Nombre de la técnica: PCR Sencilla RFLP

Función: Esta permite la rápida generación de una gran cantidad de ADN en muy poco tiempo. La
principal función atribuirle a la PCR, es su capacidad para amplificar específica, que al encontrarse
es su capacidad para amplificar una región específica, que, al encontrarse en cantidad suficiente,
facilita su observación y análisis.

Características y especificaciones:

Tener clonados los genes que se quieren analizar

Determinar el mapa de restricción de los genes a analizar

Proceso de la técnica:

Extraccion del DNA

Para comenzar el DNA se extrae de sangre, de saliva o de otras muestras y se purifica.

Fragmentación de la DNA

La DNA purificada se digiere usando las endonucleasas de la restricción, Los sitios de

reconocimiento de estas enzimas son generalmente 4 a 6 pares bajos de largo. Cuanto más corta
es la serie reconocida, mayor es el número de fragmentos generados de la digestión.

Electroforesis del gel

Los fragmentos de la restricción producidos durante la fragmentación de la DNA se analizan

usando electroforesis del gel.

Los fragmentos estan negativo –cargado y se pueden separar fácilmente por la electroforesis, que
separa las moléculas basadas en su talla y carga. Las muestras hechas de fragmentos de la DNA se
colocan en la cámara que contiene el gel electroforético y dos electrodos.

Cuando un campo eléctrico es aplicado, los fragmentos emigran hacia el electrodo positivo.
Fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente a través del gel, los más grandes detrás y
las muestras de la DNA se separan así en bandas distintas de gel.

Visualización

El gel se trata con tintes luminiscentes para hacer las bandas de DNA visibles

Ventajas

Resultados más precisos

Diferenciación

Reduce falsos positivos y falsos negativos

Se detectan directamente los cambios en el material genético

Desventajas

Requiere una muestra grande de la DNA

El aislamiento puede ser un proceso laborioso y que toma tiempo

Requiere pasos numerosos y lleva semanas obtener los resultados de rendimiento

Describir un ejemplo de su uso

Si bien se habían descrito algunas metodologías para diferenciar los genogrupos de P. salmonis,
todas ellas eran difíciles de implementar en laboratorio, o eran demandantes en tiempo y
recursos”, explica a Salmonexpert sobre el origen del desarrollo. Para resolver este problema lo
primero que hicieron fue determinar las enzimas de restricción comerciales que generaran un
patrón diferencial entre los genogrupos y que, además, ese patrón fuese sencillo de detectar en
un gel de agarosa convencional. Fue así como seleccionaron la enzima de restricción XapI, la cual
validaron en laboratorio utilizando muestras de ADN extraído de cultivos puros de P. salmonis
incluyendo las cepas de referencia LF-89 y EM-90 y 13 aislados. La técnica permite obtener
resultados en aproximadamente cinco horas, ese tiempo incluye la amplificación mediante PCR y
las dos digestiones con enzimas de restricción; una primera digestión para evaluar pureza y una
segunda para evaluar el genogrupo.
Nombre de la técnica: PCR Anidada (Nested)
Función: Consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de millones de fragmentos, es
capaz de detectar trazos minúsculos

Características y Especificaciones

Es muy especifico

Rondas de amplificación de cebadores externos e internos, producto de amplificación de la

primera PCR es el molde de la segunda

Proceso de la técnica
Inicio: Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (o 98 °C si se
está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto
sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

Desnaturalización: La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA, separándose las

dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno. Las condiciones típicas de desnaturalización
son 95ºC por 30 segundos, o 97ºC por 15 segundos; sin embargo, temperaturas más altas pueden
ser apropiadas especialmente para templados ricos en G + C.

Alineamiento: La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers. Para ello se baja la
temperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a las cadenas. La
temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers dependen de la
composición, tamaño y concentración de los primers amplificadores. Una temperatura de
alineamiento óptima es 5ºC por debajo del Tm de los primers.

Extensión: La tercera reacción se efectúa a 72º C, temperatura a la cual, la polimerasa lleva a cabo
su acción, insertando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le va indicando
la cadena que actúa como molde. El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración
de la secuencia blanco y de la temperatura. La extensión del primer se realiza tradicionalmente a
72ºC.

Ciclos: Las nuevas cadenas de ADN creados en la etapa de extensión y las plantillas de ADN
originales se desnaturalizan por calentamiento de la reacción, y otra ronda o ciclo de PCR
comienza. El ciclismo es esencialmente tomando desnaturalización, hibridación y extensión y
haciendo una y otra vez. La polimerasa de ADN de la termófilo T. aquaticus se utiliza para construir
nuevas cadenas de ADN en la PCR debido a que la etapa de desnaturalización utiliza para separar
las hebras de ADN no afecta a la polimerasa. Por lo tanto, las etapas se pueden repetir muchas
veces, cada vez con más plantilla de ADN disponible para la hibridación del cebador y extensión
por la polimerasa. La cantidad de ADN aumenta exponencialmente, generando cantidades
utilizables de ADN de alta calidad en un tiempo relativamente corto.
Ventajas y desventajas
Ventajas

Brinda alta sensibilidad y especificidad

Ideal para muestras con poca cantidad de templado

Desventajas

-Contaminación en transferencia

-No permite cuantificar la muestra

Describir un ejemplo de su uso Nombre de la técnica:

Detectar la presencia de virus del papiloma humano (VPH’s), en muestras endocervicales de

pacientes con Papanicolaou normal, mediante la técnica de PCR anidada.

El grupo de estudio se conformó por 123 pacientes atendidas en el Hospital Escuela de Ginecología
y Obstetricia de la Universidad Veracruzana cuyos resultados de PAP fueron de citología normal,
con rango de edad de 18-50 años, que dieron su consentimiento por escrito. Las muestras
endocervicales se tomaron con citrobrush, se colocaron en buffer PBS y se conservaron a 4°C hasta
su procesamiento. La extracción del ADN celular se hizo mediante la técnica de proteinasa K, con
posterior cuantificación e identificación. La detección del genoma viral se efectuó por PCR anidada
con MY09/11 y GP5+/6+, con el fin de incrementar la sensibilidad de detección del VPH. Se calculó
la prevalencia del virus, la sensibilidad y especificidad del método

Nombre de la técnica: PCR in situ

Función: Permite descubrir la presencia de una secuencia de nucleótidos mediante otra secuencia
de nucleótidos complementaria a dicha secuencia o sonda. La complementariedad entre
secuencias de bases nucleotídicas es la base de la especificidan de esta técnica. Aplicándola es
posible descubrir qué células expresan un gen determinado y cuándo lo expresan.

Características:

La fiabilidad es superior al 90%

El cebador contiene una etiqueta fluorescente que es liberada por la transcriptasa inversa que
produce ADN complementario

Se realiza en muy poco tiempo (aproximadamente 30 minutos)

Proporciona una cuantificación continua y precisa del ADN que se va formando

Especificaciones

Antes de la hibridación, los tejidos se pretratan con HCI y proteinasa y se someten a una
postfijacion con paraformaldehido
Las secciones de tejido deben adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante el
procedimiento de hibridación

Cuando se hace sobre tejidos, órganos o embriones, hay que pretratan el tejido antes de añadir la
sonda.

Proceso de la técnica

Preparación de la sonda

Tipos de marcaje

Método directo: la sonda se marca con una molécula (fluorocromo que permite visualización
inmediata de la señal tras la hibridación

Método indirecto: la sonda s marca con una molécula (digoxigenina o biotina) que requiere de un
proceso de inmunocitoquimica para ser detectada,

Las distintas formas de realizar el marcaje de la sonda independientemente del tipo de molécula
marcadora que se utilice.

Fijación, embebido en parafina y seccionamiento del tejido

Fijación: preserva las características del tejido como cuando estaba vivo. La fijación, habitualmente
, ha de ser optimizada para cada tipo de célula o tejido.

Embebido o inclusión en parafina: necesario si usamos tejido para endurecerlo y poder

seleccionarlo

Seccionamiento: se realizan secciones de tejido en un micrótomo

Hibridación de sonda con ácidos nucleicos del tejido

Pretratamiento del tejido

Inactivación de enzimas endógenos: importante en métodos indirectos

Hidrolisis y extraccion de proteínas: aumentan accesibilidad de la sonda

Hibridación: importante control de temperatura de hibridación

Detección de la señal

Método directo –Visualización señal en microscopio de fluorescencia

Método indirecto- Inmunocitoquimica

Ventajas

Alta sensibilidad, disponibilidad para detección de un bajo número de copias

Se puede emplear en células, tejidos, o animales enteros, normalmente embriones.

Permite usar al máximo la muestra de un tejido, logrando realizar cientos de hibridaciones

diferentes en el mismo tejido
Desventajas

No es una técnica de uso general

Requieren ciclos térmicos que requieren aparatos costosos, destrucción y perdida de tejidos.

Estar limitada por su incapacidad para detectar secuencias que tienen bajo número de copias de
ADN y ARN.

Describir un ejemplo de su uso

Nombre de la técnica: PCR Multiplex

Función

Emplear diversas parejas de primers, cada una de ellas específica para un virus distinto lo cual
permite detectar en la misma reacción varios patógenos diferentes.

Características y especificaciones

En una sola reacción de PCR se amplifican al mismo tiempo 2 o más genes

Se emplean más de 1 par de primers par por cada gen

Deben elegirse cebadores con temperaturas de hibridación similares

Las longitudes de los productos amplificados deben ser similares

Los tampones de PCR Múltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que reduce la
competencia entre amplicones y la discriminación de fragmentos más largos de ADN durante la
PCR Múltiplex largos de ADN durante la PCR Múltiplex.

Proceso de la técnica

Escoger un loci

Determinar el sistema de PCR a utilizar

Distribuir los amplicones

Diseñar fragmentos de control interno

Posicionar los cebadores en regiones de secuencias detalladas; en relación al tamaño de los

amplicones

Diseño de Cebadores con cinéticas de reacción similares

Desarrollar las condiciones para PCR de manera separada para cada set de cebadores

Añadir secuencialmente los sets de cebadores, alterando las condiciones como sea necesario.
Reducir las amplificaciones inespecíficas. Variar las concentraciones relativas de los sets de
cavadores para amplificación equivalente. Cambiar los sistemas de amortiguamiento si es
necesario

Ajustar los componentes de la reacción y las condiciones del termociclador para la amplificación
múltiple

Ventajas y desventajas:

Ventajas

Se obtiene la información de varios locus en una sola reacción, utilizando menor cantidad de
molde para el análisis y menor cantidad de reactivos.

Se puede generar rápidamente la construcción de una base de datos

Determinación de multiples dianas en una reacción

Desventajas

Baja sensibilidad

Para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización del
proceso

El número de pares de cebadores está limitado por el aumento de la posibilidad alineamiento

incorrecto; requiere que varios aspectos sean optimizados como los componentes o las
condiciones del termociclador.

Validación

Describir un ejemplo de su uso

Patógenos del oído medio

En pacientes con otitis media la identificación de los agentes causales a partir de muestras clínicas
empleando métodos tradicionales es difícil, laborioso y lento. Por ese motivo, en la última década
fueron optimizados distintos protocolos de PCR para la detección individual de los agentes más
habituales. La utilidad clínica de estos métodos quedó reducida por la laboriosidad de aplicar una
detección para cada posible bacteria. Sin embargo, desarrollaron una PCR múltiple que podría
tener una mayor utilidad en el diagnóstico rutinario, ya que permite detectar e identificar
simultáneamente a partir de muestras serosas los patógenos más frecuentemente aislados a partir
de muestras del oído medio: S. pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis y Alloiococcus
otitidis.

Nombre de la técnica: Real time PCR(RQ-PCR); PCR cuantitativa

Función: Permite tanto la detección como la cuantificación de ARNm, ARN y ADN, la
identificación de mutaciones puntuales (SNPs), el estudio de la expresión génica y la diferenciación
alélica

Características
Método cuantitativo en el cual se utiliza un termociclador que mide la fluorescencia mediante
ciclos PCR

El aumento de la fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de ADN

Alta especificidad, amplio rango de detección (equivalentes genómicos de la secuencia blanco)

Rapidez en la visualización del producto

Rango dinámico de detección amplio

Mayor especificidad con el uso de sondas

Permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original, o para identificar
con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión

Especificaciones
Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una
transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR.

Proceso de la técnica:
1. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de RNA objetivo.

2. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante

la incorporación de nucleótidos complementarios.

3. Fin de transcripción reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA.

4. PCR.
El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar
se pueden también utilizar). En PCR en tiempo real, se utiliza generalmente una transcriptasa
reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra
de DNA sea formada. Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal
como la Taq polimerasa), los primers específicos para el gen de interés, los deoxinucleótidos y un
buffer conveniente.

Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de cDNA, los productos de reacción son analizados

usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de etidio. Los geles de
agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificación ya que
el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa
logarítmica de amplificación.

El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA intercalándose entre
los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Sin
embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes, como el SYBR Green, que son
mucho más fluorescentes que el bromuro de etidio, se utilizan en el PCR en tiempo real.
Ventajas
En la PCR convencional se observa el resultado final de la amplificación (Fase plateau). En la PCR a
tiempo real se analizan los datos de la fase de crecimiento exponencial, que es mucho más
informativa.

El incremento de la fluorescencia es directamente proporcional al número de amplicones

generados, por tanto, se puede cuantificar.

La precisión, la resolución y la sensibilidad son mayores con la PCR a tiempo real.

La PCR convencional solo discrimina por el tamaño del amplificado, en cambio la PCR a tiempo real
discrimina por tamaño y secuencia.

No se requiere ningún proceso post-PCR por lo que se ahorra tiempo. Además, se minimizan los
problemas de contaminación por amplicones y se reduce la variabilidad en el resultado.

El rango dinámico, es decir la sensibilidad de la técnica para diferenciar entre diferentes

cantidades, es mucho mayor empleando PCR a tiempo real, hasta 6 órdenes de magnitud.

Si se emplean sondas en la detección de la fluorescencia, se evita la detección de los artefactos de

la reacción, como los dímeros de cebadores, que dan falsos positivos

Desventajas:
Requerimiento de equipamiento y reactivos muy costosos

El ADNc generado sirve solo para una amplificación y se ha reportado que es menos sensible.

Ocurre en dos pasos separadamente: retro transcripción y amplificación

Describir un ejemplo de su uso

Técnica PCR en tiempo real para prueba COVID-19
El procesamiento de la muestra es mediante una técnica de biología molecular denominada
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) también considerada como una PCR
cuantitativa. Esta técnica de PCR (RT-PCR) en tiempo real se realiza en un aparato denominado
termociclador, el cual tiene la capacidad de aumentar y disminuir la temperatura rápidamente de
forma repetida en varias ocasiones y cada vez que lo hace se le conoce como un ciclo.

Son 3 los pasos básicos de una PCR en tiempo real:

El primero es la “desnaturalización” que permite la separación de los ácidos nucleicos de la

muestra.
El segundo es la “hibridación” en la cual se van a alinear secuencias genómicas complementarias,
que en este caso sería las sondas de los 3 genes RdRp, N y E con la secuencia del virus SARS-CoV-2
en la muestra a analizar. Si es que en la muestra analizada existen secuencias de este virus, y se
complementa, cada vez que se unan se emitirá una señal fluorescente.

Finalmente, el tercer paso es la “extensión” que permite se hagan millones de copias de estas
regiones víricas en particular, este proceso tarda aproximadamente 8 horas.