4ta y 5ta Clase Tinciones Bacterianas

Facultad de Tecnología médica
Semana N° 04:
TECNICAS DE TINCIONES
BACTERIANAS Y COLORANTES
Asignatura: Bacteriología
Mg. David Lazón Mansilla
Semestre Académico 2020-1
Univ ersidad Nacional
Federico Villarreal
OBJETIVOS
• Aprender a preparar frotis bacterianos
• Realizar tinciones simples y diferenciadas, empleando diversos tipos de colorantes.
• Estudiar la morfología bacteriana y las coloraciones que adoptan en condiciones naturales y
aprender a distinguir los diversos tipos de agrupaciones bacterianas , dependiendo del tipo de
tinciones al observar al microscopio.
• Diferenciar entre colorantes ácidos y básicos
• Poder diferenciar entre bacterias grampositivas y gramnegativas , bacterias ácidos-alcohol
resistentes, endoesporas, cápsulas bacterianas en una población mixta de bacterias.
Federico Villarreal
INTRODUCCION
• Como casi todos los microorganismos, son casi incoloros

cuando se observan a través del microscopio óptico
estándar, a menudo es preciso prepararlos para la
observación y una de las maneras de hacerlo consiste en
someterlos a tinciones (coloración)
Federico Villarreal
TÉCNICAS DE
OBSERVACIÓN
MICROSCOPICAS
Federico Villarreal
TIPO DE OBSERVACIONES
MICROSCÓPICAS
1. OBSERVACIÒN EN FRESCO
2. OBSERVACION CON TINCIONES
Univ ersidad Nacional Lunes
Federico Villarreal
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

1. Observación en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.
• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular
• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.
2. Observación con tinciones

• Para observar las características morfológicas de las bacterias
•Identificación y diferenciación de microbios entre especie y dentro de la misma especie (tinción
diferencial o selectiva).
Univ ersidad Nacional Lunes
Federico Villarreal

•preparación en fresco simple
•preparación en gota pendiente
a) Tinción simple: un solo colorante.
b) Tinción diferencial: más de un colorante
c) Tinción especial: Para teñir capsulas, flagelos y esporas
✓Tinción negativa: colorea el medio que rodea a la bacteria
permaneciendo ésta sin teñir.
Federico Villarreal
Son preferibles en las situaciones siguientes:
• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.
• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular
• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas
y materias grasa.

• Para observar las características morfológicas de las bacterias
• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tinción diferencial o selectiva).
•
Federico Villarreal
EXAMEN EN FRESCO
• El examen en fresco de una suspensión microbiana , es la técnica de observación microscópica
más fácil y rápida de realizar.
• Es el método de elección cuando se desea evitar la alteración que sufren los microorganismos
de una muestra cuando es sometida a una fijación y tinción.
• Posibilita la observación de microorganismos vivos.
• Permite estudiar la morfología y estructura celular , tamaño reales, color natural y movimiento.
• La contraparte , es que si los microorganismos carecen de color natural, dando resultados
deficientes , debido a su reducido contraste.
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EXAMEN EN FRESCO
Consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en la muestra de
estudio y la presencia de otros elementos, como son leucocitos, células, eritrocitos,
cristales, etcétera, que puedan ser de gran ayuda en la valoración de las muestras.
Preparación:
Es una técnica fácil de realizar, en la que la muestra a examinar se sitúa entre un
portaobjetos y cubreobjetos. Si la muestra proviene de una muestra sólida, se debe de
emulsificar en una gota de agua destilada o solución salina; si el material es líquido, se
deposita directamente entre el porta y cubreobjetos.
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OBSERVACIÓN EN FRESCO
Las observaciones en fresco, se las puede realizar de dos maneras:

•Preparación en fresco simple ó Cámara húmeda
(lamina/laminilla)
•Preparación en gota pendiente
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PREPARACIÓN EN FRESCO SIMPLE Ó CÁMARA HÚMEDA

(LAMINA/LAMINILLA)
Se realizan a través de suspensiones de células o microorganismos

Materiales: • Procedimiento:
• Porta y cubre • Se prepara el microscopio para el uso
respectivo.
• Gotero(pipeta)
• Con el gotero o bagueta se saca la muestra.
• Asa de kolle
• Se le coloca en el porta objetos, una gota.
• Baguetas
• Luego se le coloca el cubre.
• Mechero
• Y se procede a la observación.
• Microscopio
• Solo debe realizarse la observación en
• Muestras. objetivos de 4x, 10x, 40x,
NOTA: No debe emplearse el objetivo de inmersión ,
pues al desplazar la preparación el cubreobjeto
permanece adherido al objetivo y esto crea turbulencias
en el liquido de preparación,
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PROCEDIMIENTO PARA UN PREPARADO EN FRESCO
1. Colocar una gota de SSF o agua en 2.- Tomar la muestra con el asa de siembra
una lamina portaobjeto o un gotero.
Muestra
("entre porta y cubre")
Porta objeto
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PREPARACIÓN EN FRESCO GOTA

PENDIENTE
• Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los
microorganismos.
• Sus agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias
químicas.
• Son aquellas que se realizan por la acción de la tención superficial que tiene
suspensiones de los microorganismos
• El volumen del liquido que mantiene el portaobjeto es mayor de manera que
la preparacion tiene un mayor tiempo de vida
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REALIZACION DE LA OBSERVACION MICROSCOPICA,

PREPARACIÓN EN FRESCO GOTA PENDIENTE
MATERIALES: PROCEDIMIENTO:
• LAMINAS ESCAVADAS • AL NO ENCONTRAR LAMINAS ESCAVADAS, REALIZAMOS UNA
ARTESANALMENTE, USANDO CERA DE VELA Y CON AYUDA DE UN
• AGUA ESTANCADA
SACABOCADOS.
• MICROSCOPIO
• AL NO ENCONTRAR UNA LAMINA EXCAVADA, REALIZAMOS LA MISMA
• PIPETA (O GOTERO) OPERACIÓN QUE EN LA ANTERIOR MUESTRA:
• PORTA Y CUBRE OBJETOS • SE COLOCA UNA GOTA EN EL CUBRE OBJETOS QUE PREVIAMENTE A SIDO
UNTADA UN POCO CON VASELINA CRUDA O CERA.
• SE LE COLOCA EN FORMA INVERTIDA EN EL PORTA OBJETOS QUE

ARTESANALMENTE FABRICAMOS.
• PROCEDEMOS AL OBSERVACIÓN
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PREPARACIÓN DEL FROTIS:

a) EXTENSIÓN
• De la muestra sobre el portaobjetos se hará de diferentes formas, dependiendo de la
procedencia de la muestra a examinar.
• Si es líquida, se deposita una pequeña cantidad del material en el centro del portaobjetos y
se extiende con otro portaobjetos hasta conseguir una capa fina y homogénea.
• Si el material de estudio es sólido, se emulsificará en una gota de agua destilada o solución
salina estéril, colocado en el centro del portaobjetos, y se extiende de la misma forma que
una muestra líquida. Extender directamente sobre el portaobjeto la muestra recogida con
torunda, procurando que quede una capa fina y homogénea, con un movimiento de
rotación a la torunda , conforme se vaya deslizando sobre el portaobjeto.
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a) Frotis o película (extensión)
• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
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b)SECADO
Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la preparación, cuando está seca la superficie pasa de
ser brillante a mate; para acelerar el secado se puede calentar ligeramente la parte inferior del portaobjetos
(sin quemar).
b) FIJADO
La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como objetivo no permitir que la
muestra de estudio se pierda (o se barra) en el proceso de tinción.
En frotis hematológicos no se requiere de fijación debido a que existe una coagulación rápida de las
albúminas citoplasmáticas; o si el material a teñir posee abundante material celular, se recomienda fijar con
alcohol metílico después de secar la preparación.
Los frotis de origen microbiológicos se deben de fijar con calor suave, pasando el portaobjetos sobre una
llama, tras la fijación es muy importante esperar que se enfríe antes de proceder a realizar cualquier
procedimiento de tinción.
Federico Villarreal

• El propósito de la Fijación es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y
adherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría la capa de células
durante el proceso de tinción.
• El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin que aparezcan
estructuras que no existían en la célula original.
• El calor , es en general el método de fijación mas utilizado para la observación de la morfología de
células bacterianas.
• El método químico, Cuando además de los microorganismos interesa la observación de
células animales, se utiliza un método químico como la fijación por metanol y por formol, que altera
menos que el calor la morfología de las células.
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c) FIJACIÓN DEL FROTIS

Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
• CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
• FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y
éter)
Metanol
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MUESTRAS: TECNICA
• Secreciones • Por calor: Pasamos tres veces el portaobjetos por la llama
• Orina durante unos segundos. Dejamos enfriar el porta entre los pases.
• Heces • Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido):

Añadimos unas gotas de metanol sobre la extensión
• Sangre completamente seca. Golpeamos el portaobjetos por su canto
• Muestra con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato
el exceso de metanol. Esperamos a que el metanol se evapore
completamente.
• Una vez realizado el Frotis y fijadas las bacterias, podemos
observar las preparaciones al microscopio, aunque carecen de
contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.
FROTIS
PROVENIENTES
DE CULTIVOS
(SOLIDO Y
LIQUIDO)
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COLORANTES
BACTERIANOS
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COLORANTES
Hacen más visibles las estructuras internas y
externas aumentando el contraste con el fondo
2 características fundamentales :
1. Grupos cromóforos:
• Con dobles enlaces conjugados
• Dan al colorante su color.
2. Afinidad por los componentes celulares
Por enlaces iónicos (más comunes) , covalentes o
hidrófobos
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COLORANTES: Tipos
a) SALES COLORANTES: más comúnmente usados
1. BÁSICOS:
▪ Consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Tiñen la célula bacteriana
uniformemente , Afinidad por las estructuras ácidas: (ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos ) (cromatina nuclear de pro y eucariotas) (más usados en citología
bacteriana).
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta
2. ÁCIDOS:
▪Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. No tiñen la célula bacteriana, pueden
usarse como color de contraste (coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las
células eucariotas, Afinidad por las estructuras alcalina (hemoglobina)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.
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COLORANTES: Clases
3. Neutros:
• Sales de un ácido y de una base coloreados.
• Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
• Eosinato de azul de metileno.
b) COLORANTES LIPOSOLUBLES
• Se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usados para revelar la
localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.
4. Indiferentes:
• Insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución
superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.
• Sudán III → para teñir las grasas.
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COLORACIONES : Tipos
• Vitales
• Son aquellas que se practican sobre células que están vivas, mediante la
introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo.
• Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
• Supravitales
• Son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados
del organismo del que proceden.
• No vitales
• Se realizan sobre células muertas.
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TINCIONES
BACTERIANAS
Federico Villarreal
QUE ES UNA TINCIÒN?
Una tinción es un procedimiento para visualizar un tejido

que puede implicar el uso de uno o varios colorantes de
modo simultáneo o sucesivo
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FINALIDAD DE LAS TINCIONES

BACTERIANAS
• Aumenta la resolución
• Acentúa las características morfológicas
• Conserva la muestra
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FIJACION
• Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo más posible a
las células vivas.
• La Fijación es el proceso por el cual se conservan y fijan su posición las estructuras
externas e internas de las células de los microorganismos.
• Inactiva enzimas, que pueden alterar la morfología celular.
• La fijación, endurece la estructura celular, de manera que no cambien durante la fijación ,
ni en la observación.
• Durante la fijacion , se mata al microorganismo. fijándose al portaobjetos.
FIJACION DE LA MUESTRA BACTERINA
QUIMICA
• Preserva la morfología general pero • Protege la subestructura fina y la
no las estructuras internas morfología de los microorganismos
delicados de mayor tamaño
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FIJACION QUÌMICA
• Aldehídicos
• Ácido ósmico
• Tetróxido de osmio.
• Compuestos mercúricos y
crómicos
• Alcoholes, la acetona,
• el dietil-pirocarbonato.
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1) Tinciones simples
2) Tinciones diferenciales
• Tinción de Gram
• Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)
3) Tinciones especificas
• Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin
• Tinción de flagelos de Leifson
• Tinción negativa, / Tinciòn de càpsulas (HISS)
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TIPOS DE TINCIONES
TINCIÓN SIMPLE TINCION DIFERENCIADA
Un solo colorante. • Se utilizan para distinguir entre tipos de
• Colorantes básicos microorganismos
Mas usados • Etapas :
Tienen cargas positivas • 1. Tinción primaria
Ej.: Cristal violeta, fucsina básica,
safranina, verde malaquita • 2. Tinción de contraste o secundaria
• Colorantes ácidos • Ejemplo.:
Menos usados • Coloración Gram,
Tienen cargas negativas • Coloración de Ziehl- neelsen,
Ej.: Eosina, Fucsina ácida
• Esporas
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¿QUÉ ES TINCIÓN SIMPLE?

• Es la tinción que usa un
solo colorante
• Teñir el microorganismo
entero
• Reconocer estructuras y
morfología
• Azul de metileno, safranina,
fucsina fenicada
TINCIÓN SIMPLE
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TINCIÓN DIFERENCIAL O COMPUESTA

• Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos
• Etapas :
1. Tinción primaria
2. Tinción de contraste o secundaria
Ejemplo.:
- COLORACIÓN GRAM,
- COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN,
- ESPORAS
TINCION DE GRAM
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Y GRAM NEGATIVAS
TINCIONES DE GRAM
Federico Villarreal
TINCION DE GRAM
• Ideada en 1884 por Hans Christian Joach. im Gram (1853-1938), un médico danés
con estudios en bacteriología y farmacología
• La coloración de Gram. tiene interés taxonómico ya que divide las bacterias en dos
grandes grupos:
• Bacterias Gram positivas que se tiñen de morado y
• Bacterias Gram negativas que se tiñen de rojo
• La coloración de Gram es positiva compuesta y diferencial.
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Federico Villarreal
TINCION DE GRAM
• La técnica revela diferencias constitutivas de la pared celular entre bacterias Gram
positivas y Gram negativas.
• La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano, la cuál impide que escape el complejo cristal violeta-lugol.
• Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se
encuentra unida a una membrana externa lipídica, susceptible a la decoloración con el
alcohol-acetona, el que actúa como un solvente orgánico.
• Los lípidos se disgregan con el alcohol acetona y el decolorante penetra a la célula
bacteriana decolorándola.
* El peptidoglicano (PG) es una macromolécula única, con enlaces altamente entrecruzados, forma una bolsa que rodea a la membrana
celular bacteriana y que concede rigidez a la envoltura.
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Federico Villarreal
PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS

• El peptidoglicano se dispone en varias
capas lo que le otorga grosor a la pared.
• Atraviesan el peptidoglicano
polisacáridos ácidos, denominados
ácidos teicoicos.
• Los ácidos teicoicos son de dos clases:
poliglicerol fosfato y poliribitol fosfato.
• Las funciones primarias de estos
polímeros son la estabilización del
peptidoglicano y la captura de Mg++.
Los ácidos teicoicos son polímeros de glicerol o ribitol unidos mediante enlaces fosfodiéster. Estos ácidos se encuentran en la pared
celular de las bacterias Gram-positivas, tales como Staphylococcus, extendiéndose sobre la superficie de la capa de peptidoglicano..
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Federico Villarreal
PARED CELULAR EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

• Su pared celular es más delgada, pero más compleja que la de los Gram positivas.
• El peptidoglicano se dispone en una sola capa, pero por fuera de ella se encuentra una segunda
membrana denominada membrana externa.
• La membrana externa es una membrana asimétrica, porque si bien la monocapa interna está formada
por fosfolípidos, la monocapa exterior está formada por un tipo especial de lípido, denominado
lipopolisacárido (LPS).
• El LPS es una molécula que contiene tres regiones diferentes: el lípido A, el core y el antígeno O.
• El LPS constituye una endotoxina, que se libera cuando la bacteria se divide o muere.
• Es un potente estimulador de los macrófagos, lo que causa la activa liberación de citoquinas,
responsables de las manifestaciones clínicas de las infecciones por bacterias Gram negativas y que varían
desde una fiebre hasta el shock séptico.
• En esta membrana externa se encuentran las porinas.
• La membrana externa de las bacterias Gram negativas poseen porinas que son canales cargados de agua
y que permiten la entrada y salida de sustancias de la célula al exterior y del interior de 30/06/2017
la célula. 47
Federico Villarreal
PARED CELULAR EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

• Entre la membrana externa y la membrana
celular se crea un compartimiento virtual,
llamado espacio periplásmico. Tiene una
gran importancia en el metabolismo
energético, que se basa en la alimentación
por procesos activos de diferencias de
composición química, concentración
osmótica y carga eléctrica entre este
compartimento y el citoplasma.
• El espacio periplásmico es una matriz que
incluye al peptidoglicano, enzimas, proteínas
captadoras de nutrientes y sustancias de
secreción.
• La membrana externa contiene numerosas
proteínas, siendo las porinas las más
abundantes.
• Se denominan así, porque forman poros que
comunican el exterior con el espacio
periplásmico.
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Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM
Protocolo
• Hacer un frotis
• Dejar secar al aire
• Fijar la muestra con calor a la llama de una lámpara de alcohol o
con el licor de Hoffman.
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Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM
• Cristal violeta
• El lugol entra en las células y forma un complejo insoluble con el cristal violeta.
• La mezcla de alcohol-acetona sirve para realizar la decoloración. Las bacterias
Gram. positivas no se decoloran, mientras que los Gram. negativas sí lo hacen.
• Para poner de manifiesto las bacterias Gram. negativas se utiliza una coloración de
contraste de color rojo; safranina.
• Después de la coloración de contraste las células Gram. negativas se observan de
color rojo, mientras que las Gram positivas se observan de color Morado.
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Federico Villarreal
INTERPRETACIÓN
Gram negativas Gram positivas
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Federico Villarreal
TINCIÓN BACTERIOLÓGICA DE GRAM.
El equipo para realizar la tinción de

Gram. consta de:
Colorantes y reactivos :
• Cristal Violeta, Yodo-Lugol y Safranina.
Solvente: Alcohol-Cetona. Bandeja
de tinción.
Asa bacteriológica o hisopo.
Frasco lavador.
Muestra bacteriana sólida (agar),
líquida (caldo) o espécimen clínico.
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Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM
• Paso 1.- Cubrir la

preparación con Cristal
Violeta por 60 seg. y lavar
suavemente con agua.
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Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM

preparación con Yodo-
Lugol por 60 seg y lavar
30/06/2017 54
Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM

preparación con Alcohol-
Cetona durante algunos
segundos (5-10) y lavar
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Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM
Paso 4.- Cubrir la preparación
con Safranina por 60 seg y lavar
• Secar y Observar con lente de
100x (inmersión).
Altagracia Jimenez Diaz MA 30/06/2017 56

Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM
PREPARÁNDONOS PARA LA OBSERVACIÓN AL

MICROSCOPIO
Bacterias que se tiñen de azul oscuro o
violeta por la tinción de Gram
ESTRUCTUR
A
DIFERENCIAS ENTRE GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS
Bacteria Gram + Bacteria Gram -
Pared celular simple Pared celular compleja
Capa de peptidoglucano gruesa Capa de peptidoglucano fina
No capa externa de Capa externa de lipopolisacáridos

lipopolisacáridos
Retienen cristal violeta/iodo-color Retienen safranina-color

azul/violeta rojo/rosado
GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS
POSEEN UNA PARED CELULAR MÁS COMPLEJA:

POSEEN UNA PARED CELULAR INTERNA Y UNA PARED DE -PARED CELULAR INTERNA
PEPTIDOGLUCANO. -PARED DE PEPTIDOGLUCANO
- BICAPA LIPÍDICA EXTERNA
NO TIENE MEMBRANA EXTERNA MEMBRANA EXTERNA
NO TIENE ESPACIO PERIPLASMÁTICO ESPACIO PERIPLASMÁTICO:
LA RED DE MUREÍNA ESTÁ MUY DESARROLLADA Y LLEGA A

LA RED DE MUREÍNA PRESENTA UNA SOLA CAPA
TENER HASTA 40 CAPAS
LA PENICILINA MATA A LAS GRAM POSITIVAS, LA PENICILINA NO MATA A LAS GRAM NEGATIVAS,
NO CONTIENE LPS CONTIENE LPS
EN LA TINCIÓN DE GRAM, RETIENEN LA TINCIÓN AZUL QUEDAN DECOLORADAS.
CONSERVAN EL COMPLEJO YODOCOLORANTE. PIERDEN EL COMPLEJO YODOCOLORANTE.

SON ESPORULANTES Y NO ESPORULANTES, COMO
PUEDEN SER ANAEROBIOS O AEROBIOS
STREPTOCOCCUS, CISTERIA, FRANKIA.
POSEEN OTROS COMPONENTES: ÁCIDOS TEICOICOS Y POSEEN PROTEÍNAS CON CONCENTRACIONES
LIPOTEICOICOS, Y POLISACÁRIDOS COMPLEJOS. ELEVADAS.
• Tipo de tinción diferencial empleado
para la visualización de bacterias.
• Basado en la composición de su
PARED CELULAR.
• Sirve para determinar la morfología
celular bacteriana y también para
realizar una primera aproximación a
la diferenciación bacteriana,
considerándose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se
visualizan de color violeta y
Bacteria Gram negativa a las de
color rosa.
TINCIÓN DE GRAM
Federico Villarreal
TINCIÓN DE GRAM
Bacilos Gram Positivos Bacilos Gram Negativos
Cocos Gram Negativos Cocos62Gram Positivos

TINCIONES
ESPECIFICAS
Tinciones de esporas, flagelos y capsulas
Tinciones específicas
Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre

distintos tipos de microorganismos, las tinciones específicas
incrementan el contraste en las células microbianas y revelan
estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas,
los flagelos y las cápsulas.
Federico Villarreal
La tinción de esporas de Wirtz-Conklin
Tiñe selectivamente las endosporas.

• Tinción con verde de malaquita.
• Calentamiento a emisión de vapores durante 60 segundos, para que el colorante
penetre a través de las paredes de la endospora.
• Se lava con agua durante 30 segundos que elimina el colorante verde de todas
las partes de la célula, con excepción de las esporas.
• Se tiñe con el colorante rosa safranina.
Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma el color rosa.
Federico Villarreal
• Esta tinción se clasifica dentro de las tinciones estructurales, ya que

permite destacar las endosporas.
• Teñir las endosporas bacterianas es complejo por su situación, en
el interior del cuerpo celular, y por su estructura, con varias cubiertas
impermeables. Por ello se requieren tinciones con calor para favorecer
la penetración de los colorantes.
• La técnica más empleada es la tinción de Wirtz-Conklin, que se
practica sobre extensiones fijadas por calor.
Federico Villarreal
• Los únicos géneros que producen esporas son Bacillus y Clostridium,

por lo que tendremos que usar bacterias de alguno de esos dos
géneros.
Materiales
•Asa de siembra Reactivos
•Mechero bunsen •Verde malaquita al 5%
•Portaobjetos •Safranina al 0,5%
•Barras paralelas y cristalizador
•Microscopio
•Agua destilada
•Torunda de algodón
Federico Villarreal
Procedimiento:
• Utilizar como género alguna especie
de Bacillus , ya que produce endosporas. Tiene que
ser un cultivo ya envejecido, ya que la espora es
una forma de resistencia ante condiciones adversas.
• Lo primero que haremos será cubrir la extensión
con papel de filtro y le añadiremos por
encima verde malaquita al 5%. Esto lo hacemos
para que no se seque la muestra y que cristalice el
reactivo sobre el papel y no sobre la muestra.
Calentamos el portaobjetos con un mechero o una
torunda empapada en alcohol durante 5 minutos,
evitando que el colorante entre en ebullición y se
seque.
Federico Villarreal
Después lavamos con abundante agua el exceso de

colorante.
-A continuación cubrimos la extensión con una solución
de safranina al 0,5%. Este es el colorante de contraste
que sirve para teñir las formas vegetativas.
–Lavamos con agua abundante y lo dejamos secar la
preparación a tª ambiente.
Por último visualizaremos la

muestra. Las esporas se
observan verdes, mientras
que las formas vegetativas
se ven de color rojo:
LA TINCIÓN DE FLAGELOS DE LEIFSON
Permite observar los flagelos.

• Se fija químicamente la suspensión bacteriana, mediante formol, y se hace la extensión en un
portaobjetos.
• Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
• Se cubre la preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina, de
preparación extemporánea. El ácido tánico (mordiente) engruesa los flagelos y la
rosanilina(colorante) los tiñe.
• Se retira el exceso de colorante con agua.
• Por último, se deja secar al aire, antes de su observación al microscopio.

TINCIÓN DE LA CAPSULA
Y
TINCIÓN DE HISS
Federico Villarreal
OBJETIVOS
• Definir el CONCEPTO de capsula bacteriana.

• Describir los pasos para DESARROLLAR LAS TINCIONES
mas comunes usadas para hacer visibles las capsulas bacterianas.
• Explicar la IMPORTANCIA de la capsula para la supervivencia,
identificación y virulencia de las bacterias.
Federico Villarreal
CONTENIDO:
• ¿Qué es la capsula bacteriana?
Es una ESTRUCTURA EXTERNA a la pared celular pero
sintetizada entre la membrana celular y la pared de peptidoglicano.
❖ Streptococcus, Bacillus, Klebsiella, Neisseria, etc.
S. Pneumoniae causante principal

S. mutans, S. gingivalis, S. salivaris,
de neumonías bacterianas debe su
son causantes de caries dentales.
virulencia a su capsula.
Federico Villarreal
LA CÁPSULA.
Le confiere a la bacteria su valor inmunológico.

Le impide a las células del sistema de defensa del organismo que puedan
atacarlas.
No puede ser teñida con procedimientos sencillos pero es fácil desarrollar

algunas técnicas para hacerlas visibles con respecto a la tinción de los somas
bacterianos y en contraste con el fondo de vidrio del portaobjetos.
Federico Villarreal
TINCIONES
La Tinción negativa .
Aplicada para poner en evidencia la cápsula utilizando tinta china para teñir el fondo
y Azul de Metileno para teñir el soma bacteriano.
La Tinción de Hiss.
Utiliza una reacción de expansión de la cápsula con albúmina y el contraste contra un
fondo de sulfato de cobre tiñendo el soma con violeta cristal.
Federico Villarreal
Tinción Negativa
1. Lave y flamee el portaobjetos y colóquelo en el puente de lavado.
2. Incinere el asa bacteriológica y enfrié.
3. Coloque una gota de tinta china en el centro del portaobjetos.
4. Seleccione una colonia y obtenga una muestra pequeña.
5. Colóquela en el portaobjetos, disolviéndola en la gota de tinta china.
6. Disuelva y disperse uniformemente en la superficie del portaobjetos para obtener una capa muy
delgada.
7. Deje secar muy bien.
8. Cubra con azul de metileno por un minuto.
9. Enjuague por un segundo y escurra. Deje secar y observe al microscopio con aceite de
emersión
Federico Villarreal
La tinción negativa facilita las observaciones de la

morfología y tamaño de las bacterias así como la
observación de la cápsula en algunas especies
bacterianas.
La cápsula es una estructura superficial mucosa,

más o menos gruesa que envuelve la pared celular
formada por polisacáridos o polipéptidos, que
confiere protección a las bacterias contra la
desecación y la fagocitosis.
A consecuencia de su elevado contenido en agua, se
tiñen débilmente por los colorantes.
Federico Villarreal
MECANISMO DE ACCION DELCOLORANTE

En la tinción negativa se utilizan tintes ácidos, Los tintes ácidos poseen un cromógeno negativo que no penetra la célula
de la bacteria debido a la carga negativa en la pared celular. Por esta razón la tinción lucirá como una noche estrellada. La
bacteria se verá transparente y el fondo de la laminilla del color del tinte, que en este caso, es negro.
El colorante no tiñe los microorganismos, se queda alrededor de ellos, Se usa tinta china (suspensión de partículas de
carbón coloidal) o nigrosina (colorante negro insoluble en agua) para encontrar presencia de cápsulas alrededor de
las células microbianas y micóticas, ya que este elemento no se tiñe con bases.
Federico Villarreal
TINCIÓN NEGATIVA
MATERIAL YEQUIPO
2 portaobjetos Asa bacteriológica
Aceite de inmersión Microscopio

Mechero Cultivos bacterianos
Tinta china Franela
Cronómetro Papel seda
Guantes Puente de tinción

Federico Villarreal
1. Esterilizar el asa y enfriarla

2. Colocar una pequeña gota de agua en el extremo de un portaobjetos desengrasado
TÉCNICA
3. Esterilizar nuevamente el asa y enfriarla
4. Tomar un pequeña cantidad del cultivo , con ayuda del asa hacer una extensión
sobre el portaobjetos y enseguida colocar una gota de tinta china mezclar
cuidadosamente.
5.Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjeto, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo
de 45 grados sobre la muestra.
6.Desplazar poco a poco el segundo portaobjeto a lo largo del primero para hacer una capa fina de la
mezcla.
7. Dejar secar al aire.
8. Con el frotis hacia arriba, pasar 2-3 veces sobre la flama (con esto se fijaran las bacterias)
9. Observar al microscopio.
Cryptococcus
neoformans en una
tinción con tinta china
OBSERVACIONES
Se puede observar la
cápsula
(es la capa que rodea la
esfera).
Federico Villarreal
APLICACIÓN
• En microbiología medica la demostración de la presencia de una capsula es
un medio para determinar la virulencia del microorganismo, es decir el
grado hasta el cual un patógeno puede causar una enfermedad.
• Bacterias con cápsula: Klebsiella,

Pasteurella, Bacillus, Escherichia,
Haemoplhilus
• Levadura con cápsula: Crytococcus
Klebsiella
pneumoniae
Federico Villarreal
Tinción de Hiss
1. En un portaobjetos limpio, seco y flameado, coloque una GOTA DE SUERO o
de albumina.
2. Sobre ella coloque una PEQUEÑA MUESTRA de una colonia bacteriana,
disuelva y disperse sin producir chirridos en el portaobjetos.
3. Deje SECAR al aire libre.
4. FIJE con calor suavemente.
5. Cubra el frotis con VIOLETA CRISTAL AL 1% y mantenga flameado por 2 min.
6. Lave la lamina con SULFATO DE COBRE AL 20%.
7. Deje secar al aire libre y observe con ACEITE DE INMERSIÓN.
RESULTADOS
TINCIÓN NEGATIVA TINCIÓN DE HISS
Veremos las bacterias de

color violáceo y las
cápsulas de azul muy
pálido.

4ta y 5ta Clase Tinciones Bacterianas

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4ta y 5ta Clase Tinciones Bacterianas

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Facultad de Tecnología médica

• Como casi todos los microorganismos, son casi incoloros

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

2. Observación con tinciones

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

2. Observación con tinciones

Las observaciones en fresco, se las puede realizar de dos maneras:

PREPARACIÓN EN FRESCO SIMPLE Ó CÁMARA HÚMEDA

Se realizan a través de suspensiones de células o microorganismos

PROCEDIMIENTO PARA UN PREPARADO EN FRESCO

PREPARACIÓN EN FRESCO GOTA

REALIZACION DE LA OBSERVACION MICROSCOPICA,

• SE LE COLOCA EN FORMA INVERTIDA EN EL PORTA OBJETOS QUE

PREPARACIÓN DEL FROTIS:

PREPARACIÓN DEL FROTIS:

PREPARACIÓN DEL FROTIS:

PREPARACIÓN DEL FROTIS:

c) FIJACIÓN DEL FROTIS

PREPARACIÓN DEL FROTIS:

• Heces • Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido):

QUE ES UNA TINCIÒN?

Una tinción es un procedimiento para visualizar un tejido

FINALIDAD DE LAS TINCIONES

¿QUÉ ES TINCIÓN SIMPLE?

TINCIÓN DIFERENCIAL O COMPUESTA

- COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN,

PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS

PARED CELULAR EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

PARED CELULAR EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

TINCIÓN BACTERIOLÓGICA DE GRAM.

El equipo para realizar la tinción de

• Paso 1.- Cubrir la

• Paso 2.- Cubrir la

• Paso 3.- Cubrir la

Altagracia Jimenez Diaz MA 30/06/2017 56

PREPARÁNDONOS PARA LA OBSERVACIÓN AL

Capa de peptidoglucano gruesa Capa de peptidoglucano fina

No capa externa de Capa externa de lipopolisacáridos

Retienen cristal violeta/iodo-color Retienen safranina-color

POSEEN UNA PARED CELULAR MÁS COMPLEJA:

NO TIENE MEMBRANA EXTERNA MEMBRANA EXTERNA

NO TIENE ESPACIO PERIPLASMÁTICO ESPACIO PERIPLASMÁTICO:

LA RED DE MUREÍNA ESTÁ MUY DESARROLLADA Y LLEGA A

NO CONTIENE LPS CONTIENE LPS

EN LA TINCIÓN DE GRAM, RETIENEN LA TINCIÓN AZUL QUEDAN DECOLORADAS.

CONSERVAN EL COMPLEJO YODOCOLORANTE. PIERDEN EL COMPLEJO YODOCOLORANTE.

Cocos Gram Negativos Cocos62Gram Positivos

Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre

La tinción de esporas de Wirtz-Conklin

Tiñe selectivamente las endosporas.

La tinción de esporas de Wirtz-Conklin

• Esta tinción se clasifica dentro de las tinciones estructurales, ya que

La tinción de esporas de Wirtz-Conklin

• Los únicos géneros que producen esporas son Bacillus y Clostridium,

Después lavamos con abundante agua el exceso de

Por último visualizaremos la

Permite observar los flagelos.

• Por último, se deja secar al aire, antes de su observación al microscopio.

• Definir el CONCEPTO de capsula bacteriana.

S. Pneumoniae causante principal

Le confiere a la bacteria su valor inmunológico.

No puede ser teñida con procedimientos sencillos pero es fácil desarrollar

La tinción negativa facilita las observaciones de la