli se encontr que plantas que tenan una variacin gentica menor al 1% (medida por AFLP) presentaban variaciones en los patrones de metilacin (medida por MSAP) superiores al 18%. Estas variaciones QR VRQ SURGXFLGDV SRU SROLPRUVPR GH QXFOHytidos sino por variaciones en los patrones de PHWLODFLyQ 5HVXOWDGRV VLPLODUHV VH REWXYLHURQ analizando introducciones de algodn donde la diversidad detectada por MSAP fue superior a OD REWHQLGD DQDOL]DQGR SDWURQHV GH 5)/3 5. Cambios epigenticos producidos por KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ SROLSORLGtD /D KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD \ OD SROLSORLGtD son dos mecanismos profundamente relacionados que han jugado roles muy importantes en la evolucin vegetal. Una de sus caractersticas ms sobresalientes es la capacidad de generar una amplia variacin fenotpica de gran importancia en la microevolucin adaptativa. La poliploidizacin implica la generacin de un organismo con un nmero aumentado de complementos genmicos completos. Los juegos cromosmicos adicionales pueden provenir de la misma especie (autopoliploida) o de una especie divergente (alopoliploida), implicando en este ltimo caso un proceso de hibriGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD $ VX YH] OD KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD VH GHQH FRPR OD IRUPDFLyQ GH un nuevo organismo por cruzamiento entre dos

especies diferentes aunque relacionadas. Tanto en el caso de la alopoliploida como en la KLEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD GRV JHQRPDV GLYHUgentes se unen en un ncleo hbrido, desencadenando una serie de cambios genticos y epigenticos que dan lugar a una gran variabilidad fenotpica (Figura 3). En hbridos alopoliploides sintticos de Arabidopsis se demostr que se producen inestabilidades fenotpicas asociadas con cambios en la metilacin y en la expresin gnica. Por otro lado en generaciones tempranas de hbridos alopoliploides de trigo y Brassica se reportaron cambios genticos estructurales tales como eliminacio-

Figura 3. Esquema que representa el estrs o shock genmico producido por efecto de la hibriGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD (O FUX]DPLHQWR GH GRV HVpecies que han divergido induce alteraciones en los patrones de metilacin en el ncleo hbrido que producen cambios en la transcripcin y reestructuraciones genticas tales como: movimiento de transposones, rearreglos cromosmicos y cambios en la cromatina.

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nes de secuencias. En nuestro Laboratorio VH REWXYR XQ KtEULGR LQWHUHVSHFtFR HQWUH XQ haploide de la papa cultivada Solanum tuberosum (2n=2x=24) y la especie silvestre Solanum kurtzianum (2n=2x=24). Algunas plantas KtEULGDV SUHVHQWDEDQ PDOIRUPDFLRQHV RUDOHV similares a las descritas en Arabidopsis, que LQFOXtDQ FDPELRV HQ OD PRUIRORJtD RUDO SpWDORV GLVHFWDGRV DQWHUDV DWURDGDV \ HVWLORV UHtorcidos entre otras. Por otro lado, los hbridos presentaban nuevos fragmentos de AFLP y 5$3' 5DQGRP $PSOLHG 3RO\PRUSKLF '1$) que no estaban presentes en los padres. As mismo, el anlisis de la metilacin por MSAP

mostr cambios en los patrones de metilacin de las plantas hbridas en relacin a las especies progenitoras. Estos resultados obtenidos HQ GLVWLQWRV KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV VXJLHUHQ que existe una correlacin entre la remodelacin general de la metilacin del genoma hbrido, los cambios genticos y la alteracin de la actividad gnica y el fenotipo. En resumen, tanto la poliploida como la hiEULGDFLyQ LQWHUHVSHFtFD LQGXFHQ FDPELRV JHnmicos como producto del estrs generado por la duplicacin gnica o por la reunin de dos genomas divergentes en un ncleo hbriGR $GHPiV GH OD PHWLODFLyQ GHO $'1 RWURV PH-

Figura 4. Anlisis de la segregacin de los patrones de metilacin en plantas de las generaciones F1 y 5&1 $ SRUFLyQ GH ORV SDWURQHV GH DPSOLFDFLyQ 06$3 GH S. tuberosum (tbr), S. kurtzianum (ktz), dos hbridos F1 (H1 y H4 \ WUHV SODQWDV GH OD UHWURFUX]D  5&1) H1 x S. kurtzianum y H4 x S. kurtzianum. El $'1 H[WUDtGR IXH GLJHULGR FRQ Eco5,HpaII (H) y Eco5,MspI (M). El Patrn de metilacin del fragmento 1 cambia en las progenies sucesivas. El fragmento 2 muestra un patrn de metilacin altamente conservado. % LQWHUSUHWDFLyQ JUiFD GH ORV IUDJPHQWRV 06$3  \  GHO SDQHO $ /RV FXDGUDGRV UHSUHVHQWDQ HO VLWLR de reconocimiento doble cadena (CCGG) de los isoesquizmeros HpaII/MspI. Cuadrados negros indican citosinas metiladas.

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canismos tales como, acetilacin y metilacin de histonas, activacin de transposones y reJXODFLyQ SRU SHTXHxRV $51V \ $51 GH LQWHUIHrencia pueden causar cambios en la expresin gnica de hbridos y poliploides. 6. Herencia de los patrones de metilacin La obtencin de mutantes que afectan la PHWLODFLyQ GHO $'1 KD SHUPLWLGR XQ DPSOLR GHsarrollo de esta rea. Las anormalidades en el desarrollo observadas en mutantes ddm1 de Arabidopsis son trasmitidas a la progenie, inclusive en lneas que segregan respecto a la mutacin ddm1. Estas observaciones morfolgicas de plantas ddm1 se correlacionan con datos moleculares, ya que la reduccin en la metilacin que afecta a la mayora de las secuencias del genoma de estas plantas, tanto repeticiones como secuencias de bajo nmero de copias, pueden ser heredadas establemente a travs de la mitosis y meiosis. Esto indica que la informacin epigentica, en forma de PHWLODFLyQ GLIHUHQFLDO GHO $'1 SXHGH VHU WUDVmitida en plantas a travs de generaciones de reproduccin sexual. Otro modelo experimental que ha permitido obtener importante informacin acerca de la dinmica en los patrones de metilacin es la obtencin de alopoliploides H KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV VLQWpWLFRV /D REtencin de progenies a travs de cruzamientos sexuales controlados permite una comparacin precisa entre la generacin parental y la desFHQGHQFLD (Q OD )LJXUD  VH HMHPSOLFD FyPR a travs de anlisis MSAP se pueden inferir los patrones de metilacin de secuencias CCGG. Estudiando generaciones sucesivas de reproGXFFLyQ VH[XDO )LOLDO ) 5HWURFUX]D  5& etc.) se puede evidenciar si ocurren cambios en la metilacin y qu estabilidad tienen los mismos. Datos obtenidos en hbridos interesSHFtFRV VLQWpWLFRV GLSORLGHV \ SROLSORLGHV GH varias especies indican que en el genoma de las plantas existen secuencias particularmente sensibles a remodelar su metilacin (Fragmento 1 de la Figura 4). Por otro lado, hay secuencias con patrones de metilacin altamente conservados evolutivamente, ya que especies diferentes comparten un mismo patrn, el cual a su vez se hereda invariablemente en todas las plantas obtenidas en generaciones sucesi-

vas de reproduccin sexual (Fragmento 2 de la Figura 4). Desde un punto de vista evolutivo la variabilidad generada por mecanismos epigenticos ampla la variabilidad gentica ya que aparecen nuevos epialelos que pueden ser seleccionados en poblaciones naturales. Adems, las variantes epiallicas son potencialmente reversibles y generaran fenotipos ms H[LEOHV TXH VH DGDSWDUtDQ D DPELHQWHV FDPbiantes. A partir de este tipo de evidencias, un concepto que est ampliamente documentado para fenmenos genticos, debe ser ampliado de manera que abarque la informacin epigentica: en cada generacin se reconstituye un reservorio epigentico enteramente nuevo, del cual surgen los individuos que son los blancos de la seleccin natural en esa generacin. 6. Lecturas recomendadas
$GDPV ./ DQG :HQGHO -)  1RYHO SDWWHUQV of gene expression in polyploid plants. Trends in Genetics 21:569-543. Jablonka E. and Lamb M. 1995. Epigenetic inheritance and evolution. The Lamarckian dimension. 2[IRUG 8QLYHUVLW\ 3UHVV 1HZ <RUN  SS Kalisz S. and Purugganan M.D. 2004. Epialleles vs '1$ PHWK\ODWLRQ FRQVHTXHQFHV IRU SODQW HYROXtion. Trends in Ecology and Evolution 19:309-314. Madlung A. and Comai L. 2004. The effect of stress on genome regulation and structure. Annals of Botany 94:481-495. 0DUO &) &DPDGUR (/ DQG 0DVXHOOL 5:  Phenotypic instability and epigenetic variability in a diploid potato of hybrid origin, Solanum ruizlealii. BMC Plant Biology 9:21. 5DSS 5$ DQG :HQGHO -)  (SLJHQHWLFV DQG SODQW HYROXWLRQ 1HZ 3K\WRORJLVW  5LGGOH 1& DQG %LUFKOHU -$  (IIHFWV RI UHXnited diverged regulatory hierarchies in allopolyploids and species hybrids. Trends in Genetics 19:597-600.

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II. CAPTULO 4 Mutagnesis, TILLING y EcoTILLING


Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara Gabriela Pacheco y Esteban H Hopp 3.1. Mutagnesis clsica 3.1.1. Introduccin El concepto de mutacin en Biologa fue introducido a principios del siglo pasado por de Vries, para designar a los cambios heredables de aparicin sbita. Hoy en da las mutaciones VH H[SOLFDQ SRU DOWHUDFLRQHV HQ HO $'1 TXH YDQ desde cambios en una o unas pocas bases (mutaciones de punto) hasta prdidas, adiciones o WUDQVORFDFLRQHV GH JUDQGHV SRUFLRQHV GH $'1 (cambios estructurales) o incluso cromosomas y genomas enteros; tambin podran incluirse entre ellas las alteraciones heredables de naturaleza epigentica, por ejemplo los cambios HQ OD PHWLODFLyQ GHO $'1 YHU *UDQW'ZRQWRQ y Dickinson, 2005). Las mutaciones son el origen primario de la variabilidad gentica y, por lo tanto, cierto control sobre su frecuencia y/o espectro puede considerarse una herramienta de gran valor para el mejoramiento de las plantas FXOWLYDGDV $ QHV GH OD GpFDGD GHO  6WDGOHU desarroll magistralmente las bases de la mutagnesis experimental en plantas cultivadas, hecho que fue contemporneo a los trabajos pioneros de Muller sobre mutagnesis en Drosophila. El primer xito comercial consisti en una mutante de tabaco de hoja clara y de gran calidad obtenida por Tollenar (Holanda) que lleg a cubrir una importante rea de cultivo en Indonesia a mediados de la dcada del 30. Hoy en da existen en el mundo miles de cultivares inscriptos obtenidos por esta metodologa. Se incluyen en esta lista, cultivos de gran importancia econmica, como los principales cereales, oleaginosas, as como, numerosas especies de hortalizas y cultivos industriales. Los caracteres que han sido mejorados son muy diversos: tolerancia a herbicidas, a estrs biticos o abiticos, calidad nutricional, industrial, etc. (para ms informacin ver IAEA 1995, Datta 2005). Adems, la ampliacin de la variabilidad disponible por medio de las mutaciones inducidas

ha contribuido considerablemente a dilucidar procesos biolgicos fundamentales para la vida vegetal y para la productividad de los cultivos. Las investigaciones en busca de mejorar la HIHFWLYLGDG \ OD HVSHFLFLGDG GH ORV WUDWDPLHQtos mutagnicos sobre las plantas cultivadas, y de procedimientos de manejo y seleccin ms HFLHQWHV WXYLHURQ XQ JUDQ DXJH HQ ODV GpFDdas del 50, 60 y 70. Hoy existe un renovado inters por esta temtica al que sin duda contribuy el enorme conocimiento generado por la biologa molecular, que alej viejos fantasmas sobre la variabilidad inducida, y el reciente desarrollo de tcnicas moleculares de gran capacidad de anlisis como la tcnica de gentica reversa denominaGD 7,//,1* GHO LQJOpV Targeting Induced Local Lesions in Genomes). A continuacin se discuten los principales IDFWRUHV D WHQHU HQ FXHQWD SDUD OD DSOLFDFLyQ Hciente de la metodologa clsica de mutaciones inducidas en plantas cultivadas. La descripcin detallada de protocolos puede consultarse por HMHPSOR HQ 1HXIIHU  ,$($  .RRUQneef, 2002. 3.1.2. Tratamientos mutagnicos 3.1.2.1. Agentes mutagnicos /RV DJHQWHV DUWLFLDOHV XWLOL]DGRV HQ PXWDJpnesis clsica pueden dividirse segn su naturaleza en dos grandes grupos: fsicos o qumicos. 2WUD PDQHUD DUWLFLDO GH LQFUHPHQWDU OD WDVD de mutaciones es a travs de las condiciones especiales del cultivo in vitro de clulas o de tejidos (variacin somaclonal). Tambin existen factores de naturaleza biolgica que causan algn tipo de inestabilidad gentica mayor a la habitual de la especie, como la producida por ejemplo por genes relacionados con los sistePDV GH UHSDUDFLyQ GH $'1 R SRU OD DFWLYDFLyQ de transposones. Agentes fsicos Entre stos tenemos distintos tipos de radiaciones ionizantes como los rayos X, los rayos gamma, los neutrones, los protones y las partculas alfa, cada una de ellas con diferente poder de ionizacin y de penetracin. Las radiaciones ionizantes al atravesar la materia producen iones radicales inestables y electrones libres, que a su vez originan una

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serie de reacciones qumicas directas (por ionizacin de un tomo en una molcula), o indirectas (por reaccin de las macromolculas con productos radiolticos, mayormente con los radicales OH del agua). Entre otros cambios TXtPLFRV TXH DIHFWDQ HO $'1 RFXUUH OD GHDPLnacin de bases y produccin de 8-hidroxiadenina y de varios glicoles de timina, oxidacin de alcoholes de la desoxirribosa y roturas de las uniones carbono-carbono. Los tratamientos con radiaciones ionizantes implican habitualmente altos niveles de dao cromosmico, originando roturas simples y dobles de las cadeQDV GH $'1 \ HIHFWRV VLROyJLFRV GHOHWpUHRV que conducen a una alta letalidad celular y a una alta esterilidad de las plantas de la primera generacin, todo lo cual limita la obtencin de una alta tasa de mutaciones en la segunda generacin. La magnitud y el tipo de dao ocasionado por las radiaciones ionizantes son marcadaPHQWH LQXLGRV SRU FLHUWDV FDUDFWHUtVWLFDV GHO material tratado, como el estado metablico y el contenido de agua y de oxgeno. As tambin, los efectos de determinada dosis pueden variar de acuerdo al mayor o menor tiempo en que se aplica (tasa de irradiacin), desde unos pocos segundos o minutos (irradiacin aguda) hasta meses o aos (irradiacin crnica). Los efectos letales de determinada dosis pueden disminuirse, por ejemplo, cuando se aplica repartida en distintos momentos, con intervalos de uno o varios das de recuperacin o incluso dividida en aplicaciones agudas realizadas en aos sucesivos (tratamientos recurrentes). Las radiaciones ionizantes que ms se han XWLOL]DGR SDUD LQGXFLU YDULDELOLGDG FRQ QHV GH WRPHMRUDPLHQWR VRQ ORV UD\RV ; \ ORV JDPPD con longitudes de onda del orden de fracciones de nanmetros (nm) a varios nm. Si bien los rayos gamma tienen mayor poder de penetracin que los X, los dos pueden penetrar desde varios milmetros a centmetros, siendo por lo tanto adecuados para tratamientos aplicados sobre semillas o yemas vegetativas. Ambas son radiaciones de origen electromagntico de baja energa lineal liberada al atravesar la PDWHULD SRU OR TXH VRQ FODVLFDGDV FRPR QR densamente ionizantes, en contraposicin con las densamente ionizantes, como por ejemplo

los neutrones ligeros. Las consecuencias genticas tpicas de las radiaciones ionizantes son las aberraciones cromosmicas, como las deleciones y translocaciones, que han resultado de utilidad para la ubicacin de numerosos genes sobre los cromosomas. Las deleciones producidas por las radiaciones densamente ionizantes son de mayor tamao y se agrupan, formando clusters, siendo ms difciles de reparar. Las de mayor tamao difcilmente sorWHDQ HO OWUR GH OD JDPHWRJpQHVLV SRU OR TXH HQ muchos casos no son transmitidas sexualmente a las progenies. Las deleciones conducen a knock outs gnicos y han sido utilizadas por ejemplo para inactivar genes que promueven la susceptibilidad a algunas enfermedades en trigo. En combinacin con la tecnologa de miFURDUUHJORV SXHGHQ SHUPLWLU OD LGHQWLFDFLyQ de genes candidatos cuya expresin pueden cambiar drsticamente. En muchos casos, las deleciones pueden ser localizadas por medio de Southern blot R 3&5 UHDFFLyQ HQ FDGHQD de la polimerasa). Por otro lado, las propiedades de las radiaciones ionizantes para romper los cromosomas y permitir as translocaciones han sido utilizadas desde hace ms de 50 aos para transferir segmentos cromosmicos entre distintas especies; tcnica que se ha utilizado para mejorar la resistencia a enfermedades en trigo. La luz ultravioleta es tambin una radiacin de origen electromagntico, pero a las longitudes de onda habitualmente utilizadas no se considera ionizante. Su longitud de onda es varios miles de veces superior a la de los rayos X y gamma, y por su baja penetracin slo es utilizable sobre materiales muy delgados, como por ejemplo granos de polen y cultivos celulares o de tejidos. La luz ultravioleta origina XQ GDxR PX\ HVSHFtFR VREUH HO $'1 FRQVWLtuido mayormente por la formacin de dmeros GH WLPLQD TXH D VX YH] VRQ HFLHQWHPHQWH UHparados por sistemas celulares muy especializados. Su efecto biolgico vara considerablemente de acuerdo a la longitud de onda, siendo OD GH PD\RU DEVRUFLyQ SRU HO $'1 DTXHOOD HQ HO rango de 250 a 290 nm. Agentes qumicos Las primeras investigaciones sobre la capacidad mutagnica de las sustancias qumicas

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datan de principios del siglo pasado, pero su XVR HQ WRPHMRUDPLHQWR VH FRQFUHWy PXFKRV aos despus a travs de los trabajos que facilitaron el uso al disminuir los requerimientos en equipamientos e instalaciones. Existen muchas sustancias con capacidad mutagnica, sin embargo los ms utilizados FRQ QHV SUiFWLFRV VRQ ORV GHQRPLQDGRV VXpermutgenos, entre ellos varios agentes alquilantes y la azida sdica, que pueden aumentar varios cientos de veces las tasas de mutacin espontnea. A diferencia de los tratamientos con radiaciones ionizantes donde las molculas son afectadas indiscriminadamente, los mutgeQRV TXtPLFRV VXHOHQ VHU PiV HVSHFtFRV /RV ejemplos clsicos son el cido nitroso y los anlogos de bases, productores de sustituciones del tipo transicin, y las acridinas que producen mutaciones de desfase de lectura. Los mutgenos qumicos que ms se han utilizado HQ WRPHMRUDPLHQWR VRQ ORV DJHQWHV DOTXLODQtes, denominados as por incorporar grupos alquilo a las macromolculas. A este grupo pertenecen los alquil alcano sulfonatos, como el etil metano sulfonato (EMS) y el metil metano sulfonato (MMS), los dialquil sulfatos, como el dimetilsulfato (DMS) y el dietilsulfato (DES); y ORV FRPSXHVWRV QLWURVRV FRPR OD 1PHWLO1QLWURVRXUHD 018 R 01+ \ OD 1HWLO1QLWURVR XUHD (18  6H WUDWD GH FRPSXHVWRV HOHFWURflicos que reaccionan con tomos que tienen XQ SDU GH HOHFWURQHV OLEUHV FRPR 6 1 \ 2 HQ ese orden, de mayor a menor fuerza nucleoflica), y de esta manera actan sobre las bases y ORV JUXSR IRVIDWRV GHO $'1 \ WDPELpQ VREUH ODV protenas. Los agentes de mayor reactividad, FRPR HO 006 \ HO '06 WLHQHQ DQLGDG SRU ORV FHQWURV PiV QXFOHRItOLFRV \ HQ HO $'1 DWDFDQ PD\RUPHQWH HO QLWUyJHQR  GH OD JXDQLQD 1 G) y muy poco al O6-G o al grupo fosfato. Por el contrario, los agentes de menor reactividad FRPR (18 WLHQHQ XQ PD\RU HVSHFWUR GH VLWLRV de alquilacin y afectan en mayor proporcin al O6-G. Esto tiene su importancia si consideramos que la O6-alquilG sera la principal causa de apareamientos errneos de G con T, mienWUDV TXH OD 1DOTXLO* RULJLQD GHSXULQDFLyQ \ errores de reparacin, que tienden a derivar en roturas cromosmicas y ocasionalmente en

GHOHFLRQHV GH SDUHV GH EDVHV /D 018 WDPbin de baja reactividad, adems de las alquilaciones mencionadas, forma mayor cantidad de fosfodisteres, los que pueden derivar en URWXUDV GH FDGHQDV GH $'1 \ FRQWULEXLU D OD OHtalidad. El mutgeno qumico que ms se ha utilizado es el EMS, que habitualmente se asume como productor de mutaciones de punto del tipo transicin G/C a A/T. En relacin a esto es interesante advertir que hay 5 aminocidos que en sus codones slo tienen G o C en posiciones sinnimas, por ejemplo lisina (AAA o AAG) y tirosina (UAU o UAC), por lo que no podran ser cambiados por otros aminocidos mediante transiciones del tipo G/C a A/T. 8Q PXWiJHQR PX\ HFLHQWH HQ DOJXQDV SODQtas cultivadas, como cebada, arveja, trigo y arroz, es la azida sdica. Esta droga no es de por s mutagnica sino que necesita de la va de la sntesis de L-cistena para transformarse en el metabolito mutagnico azido-alanina. La azida no se ha visto como mutagnica en mamferos y por lo tanto desde el punto de vista de la bioseguridad, no sera peligrosa como mutgeno en humanos, ms all de su reconocida toxicidad como veneno de la respiracin oxidativa. En cebada, la azida sdica induce esencialmente sustituciones de bases, en su mayor parte transiciones, existiendo resultados divergentes en la bibliografa sobre su tipo: G/C a A/T o viceversa. Tanto la azida como el EMS, por su propiedad de inducir mutaciones de punto, son mutgenos indicados para la obtencin de series allicas y ambos han sido utilizados para generar poblaciones para anlisis de gentica reYHUVD FRPR HO 7,//,1* YHU PiV DGHODQWH  $FWXDOPHQWH ODV WpFQLFDV GH 7,//,1* HVWiQ DSRUtando una enorme cantidad de informacin sobre el efecto molecular de los mutgenos. Esto ha permitido detectar que ms del 50 % de las mutaciones inducidas por EMS o azida sdica son de sentido cambiado, y ms del 20 % son mutaciones silenciosas. En trminos generales aplicando estos agentes en varias plantas FXOWLYDGDV VH KDQ LGHQWLFDGR SROLPRUVPRV HQ QXFOHyWLGRV VLPSOHV 613V FRQ XQD IUHFXHQFLD que va de 1/50 a 1/500 kb. Se cree importante sealar que adems de las propiedades particulares de los mutgenos

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KD\ IDFWRUHV ELROyJLFRV TXH LQX\HQ VREUH OD tasa y el espectro de mutaciones, como la fase en que se encuentre la clula en el momento de ser tratada (G1, S o G2), la composicin de bases y el tamao del gen y, dependiendo del WLSR GH GDxR OD HFLHQFLD GH ORV GLVWLQWRV VLVtemas de reparacin celular y las condiciones en que estos acten. Todo esto hace que dosis similares de un mismo mutgeno puedan tener efectos biolgicos muy dispares. 3.1.2.2. Materiales tratados rganos seleccionados para el tratamiento En el caso de especies propagadas por semillas, stas han sido el rgano preferido a tratar, ofreciendo la ventaja de un manejo sencillo que permite trabajar con grandes cantidades de material en condiciones relativamente fciOHV GH FRQWURODU /D SULQFLSDO GLFXOWDG GHO WUDtamiento de semillas radica en la constitucin multicelular del embrin, que hace que los individuos originados a partir de la semilla tratada resulten quimricos, es decir compuestos por clulas o clones celulares de distinta constitucin gentica. Esto es as porque en cada clula, los cambios genticos o mutaciones que potencialmente puede producir el mutgeno pueden tener muchsimas alternativas diferentes, haciendo cercana a cero la probabilidad de que un grupo de clulas meristemticas muten simultneamente en el mismo gen y posicin nucleotdica Los clones celulares que forman la planta adulta tienen un crecimiento irregular de difcil prediccin que complica el diseo de XQ PDQHMR HFLHQWH GHO PDWHULDO H[SHULPHQWDO A pesar de esto, el tratamiento de semillas ha dado numerossimos xitos aplicados al mejoramiento de diversos cultivos. Como se seal anteriormente los tratamientos fsicos de semillas deben hacerse con radiaciones que tengan VXFLHQWH SHQHWUDFLyQ SRU HMHPSOR UD\RV ; rayos gamma, o neutrones ligeros, as como tambin se deber prestar atencin a los diverVRV IDFWRUHV TXH LQX\HQ HQ HO HIHFWR ELROyJLFR de las radiaciones. Por otro lado, los tratamientos qumicos de semillas se aplican mediante inmersin en solucin acuosa y con agitacin constante durante varias horas. Los tratamientos cortos suelen aplicarse despus de un remojo en agua que potencia marcadamente el

efecto de los mutgenos. Luego del tratamiento qumico, la semilla se lava cuidadosamente y se seca, y una vez eliminada la humedad VXSHUFLDO HVWDUi OLVWD SDUD OD VLHPEUD (Q OD semilla tratada se inicia la generacin M1, esta nomenclatura denota la primera generacin de PXWDQWHV \ VH GLIHUHQFLD GH XQD ) HQ TXH 12 es resultado de un cruzamiento, sino de un tratamiento mutagnico. En las plantas de propagacin vegetativa los equivalentes a las semillas son los rganos de multiplicacin como yemas, rizomas, etc. stos son tambin rganos multicelulares y la complejidad de crecimiento de los sectores mutaGRV HV D~Q PD\RU TXH HQ ODV VHPLOODV 1R REVtante, esto no ha sido impedimento para que, en la prctica, se hayan obtenido numerosos cultivares mejorados. En general los rganos vegetativos son ms sensibles que las semillas a los efectos txicos de los mutgenos qumicos y resulta ms difcil lograr aplicaciones homogneas. Por ello, las radiaciones ionizantes FRQ VXFLHQWH SHQHWUDFLyQ KDQ VLGR ODV PiV utilizadas en estos casos. Por medio de irradiacin de yemas con altas dosis puede reducirse el nmero de clulas del vstago y as tender a la obtencin de vstagos mutantes no quimricos. El problema del quimerismo de las plantas M1 puede evitarse tratando rganos unicelulares como vulos, polen o proembriones unicelulares, y en el caso de plantas de multiplicacin vegetativa, por tratamiento de yemas adventicias o de cultivos in vitro de clulas o tejidos. La utilizacin de mutagnesis inducida en combinacin con el cultivo in vitro presenta adems la ventaja de permitir una seleccin sobre un gran nmero de clulas mutagenizadas. Si bien esta seleccin est limitada a caracteres que puedan ser evidenciados en estas condiciones, son varios los casos que han resultado exitosos, por ejemplo con respecto a mejorar la tolerancia a temperaturas extremas y resistencia a algunas enfermedades y herbicidas. Eleccin de los genotipos parentales /D ORVRItD GH OD PXWDJpQHVLV LQGXFLGD DSOLcada al mejoramiento es en cierta medida similar a la de la retrocruza, en el sentido que se

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busca cambiar un gen (o unos pocos) conservando un fondo gentico determinado. Por otro lado, se diferencia claramente de ella en que la variante allica de inters es generada de novo y, por lo tanto, puede ser una variante no presente en el germoplasma actual de la especie. Es aconsejable partir de genotipos con un buen fondo gentico, de manera que puedan ser mejorados por cambios en uno o unos pocos genes. Por ejemplo, puede mejorarse la resistencia gentica a determinada enfermedad conservando un fondo gentico de buenas caractersticas agronmicas y/o de calidad industrial o comercial. Tambin por cambios en un solo gen puede adaptarse un genotipo a una nueva regin mediante mutantes para el largo de ciclo, o por ejemplo cambiar drsticamente la calidad industrial por mutantes en las caractersticas del aceite de la semilla. 3.1.3. Evolucin de los daos de los tratamientos mutagnicos 3.1.3.1 Desarrollo de los sectores mutantes Tal como se ha descripto, el tratamiento de rganos multicelulares originar plantas M1 quimricas en las que las mutaciones inducidas slo ocuparn un sector. El tamao y la forma de estos sectores mutantes dependern de varios factores: A) Factores inherentes al material tratado, como el estado de desarrollo y la estructura del embrin o del meristema vegetativo y la ontogenia de la especie. Esto ha sido estudiado principalmente mediante marcadores cloroflicos y mutantes del polen, y ms recientemente por tcnicas basadas en la recombinacin de $'1 SDUD DFWLYDU PDUFDGRUHV HVSHFtFRV (Q plantas con alta capacidad de macollaje, como cebada o trigo, la tendencia general es que el tejido germinativo de las espigas principales provenga de varias clulas iniciales (generalmente de 4 a 12) mientras que puede encontrarse que ms de una espiga lateral provenga de la misma clula inicial. B) Factores relativos al tratamiento como el tipo de mutgeno, dosis y condiciones de aplicacin. En general los tratamientos que inducen alta letalidad celular, como por ejemplo altas dosis de radiaciones ionizantes, reducirn el nmero de clulas meristemticas a partir de

las cuales se formar la planta M1 y por lo tanto en stas tender a aumentar el tamao de cada uno de los clones celulares. C) Factores relativos al mutante inducido, esSHFLDOPHQWH HQ OR TXH VH UHHUH D VX H[SUHVLyQ y competitividad. En especies reproducidas sexualmente los sectores mutantes tendrn TXH VRUWHDU GRV WLSRV GH OWURV VHOHFWLYRV SDUD llegar a la segunda generacin (M2). En esta generacin, salvo excepciones, las plantas tendrn una constitucin gentica homognea en todo el soma. En el caso de plantas autgamas, la segregacin de homocigotas mutantes en M2, permitir la observacin de los alelos mutantes que tengan expresin recesiva. En el caso de las algamas para que esto ocurra ser necesario realizar la autofecundacin forzada de las plantas M1. En el maz, por ser una planta diclino monoica en la que los clones ceOXODUHV TXH IRUPDQ ODV RUHV IHPHQLQDV \ PDVculinas se originan en distintas clulas iniciales de la semilla, la autofecundacin de las plantas M1 slo servir para el control genealgico pero no para la segregacin de homocigotas mutantes en la M2. Esto hace que la aplicacin de mutgenos sobre rganos unicelulares que evitan la formacin de plantas quimricas, como el polen, resulte especialmente interesante en maz. 9ROYLHQGR D ORV OWURV VHOHFWLYRV SULPHUR RFXrrir la seleccin somtica o diplntica a nivel de los tejidos quimricos del soma de la planta M1. La competencia de un sector mutante con su entorno puede comenzar muy temprano a nivel de la clula mutante original. Luego a nivel de la gametognesis de las plantas M1 ocurrir la seleccin gamtica o haplntica. Lo arriba mencionado es vlido para los genes localizados en el ncleo, pero en el caso de genes localizados en las organelas citoplasmticas (plstidos y mitocondrias), que obedecen a UHJODV GH OD KHUHQFLD PiV H[LEOHV HO GHVDUURllo de las quimeras es ms complejo que para los nucleares, sumado a que la competencia del alelo mutante tambin puede ocurrir a nivel intracelular entre los distintos genomas de una organela. Una representacin esquemtica que ilustra la evolucin en uno y otro caso puede encontrarse en Kirk y Tilney-Bassett (1978). En las plantas multiplicadas vegetativamente, la seleccin gamtica y la recombinacin

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sexual estarn ausentes, a lo que se agrega que en las yemas, las clulas meristemticas tienen una organizacin del tipo tunica corpus, es decir que estn organizadas en capas histognicas que cubren un cuerpo central y que al crecer se comportan, en cierta manera, como independientes. Por otro lado, estas plantas son comnmente poliploides y con un alto nivel de loci heterocigotas, todo lo cual hace que un espectro muy diferente de mutantes puede estar disponible para el mejoramiento vegetal. La LQXHQFLD GH ORV JHQHV DO HVWDGR KHWHURFLJRWD sobre la expresin de los sectores mutantes a nivel somtico fue estudiada por Prina y Favret (1988) utilizando como modelo la cebada. 3RU RWUR ODGR OD SROLSORLGtD SXHGH LQXLU QRtablemente la expresin y vitalidad de las mutantes, los genotipos poliploides tienen mayor capacidad de soportar cambios drsticos como grandes deleciones de cromosomas o incluso

de cromosomas enteros. En stos habitualmente se observa una menor proporcin de cambios fenotpicos drsticos que en los diploides. 3.1.3.2. Expresin de los distintos daos El esquema de la Figura 1 indica los distintos momentos en que pueden observarse los daos producidos por el tratamiento de semillas (para ms detalles ver Prina, 1989). Las proporciones de los distintos daos tienen tenGHQFLDV GHQLGDV GH DFXHUGR DO PXWiJHQR \ la manera en que se aplique. Si comparamos mutgenos como el EMS y la azida sdica con los rayos X, a iguales niveles de dao en las plantas M1 (sectores somticos, aberraciones cromosmicas, letalidad), con los primeros tendremos tasas de mutaciones muy superiores en la generacin M2. Tal informacin es til para la eleccin de las dosis ms adecuadas en base a observaciones en las plantas M1. En

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principio puede pensarse que a mayores dosis se obtendr un mayor nmero de mutantes en la M2, pero la eleccin no es tan sencilla. En el caso de las radiaciones ionizantes suele recomendarse el uso de la dosis letal 50, buscando un compromiso entre la cantidad de plantas sobrevivientes en la M2 y la cantidad de mutaciones que ellas porten. Con los qumicos los efectos letales suelen no tener una correlacin directa con los efectos mutagnicos. Con variaciones importantes entre especies e incluso entre genotipos de una misma especie, las ms recomendables son las concentraciones intermedias. En los tratamientos de azida VH KD YLVWR XQD LQXHQFLD PX\ PDUFDGD GHO S+ de la solucin. Con estos mutgenos, el dao ms limitante suele ser la esterilidad de la M1. Es importante sealar que no siempre es recomendable utilizar los tratamientos que den las ms altas tasas de mutaciones en M2, ya que si bien esto aumenta la probabilidad de obtener una mutante buscada analizando una determinada cantidad de material, tambin aumenta la probabilidad de inducir mutaciones simultneas en una misma clula lo que luego puede requerir un trabajo considerable para eliminar por retrocruza los alelos no deseados. 3.1.4. Manejo y seleccin La semilla M1 usualmente se siembra a campo semilla por semilla para permitir la individualizacin de las plantas a la cosecha. En lo posible, debe realizarse en lote aislado, geoJUiFD \R WHPSRUDOPHQWH GH RWUDV SDUFHODV del cultivo. Para mutantes de efecto marcado que son fcilmente distinguibles a nivel de individuos habitualmente la seleccin comienza en la M2. En el caso de mutantes que conducen a cambios fenotpicos leves o cuya expresin tieQH XQD LPSRUWDQWH LQXHQFLD DPELHQWDO HV PiV FRQDEOH UHDOL]DU OD VHOHFFLyQ HQWUH IDPLOLDV GH generaciones ms avanzadas. (Q IRUPD VLPSOLFDGD SRGHPRV GHVFULELU WUHV tipos bsicos de manejo del material mutagenizado para pasar de M1 a M2: 1-Manejo genealgico por progenies de espigas, panojas o ramas: fue propuesto por Stadler en 1930, en los albores de la mutagnesis experimental. Implica un mayor trabajo inicial, SHUR WLHQH HO EHQHFLR GH TXH SHUPLWH UHFRQR-

cer las mutaciones inducidas por el tratamiento mutagnico de otras preexistentes, o de las originadas por mezcla de semillas o de polen. Por otro lado, en el caso de hallarse mutantes idnticas permite evaluar la probabilidad de que se hayan originado en el mismo o en distintos eventos mutacionales. 2- Manejo por conjunto o pool de 1 semilla por espiga, panoja o rama: en este caso la cosecha se limita a una semilla de cada una de ODV LQRUHVFHQFLDV SULQFLSDOHV GH ODV SODQWDV M1 con las que se formar un conjunto (pool). Se basa en que cada una de las semillas del pool provendr de clulas iniciales diferentes, y por lo tanto en un mismo pool no se encontrarn mutantes provenientes de un mismo evento mutacional. La formacin de varios pools como el descrito aumentar la probabilidad de aislar una mutante determinada pero, por otro lado, no permitir distinguir sobre el origen mutacional de mutantes idnticas que aparezcan en pools diferentes. Este manejo es adecuado cuando se quiere seleccionar mutantes de efectos moderados y/o de expresin altamente LQXLGD SRU HO DPELHQWH SDUD OR TXH HV UHFRmendable comenzar la seleccin en familias de la generacin M3. 3-Manejo en masa: se cosechan en masa o bulk todas las plantas M1 de un mismo tratamiento. Tambin puede limitarse el tamao de los bulks haciendo varios por tratamiento. Para este manejo se recomienda una siembra densa para limitar el crecimiento de las plantas M1 y as aumentar el nmero de los sectores M1 que sern analizados en M2 los que, de esta manera estarn ms homogneamente representados. Este manejo slo es aplicable cuando se dispone de una metodologa de seleccin individual barata y de aplicacin masiva. Al principio es menos laborioso que los anteriores, pero no distingue la variabilidad inducida de la preexistente, ni las mezclas de semilla o polen. Adems, puede incrementar notablemente el trabajo posterior si es que se obtienen muchas mutantes similares y se quiere distinguir si se originaron de manera independiente, o si provienen del mismo evento mutacional. En cuanto a la cantidad de material a tratar es obvio que a mayor cantidad de sectores mutantes representados en el momento de la

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seleccin, ser mayor la chance de aislar una mutante determinada. Cada uno de los manejos mencionados estar limitado en forma diferente por el trabajo de conduccin. Los clculos tericos sobre la cantidad de material a manejar en M1 y M2 son de relativa validez dada la multiplicidad de factores a tener en cuenta, muchos de los cuales son slo parcialmente controlables o predecibles. Habitualmente estos clculos se basan en probabilidades de knock out gnicos, considerando a todos los genes con igual chance de ser afectados. La crianza de la M1 habitualmente requiere poco esfuerzo y espacio en comparacin con las otras etapas, por lo que es recomendable criar material DGLFLRQDO SDUD DVHJXUDU XQD SREODFLyQ 0 VXcientemente grande, lo que adems puede permitir seleccionar entre tratamientos de acuerdo a observaciones sobre la M1. Algunos autores sealan que al trabajar con Arabidopsis, a meQXGR VH SUHHUH FULDU JUDQ FDQWLGDG GH SODQWDV M1 y luego someter a la seleccin unas 2000 a 125000 plantas M2. Mientras que en el caso del maz, que por ser algama requiere una autofecundacin controlada para poder seleccionar mutantes recesivas, se considera que 1000 plantas M1 no quimricas obtenidas por trataPLHQWRV GH SROHQ SXHGHQ VHU VXFLHQWHV SDUD tener chance de obtener al menos una mutante recesiva por locus. En autgamas, donde obviamente la autopolinizacin de las plantas M1 no insume un trabajo adicional, es recomendable incrementar el nmero de plantas M1 que pasan a la generacin M2 a varios miles. 3.1.5. Conclusiones Podemos sealar entonces, tres pasos fundamentales y complementarios en la mutagQHVLV LQGXFLGD DSOLFDGD DO WRPHMRUDPLHQWR ellos son:  5HDOL]DU WUDWDPLHQWRV PXWDJpQLFRV DSURpiados para originar una importante cantidad de clulas mutantes, pero en lo posible con una o unas pocas mutaciones cada una (evitando la multiplicidad de cambios mutacionales en una misma clula) y, adicionalmente, con bajos niveles de otros daos que afecten la viabilidad y/o vitalidad de las clulas y/o de los individuos mutantes.  +DFHU XQ PDQHMR HFLHQWH GHO PDWHULDO

mutagenizado en funcin del crecimiento de los sectores mutados en las plantas de la primera generacin y, de ser posible, con un control genealgico adecuado, que permita distinguir sobre el origen de mutantes similares. 3) Una vez que los alelos mutantes puedan ser detectados, aplicar una metodologa de seOHFFLyQ HFLHQWH TXH SHUPLWD DQDOL]DU JUDQGHV cantidades de material. Si bien la mutagnesis inducida tradicional es un proceso con un amplio espectro de resultados posibles y dependiente de mltiples factores, que pueden ser relativamente controlados, lejos est de ser una tcnica que depende totalmente del azar. Al xito de esta metodologa contribuirn los conocimientos de la biologa de la especie y del genotipo particular a tratar, la informacin disponible sobre su respuesta a los tratamientos mutagnicos, el conocimiento de las bases genticas del carcter a mejorar, etc. Sin duda que los resultados de esta metodologa se vern potenciados por un WUDEDMR PXOWLGLVFLSOLQDULR GH JHQHWLVWDV VLyORgos y mejoradores, sin descartar el aporte que puedan hacer muchas otras especialidades. El potencial de la mutagnesis clsica sin duda se ve hoy en da enormemente acrecentado por su uso en combinacin con las nuevas tcnicas de la biologa molecular y la biotecnologa. 3.2. TILLING y EcoTILLING 7,//,1* GHO LQJOpV Targeting Induced Local Lesions in Genomes) es una tcnica de bsqueda de mutaciones focalizada en un gen o secuencia nucleotdica conocida, que permite el anlisis de muestras de muchos individuos que provienen de una poblacin previamente PXWDJHQL]DGD HQ IRUPD DUWLFLDO R TXH SXHGHQ portar variacin natural sin necesidad de tratamientos mutagnicos, en este ltimo caso se la GHQRPLQD (FR7,//,1* 'DGR TXH VH OD XWLOL]D para averiguar la funcin de un gen o secuencia incgnita, se la considera como una tcnica GH JHQpWLFD LQYHUVD D SDUWLU GH PRGLFDFLRQHV genotpicas se evalan los efectos fenotpicos de las mismas para descifrar la funcionalidad de la secuencia), con ventajas sobre el knock out tradicional porque los sistemas de reempla]R DOpOLFR VRQ LQHFLHQWHV HQ SODQWDV VXSHULRres. Otra ventaja es que la mutagnesis con

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mutgenos como el EMS o la azida sdica no necesariamente anulan completamente la funcin del gen, como s lo hace el knock out o el knock down que se obtiene cuando se utiliza $51 LQWHUIHUHQWH R FXDQGR VH XWLOL]DQ UDGLDFLRnes ionizantes que producen deleciones (como tratamiento mutagnico). Esto, potencialmente, permite evaluar los efectos de reemplazo de cada uno de los nucletidos individuales del gen. (O 7,//,1* SHUPLWH LGHQWLFDU HVWDV PXWDciones puntuales aunque para poder utilizarlo se requiere conocer previamente la secuencia nucleotdica del gen o segmento genmico que se desea estudiar; sin embargo, no es necesario conocer la secuencia completa del genoma. El mtodo fue desarrollado originalmente en Arabidopsis thaliana y su uso se extendi posteriormente a plantas cultivadas como el maz, la papa, el trigo, la soja, el tomate, la lechuga \ HO JLUDVRO +D VLGR PX\ XWLOL]DGD FRQ QHV GH mejoramiento agronmico porque tiene la ventaja de que no conlleva las regulaciones a las que estn sometidas las plantas genticamenWH PRGLFDGDV (QWUH ORV JHQHV HVWXGLDGRV estn los relacionados a la calidad de almidn en granos (en mutantes con mayor amilopectina como los waxy), senescencia, enanismo, resistencia a oidios, larga vida en estante (en WRPDWH \ OHFKXJD  UHGXFFLyQ GH LVRDYRQDV \ DOpUJHQRV HQ VRMD PRGLFDFLyQ GH OD FRPSRVLcin de aceites en girasol, etc. (O (FR7,//,1* HQ FDPELR VH RULHQWy D OD XWLlizacin de ecotipos como fuente de diversidad para estudiar genes relacionados a la resistencia a estrs abitico (como por ejemplo los FRGLFDQWHV SDUD GHKLGULQDV R SDUD HQFRQWUDU nuevos marcadores moleculares funcionales GH WLSR 613 SROLPRUVPRV GH XQ VROR QXFOHytido, ver captulo correspondiente en este mismo libro). La tcnica consiste esencialmente de dos pasos: 1) la aplicacin de mutagnesis qumica inducida tradicional como se describi en este captulo, usualmente empleando EMS (etilmetanosulfonato); y 2) la utilizacin de una novedosa estrategia de bsqueda y deteccin de las mutaciones inducidas sobre un determinado gen o secuencia nucleotdica de inters. En la Figura 2 ilustra el proceso. Usualmente se

mutagenizan semillas o granos de polen para inducir la aparicin de mutaciones puntuales a lo largo del genoma. Las plantas derivadas de estas semillas tratadas con mutgenos se denominan M1 y, como ya se mencion, suelen ser quimricas y las mutaciones inducidas se encuentran en heterocigosis. Usualmente a las plantas M1 se las endocra dejndolas autofecundar en el caso de autgamas, o se procede a la autopolinizacin forzada en algamas para poder tener control de las genealogas y asegurar su conservacin. Usualmente se cosecha una semilla por planta M1 para pasar a la prxima generacin, pero esto bien puede hacerse FRQ XQD VHPLOOD SRU LQRUHVFHQFLD SULQFLSDO con muy bajo riesgo de repetir en la muestra dos mutantes provenientes del mismo evento mutacional. Por la endocra de las plantas M1 los genes mutados tendern a hacerse homocigotas, sin embargo no es imprescindible que alcancen la homocigosis para que puedan ser GHWHFWDGRV SRU 7,//,1* /D JHQHUDFLyQ 0 HV segregante: cada individuo podr ser homocigota mutante, heterocigota u homocigota salvaje en cada uno de los genes afectados, pero sern de constitucin gentica homognea en todo su soma, es decir no quimricos. De cada SODQWD 0 TXH GHEH VHU GHELGDPHQWH LGHQWLFDGD VH H[WUDH $'1 GH ODV KRMDV SDUD HO DQilisis de el/los gen/es de inters. Por otro lado, se guardan sus semillas para poder disponer en el futuro de sus descendencias (poblaciones M3). De este modo es posible conservar las mutaciones detectadas mediante el anlisis GH $'1 \ DGLFLRQDOPHQWH GLVSRQHU GH SREODciones que puedan distribuirse internacionalmente entre los consorcios de investigacin de cada especie (es comn que se comparta el material de las poblaciones mutantes de las especies ms estudiadas, como Arabidopsis y maz, entre los consorcios internacionales). 3DUD UHGXFLU FRVWRV ORV $'1V SURFHGHQWHV de distintas plantas M2 (usualmente entre 2 y 10) se pueden mezclar para su anlisis en un mismo tubo. Sobre una parte de la mezcla se UHDOL]DUi XQD DPSOLFDFLyQ SRU 3&5 XWLOL]DQGR ROLJRQXFOHyWLGRV FRQ VHFXHQFLDV DQTXHDQWHV al segmento genmico de inters (previamente diseados en base a la secuencia conocida). /RV SURGXFWRV GH DPSOLFDFLyQ TXH FRQVLV-

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tirn en una mezcla de secuencias normales y mutadas, se desnaturalizan sometindolos a alta temperatura y se les permite rehibridar entre s bajando la temperatura. Algunas de las cadenas rehibridadas podrn ser heteroduplexas, es decir, una de las cadenas provendr de una secuencia mutada y otra de una normal produciendo una doble cadena que contiene bases mal apareadas por falta de complementariedad. Estas bases mal apareadas sern reconocidas por la enzima endonucleasa CelI, produciendo un corte donde encuentra la anomala. Los productos de la digestin con Cell se resuelven por electroforesis en geles de poliacrilamida, y si los oligonucletidos utilizados HQ OD 3&5 IXHURQ SUHYLDPHQWH PDUFDGRV FRQ XRUyIRURV GH XRUHVFHQFLD URMR \ YHUGH HQ OD JXUD  ORV SURGXFWRV GHO FRUWH SRGUiQ VHU LGHQWLFDGRV SRU VX PHQRU WDPDxR FRPSDUDGR FRQ ORV $'1V QR FRUWDGRV YHU JXUD  /D XWLOL]DFLyQ GH  XRUyIRURV HQ OXJDU GH XQR D\XGD D UHGXcir el nmero de falsos positivos. Sobre esta tcnica bsica se introdujeron PRGLFDFLRQHV FRPR SRU HMHPSOR OD XWLOL]Dcin de geles no desnaturalizantes de poliacrilamida o agarosa y tincin con bromuro de etidio, que funcion muy bien en trigo. En los casos en que se utiliza irradiacin X o gamma para la induccin de mutaciones, el paso de digestin se saltea y se analiza en geles de secuenciacin. A medida que se van reduciendo los costos de secuenciacin y se convierta en rutina la deWHFFLyQ GH 613V SRVLEOHPHQWH UHHPSODFHQ HO tratamiento con CelI HQ OD WpFQLFD GH 7,//,1* Al da de hoy las publicaciones de ultra-deep sequencing en virus, permiten detectar genomas con variaciones en mezclas que contienen muchsimos genomas no mutados. Otra variante utilizada es la DHPLC (del ingls, denaturing high-performance liquid chromatography) basada en la utilizacin de columnas para cromatografa lquida de alta presin que SHUPLWHQ GLIHUHQFLDU $'1 KHWHURG~SOH[ GHO KRmodplex. Para reducir el nmero de muestras DQDOL]DGDV YDULRV SURGXFWRV GH 3&5 \ SRVWHrior digestin con CelI se siembran en el mismo carril de un gel (por ejemplo toda una columna). Por otro lado se siembra tambin toda una OD 'H HVWD PDQHUD OD DSDULFLyQ GH EDQGDV GH

igual tamao en carriles pertenecientes a coOXPQDV \ ODV SHUPLWH LGHQWLFDU OD LQWHUVHFFLyQ HQ OD TXH VH HQFXHQWUD HO SRFLOOR FRQ HO $'1 mutado (de un modo similar al esquema que se propone en la Figura 2). (Q HO (FR7,//,1* PHQRV XWLOL]DGR TXH HO 7,//,1* HQ OXJDU GH DQDOL]DU SREODFLRQHV SURvenientes de mutagnesis inducida, los materiales de partida que se utilizan como fuente de variabilidad suelen ser los almacenados en bancos de germoplasma, o bien ecotipos de especies no domesticadas. Los problemas de este enfoque alternativo son varios: el acceso al material puede ser limitante, los fondos genticos son demasiado variables, las mutaciones que disminuyen la adaptacin de una planta no suelen estar representadas porque son HOLPLQDGDV SRU VHOHFFLyQ QDWXUDO R DUWLFLDO HWF 3.3. Mutagnesis de insercin con transposones y ADN-T Otro sistema utilizado en gentica inversa para el anlisis funcional de genes consiste en la activacin de transposones endgenos (siendo el Ac-Ds de maz el ms emblemtico), mediante cruzamientos entre genotipos que resulten en la activacin de dichos transposones o mediante la introduccin de transposones forneos por ingeniera gentica (por ejemplo, el sistema Ac de maz fue introducido en papa, el Enhancer o SPM de maz en Arabidopsis o el PXWDGRU 5REHUWVRPLDQR Mu en maz). Una de las grandes ventajas de esta tcnica es que el elemento insertado proporciona un marcador molecular de secuencia conocida (tag) en el sitio de insercin (sitio de knock out), que puede facilitar el aislamiento del gen mutado por prdida o ganancia de funcin debido a que la insercin es reversible. Las desventajas principales de esta aproximacin son: que las mutaciones pueden ser inestables (revertir), y que la transposicin tiene frecuencias bajas y no siempre la insercin es totalmente azarosa. Para potenciarla se pueden colocar promotores fuertes como el 35S del virus del mosaico GHO FROLRU &D09 SDUD FRQWURODU OD H[SUHVLyQ del gen de la transposasa. Las ventajas de haFHU HVWR VH UHHMDQ HQ XQ DXPHQWR VLJQLFDWLYR en la tasa de mutacin (hasta 1x10-4 en maz, por ejemplo), y en que provee una secuencia

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fornea conocida en el sitio de insercin, lo cual facilita el posterior clonado molecular. Existen algunas variantes de esta tcnica como la captura de genes o de promotor (gene o promotor trapping), en este caso se pueden incluir secuencias forneas de genes reporteros como uidA (GUS), gfp (GFP) y sus variantes de otros colores, o genes involucrados en la sntesis de antocianas (Lc), con o sin pro-

motores funcionales. Si el gen indicador que no contiene promotor se inserta al azar bajo el control de algn promotor endgeno, entonces se activar su expresin y se visualizar fcilmente. Otra ventaja de esta aproximacin HV OD LGHQWLFDFLyQ VHQFLOOD VLQ QHFHVLGDG GH disponer de un fenotipo mutante, lo cual es til cuando existen genes redundantes, heterocigosis o cuando se analizan genes activos

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en distintos estadios de desarrollo. La funcin gnica puede caracterizarse posteriormente en las mismas lneas si la insercin ha producido un knock out. /D PXWDJpQHVLV GH LQVHUFLyQ FRQ $'17 (segmento T de transferencia del plsmido Ti) consiste en aprovechar la propiedad del sistema basado en Agrobacterium tumefaciens, para la transformacin gentica de plantas. El segmento T se inserta tericamente al azar en cualquier sitio de la eucromatina de las plantas, permitiendo as generar colecciones de mutantes de insercin con las caractersticas ya mencionadas anteriormente para los transposones; pero con mayor estabilidad que stos y menor preferencia por el sitio de insercin. Sin embargo, como las frecuencias de mutacin son extremadamente bajas, slo se utilizan actualmente en combinacin con transposones. Es decir que se incluye un transposn activo dentro del segmento T para inducir mutagnesis por transposicin en la especie transformada. Una de sus desventajas, es que su uso estar limitado a aquellas especies que son transformadas por agrobacterias. Lecturas Recomendadas
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II. Capitulo 5 Variacin somaclonal


Susana Cardone, Sofa Olmos y Viviana Echenique 1 Introduccin El cultivo in vitro representa un momento de estrs para las clulas y tejidos vegetales y puede desencadenar procesos mutagnicos durante el establecimiento del explanto, la induccin de callo y la formacin de embriones o vstagos durante el proceso de regeneracin de plantas. Algunos de los cambios genticos ocurridos en las plantas regeneradas pueden resultar variantes atractivas, con utilidad potencial en el mejoramiento vegetal para el desarrollo de nuevas variedades. /DUNLQ \ 6FRZFURIW  OODPDURQ variacin somaclonal a los cambios ocurridos en las plantas regeneradas y que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de cambios reversibles que pueden PRGLFDU OD H[SUHVLyQ GH FLHUWRV JHQHV (Vtos cambios que no implican alteracin en la secuencia nucleotdica se denominan epigenticos (Madlung y Comai, 2004). Algunos autores los consideran variantes somaclonales mientras que otros slo incluyen en la misma aquellos cambios que no revierten en ciclos sucesivos de reproduccin sexual. Los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal no han sido completamente dilucidados. Sin embargo, se han propuesto varias causas de posible incidencia en la ocurrencia de la misma. Entre esas causas se citan: el genotipo, la fuente de explanto, el tiempo en cultivo, las condiciones y composicin del medio de cultivo y la va de regeneracin. La comprensin de estas causas ayudara a mejorar la interpretacin de los procesos celuODUHV GH UHVSXHVWD DO HVWUpV \ SHUPLWLUtD GHQLU como actan en los procesos de evolucin. Entre los fenmenos que ocurren durante el cultivo in vitro se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinacin somtica e intercambio de cromtidas hermanas, rearreglos gnicos somticos, activacin de elementos genticos transponibles,

DPSOLFDFLyQ \ PHWLODFLyQ GHO $'1 \ FDPELRV HQ HO $'1 GH ODV RUJDQHODV 3RU HOOR DXQTXH los caracteres morfolgicos (como por ejemplo HO KiELWR GH FUHFLPLHQWR OD PRUIRORJtD RUDO etc.) son fciles de evaluar, otros cambios no VH PDQLHVWDQ HQ YDULDQWHV PRUIROyJLFDV HYLdentes. Una diferencia estructural en un producto gnico puede no alterar su actividad ELROyJLFD OR VXFLHQWH FRPR SDUD SURGXFLU XQ IHQRWLSR PRGLFDGR SRU OR WDQWR OD YDULDFLyQ debe analizarse a varios niveles. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparicin ocasional de variantes no encontradas en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronmico, permite utilizar este fenmeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado, en algunos casos, para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia econmica, entre los que se incluyen: resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos cidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta tcnica involucra un balance entre la cantidad de variacin inducida y el mantenimiento de los caracteres agronmicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontr resistencia a la oruga militar en un cultivar que reuna otras buenas caractersticas, dando origen al cultivar %UD]RV5 Si bien desde el punto de vista prctico no es XQD WpFQLFD PX\ HFLHQWH GDGR TXH QR HV SRsible predecir ni dirigir el tipo de variacin y se hace menester trabajar con poblaciones grandes de plantas, es necesaria la compresin del mecanismo para evitarlo en casos donde se UHTXLHUH GHOLGDG JHQpWLFD FRPR HQ OD PLFURpropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin de plantas. En algunos casos puede representar una fuente de variacin rpida y de fcil acceso para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genticos limitados o de base gentica estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas puede ser limitada. Los primeros casos de variacin somaclonal se registraron en plantas de reproduccin agmica como la caa de azcar y la papa,

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pero el fenmeno ha sido observado en monocotiledneas como trigo, maz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorn (Eragrostis curvula) y en dicotiledneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparicin de variacin somaclonal Hemos mencionado, previamente, algunos GH ORV SRVLEOHV IDFWRUHV TXH WLHQHQ LQXHQFLD en la aparicin de variacin somaclonal. En este punto trataremos cada uno por separado. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios depender de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el mismo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variacin que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variacin somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtencin de variedades. El nivel de ploida del genotipo es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrs y en papa se observ que, durante el cultivo de tejidos, las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidas. La explicacin ms razonable para este hecho es que los poliploides, con ms de dos juegos completos de cromosomas, estn tamponados, y por lo tanto toleran la ganancia o prdida de cromosomas, pudiendo as cumplir con los requisitos impuestos por la regeneracin. En los diploides, la prdida o la alteracin de cromosomas que llevan genes vitales impedir la regeneracin de las plantas, llegando con xito a esta etapa slo aquellos explantos que tengan su complemento cromosmico completo. Existen evidencias de una mayor inestabiOLGDG HQ KtEULGRV LQWHUHVSHFtFRV FXOWLYDGRV in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los hbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum, donde el cultivo in vitro genera entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que suelen contener slo el genoma de Hordeum vulgare.

Explanto. La variacin observada entre plantas regeneradas puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genticos. Esto VLJQLFD TXH GHQWUR GH XQD PLVPD SODQWD H[LVten diferentes linajes celulares, esto se debe D XQD VHULH GH FDPELRV HQ HO $'1 QXFOHDU GH ciertos tipos celulares producidos durante el desarrollo. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus clulas son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes lneas celulares pueden dar origen a plantas genticamente diferentes. Por lo tanto, la utilizacin de explantos con tejidos quimricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variacin. Sin embargo, la recuperacin de quimeras a partir de explantos no quimricos es un fenmeno frecuente que puede ocurrir, a partir de procesos organognicos, o por causas desconocidas. La utilizacin de explantos con tejidos organizados, como esquejes radicales o caulinares, es una buena opcin si es necesario mantener estabilidad gentica durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, an con explantos seguros. El cultivo de meristemas aislados minimiza el riesgo de variacin somaclonal. Esto no debe tomarse como regla, ya que utilizando tcnicas moleculares fue posible detectar variacin en plantas de frutilla y paraso obtenidas a partir de meristemas. Ell cultivo de protoplastos parecera inducir inestabilidad gentica, como fue observado en papa y tabaco; esto se ha asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneracin de plantas a partir de explantos tan pequeos. La va de regeneracin tambin tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los gneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variacin observada en cultivos embriognicos fue relativamente menor que la que obtenida en cultivos organognicos. Esto probablemente se debe a la gran presin de seleccin impuesta en la formacin de los embriones, mayor que la requerida en la formacin de vstagos. Se cree que el gran nmero de genes requeridos para la iniciacin y maduracin de embriones cigticos y somticos impedira la acumulacin de mutaciones deletreas. Sin

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embargo, tambin se observaron variantes en plantas de caf, apio y caa de azcar regeneradas a travs de embriognesis somtica. En estos casos se advirti que algunos fenotipos anormales de embriones somticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maz. La mayor parte de la variacin obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. Los mecanismos de iniciacin de un callo parecen ser similares a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la induccin de en]LPDV \ SURGXFWRV HVSHFtFRV GH VLWXDFLRQHV de estrs. La desdiferenciacin que ocurre durante la induccin del callo, altera procesos celulares que resultan en cambios genmicos, uno de los ms frecuentes es la inestabilidad cromosmica. La naturaleza del callo tambin puede afectar el nivel de variacin obtenida. Un callo verdadero es una masa de clulas desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variacin. En varias monocotiledneas el callo representa, a menudo, una masa de rganos suprimidos o proembriones ms que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad gentica, como se ha observado en esprrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observ que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos provenientes de semillas fueron anormales, mientras que las obtenidas SRU FDOORV GH LQRUHVFHQFLDV IXHURQ PX\ VHPHjantes a las plantas de las cuales provenan los explantos. En ocasiones, tambin fue posible observar variacin en plantas obtenidas por regeneracin directa, es decir, sin que medie un proceso previo de desdiferenciacin celular ni formacin de callo. El estado fsico del medio de cultivo tamELpQ LQX\H HQ HO QLYHO GH YDULDFLyQ REWHQLGD Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio slido o en medio lquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotpica y/o incrementar el nmero de plantas albinas y tambin la GHFLHQFLD GH R[tgeno que se genera durante el transcurso del cultivo. La tensin de oxgeno a la que estn

H[SXHVWDV ODV FpOXODV VXSHUFLDOHV GHO FDOOR HV diferente a la de las clulas situadas en profundidad. La anaerobiosis resultara en la produccin de etanol, el cual podra comportarse como un mutgeno. Un efecto similar podra tener la acumulacin de metabolitos producidos por las propias clulas durante el cultivo. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico), han sido sealados como inductores de inestabilidad. Estos ejercen profundos efectos sobre la respiracin celular, el consumo de azcares y en el control de la divisin celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la induccin de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Aparentemente el 2,4-D induce desdiferenciacin y provoca un incremento sustancial en la transcripcin. Esto puede alterar la estructura de la cromatina, por lo cual se lo utiliza en gramneas como inductor de aneuploidas. La relacin auxina:citosina tambin suele afectar en este sentido. El 2,4-D, el AIA (cido indolactico) y HO $1$ iFLGR QDIWDOHQDFpWLFR KDQ VLGR VHxDODdos como los responsables de los incrementos en la metilacin de las citosinas, que tienen lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores del $'1 GRQGH ODV FLWRVLQDV VH HQFXHQWUDQ PHWLladas en posicin 5 son considerados puntos calientes de mutacin, ya que la desaminacin de una 5-metilcitosina resulta en un cambio de citosina a timina. Un estudio realizado en papa indicara que el tipo y la concentracin de los reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo in vitro no generara variacin gentica. Los efectos seran ms importantes durante el crecimiento del callo y la iniciacin de los vstagos. Estos datos sugieren que la fase de callo sera un perodo sensible en el cual la manipulacin hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas; de manera que las hormonas induciran inestabilidad gentica sin ser, necesariamente, el origen de la misma. La GHFLHQFLD R H[FHVR GH PLQHUDOHV en el medio de cultivo podran ser causa de variacin. Este fenmeno se ha observado tambin en plantas creciendo en condiciones de campo. Un ejemplo tpico lo constituyen plantas GH OLQR VRPHWLGDV D H[FHVR R GHFLHQFLDV GH

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azufre, nitrgeno, fsforo, calcio y magnesio. En estas plantas se observaron cambios genmicos estables y heredables. En este caso los cambios fueron inducidos por una fertilizacin excesiva del suelo, obtenindose as lneas estables, denominadas genotrofos, caracterizaGDV SRU GLIHUHQWH FRQWHQLGR GH $'1 QXFOHDU \ citoplasmtico. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variacin, aumentando la proporcin de variantes en cultivos envejecidos y tambin en plantas obtenidas a travs de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maz, avena, tabaco, triticale y raigrs triploide. La variacin puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos jvenes. El nmero ptimo de subcultivos podra estimarse empriFDPHQWH OXHJR GH UHDOL]DU SUXHEDV GH GHOLGDG gentica en las plantas regeneradas, a travs de subcultivos subsecuentes. Una observacin comn es que en los perodos prolongados de cultivo hay una prdida de totipotencia y que esto sucedera debido a la acumulacin de mutaciones y a la alteracin de los genes que son responsables de la regeneracin. Sin embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de WUDEDMR HQ OD 816 HQ FRODERUDFLyQ FRQ HO ,%21( GHPRVWUy TXH HQ SODQWDV PLFURSURSDJDGDV de paraso gigante las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no habiendo una relacin lineal entre el nmero de subcultivos y la cantidad de variacin obtenida. La variacin en este caso se detect mediante OD WpFQLFD GH 5$3'V D OR ODUJR GH GH  VXEFXOtivos (Olmos y col., 2002). 3 Cambios genmicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algn momento esa capaciGDG GH DPRUWLJXDFLyQ VH YXHOYH GHFLHQWH \ ORV organismos caen en un estado de crecimiento subptimo que parece inducir mecanismos de cambios genmicos. Las bases metablicas de la interaccin entre el estrs y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia GH DOWHUDFLRQHV D QLYHO GHO $'1 D FRQVHFXHQcia de diferentes estreses ambientales, depen-

diendo de la intensidad del estrs y del estado de diferenciacin de las clulas, en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurriran, en parte, debido a una prdida del control del ciclo celular. Entre las alteraciones genticas se citan mutaciones puntuales, cambios en la estructura o el nmero de cromosomas y activacin de elementos genticos transponibles. Estos ltimos causan reorganizaciones moleculares, no solo por su transposicin, sino tambin SRUTXH JHQHUDQ DPSOLFDFLRQHV \ GHOHFLRQHV El cultivo in vitro tambin incrementa la frecuencia de intercambio entre cromtidas hermanas o crossing over" somtico. Varias hiptesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como son las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones cromosmicas estructurales y numricas, la activacin de transposones y las mutaciones gnicas. Kaeppler y Phillips (1993) proponen la existencia una base molecular comn para todos estos eventos mutagnicos que comprendera una alWHUDFLyQ HQ ORV SDWURQHV GH PHWLODFLyQ GHO $'1 Estos cambios en la metilacin podran afectar OD H[SUHVLyQ GH JHQHV HVSHFtFRV LQFOX\HQGR elementos transponibles o podran afectar la estructura de la cromatina de una manera ms global, involucrando, por lo tanto, a un gran nmero de genes. El mecanismo por el cual suceden estos cambios no ha sido totalmente dilucidado pero se los ha vinculado con una replicacin tarda de la heterocromatina que tambin provocara eventos de ruptura cromosmica. Los cambios en los modelos de metilacin causados por el cultivo de tejidos no seran aleatorios y en raigrs se ha propuesto la existencia de puntos FDOLHQWHV GH LQHVWDELOLGDG HQ HO $'1 JHQyPLFR Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrs severo de nutrientes o de agua no experimentan el mismo tipo de cambios encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. El cultivo de tejidos podra representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrs, que podra LQGXFLU XQD UHVSXHVWD ~QLFD \ XQ SHUO SDUWLFXODU de mutacin. Un posible efector de esta variacin podran ser los reguladores de crecimiento. En cuanto a los cambios en el nmero de cromosomas, la poliploida es el ms comn de estos fenmenos, y estara relacionada con

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fallas en la mitosis, mientras que la aneuploida puede surgir por segregacin desigual en la mitosis o por fragmentacin nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el nmero cromosmico pueden afectar el fenotipo. En papa, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploida o por duplicacin cromosmica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides presentaban cambios fenotpicos evidentes. La variacin somaclonal tambin puede afectar el genoma de los plstidos y las mitocondrias. En plantas de sorgo androestriles obtenidas in vitro se observ restauracin parcial de la fertilidad y en plantas androestriles de maz con citoplasma T (que eran, adems, susceptibles a Helminthosporium maydis) hubo reversin de la androesterilidad y de la susceptibilidad al patgeno. Estos cambios VH FRUUHVSRQGtDQ FRQ PXWDFLRQHV HQ HO $'1 mitocondrial. Otro caso de variacin debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras de Gramneas. En plantas albinas de trigo obtenidas por cultivo de anteras se obserYDURQ GHOHFLRQHV \ UHDUUHJORV HQ HO $'1 GH ORV cloroplastos. Si bien parecera que los tejidos somticos son menos sensibles a la variacin, tambin se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. 4 Niveles de deteccin de la variacin somaclonal Los mecanismos que operan para inducir variacin son numerosos y diversos y, probablemente, actan en simultneo, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de PRGLFDFLRQHV JHQyPLFDV JHQHUDGDV SRU FXOtivo in vitro reviste inters desde un punto de vista prctico, ya que las mismas podran ser potentes fuentes de material para seleccionar variantes de inters y desde un punto de vista terico, ya que posibilitaran realizar estudios bsicos acerca de las causas de la variacin y el posible control de la misma. La ocurrencia de variacin somaclonal puede detectarse con marcadores morfolgicos, bioqumicos y moleculares. La correlacin de dichos marcadores con caracteres agronmi-

cos es un requisito relevante para su implementacin en los programas de mejoramiento. La utilizacin de marcadores morfolgicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa desde el punto de vista del mejoramiento y citada en varios trabajos de investigacin. El examen visual y la utilizacin de un analizador de imgenes posibilitaron la diferenciacin entre fenotipos normales y aberrantes en Pelargonium. Tambin se detectaron cambios en altura, tamao de hojas, nmero y peso de semillas de plantas de man obtenidas in vitro. En anan se observaron cambios estables en el color y textura de las hojas, tamao de los frutos y tasa de proliferacin de vstagos; el cultivo de tejidos de violeta africana result en XQ  GH YDULDFLyQ HQ HO FRORU GH ODV RUHV GH plantas regeneradas. A QLYHO VLROyJLFR, tanto en cereales como en frutales se detectaron y seleccionaron variantes que presentaron resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales y condiciones de acidez en el suelo, entre otros. Estos estudios se basaron en la utilizacin de altas presiones de seleccin durante la regeneracin, mediante la adicin de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneracin, como inculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo permite revelar cambios en el nmero de cromosomas (poliploidas, aneuploidas) y en la estructura de los mismos (translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones). Las alteraciones cariotpicas constituyen una fuente importante de variacin, que muchas veces es subestimada cuando se trabaja con mtodos tradicionales de conteo cromosmico. Las tcnicas de bandeo cromosmico brindan ms informacin acerca de la estructura cromosmica y las alteraciones que pueden surgir en este sentido. Por ejemplo, en plantas de Brachycome dichromosomatica regeneradas a partir de suspensiones celulares, esta tcnica permiti detectar reordenamientos cromosmicos, mientras el nmero cromosmico permaneci estable. La hibridacin in situ es otra de las tcnicas que permiten examinar los cariotipos de una forma ms exacta y resulta particularmente til para revelar anormalidades en la estructura de los cromosomas.

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Entre los marcadores bioqumicos utilizados para analizar plantas regeneradas y sus progenies, se encuentran las isoenzimas. Las mismas permitieron detectar variacin en plantas de Populus tremuloides regeneradas a travs de callos. El anlisis se realiz mediante electroforesis en geles de almidn, utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenada (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco-isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6PGD). Los patrones electroforticos permitieron diferenciar las plantas control de las variantes, sin embargo, las plantas albinas obtenidas HQ HVWH HQVD\R QR SUHVHQWDURQ SROLPRUVPRV en los loci estudiados. Tampoco se encontraron variantes cuando se estudiaron lneas de callos derivadas de embriones cigticos y somticos de abeto. Los 25 loci analizados, utilizando 15 sistemas isoenzimticos, mostraron fenotipos isoenzimticos normales. Otro ejemplo, utilizando esta metodologa, se llev a cabo en lneas isognicas de Trifolium pratense L. que diferan en su capacidad de regeneracin. En este caso los patrones isoenzimticos de esas lneas resultaron idnticos para los sistemas GH SHUR[LGDVDV 35;  JOXWDPDWR GHVKLGURJHnadas (GDH), alcohol deshidrogenasas (ADH) y esterasas (EST). Si bien las isoenzimas aportan informacin til acerca de la variacin generada in vitro, su DQiOLVLV UHHMD ORV SURGXFWRV GH JHQHV H[SUHsados, cuya regulacin puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o VLROyJLFRV 3RU RWUR ODGR VyOR VH WUDQVFULEH \ traduce una pequea proporcin del genoma. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas sobre las isoenzimas ya que permiten detectar mutaciones en diferentes tipos de secuencias y adems, porque no son inXHQFLDGRV SRU HO DPELHQWH QL SRU ORV HVWDGLRV fenolgicos. Los RAPDs IUDJPHQWRV SROLPyUFRV GH $'1 DPSOLFDGRV DO D]DU SHUPLWLHURQ GHWHFWDU OD H[LVWHQFLD GH SROLPRUVPRV HQ SODQWDV de Triticum tauschii obtenidas de callo. Estos marcadores tambin se utilizaron para evaluar OD GHOLGDG JHQpWLFD HQ SODQWDV UHJHQHUDGDV de pino, abeto, festuca, roble y gingseng,. En FDxD GH D]~FDU ORV PDUFDGRUHV 5$3'V SHUPL-

tieron comprobar la susceptibilidad diferencial del genotipo al pasaje por cultivo in vitro, adems de reunir informacin para encarar nuevos cruzamientos en programas brasileros de mejoramiento de esta especie. Existen numerosos ejemplos que indican que la variacin molecular no siempre se expresa a nivel fenotpico y viceversa. Por ejemplo en el gnero Musa OD WpFQLFD GH 5$3'V UHYHOy SROLPRUVPRV HQ SODQWDV PLFURSURSDJDGDV GH IHnotipo normal. Del mismo modo, plantas regeneradas de palmera datilera que presentaban IHQRWLSRV RUDOHV DQRUPDOHV WXYLHURQ SDWURQHV moleculares normales. Otros marcadores tiles son los AFLP (poOLPRUVPR HQ OD ORQJLWXG GH IUDJPHQWRV DPSOLFDGRV GH $'1  TXH SHUPLWLHURQ GHWHFWDU la existencia de diferencias moleculares entre plantas de banana con fenotipos normales y aberrantes. Los microsatlites o SSRs, iniciales de su nombre en ingls simple sequence repeats, son altamente informativos, ya que son abundantes y estn dispersos a travs del genoma. Estos marcadores se utilizaron para el anlisis de plntulas de lamo, obtenidas por micropropagacin, donde se observaron PLFURVDWpOLWHV SROLPyUFRV HQ SODQWDV IHQRWtSLcamente normales. A veces, para detectar una variante obtenida in vitro es necesario realizar pruebas especFDV 3RU HMHPSOR FXDQGR VH HYDOXDURQ VRmaclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernculo y a campo, para resistencia a la RUXJD PLOLWDU 8Q VRPDFOyQ HO %UD]RV5 WHna un rendimiento equivalente al del cultivar madre, pero adems era resistente a dicho insecto. Esto se debe a que produce niveles ms bajos de un estimulante para la alimentacin del insecto. Es decir que mantena los caracteres agronmicos positivos del cultivar parental, pero tena un cambio en la produccin de un metabolito secundario que confera resistencia a la oruga. 5 La variacin somaclonal y su aplicacin en el mejoramiento gentico La base del mejoramiento gentico es la optimizacin de las interacciones gnicas. Para lograr combinaciones gnicas ptimas o superiores se requiere de diversidad gentica. Esta

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diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones induciGDV ItVLFDV R TXtPLFDV R SURGXFLGDV SRU $'1 T, por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridacin somtica y transformacin gentica. La variacin somaclonal proporcionara una fuente adicional de variabilidad gentica, potencialmente til en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variacin somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera: Es una tcnica poco costosa: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. Constituye una forma rpida de generar variabilidad gentica, particularmente para cultivos con base gentica estrecha y que son difciles de mejorar a travs de tcnicas tradicionales. Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. Puede utilizarse para mejorar especies de propagacin sexual y vegetativa. /DV WDVDV GH PXWDFLyQ VRQ UHODWLYDPHQWH elevadas si se comparan con las tasas de mutaciones espontneas. La variacin somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutacin cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutacin espontnea de 10-7 -9 mutaciones por par de nucletidos por generacin. El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad gentica durante el cultivo in vitro, permitira utilizar el fenmeno como estrategia de mejoramiento y permitira eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad gentica. El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutgenos qumicos o fsicos, ya que, en el caso de la variacin somaclonal, la mayora de los cambios deletreos producidos son HOLPLQDGRV SRU HO OWUR TXH UHSUHVHQWD OD regeneracin de plantas. Entre las desventajas cabe mencionar:

En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia prctica. La baja tasa de regeneracin de plantas en cultivos de largo trmino. Generalmente en estos casos existe prdida de la capacidad morfognica. La regeneracin est limitada a genotiSRV HVSHFtFRV TXH SXHGHQ QR VHU GH mucho inters para los mejoradores. Algunos somaclones son inestables (variacin epigentica). Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploida, esterilidad, etc. Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debera FXPSOLU ORV VLJXLHQWHV UHTXLVLWRV Involucrar caracteres agronmicamente tiles. El nivel de expresin del carcter debe superar al de sus progenitores. El carcter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronmicos de la variedad que son importantes para el cultivo. La variacin debe ser heredable y estable (sin reversin) en la progenie. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia prctica. El recurso es utilizar cultivaUHV DOWDPHQWH DGDSWDGRV SDUD PRGLFDU unos pocos caracteres, ya que resulta ms sencillo mejorar selectivamente una variedad de uso corriente que crear una nueva. 5.1 Estrategias para la seleccin de variantes tiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variacin somaclonal comprenden: a) Obtencin de plantas por cultivo de clulas o tejidos, que luego son analizadas para el carcter deseado.

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La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtencin de un cultivar por variacin somaFORQDO 3DUD HVWH Q VH FXOWLYD OD PHMRU YDULHGDG disponible y se seleccionan, entre las plantas

regeneradas, aquellas que expresen el carcWHU GH LQWHUpV (VWDV SODQWDV JHQHUDFLyQ 5 se emplean para generar progenies sexuales (en el caso de plantas con este tipo de repro-

Figura 1. Estrategia para la produccin comercial de variantes somaclonales (izauierda) y gametoclonales (derecha), en arroz.

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duccin), sobre las cuales se vuelve a realizar la seleccin para el carcter agronmico buscado, tratando de mantener a la vez todas las caractersticas favorables de la variedad. En plantas autgamas, como trigo, arroz y cebada, se considera aceptable la evaluacin de la esWDELOLGDG GHO FDUiFWHU KDVWD OD JHQHUDFLyQ 5 $ partir de este momento pueden realizarse cru]DPLHQWRV GH ODV SODQWDV 5 VHOHFWDV FRQ ODV OtQHDV SDUHQWDOHV D Q GH GHWHUPLQDU PHGLDQWH el anlisis de segregacin, la base gentica del carcter mejorado. Posteriormente, cuando se tenga semilla disponible, se realizarn pruebas agronmicas en diferentes ambientes, al menos en dos aos distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expreVLyQ GHO FDUiFWHU (O SURJUDPD QDOL]D FRQ OD etapa de multiplicacin de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. 8QD PRGLFDFLyQ SDUD OD SURGXFFLyQ GH QXHvas variedades est basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utilizan clulas haploides de plantas F1, como fuente de explanto, las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Los gaPHWRFORQHV VH UHHUHQ D JHQRWLSRV KDSORLGHV derivados del cultivo de anteras. Por medio de esta metodologa se podran recuperar caracteres recombinados de ambos parentales, adems de los que pudieran surgir in vitro. Las plantas haploides obtenidas son duplicadas mediante la exposicin al alcaloide colchicina. Las evaluaciones a campo se realizan en forma conjunta a medida que los nuevos materiales van siendo multiplicados, de manera de aumentar las replicas bajo diferentes condiciones ambientales. b) Seleccin a nivel celular o seleccin in vitro. Se realiza con el objetivo de obtener resistencia a estreses biticos o abiticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a: toxinas fngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta prctica pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se

procede a la regeneracin de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento. La seleccin efectuada sobre cultivos celulares, in vitro, puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: - Seleccin directa en un solo paso, donde el agente de seleccin es utilizado en concentraciones dobles o triples de la MIC (concentracin mnima que produce un 100 % de inhibicin). - Seleccin en varios pasos, donde la concentracin del agente selectivo es gradualmente incrementada en cultivos sucesivos y frecuentes. El primero es un mtodo simple y efectivo, ya que las clulas sensibles al agente morirn, permitiendo el crecimiento de las tolerantes. Sin embargo, elevados niveles de estrs sern deletreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor nivel de diferenciacin tisular hubiesen sido capaces de regenerar plantas tolerantes. La eleccin de un mtodo u otro depender de un monitoreo preliminar que brinde informacin acerca de la reaccin del tejido vegetal a las concentraciones letales y subletales del agente selectivo. En la Figura 2 se representan las etapas de la seleccin in vitro. En el ejemplo, diferentes variedades de arroz son evaluadas para tolerancia al aluminio. La induccin y la proliferacin de callo en el medio de cultivo al que se ha adicionado aluminio, es indicadora de la tolerancia del genotipo al metal en cuestin. Una vez regeneradas las plantas, se requieren evaluaciones posteriores realizadas a campo, en suelos con concentraciones elevadas de DOXPLQLR D Q GH FRUURERUDU OD WROHUDQFLD GHmostrada in vitro. La bsqueda de variantes a nivel celular SHUPLWH YHULFDU \ VHOHFFLRQDU IHQRWLSRV DGHcuados entre millones de clulas, con una inversin menor en tiempo, espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes especies entre las que pueden citarse: arroz, clavel, crtamo, banana, vid, frutilla y trigo. Sin embargo, no existe total garanta de que la resistencia manifestada in vitro se expresar a nivel de la planta entera. Hay diferentes expli-

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Figura 2. Seleccin in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas concentraciones de aluminio.

caciones para este fenmeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenticos, a la naturaleza quimrica del material, al uso de toxinas no HVSHFtFDV HQ HO FDVR GH UHVLVWHQFLD D HQIHUmedades), a la complejidad del carcter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequa) o a la imposibilidad de las clulas para expresar el carcter cuando se diferencian. Para las dos estrategias que se citaron previamente, a y b, la obtencin de resistencia slo ser posible si sta existe en la poblacin original (entonces el cultivo in vitro slo servira para recuperar los genotipos tiles) o bien si surge por variacin somaclonal durante el proceso de cultivo. 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente Dentro de los primeros registros de variacin somaclonal en cultivos de importacia econmica se encuentra la variacin registrada en arroz, donde se inform en detalle la variacin obtenida en la progenie derivada de la autofe-

cundacin de plantas regeneradas. Se lograron avances en el mejoramiento de esta especie en caracteres cuali y cuantitativos. Ejemplos en ste y otros cultivos importantes, con variedades comerciales obtenidas por esta tcnica, se detallan en la Tabla 1. Adems, se pueden mencionar logros en otros cultivos, por ejemplo: En papa, se logr resistencia a Phytophthora infestans, a Alternaria solani y a la colonizacin SRU iGRV TXH WUDQVPLWtDQ HO YLUXV < 39<  \ HO YLUXV GHO HQUROODPLHQWR GH OD KRMD 3/59  (Q este caso la resistencia surgi a travs del cultivo de protoplastos provenientes de suspensiones celulares cromosmicamente variables GHO FXOWLYDU 5XVVHW %XUEDQN En banana se obtuvo resistencia a Fusarium en cultivares que no haban podido ser mejoUDGRV SRU PpWRGRV WUDGLFLRQDOHV 1R REVWDQWH para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes, se necesit un trabajo posterior que permiti combinar ambas caractersticas en un somacln.

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Especie Geranio Batata

Carcter Arquitectura floral Calidad de races y arquitectura del canopeo

Origen Purdue Univ., USA North Carolina Research Service,USA Sugarcane Research Centre,Fiji Molecular Genetic, USA DNA Plant technology of New Jersey, USA DNA Plant technology of New Jersey, USA Plantech Research Institute, Japan Univ. Agricultural Sciences, Hungary ICAR, India

Caa de azcar Resistencia a estrs abitico y a enfermedades Maz Tomate Apio Arroz Contenido de triptfano Contenido de materia seca Contenido de materia seca Resistencia a enfermedades

Mostaza

Rendimiento

Tabla 1. Especies con variedades obtenidas por la estrategia de variacin somaclonal.

En tabaco, se obtuvieron cultivares tolerantes a aluminio y resistentes a herbicidas. Tambin, mediante la aplicacin de esta estrategia se obtuvieron cambios interesantes para su explotacin comercial en especies ornaPHQWDOHV 9DULDFLRQHV HQ HO FRORU GH ODV RUHV OD DUTXLWHFWXUD GH OD SODQWD \ HO Q~PHUR GH RUHV por planta se citaron en gerbera, clavel, crisantemo, tulipn, violeta africana y begonia. Dentro de las especies forrajeras, se han observado variaciones en plantas de alfalfa regeneradas por cultivo in vitro, para caracteres como altura y resistencia a Fusarium oxysporum. En gramneas forrajeras como Lolium y Festuca arundinacea se han citado cambios, en varios caracteres como por ejemplo: morfologa de planta, forma y tamao de hoja y HVSLJD GHVDUUROOR RUDO YLJRU \ VXSHUYLYHQFLD y en pasto bermuda (Cynodon dactylon), resistencia al moteado de la hoja En el laboratorio de Gentica del Dpto. de $JURQRPtD GH OD 816 VH OOHYy D FDER XQ SUR-

yecto para obtener somaclones de pasto llorn. Se trabaj con varios cultivares de esta gramnea apomctica y luego de la evaluacin de un gran nmero de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: - Una planta diploide sexual, obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Este PDWHULDO IXH UHJLVWUDGR HQ HO ,QVWLWXWR 1DFLRQDO de Semillas. - Utilizando un tratamiento de duplicacin cromosmica, se trat semilla, de una planta 51 derivada de la planta anterior obteniendo un genotipo tetraploide, altamente sexual, tambin registrado. Estos dos materiales se utilizan actualmente para realizar estudios bsicos acerca del modo de reproduccin (apomixis) y en la generacin de poblaciones de mapeo para el anlisis del modo reproductivo y de caracteres agronmicos de importancia. - Dos plantas heptaploides apomcticas a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Una

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de dichas plantas fue registrada como cultivar Don Luis, en honor al Ing. Luis Mroginski. Este cultivar presenta buenas caractersticas agronmicas. La obtencin de variacin in vitro, en trigo, y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En trigo, se ha obtenido resistencia a Helminthosporium sativum. En cebada se encontr tolerancia en somaclones regenerados en medios conteniendo el herbicida glifosato. En sorgo, se obtuvo variacin estable para altura, nmero de macollos, mayor produccin de granos y tolerancia a suelos cidos y a sequa. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones D QLYHO GHO $'1 PLWRFRQGULDO \ GH SURWHtQDV GH la semilla, como las gliadinas. En ambas especies se informaron cambios estables en varios caracteres como por ejemplo: longitud de la espiga, nmero de granos por espiga, peso de granos, densidad y biomasa de la espiga, contenido de protena en grano, altura de la planta, fertilidad, nmero de macollos, color del grano, tiempo de espigazn, dureza, sensibilidad al cido abcsico y color de las glumas. Las mutaciones observadas fueron de dominantes a recesivas y viceversa. El nico antecedente en nuestro pas de bsqueda de variacin somaclonal en trigo, es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares con elevados niveles de inestabilidad cariotpica espontnea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosmica, patrn de gliadinas, color del grano y de las JOXPDV WLSR GH DULVWDV QLYHOHV GH FORUROD \ morfologa de la planta. Slo se detect, como consecuencia del cultivo in vitro, una translocacin no descripta previamente y un patrn diferente de gliadinas. En este caso, se concluy que la tcnica no fue efectiva para inducir variacin que pudiera ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col., 1996). La variacin somaclonal ha sido vastamente registrada y tratada en la bibliografa. Sin embargo, su utilizacin como estrategia para la obtencin de variantes agronmicamente aproYHFKDEOHV HV GLVFXWLGD 1R REVWDQWH DGHPiV de su aplicacin en la generacin de variabilidad gentica (que resulta particular para cada grupo de plantas, especie, genotipo y condicio-

nes), es un fenmeno a considerar cuando se requiera utilizar cultivo de tejidos para regenerar plantas genotpicamente estables. 7 Lecturas recomendadas
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II. CAPTULO 6 Aplicacin de la transformacin gentica al mejoramiento vegetal


Marina L. Daz, Diego C. Zappacosta, 3DVFXDO 0 )UDQ]RQH \ 5D~O ' 5tRV 1 Introduccin El mejoramiento gentico vegetal se origin hace aproximadamente 10.000 aos, cuando el hombre se hizo agricultor y comenz la domesticacin de las plantas. En el siglo XX, con la incorporacin de los cruzamientos sexuaOHV HO FRQRFLPLHQWR GH OD ELRORJtD RUDO GH ODV especies, el desarrollo de la gentica y de la estadstica experimental, entre otros avances, se conformaron los mtodos de mejoramiento actualmente utilizados. El mejoramiento gentico convencional se basa en la existencia de variabilidad gentica para los caracteres que se desea mejorar y la manipulacin de la misma mediante la reproduccin sexual. Esto hace que el aprovechamiento de la variabilidad este restringido por barreras de compatibilidad reproductiva. El reciente desarrollo de mtodos de transferencia de genes que no implican cruzamientos, como la transformacin gentica, permite superar esta limitacin, abriendo nuevas perspectivas en el mejoramiento de las plantas. La transformacin gentica o transferencia de genes, tcnica tambin conocida como ingeniera gentica, permite introducir en plantas genes provenientes no solo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Asimismo, a travs de esta WHFQRORJtD HV SRVLEOH PRGLFDU OD H[SUHVLyQ GH genes presentes en el genoma de la planta. Si bien se suele denominar OGMs (organismos JHQpWLFDPHQWH PRGLFDGRV D ODV SODQWDV REtenidas mediante esta metodologa, es oportuno considerar que todas las plantas que han sido mejoradas por el hombre a partir de su GRPHVWLFDFLyQ KDQ VLGR PRGLFDGDV JHQpWLFDmente por lo cual son OGMs y consideramos ms apropiado utilizar para las plantas obtenidas mediante transformacin gentica la deno-

minacin de plantas transgnicas. Conviene destacar que la transformacin de plantas es una tecnologa que aporta variabilidad gentica conocida sin alterar el fondo gentico por lo que puede ser considerada como una metodologa conservativa de mejoramiento, similar, en ese sentido, a la mutagnesis inducida o a la retrocruza. Este ltimo aspecto es de gran importancia ya que la creacin de cultivares es un proceso acumulativo, es decir, que se desea introducir caractersticas favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. El germoplasma transgnico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento el cual depender de la especie y del tipo de cultivar a obtener. En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresin de un transgen (gen introducido por va asexual) en clulas vegetales y al ao siguiente se obtuvieron las primeras plantas transgnicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicacin de esta tecnologa a ms de 120 especies. Las plantas transgnicas se obtienen por diversos mtoGRV ORV TXH KDQ VLGR PRGLFDGRV SDUD FDGD especie en particular, aumentndose de esta IRUPD OD HFLHQFLD GH ORV PLVPRV Entre sus aplicaciones de inters agropecuario se encuentran la obtencin de plantas con resistencia a estreses biticos (virus, insectos, hongos y bacterias), a estreses abiticos (salinidad, sequa, etc.), tolerancia a herbicidas SDUD IDFLOLWDU HO FRQWURO GH PDOH]DV \ PRGLFDcin de la calidad nutricional de los cultivos entre otras. La transformacin gentica tambin constituye una herramienta til para estudios bsicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y funcin de genes esSHFtFRV DVSHFWR SDUWLFXODUPHQWH UHOHYDQWH en la era genmica. 2 Requerimientos para la obtencin de plantas transgnicas Para todas las tcnicas de transformacin desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen a introducir (ste conVLVWH HQ VHFXHQFLDV UHJXODWRULDV \ FRGLFDQWH clonadas en un vector de transformacin) y de XQD PHWRGRORJtD HFLHQWH SDUD VX WUDQVIHUHQcia al genoma vegetal. Luego se induce el de-

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sarrollo de plantas mediante distintas tcnicas de cultivo de tejidos y se procede al anlisis molecular de las plantas regeneradas in vitro SDUD LGHQWLFDU DTXHOODV TXH SRUWHQ \ H[SUHVHQ el o los transgenes en los niveles deseados. Finalmente, mediante experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgnicos y su descendencia. Por lo tanto, los elementos bsicos que se requieren en trabajos de transformacin gentica en plantas son: 1. 8Q VLVWHPD HFLHQWH GH FXOWLYR GH WHMLGRV que permita regenerar plantas completas y frtiles. 2. Vectores apropiados, que permitan el clonado del gen de inters y su transferencia al tejido blanco de transformacin. 3. Un protocolo de transformacin, es decir, un sistema de transferencia de genes y de seleccin del material transformado. 4. Herramientas de anlisis molecular para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo en la planta. Antes de iniciar la descripcin de los items anteriores, resulta importante destacar que para lograr una planta transgnica deben ocurrir tres procesos en una misma clula: a) El transgen debe ser transferido al interior de la clula, E (O WUDQVJHQ GHEH LQWHJUDUVH DO $'1 FHOXlar y c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la clula transgnica en la que se YHULFDURQ ORV SURFHVRV D \ E Dado que las clulas tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de estos procesos, la puesta a punto de un proWRFROR HFLHQWH GH WUDQVIRUPDFLyQ JHQpWLFD UHquiere maximizar la cantidad de clulas competentes para todos ellos de manera simultnea. 2.1 Cultivo de tejidos vegetales Los mtodos de transformacin ms utilizados actualmente se basan en la obtencin de clulas transgnicas y posterior recuperacin de plantas completas y frtiles a partir de las mismas a travs del cultivo y seleccin in vitro. Esto es posible gracias a la propiedad de

totipotencia expresada por las clulas vegetales. En la mayora de las especies se observa XQD LPSRUWDQWH LQXHQFLD GHO JHQRWLSR HQ OD respuesta al cultivo in vitro, razn por la cual es frecuente que se utilizen genotipos modelo GH DOWD UHVSXHVWD FRQ QHV H[SHULPHQWDOHV los cuales no necesariamente presentan inters agronmico. Por ello, cuando se usa esta WHFQRORJtD FRQ QHV GH PHMRUDPLHQWR JHQpWLFR es muy importante conocer la respuesta morfogentica de distintos genotipos con adaptacin local, de modo de poder transformar directamente genotipos con valor agronmico. Por otra parte, en el cultivo in vitro, un prolongado perodo de subcultivos puede inducir la aparicin de variacin somaclonal no deseable ya TXH HV FRQYHQLHQWH LQWURGXFLU VROR ODV PRGLcaciones que se desean y en forma controlada. 2.2 Construccin del vector Para introducir un transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plsmido). Para ello, PHGLDQWH OD WHFQRORJtD GHO $'1 UHFRPELQDQWH VH GLJLHUH HO $'1 H[WUDtGR GH XQ RUJDQLVPR cualquiera sea su origen, con enzimas de restriccin. Estas endonucleasas tienen la capaFLGDG GH UHFRQRFHU HQ HO $'1 VHFXHQFLDV HVSHFtFDV FRPSXHVWDV SRU SRFRV QXFOHyWLGRV \ posteriormente producir cortes en las mismas. Los fragmentos de restriccin as obtenidos pueden ser ligados enzimticamente a vectores de clonado, obtenindose, de este modo, FORQHV GH $'1 UHFRPELQDQWH YHU SDUWH ,  $Oternativamente, se puede utilizar una tecnologa de clonado basada en el mecanismo de UHFRPELQDFLyQ VLWLRHVSHFtFD GHO IDJR ODPEGD FRQRFLGD FRPR VLVWHPD *$7(:$< ,QYLWURJHQ  Un transgen est compuesto por una secuenFLD FRGLFDQWH UHJLyQ WUDGXFLEOH FRPSUHQGLGD entre los codones de iniciacin y terminacin de la traduccin) y por secuencias regulatorias que determinan tanto el momento del desarrollo de la planta como el tejido y el nivel en el que se expresar. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias (procariotas) \ XVXDOPHQWH QR SXHGHQ H[SUHVDUVH HFLHQWHmente en clulas eucariotas. Por lo tanto, resulta necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su

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expresin en clulas vegetales. En este contexto, la secuencia ms importante es la coUUHVSRQGLHQWH DO SURPRWRU VLWLR GHO $'1 DO FXDO VH XQH OD HQ]LPD $51SROLPHUDVD SDUD LQLFLDU el proceso de transcripcin (Fig. 1). En la eleccin del promotor a utilizar en la construccin del transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrn de expresin pueden variar al ser utilizados en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos, que permiten la expresin del gen en toda la planta en forma continua, los inducibles, que responden a factores ambienWDOHV \ QDOPHQWH ORV HVSHFtFRV GH WHMLGR TXH permiten la transcripcin en rganos y tejidos particulares (Tabla 1). Los promotores pueden VHU PRGLFDGRV FRQ HO Q GH DXPHQWDU OD H[presin de los genes que regulan. As, pueden truncarse, adicionrseles un intrn o unrseles secuencias de otros promotores. Adems, es necesario que el transgen disponga de una re-

gin no traducida en el extremo 3 del mismo, que incluya la seal de corte y poliadenilacin (terminador), necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente. Por otra parte, el nivel y patrn de expresin del gen tambin puede estar afectado por la posicin del mismo en el genoma de la planta, fenmeno conocido como efecto de posicin. Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas como intenVLFDGRUHV \ VLOHQFLDGRUHV D OD HVWUXFWXUD GH la cromatina, al patrn de metilacin, etc. Este aspecto es particularmente relevante considerando que con los mtodos de transformacin gentica nuclear utilizados actualmente, las inserciones de los transgenes en el genoma de la planta son al azar, As, la cantidad de protena producida por un transgen comnmente vara ms de 100 veces entre individuos transformantes obtenidos en el mismo experimento. La solucin para evitar los efectos de posicin es GLULJLU OD VHFXHQFLD GH LQWHUpV D VLWLRV HVSHFt-

Figura 1: Estructura molecular del transgen

Tabla 1: Promotores usados en la transformacin gentica de plantasv

Constitutivos

nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium) 35 S (virus del mosaico del coliflor) Ubi (ubiquitina de maz) Act 1 (actina de arroz) TA 29 (tapete de la antera de tabaco) faseolina (cotiledones de poroto) TobRB 7 (raz de tabaco) patatina (tubrculo de papa) glutenina (endosperma de trigo) subunidad pequea de Rubisco (luz) alcohol deshidrogenasa-1 (anaerobiosis) protena de shock trmico (calor)

Promotores
Especficos de tejido

Inducibles

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cos del genoma vegetal, elegidos por su patrn de expresin adecuado y estable. Esto podra lograrse usando sistemas de recombinacin KHWHUyORJD VLWLRHVSHFtFRV R PHGLDQWH UHHPplazo gnico por recombinacin homloga. 2.3 Mtodos de transformacin La pared celular constituye un obstculo SDUD OD HQWUDGD GHO $'1 D OD FpOXOD TXH WRGRV los mtodos de transformacin gentica tienen que superar de algn modo. Estos mtodos pueden dividirse en: a) Transformacin mediada por Agrobacterium, vector biolgico que participa del proceso de transferencia. b) Mtodos de transformacin gentica directa, tambin llamados fsicos, mediante los cuales, por distintos mecanismos no biolgiFRV VH LQWURGXFH HO $'1 HQ OD FpOXOD 2.3.1 Transformacin mediada por Agrobacterium Las bacterias del gnero Agrobacterium son Gram-negativas, aerbicas obligadas y viven en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saproftico o parastico. El gQHUR FRPSUHQGH FXDWUR HVSHFLHV WRSDWRJpQLcas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. tumefaciens y A. rhizogenes). Ambas especies son capaces de infectar una amplia variedad de especies de dicotiledneas. La patognesis se inicia a partir de heridas, provocando la proliferacin de las clulas individuales infectadas. As, A. tumefaciens causa tumores, enfermedad que se conoce como agalla de la corona y A. rhizogenes induce la proliferacin de races dando lugar a la enfermedad denominada raz en cabellera. La capacidad patognica de estas bacterias est asociada a la presencia de megaplsmidos (150-200 kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por tumor-inducing o inductor GH WXPRUHV R 5L SRU URRWLQGXFLQJ R LQGXFWRU de races), presentes en algunas de las agrobacterias. Se demostr que durante la patognesis un fragmento de estos plsmidos llamaGR 7$'1 SRU WUDQVIHU'1$  HV WUDQVIHULGR D OD FpOXOD YHJHWDO GRQGH VH LQWHJUD DO $'1 cromosmico y cuya expresin causa proliferacin de clulas de la planta a travs de la sntesis y alteracin de la respuesta a hormonas

YHJHWDOHV (O 7$'1 FRQWLHQH JHQHV OODPDGRV RQFRJHQHV TXH VH H[SUHVDQ HFLHQWHPHQWH en la clula vegetal infectada y producen sntesis de hormonas vegetales, responsables de la proliferacin anormal del tejido. Adems, contiene los genes responsables de la sntesis de opinas (fuente de carbono y nitrgeno para la bacteria). El sistema mediado por A. tumefaciens es el ms estudiado y utilizado en la transformacin GH SODQWDV (O 7$'1 HVWi GHOLPLWDGR SRU GRV repeticiones directas imperfectas de 25 pares GH EDVHV SE TXH OR DQTXHDQ OODPDGDV ERUdes derecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes son los nicos elementos en cis necesarios SDUD GLULJLU HO SURFHVDPLHQWR GHO 7$'1 &XDOTXLHU IUDJPHQWR GH $'1 XELFDGR HQWUH HVWRV bordes puede ser transferido a la clula vegetal. Contrariamente a lo que sucede con otros WLSRV GH VHFXHQFLDV PyYLOHV GH $'1 FRPR ORV WUDQVSRVRQHV DXWyQRPRV HO 7$'1 QR FRGLFD los productos que median su transferencia. El 7$'1 HV XQD UHJLyQ UHODWLYDPHQWH JUDQGH ca. 20 Kb) que contiene genes con secuencias regulatorias (promotores y seales de poliadenilacin) tpicamente eucariticas que permiten VX H[SUHVLyQ HFLHQWH HQ FpOXODV YHJHWDOHV Desde la dcada de 1950 se sabe que los tumores de la agalla de la corona se desarrollan si hay A. tumefaciens patognicas en presencia de heridas. Un aspecto destacable de esta bacteria es que usa la respuesta de la planta a las heridas (cicatrizacin y defensa) como quimioatractivo y activador del proceso de patognesis. Luego de la adhesin de la bacteria a la clula vegetal, etapa en la que estn involucrados genes cromosmicos bacterianos (chv A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce HO SURFHVDPLHQWR \ OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 mediados por los genes vir (por virulencia) que son inducidos por azcares y compuestos fePlsmido TI salvaje Borde izquierdo
Oncogenes

Genes de opinas

Borde derecho

Plsmido TI modificado Borde izquierdo


Gen de seleccin

Gen de inters

Borde derecho

Figura 2: (VWUXFWXUD GHO 7'1$

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nlicos, como la acetosiringona, producidos por clulas vegetales heridas. Se conoce con mucho detalle la etapa de la patognesis que ocurre en la bacteria (ver revisin de Gelvin, 2000). La regin de virulencia (de alrededor de 30 Kb) est organizada en operones esenciaOHV SDUD OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 vir A, vir B, vir D, vir * R TXH SHUPLWHQ LQFUHPHQWDU OD Hciencia de la transformacin (vir C, vir E). El conocimiento de la interaccin de Agrobacterium con las plantas se profundizar a partir de la disponibilidad (2001) de la secuencia nucleotdica completa del genoma de esta bacteria. El desarrollo de la patognesis causada por Agrobacterium representa una situacin nica en la naturaleza: la transferencia de un elePHQWR JHQpWLFR 7$'1 GH XQ RUJDQLVPR SURcariota a un organismo eucariota superior, con su subsiguiente integracin y expresin en el genoma hospedante. Este mecanismo de ingeniera gentica natural es aprovechado para la transferencia de genes de inters a las plantas. Para ello, los oncogenes y los genes de VtQWHVLV GH RSLQDV SUHVHQWHV HQ HO 7$'1 VRQ reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a transferir (Fig. 2). El mtodo llamado del explante (Horsch et al., 1984), consiste en inocular un explante (rgano vegetal) con A. tumefaciens, dejar la bacteria en contacto con el mismo durante un cierto tiempo en el cual se SURGXFH OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 PRGLFDGR 3RVWHULRUPHQWH VH WUDQVHUHQ ORV H[SODQWHV a un medio de cultivo que contiene un antibitico que acta como bacteriosttico para detener el desarrollo de Agrobacterium y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y seleccin in vitro se recuperan las plantas transgnicas (Fig. 3). El anlisis por hibridacin molecular de plantas transgnicas y su progenie ha demostrado que HO 7$'1 VH LQFRUSRUD DO $'1 FURPRVyPLFR \ se hereda en forma estable. Los plsmidos Ti sin oncogenes se denominan desarmados, son de gran tamao y resulWD GLItFLO LQWURGXFLU JHQHV HQ VX 7$'1 XVDQGR WpFQLFDV KDELWXDOHV GH $'1 UHFRPELQDQWH 3RU esta razn se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados, y los bina-

rios. En los vectores cointegrados la insercin GHO $'1 TXH FRQWLHQH ORV WUDQVJHQHV GHQWUR GHO 7$'1 GH XQ SOiVPLGR 7L GHVDUPDGR VH ORJUD por recombinacin homloga. En el sistema alternativo, sobre la base de la capacidad de los genes de virulencia de actuar en trans, movili]DQGR HO 7$'1 SUHVHQWH HQ RWUR SOiVPLGR VH construyen los denominados vectores binarios TXH FRQWLHQHQ XQ 7$'1 QR RQFRJpQLFR HQ XQ plsmido pequeo con un origen de replicacin funcional en un amplio espectro de hospedantes, caractersticas que permiten su fcil manipulacin gentica en E. coli. La introduccin de un vector binario a una cepa de Agrobacterium que contenga un plsmido llamado helper de virulencia (con la regin vir intacta y sin 7$'1  OD KDFH DSWD SDUD OD WUDQVIHUHQFLD GHO 7$'1 D ODV FpOXODV YHJHWDOHV 6L ELHQ DPERV WLSRV GH YHFWRUHV VRQ KHUUDPLHQWDV HFLHQWHV para la transformacin se aprecia una notable preferencia por el uso de vectores binarios. /D LQWHJUDFLyQ GHO 7$'1 HQ HO $'1 FURPRsmico de la planta se produce al azar, por recombinacin ilegtima, preferencialmente en regiones genmicas con actividad transcripcional y mediado por protenas de la bacteria y de la planta. Este sistema de transformacin SHUPLWH WUDQVIHULU IUDJPHQWRV GH $'1 GH KDVWD 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen caractersticas tanto de cromoVRPDV DUWLFLDOHV GH EDFWHULDV %$&V FRPR de vectores binarios. El uso de estos vectores SHUPLWH FORQDU IUDJPHQWRV GH $'1 GH JUDQ WDmao y posteriormente transferirlos al genoma vegetal va A. tumefaciens. Esta tecnologa es de gran utilidad para el clonado posicional de genes. Ms de 600 especies vegetales son hospedantes naturales de A. tumefaciens. Estas son en su mayora dicotiledneas y gimnospermas y ms raramente monocotiledneas. Para muchas de ellas se han puesto a punto protocolos de transformacin gentica basados en este vector. El inters en el desarrollo de este tipo de tecnologa hizo que se expandiera el rango de hospedantes de A. tumefaciens a especies que no son susceptibles a este patgeno en condiciones naturales. Esto fue posible debido al amplio conocimiento que se tiene de la interaccin Agrobacterium/clula vegetal. As, se

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ha puesto nfasis en la utilizacin de A. tumefaciens como vector de transformacin en gramneas y se han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz, maz, cebada, trigo y gramneas forrajeras). Cabe notar que su aplicacin es rutinaria en arroz y maz. La transformacin con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la produccin de races con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos secundarios como productos farmacuticos, aditivos alimentarios y cosmticos y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulacin de la rizognesis en especies recalcitrantes, por ejemplo leosas. 2.3.2 Transformacin directa o por mtodos fsicos La primer metodologa de transformacin gentica de plantas desarrollada fue la de A. tumefaciens, pero no result inicialmente de utilidad para abordar la transformacin de especies de gran importancia econmica como los cereales, debido a que stos no son hospedantes naturales de esta bacteria. Esta situacin condujo al desarrollo de los mtodos fsicos de transformacin. En ellos el transgen es introducido en la clula vegetal mediante distintas tcnicas que se detallan a continuacin: Transformacin de protoplastos /D LQWURGXFFLyQ \ H[SUHVLyQ GH $'1 IRUiQHR en protoplastos fue el primer mtodo de transferencia directa claramente demostrado en plantas. Se dispona, para algunas especies, GH SURFHGLPLHQWRV HFLHQWHV SDUD OD UHJHQHUDcin a partir de protoplastos, clulas que carecen temporariamente de pared celular que es OD SULQFLSDO EDUUHUD SDUD OD LQWURGXFFLyQ GH $'1 en las clulas vegetales. Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecnica o por un proceso enzimtico que digiere la pared. As se obtiene una suspensin que contiene millones de clulas individuales lo que favorece la transformacin de clulas aisladas. Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporacin, microinyeccin o liposomas. La transformacin de protoplastos mediada por PEG es el mtodo ms comnmente usado. Tanto el

PEG como la electroporacin producen poros en la membrana plasmtica por alteracin de la polaridad de la misma y por ellos penetra el $'1 IRUiQHR (Q HO ~OWLPR FDVR VH VRPHWH D ORV protoplastos a un campo elctrico. Ambas tcnicas permiten el tratamiento simultneo de un gran nmero de protoplastos. La microinyeccin es un mtodo difcil y laborioso que consiste en OD LQWURGXFFLyQ GH $'1 GHQWUR GH SURWRSODVWRV individuales mediante el uso de capilares de inyeccin y micromanipulador y con esta metodologa es posible lograr un alto grado de integraFLyQ GHO $'1 IRUiQHR Cabe notar que el cultivo de protoplastos es OD PHWRGRORJtD PiV VRVWLFDGD GH FXOWLYR in vitro de plantas por lo cual representa gran complejidad experimental y no est disponible ms que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologas alternativas de transformacin directa como la electroporacin de tejidos, HO XVR GH EUDV GH FDUEXUR GH VLOLFLR SDUD IDFLOLWDU OD HQWUDGD GHO $'1 D ODV FpOXODV HQ cultivo y el bombardeo con microproyectiles o micropartculas siendo este ltimo el ms utilizado actualmente dentro de los mtodos fsicos. Bombardeo de micropartculas Es un proceso por el cual micropartculas FXELHUWDV FRQ $'1 VRQ DFHOHUDGDV SRU XQ JDV comprimido e introducidas en clulas vegetales. Inicialmente la fuerza impulsora de las partculas estaba dada por plvora, pero luego fue reemplazada por el sistema de helio comprimido que brinda una mejor regulacin de la fuerza, distribucin de microproyectiles y mayor reproducibilidad entre bombardeos. Se utilizan microproyectiles de oro o tungsteno (qumicamente inertes) cuyos tamaos van desde 0,5 a  P TXH DO VHU GLVSDUDGRV D JUDQGHV YHORFLdades pueden atravesar pared y membranas de la clula vegetal bombardeada sin causarle GDxRV VLJQLFDWLYRV .OHLQ et al., 1987). Como blanco de bombardeo se pueden emplear diversos tipos de explante vegetal, desde clulas o protoplastos hasta plntulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. El explante es generalmente sometido a un tratamiento osmtico pre y post bombardeo que produce plasmlisis celular,

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evitando que el impacto y la penetracin de las partculas daen las clulas (Fig. 3). Los vectores plasmdicos que se usan en este tipo de procedimiento solo requieren un origen de replicacin que permita un alto nmero de copias de los mismos en E. coli, aspecto que facilita HQ OD SUiFWLFD OD SUHSDUDFLyQ GHO $'1 QHFHVDrio en grandes cantidades para la transformacin gentica por este mtodo. Esta tcnica, sin embargo, tiene limitaciones. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas, dada por cutculas endurecidas, paredes celulares OLJQLFDGDV R VXSHUFLHV YHOORVDV 6LQ HPEDUgo la principal limitacin del mtodo contina siendo la baja relacin entre el total de clulas sometidas al bombardeo y el nmero de clulas que logran incorporar de manera permanente el transgen. A pesar de esta limitacin, la versatilidad de la aceleracin de partculas para introducir transgenes ha superado muchas de las barreras asociadas a otros mtodos de transformacin, como son el rango de huspedes de Agrobacterium \ ODV GLFXOWDGHV inherentes al cultivo y regeneracin de protoplastos. Este mtodo, conocido tambin como biolstica, ha demostrado ser una buena opcin para la produccin de plantas transgnicas de

soja, sorgo, papaya, esprrago, caa de azcar y trigo, entre otras. 2.3.3 Transformacin directa vs. indirecta Con el transcurso de las investigaciones se ha logrado optimizar los protocolos de transformacin para muchas especies vegetales. Ambas vas de transformacin presentan ventajas y desventajas que las hacen ms o meQRV FRQYHQLHQWHV SDUD ORV GLVWLQWRV QHV (Q la Tabla 2 se presenta una comparacin entre la transformacin del genoma nuclear mediada por A. tumefaciens y el mtodo biolstico como representante de los mtodos de transformacin directa. Uno de los procesos necesarios para obtener plantas transgnicas, es la integracin del WUDQVJHQ DO $'1 FURPRVyPLFR &RQ UHODFLyQ D este proceso existen diferencias entre ambos mtodos. A. tumefaciens posee un mecanismo QDWXUDO PX\ HFLHQWH SDUD WUDQVIHULU DO Q~FOHR FHOXODU HO 7$'1 TXH FRQWLHQH HO WUDQVJHQ \ producir una integracin aleatoria en regiones cromosmicas con actividad transcripcional. Generalmente, los patrones de insercin de transgenes son ms sencillos en comparacin a los producidos por el mtodo biolstico. As el nmero de copias que se incorpora es bajo

Tabla 2: Comparacin entre mtodos de transformacin del genoma nuclear

Agrobacterium Especies a transformar

Mtodo biolstico

dicotiledneas y algunas monocotiledneas alta aleatoria en regiones con transcripcin bajo nmero de copias independientes precisa compleja mayor

sin limitaciones

Eficiencia de transformacin Tipo de integracin en el genoma vegetal

baja aleatoria multicopia en tandem imprecisa simple menor

Construccin de vectores Dependencia del genotipo vegetal

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 249

Figura 3: Comparacin de tcnicas de transformacin directa e indirecta

y cuando hay ms de una copia, stas suelen distribuirse en loci independientes, lo que facilita la posterior eliminacin de las copias no deseadas por segregacin. Por otra parte, el PHFDQLVPR LQYROXFUDGR KDFH TXH VH WUDQVHUD XQ VHJPHQWR GH $'1 GHQLGR HO 7$'1 acompaado de protenas que lo protejen de la accin de nucleasas. Por el contrario, en el PpWRGR ELROtVWLFR HO $'1 WUDQVIHULGR QR HVWi asociado a protenas, por lo que al ser parcialmente degradado solo parte del mismo llega al Q~FOHR GRQGH VH SURGXFH FRQ EDMD HFLHQFLD OD LQWHJUDFLyQ DO D]DU HQ HO $'1 FURPRVyPLFR En este mtodo es comn que se produzcan inserciones de varias copias del transgen en

un mismo sitio del genoma con distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. Este ltimo aspecto es considerado como una desventaja ya que tanto desde el punto de vista de la percepcin pblica como el de la optimizacin de la expresin de los transgenes, es deseable disponer de inserciones simples \ ELHQ GHQLGDV PROHFXODUPHQWH (VWR HV SDUticularmente relevante cuando se tiene por objetivo el desarrollo de productos comerciales. As, el fenmeno de silenciamiento de transgenes (prdida de su expresin), observado en algunos casos, puede resultar de la presencia de varias copias del transgen. Por otra parte, cuando se utiliza el mtodo biolstico, el seg-

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PHQWR GH $'1 SODVPtGLFR TXH VH LQWHJUD DO $'1 FURPRVyPLFR QR HVWi GHQLGR FRPR HQ HO FDVR GH 7$'1 VLQR TXH HV GH ORQJLWXG YDriable. La construccin de vectores es mucho ms sencilla en el caso del mtodo biolstico. Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigacin, en los cuales muchas veces se requiere utilizar un nmero considerable de vectores diferentes. Es conveniente destacar que en ambos mtodos la integracin del transgen en el genoma se produce al azar, como consecuencia de ello, diferentes plantas transgnicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. As, la expresin fenotpica de un transgen ser diferente en distintas plantas transgnicas que contienen el mismo transgen, por lo cual para claULFDU OD VLWXDFLyQ VH FRQVLGHUD D FDGD XQD GH ellas como eventos de transformacin distintos. /D HFLHQFLD GH DSOLFDFLyQ GH FXDOTXLHUD GH estos mtodos de transformacin al mejoramiento vegetal, depende en gran medida de la disponibilidad de genotipos con muy buena respuesta al cultivo in vitro. Finalmente, cabe mencionar que en el caso de A. tumefaciens, debido a que se trata de una interaccin biolgica planta/bacteria, la dependencia del genotipo HV PXFKR PiV DFHQWXDGD \D TXH LQX\HQ WDPELpQ HQ OD HFLHQFLD GH WUDQVIRUPDFLyQ WDQWR HO genotipo de la planta como el de la bacteria.

2.3.4 Genes de seleccin e informadores En el proceso de obtencin de plantas transgnicas, los genes marcadores seleccionables (Tabla 3), generalmente de origen bacteriano, cumplen un rol de relevancia ya sea en forma individual para poner a punto un protocolo de transformacin o como acompaantes del gen de inters que se desea introducir. El gen marcador seleccionable otorga a las clulas transgnicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las clulas no transgnicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. (QWRQFHV VL HO JHQ PDUFDGRU FRGLFD SDUD XQD SURWHtQD TXH FRQHUH UHVLVWHQFLD D DJHQWHV totxicos como antibiticos o herbicidas, las clulas que lo expresen podrn crecer y desarrollarse en medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las clulas no transgnicas no lo harn (seleccin negativa). En otros casos, la ventaja estar dada por la posibilidad de utilizar diferencialmente un sustrato. As, el gen man A de E. coli permite a las clulas vegetales que lo expresan utilizar la manosa como fuente de carbono, lo cual no es posible para las clulas no transgnicas (seleccin positiva). Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados. Por ello, es importante evaluar este aspecto cuando se elige el gen de seleccin a utilizar, as como el agente selectivo y las concentraciones del mismo.

Marcadores

Seleccionables (Agente selectivo) npt II (kanamicina, paromomicina, G418) hph (higromicina) pat o bar (phosphinotricina, bialaphos) CP 4 (glifosato) man A (manosa 6 fosfato)

Visualizables (Fenotipos asociados) gus A (color azul ndigo) luciferasa (luminiscencia) gfp (fluorescencia verde)

Tabla 3: Genes marcadores utilizados comnmente en transformacin de plantas

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 251

En la puesta a punto de las metodologas de transferencia de genes son asimismo de gran utilidad los genes marcadores visualizables o informadores que posibilitan la observacin directa de las clulas que los expresan (Tabla 3). (VWRV JHQHV FRGLFDQ SDUD SURWHtQDV TXH QR estn presentes en las clulas vegetales y producen un fenotipo caracterstico de fcil y rpida observacin. As, el gen gus A proveniente de E. coli FRGLFD SDUD OD enzima -glucuronidasa. Esta protena puede ser detectada cualitativamente por tincin histoqumica. En esta WpFQLFD HQ SUHVHQFLD GH XQ VXVWUDWR HVSHFtFR esta enzima cataliza la produccin de un precipitado azul-ndigo de fcil visualizacin. Este marcador tambin puede ser detectado cuanWLWDWLYDPHQWH XVDQGR WpFQLFDV XRURPpWULFDV Como ejemplo de la aplicacin de estos mtodos de deteccin, podemos mencionar el estudio de la expresin de promotores en plantas. Para ello se puede construir un vector con la VHFXHQFLD FRGLFDQWH GH Jus A bajo el control del promotor en estudio y una secuencia de terminacin de transcripcin, y obtener plantas transgnicas. El estudio de las mismas permite conocer el patrn de expresin espaciotemporal del promotor (en que tipo de clulas y cuando se expresa) por tincin histoqumica y VX QLYHO GH H[SUHVLyQ SRU XRURPHWUtD 3RU RWUD SDUWH HO JHQ GH OD SURWHtQD XRUHVcente verde, gfp JUHHQ XRUHVFHQW SURWHLQ  aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen clulas que expresan este gen, se observa un brillo verde XRUHVFHQWH $O VHU HVWH XQ HQVD\R QR GHVWUXFtivo, es decir que permite conservar vivo el material en estudio, representa una herramienta de utilidad para visualizar diferentes etapas del proceso de transformacin. 2.4 Tcnicas de deteccin del transgen y sus productos Luego de la seleccin in vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas por mtoGRV PROHFXODUHV SDUD LGHQWLFDU DTXHOODV TXH porten y expresen los transgenes en los niveles deseados. Para ello se emplean tcnicas como:

- Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR): con el uso de primers homlogos a la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Esta tcnica permite hacer un screening rpido de las plantas regeneradas, aunque tiene algunas limitaciones. As, un resultado positivo indica solamente que en OD PXHVWUD H[LVWH XQD VHFXHQFLD TXH DPSOLFD con los primers utilizados pero no demuestra que el transgen se encuentre incorporado al genoma de la planta. Para esto ltimo se requiere un estudio de hibridacin molecular o el estudio de la transmisin sexual del transgen. La robustez de esta prueba se maximiza utilizando temperaturas de annealing o apareamiento de primers altas (ms de 60 qC) y primers relativamente largos (ms de 20 nuFOHyWLGRV  8QD YDULDFLyQ GH HVWD WpFQLFD 3&5 en tiempo real, resulta de utilidad para evaluar el nmero de copias del transgen incorporadas al genoma de la clula vegetal (ver parte I). - Hibridacin molecular o Southern blotting: es una de las herramientas moleculares mas poderosas para caracterizar las plantas transgnicas. Adems de indicar la presencia o no de la secuencia de inters, da informacin acerca de la integracin de la misma en el genoma de la clula husped (nmero de copias integradas y nmero de loci en los cuales se produjo la integracin). En la Figura 4 se representa el anlisis de un caso hipottico de transformacin mediante Agrobacterium, aunque este es aplicable tambin a plantas obtenidas por mtodos directos. El esquema 4-a representa parte del vector que contiene el gen de inters y el gen marcador. Si se utiliza FRPR VRQGD HO 7$'1 FRPSOHWR \ OD GLJHVWLyQ GHO $'1 JHQyPLFR VH UHDOL]D FRQ HQ]LPDV GH UHVWULFFLyQ TXH QR FRUWDQ GHQWUR GHO 7$'1 HO nmero de bandas del patrn representa el nmero de sitios de insercin. El tamao de las EDQGDV VHUi PD\RU TXH HO 7$'1 \D TXH VH estn utilizando enzimas que cortan por fuera de este. Plantas transgnicas obtenidas en forma independiente tendrn patrones de hibridacin diferentes (4-b). Por otra parte, si la enzima tiene un sitio de corte nico dentro GHO 7$'1 XWLOL]DQGR OD VRQGD DQWHV PHQFLRnada, esta dar dos seales de hibridacin

252 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Hind III

Eco RI

Sal I

Sal I

Hind III

a)

BI

Gen marcador 2 kb b) 1 2 3 4 5 c) 1 2 3 4

Gen de inters 3 kb 5 d) 1 2 3 4 5

Sitio de corte: Sonda: Frag: tamao cantidad

Ausente dentro del TADN


T-ADN (frag. Hind III)

Uno interno (Eco RI)


T-ADN (frag. Hind III)

Un sitio (EcoRI) entre el marcador y el transgen Gen marcador > 2 kb Igual en en b)

> 5 kb Variable

> 2 kb El doble que en b)

e) 1

f) 1

Sitio de corte: Sonda: Frag: tamao cantidad

Un sitio (Eco RI) entre el marcador y el transgen Transgen > 3 kb Igual que en d)

Dos sitios (Sal I) dentro del transgen Fragmento (Sal I) del transgen 1 kb Uno

Figura 4: Patrones de Hidridacin de Southern Blot (Tomado de Bhat y Srinivasan, 2002)

para cada sitio de insercin independiente del 7$'1 F  /D DSDULFLyQ GH XQ Q~PHUR LPSDU de bandas indica que en un mismo sitio se insertaron mltiples copias, ocurrieron rearreglos R VH SURGXMR HO WUXQFDGR GHO 7$'1 6L VH GLgiere la muestra con una enzima de restriccin que posee un sitio nico de corte entre el gen marcador y el gen de inters y utilizando como sonda el gen marcador, se obtendr una sola banda por cada insercin independiente (4-d). Si la membrana se hibrida con el gen de inters (4-e) aparecer un patrn que tendr el mismo nmero de bandas que el anterior. La ausencia de una banda indica la insercin de una copia truncada de uno de los genes y la

prdida del sitio de corte. La aparicin de una EDQGD GHO WDPDxR GHO 7$'1 SXHGH LQGLFDU OD presencia de repeticiones en tandem. Para estimar el nmero de copias del transgen en un locus transgnico, se deben utilizar enzimas de UHVWULFFLyQ FRQ VLWLRV DQTXHDQWHV GHO WUDQVJHQ y como sonda el transgen. Se observar una sola banda del tamao del transgen, sin embargo la intensidad de la seal variar entre las distintas plantas analizadas de acuerdo al nmero de copias del mismo (4-f). Para realizar esta comparacin es necesario utilizar simultneamente estndares conteniendo un nmero conocido de copias del transgen. Esta determinacin no es del todo precisa ya que puede

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 253

existir variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestin de las muestras y a OD SRVLEOH GHJUDGDFLyQ GHO $'1 (Q OR TXH UHVSHFWD D OD FXDQWLFDFLyQ HVWD tcnica ha sido reemplazada en gran medida, HQ ORV ~OWLPRV DxRV SRU OD 3&5 HQ WLHPSR UHDO R UHDO WLPH 3&5 DQWHV PHQFLRQDGD GDGR TXH esta ltima resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos cantidad de material vegetal para realizar el anlisis. - Anlisis de ARN: 7DQWR ODV WpFQLFDV GH 57 3&5 WUDQVFULSFLyQ UHYHUVD VHJXLGD GH 3&5 FRPR OD KLGULGDFLyQ GH $51 R 1RUWKHUQ EORWting pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de inters preVHQWHV HQ OD PXHVWUD /D 573&5 SUHVHQWD DOJXQDV YHQWDMDV IUHQWH DO 1RUWKHUQ EORWWLQJ se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra es de fcil preparacin. Por otra parte, la hibridacin del $51 XWLOL]D FRPR VRQGD HO WUDQVJHQ RIUHFH informacin sobre el tamao del transcripto y SHUPLWH VX FXDQWLFDFLyQ &DEH GHVWDFDU TXH OD 573&5 SXHGH WDPELpQ VHU XWLOL]DGD FRPR WpFQLFD GH FXDQWLFDFLyQ GH WUDQVFULSWRV - ELISA y Western blotting: aquellas plantas que poseen la secuencia de inters y la expresan como transcripto, pueden ser anaOL]DGDV FRQ HVWDV WpFQLFDV LQPXQROyJLFDV D Q de determinar la presencia de la protena codiFDGD SRU HO WUDQVJHQ /D DFWLYLGDG GH OD SURWHtQD FRGLFDGD SRU HO transgen debe ser medida, ya sea por ensayos ELRTXtPLFRV R SRU ELRHQVD\RV D Q GH LQWHUpretar correctamente el fenotipo de la planta REWHQLGD $GHPiV HV FRQYHQLHQWH FRQUPDU la estabilidad meitica de los transgenes estudiando su transmisin sexual a la generacin siguiente. Estas tcnicas se encuentran descriptas detalladamente en la parte I y su aplicacin para HO DQiOLVLV GH SODQWDV WUDQVJpQLFDV HQ 5HJLVWHU (1997) y en Bhat y Srinivasan (2002). Finalmente el comportamiento de los individuos transgnicos se estudia en laboratorio, invernculo y campo. Cabe aclarar que para realizar experimentos de invernculo y de campo en Argentina es necesario contar con

autoUL]DFLyQ GH OD &RPLVLyQ 1DFLRQDO $VHVRUD GH %LRWHFQRORJtD $JURSHFXDULD &21$%,$ YHU parte VII). 3 Aporte de la transformacin gentica a la variabilidad gentica Como ya se mencion, la transformacin gentica permite introducir variabilidad gentica novedosa en las diferentes especies vegetales. Este aporte puede ser realizado de diferentes maneras: D /D H[SUHVLyQ GH VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV no existentes en la especie (ejemplo: protenas insecticidas de origen bacteriano). b) La expresin de nuevas formas allicas de genes que ya estn presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja). F /D H[SUHVLyQ GH VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV presentes en el genoma pero bajo el control de QXHYDV VHFXHQFLDV UHJXODWRULDV TXH PRGLFDQ su nivel o patrn de expresin (ejemplo: protenas relacionadas a la patognesis). d) La inhibicin de la expresin de genes residentes en el genoma. Para lograr la inhibicin de la expresin gnica se pueden usar diferentes tcnicas: cosuSUHVLyQ $51 DQWLVHQWLGR \ OD GHQRPLQDGD LQWHUIHUHQFLD GHO $51 7RGDV HOODV VH EDVDQ HQ XQ proceso denominado silenciamiento gnico que LQYROXFUD OD GHJUDGDFLyQ GHO $51 PHQVDMHUR producido por un gen determinado (ver captulo siguiente). Un inconveniente que se encuentra tanto en el mejoramiento convencional como en la ingeniera gentica es la incorporacin de mltiples genes. A esto se lo llama piramidizacin de genes y es necesario para la expresin de caractersticas complejas de naturaleza polignica (por ej. vas biosintticas), la obtencin de resistencia a enfermedades ms duradera donde se requiere ms de un gen para evitar la cada de la resistencia, para otorgar resistencia conjunta a varios patgenos o la incorporacin de mltiples caractersticas. Algunas estrategias para alcanzar este objetivo son las siguientes: a) cruzamiento de dos plantas transgnicas con distintos transgenes b) re-transformacin en eventos consecutivos

254 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

c) co-transformacin en el mismo evento La co-transformacin es la alternativa ms utilizada y ventajosa, ya que los transgenes co-transformados tienden a co-integrarse en la misma posicin en el genoma en la mayor proporcin de los eventos transgnicos. Esto asegurara la no segregacin de los genes, lo cual es muy til cuando se quiere incorporar una caracterstica polignica. La mayora de los procesos metablicos que pueden ser sujetos a manipulacin dependen de la interaccin entre numerosos genes y el XMR GHQWUR GH ODV YtDV ELRTXtPLFDV HV D YHces coordinado con otras vas, por lo que la manipulacin efectiva slo puede ser alcanzada coordinando el grado de expresin de los distintos transgenes. Coordinar la expresin de mltiples transgenes sobre una misma va metablica es muy difcil de alcanzar, ya que la expresin de los transgenes depende del lugar donde se inserten en el genoma. Existen algunas estrategias elegidas para la manipulacin de estas caractersticas: - transgenes policistrnicos (un promotor con varios transgenes) - poliprotenas El avance tcnico en esta rea es uno de los mayores desafos de la biotecnologa vegetal, ya que las nuevas generaciones de transgnicos requieren de la incorporacin de mltiples caractersticas. 4 Obtencin de plantas transplastmicas Las clulas vegetales contienen tres genomas: el nuclear, el plastdico y el mitocondrial. Los mtodos presentados en las secciones precedentes tienen como blanco de transformacin al genoma nuclear. Sin embargo en los ltimos aos la obtencin de plantas transplastmicas ha recibido notable atencin. As, el genoma de los plstidos (plastoma) se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniera gentica ya que esta tecnologa ofrece una serie de ventajas sobre la transformacin del genoma nuclear: 1. Se pueden obtener altos niveles de expresin de los transgenes y elevados niveles de acumulacin de las protenas

2. 3.

4. 5.

6.

FRGLFDGDV SRU HOORV KDVWD HO  GH ODV protenas solubles totales). Cabe notar que el nivel de acumulacin observado a partir de transgenes nucleares es generalmente inferior al 1%. Es posible expresar un transgen opeUyQ FRQ YDULDV VHFXHQFLDV FRGLFDQWHV bajo el control de un mismo promotor. 1R VH REVHUYD HIHFWR GH SRVLFLyQ GHELGR a que la integracin del transgen est dirigida a un sitio particular del plastoma. Esto hace que no sea necesario obtener una gran poblacin de transformantes, a diferencia de lo que actualmente ocurre con las plantas transgnicas nucleares. 1R VH REVHUYD VLOHQFLDPLHQWR GH WUDQVgenes. Para las especies que tienen transmisin materna de los plstidos (la mayora). Se minimiza la dispersin de los transgenes por el polen debido a la baja de transmisin de los plstidos por el mismo. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema gentico de los plstidos, se ha demostrado que estas organelas pueden procesar protenas eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formacin de puentes disulfuro gracias a la presencia de protenas chaperonas y sistemas enzimticos endgenos.

Los protocolos existentes para la obtencin de plantas transplastmicas se basan en la transferencia de genes por el mtodo biolstico, XQ HFLHQWH SURFHVR GH FXOWLYR \ VHOHFFLyQ in vitro, y la utilizacin de vectores con secuencias homlogas al genoma del cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en la transformacin del genoma nuclear, la integracin dirigida de los transgenes en el plastoma se realiza mediante recombinacin homloga. Para lograr esto, los vectores contienen los transgenes de LQWHUpV DQTXHDGRV SRU VHFXHQFLDV FRQ DOWD KRPRORJtD DO $'1 SODVWtGLFR /D KRPRORJtD HQWUH HO $'1 GHO YHFWRU \ GHO $'1 GHO FORURplasto determina la potencialidad del plsmido para ser utilizado en la transformacin gentica del plastoma. En este contexto, la existencia de secuencias altamente conservadas en el

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 255

plastoma de varias especies es explotada para el diseo de vectores universales, potencialmente tiles en la transformacin de los cloroplastos de numerosas especies. La expresin exclusivamente plastdica de los transgenes queda asegurada a travs de la utilizacin de SURPRWRUHV HVSHFtFRV GHO FORURSODVWR FX\D transcripcin tiene caractersticas tpicamente procariticas. 5 Perspectivas La continuidad en el desarrollo de tecnologa de transferencia de genes en plantas es importante tanto para ampliar el rango de especies a transformar como el de genotipos dentro de cada especie. En los ltimos aos se nota un creciente inters en el control del nivel de expresin de transgenes as como de su regulacin espacial y temporal. La expresin de los genes nucleares eucariticos est controlada en varios niveles que involucran la transcripcin propiamente dicha, el procesamiento, transporte y estabilidad de los transcriptos y su WUDGXFLELOLGDG DVt FRPR OD HVWDELOLGDG PRGLcacin y compartimentalizacin del producto SURWHLFR QDO. Por otra parte, es necesario aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresin de transgenes, de modo de disear protocolos de transferencia que minimicen las posibilidades de silenciamiento gnico. En este contexto, est recibiendo notable atencin el estudio de la recombinacin homloga como mecanismo para la transformacin del genoma nuclear. Del anlisis comparativo de mtodos presentado cabe destacar tres aspectos actualmente en desarrollo. Por un lado, contina el inters en extender el uso de la transformacin mediada por A. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la bacteria. Por otro lado, como fuera anteriormente mencionado, los mtodos de transformacin gentica actualmente en uso requieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo cual resulta en una clara limitacin cuando se desea aplicar esta tecnologa a los materiales usados por los mejoradores, los que generalmente no poseen esta caracterstica. Por ello, se est tratando de reducir y si es posible evitar la fase de cultivo in vitro durante el proceso de

transformacin, lo que permitir ampliar el rango de genotipos a los cuales se podr aplicar esta moderna tecnologa. As, se desarroll un PpWRGR HFLHQWH \ UHSURGXFLEOH GH WUDQVIRUPDcin in planta para Arabidopsis thaliana. Este FRQVLVWH HQ LQOWUDU FRQ YDFtR SODQWDV DGXOWDV de esta especie, con una suspensin de A. tumefaciens de modo que los tejidos y rganos reproductivos sean invadidos por la bacteria. 3RVWHULRUPHQWH VH SURSXVR XQD VLPSOLFDFLyQ de este mtodo que consiste en reemplazar el WUDWDPLHQWR GH YDFtR \ VXPHUJLU OD LQRUHVFHQcia en una suspensin bacteriana que incluye un surfactante. Las plantas transgnicas que se obtienen por autofecundacin de las plantas as transformadas, son hemicigotas y se demostr que esta metodologa produce la transformacin de la gameta femenina. Finalmente, debido a la importante restriccin que puede VLJQLFDU OD XWLOL]DFLyQ GH PpWRGRV GH WUDQVIRUmacin gentica protegidos por patentes, se ha est estudiando el desarrollo de mtodos que utilizan, a partir de herramientas derivadas de Agrobacterium, otras bacterias como vectores alternativos de transformacin. El logro de determinados objetivos como puede ser el redireccionamiento de una ruta PHWDEyOLFD R OD PRGLFDFLyQ GH XQ FDUiFWHU complejo de inters agronmico como por ejemplo la resistencia durable a enfermedades fngicas, requiere de la integracin de mltiples transgenes y de la expresin coordinada de los mismos en la planta. Este tema est recibiendo notable atencin. Los mtodos de transformacin que hemos descripto se basan en la utilizacin de genes marcadores seleccionables. Sin embargo, hay razones por las cuales la presencia del marcador no es deseable en plantas transgnicas TXH VH OLEHUDQ DO DPELHQWH +D\ XQ PDQLHVWR rechazo por parte del pblico con respecto a la utilizacin de genes de resistencia a antibiticos y en determinadas situaciones, el uso de genes de resistencia a herbicidas puede ser inconveniente. Por otra parte, desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos transgenes y con la metodologa convencional no hay ms que un nmero limitado de genes marcadores disponibles. Por ello se

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consideran estrategias alternativas para la obtencin de plantas transgnicas libres de marcadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha recibido ms esfuerzo hasta ahora, plantea la remocin va cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido la planta transgnica. Una posibilidad para ello es cotransformar. Esto implica que el transgen de inters y el marcador seleccionable estn presentes en vectores distintos y que posteriormente se separen los genes por segregacin luego de la reproduccin sexual. Sin embargo, esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias particulares como cuando QR VH GLVSRQH GH XQ SURWRFROR HFLHQWH GH FRtransformacin o cuando no se desea reproducir sexualmente la planta transgnica. Otra opcin dentro de esta lnea es la utilizacin del VLVWHPD GH UHFRPELQDFLyQ VLWLRHVSHFtFD GH origen viral Cre/lox. Esta estrategia requiere primero la obtencin de plantas transgncias portadoras del gen de la recombinasa (cre) y posteriormente la introduccin del transgen DQTXHDGR SRU VLWLRV OR[ GH UHFRQRFLPHQWR Ms recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo de mtodos de transformacin que no usen marcadores seleccionables. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformacin a travs del uso de genes que promuevan la regeneracin. Finalmente, las plantas transgnicas actualmente cultivadas comercialmente, en su mayora resistentes a herbicidas y a insectos, nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y mejores generaciones de productos. A pesar de estos avances en el desarrollo de esta tecnologa, su aplicacin comercial se ve limitada por el elevado costo que tiene el pasaje por el estricto sistema de controles que regula su aplicacin. Esto restringe notoriamente las especies a ser usadas en transformacin y los caracteres a mejorar mediante la misma.

6 Lecturas recomendadas
Bhat S., Srinivasan S. 2002. Molecular and genetics analyses of transgenic plants: considerations and approaches. Plant Science 163:673-681. %LUFK 5  3ODQW WUDQVIRUPDWLRQ 3UREOHPV DQG VWUDWHJLHV IRU SUDFWLFDO DSSOLFDWLRQV $QQX 5HY Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 48: 297-326. )UDQoRLV , %URHNDHUW : &DPPXH %  'LIIHUent approaches for multi-transgene-stacking in plants. Plant Science 63: 281-295. Gelvin S. 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the GeneJockeying Tool. Microbiology and Molecular BiRORJ\ 5HYLHZV 0DU   *HSWV 3  $ &RPSDULVRQ EHWZHHQ &URS 'Rmestication, Classical Plant Breeding, and GeQHWLF (QJLQHHULQJ &URS 6FL  Halpin C. 2005. Gene stacking in transgenic plants WKH FKDOOHQJH IRU st century plant biotechnology. Plant Biotechnology Journal, 3:141-155. +DQLQ 0 3DV]NRZVNL -  3ODQW JHQRPH PRGLFDWLRQ E\ KRPRORJRXV UHFRPELQDWLRQ &XUrent Opinion in Plant Biology 6: 157-162. +RUVFK 5 )UDOH\ 5 5RJHUV 6 6DQGHUV 3 /OR\G $ +RIIPDQ 1  ,QKHULWDQFH RI IXQFWLRQDO foreign genes in plants. Science 223: 496-498. .OHLQ 7 :ROI ( :X 5 6DQIRUG -  +LJK YHlocity microprojectiles for delivering nucleic acids LQWR OLYLQJ FHOOV 1DWXUH   /HH / \ *HOYLQ 6  7'1$ %LQDU\ 9HFWRUV DQG Systems. Plant Physiology Vol. 146: 325-332. Maliga P. 20