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© Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jr. Cápac Yupanqui 1400,
Jesús María Telf. 471-3254,
Fax: 471-7443
Lima, Perú, 1995
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MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS EN BACTERIOLOGIA DE
TUBERCULOSIS
COMITE RESPONSABLE:
Blgo. Luis Asencios Solís
Blgo. Neyda Quispe Torres
Dr. Hemán Sanabria Rojas.
Dr. Augusto Yi Chu.
REVISION:
Dra. Isabel N. de Kantor
Asesora OPSIOMS
COMITE EDITOR:
Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas
Dr. Jaime Chang Neira
Lic. Liliana Vigil Romero
COLABORACION:
PROGRAMA NACIONAL DE ENFERMEDADES
TRANSMISIBLES: CONTROL DE TUBERCULOSIS
Dr. Pedro Guillermo Suárez Aguilar
Director
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INDICE
PRESENTACIÓN ........................................................................................................7
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................8
RESOLUCIÓN JEFATURA .......................................................................................9
CAPITULO I
LAS MUESTRAS
CAPITULO II
LA BACILOSCOPIA (Examen microscópio)
CAPITULO III
EL CULTIVO
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3.8 Envío de cultivos al Laboratorio de Referencia
de tuberculosis (Anexo 7).........................................................................................32
3.9 Requerimientos para la preparación del medio
a base de huevo.........................................................................................................33
CAPITULO IV
REFERENCIAS BIBLIOGAFICAS ..........................................................................36
ANEXOS .......................................................................................................................37
Anexo 1:
Solicitud para la investigación bacteriológica en TBC ............................................38
Anexo 2:
Registro de muestras para investigación
bacteriológica en TBC ..............................................................................................40
Anexo 3:
Preparación de reactivos para baciloscopía ..............................................................42
Anexo 4:
Cantidad de reactivos y cálculos de módulo individual
para baciloscopía ......................................................................................................43
Anexo 5:
Parámetros para programación del módulo individual ............................................44
Anexo 6:
Preparación del material para Cultivo de Microbacterias ........................................ 46
Anexo 7:
Informe mensual de baciloscopía y cultivo .............................................................. 48
Anexo 8:
Directiva Nº 001-95: Prueba de sensibilidad de Micobacterium tuberculosis
a los medicamentos antituberculosos ....................................................................... 49
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PRESENTACION
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INTRODUCCION
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CAPITULO I
LAS MUESTRAS
1.0. ASPECTOS GENERALES
1.1.1.a. Calidad:
1. 1. 1.b. Calidad:
10
mientras dure la terapia antituberculosa.
1. 1.1.d. El Envase:
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1.1.1.e.2.Muestra matinal:
Las etapas son en esencia las mismas que las descritas para la
obtención de las muestras en el momento de la consulta. Debe darse
al paciente otro recipiente numerado, el que llevará a su domicilio,
con instrucciones para que escupa en su interior al levantarse por la
mañana y siempre antes del desayuno. El paciente debe colocar el
envase con la tapa bien cerrada en una bolsa plástica y llevarlo al
laboratorio inmediatamente.
1.1.2.2 Nebu/izaciones .
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recolector. El personal que recoge la muestra debe adoptar las medidas
de bioseguridad y las precauciones correspondientes.
Deben procesarse por cultivo, pues la escasa cantidad de bacilos así como la
presencia de mycobacterias saprofitas, hacen que la baciloscopía no sea
concluyente.
1.2.1 Orina
La muestra más recomendada es la muestra de orina obtenida en la
primera micción de la mañana, previa higiene externa con agua y jabón.
Es preferible recolectar entre 300-500 mI. en un envase limpio y estéril
de boca ancha, que facilite la recolección directa. La muestra debe ser
procesada inmediatamente siempre por cultivo. Se sugiere cultivar por lo
menos tres muestras seriadas.
Debe recordarse que la prueba de baciloscopía efectuada al sedimento
urinario no necesariamente es diagnóstico concluyente de
tuberculosis, por cuanto existen mycobacterias saprofitas en orina,
que pueden producir resultados falsos positivos en el examen de
baciloscopía.
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1.2.5 Biopsias y material resecado
Se utiliza un envase estéril. La muestra se divide en dos partes: una
parte se envía de inmediato al laboratorio para el cultivo y la otra se
conserva o envía para el estudio histopatológico en un frasco con
formol al 10%.
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1.3.3. Recepción de la muestra:
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CAPITULO II
LA BACILOSCOPIA
(EXAMEN MICROSCOPICO)
La baciloscopía es un examen básico para el diagnóstico de la tuberculosis, útil
para el control de la evolución del tratamiento administrado al paciente, por lo que su
conocimiento debe alcanzar a los servicios de salud del país de todos los ni veles. En
el Anexo l se muestra la ficha utilizada para efectuar las solicitudes de investigación
bacteriológica de Micobacterias en tuberculosis.
- Recepción de muestras.
- Preparación y fijación de los extendidos.
- Coloración de los extendidos.
- Para microscopía y registro de resultados.
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- Bandeja de acero inoxidable o fierro enlozado para recepción de
muestras.
- Tres frascos tipo cuentagotas para los colorantes y decolorantes; de
preferencia 2 juegos.
- Papel carbón (opcional).
- Papel de filtro.
- Un recipiente de latón con tapa para incineración del material
contaminado.
- Aceite de inmersión.
- Tolueno o bencina.
- Reactivos: fucsina básica, azul de metileno, fenol en cristales, ácido
clorhídrico, alcohol de 95° ó comercial yagua destilada. Libro de
Registro.
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2.2.2. Identificación de muestras y láminas.
- Numerar los envases. Numerar las láminas portaobjetos empleando un
lápiz graso, en forma correlativa. Deberá trazarse una línea en cada
lámina portaobjeto empleando el lápiz graso, la que dividirá la
superficie en una tercera parte destinada a la numeración y dos terceras
partes para hacer el extendido. Esta línea debe trazarse en la cara
inferior de la lámina a fin de evitar que se borre la numeración al
momento de efectuar la coloración.
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- Colocar la partícula útil sobre el portaobjeto y extenderla, haciendo
movimientos de vaivén, hasta lograr que el extendido sea homogéneo (ni
muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lámina, para
evitar que el operador se contamine al manipularla. Por ningún motivo
debe calentarse la lámina mientras se haga el extendido, debido a que
por el calor se forman círculos concéntricos y precipitados granulosos.
- Pasar por la llama del mechero los bordes de la lámina extendida,
colocar sobre el soporte de madera y dejar secar a temperatura ambiente.
- Terminado el extendido, descartar los aplicadores en el receptáculo de
incineración, cerrar el envase y proseguir en igual forma para las demás
muestras.
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2.3.1. Primer Paso: Coloración de bacilos
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- Eliminar la fucsina tomando la lámina por el extremo numerado, entre el
dedo pulgar y el índice o con una pinza, inclinándola hacia adelante y
dejando caer agua corriente a baja presión sobre la parte que no tiene el
extendido.
- Una vez eliminado el alcohol ácido lavar nuevamente la lámina con agua a
baja presión, cuidando de no desprender la película que formó el
extendido.
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2.3.3. Tercer Paso: Coloración de fondo
- Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno,
previamente filtrado, durante 30 segundos a un minuto.
- Eliminar el azul de metileno y lavar cada lámina con agua a baja presión,
por ambos lados (el que tiene el extendido, como el otro lado).
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2.4. OBSERVACION MICROSCOPICA DE LA MUESTRA COLOREADA
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útiles, lo que un laboratorista capacitado hace en aproximadamente 5 minutos. Se
considera campo microscópico útil aquel en el cual se observa elementos
celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y células ciliadas). Los
campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la
lectura.
- El observador irá tomando nota del número de bacilos observados y del número
de campos microscópicos a observarse, que variará según la cantidad de bacilos
que contenga la muestra.
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Al término de la lectura retirar la lámina de la platina del microscopio, limpiar el
aceite de inmersión de la lámina con tolueno y guardar la lámina. Limpiar el exceso
de aceite del objetivo de inmersión del microscopio con papel lente humedecido con
tolueno.
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2.9. REGISTRO DIARIO DE BACILOSCOPIAS
Los registros son medios prácticos para obtener información que ayudan en las
actividades de vigilancia, supervisión y evaluación del Programa. Además
ofrecen la información necesaria para preparar los informes mensuales y
trimestrales sobre detección y control de casos.
Una vez terminadas las lecturas, debe hacerse el registro diario de las
baciloscopías para su informe al Programa Nacional de Control de
Tuberculosis. Utilizar una numeración correlativa anual (se empezará
anualmente el 2 de enero y terminará el 31 de diciembre del mismo año, desde
el número 1 hasta el último correspondiente).
2.11.3. Las partes ópticas y las lentes deben limpiarse cuidadosamente con un
trapo de lino fino o piel de gamuza que no desprenda pelusa. Nunca
debe friccionarse el papel o gamuza sobre la lente.
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acumulación de polvo y pelusas. El microscopio debe guardarse en su
estuche de protección (con una bolsa conteniendo no menos de 0,5 kg.
de Silicagel seco de color azul) lejos de la humedad y polvo.
2.11.8. Utilizar alcohol etílico 95° para la limpieza de lentes de los oculares, filtro
y todos los elementos y lentes de condensador.
2.11.9. Para la limpieza diaria del microscopio se requiere disponer del siguiente
material:
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CAPITULO III
EL CULTIVO
3.1. ASPECTOS GENERALES E INDICACIONES DEL METODO DE
CULTIVO PARA MYCOBACTERlUM TUBERCUWSlS.
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3.2.1. Procedimiento para muestras obtenidas asepticamente:
Las muestras obtenidas asépticamente, que recolectadas en un recipiente
estéril pueden cultivarse prescindiendo del proceso de descontaminación
incluyen a:
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3.3. CONSERVACION DE LA MUESTRA
3.5.1. PROCEDIMIENTOS
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las tapas).Agregar4 mI. de solución estéril de hidróxido de sodio (
NaOH) al 4 %.
3.5.l.c. Dejar a 37°C por 20 minutos en estufa (o baño maría).
3.6. LECTURA
El desarrollo de M. tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas.
Las colonias típicas son de color crema, secas, rugosas de aspecto de coliflor.y de
borde irregular. (Fotos 2, 3 Y 4).
- No se observan colonias.
Nº... Número total de colonias, si hay menos de 20.
+ De 20 a 100 colonias.
++ Colonias separadas más de 100.
+++ Colonias confluentes (se observa desarrollo en toda la superficie del
medio).
c Cultivo contaminado.
Se debe realizar frotis y coloración Ziehl-Neelsen de las colonias que no
tienen morfología típica. De observarse B.A.A.R.*, se enviará el cultivo
para su tipificación al I.N.S.
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3.8. l. Objetivos del envío de cultivos al laboratorio referencial:
Las cepas se enviaran al Laboratorio de Referencia para:
- Balanza analítica.
- Espátula.
- Papel glacine.
- Erlenmeyer (500 mI), para preparar la solución.
- Probeta (100 mi), para medir agua destilada, para la solución de sales.
- Baño maría, para disolver la solución de sales.
- Fosfato monopotásico (KH2PO4).
- Glutamato de sodio.
- Agua destilada.
- Huevos frescos
- Algodón, para la limpieza de los huevos
- Baguetas o palillos, para homogenizar los huevos
- Gasa, para filtrar el huevo homogenizado (4 capas de gasa estéril)
- Probeta (250 mi), para medir el huevo homogenizado
- Beaker (500 mI), para homogenizar los huevos
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- Embudo, para filtrar el huevo homogenizado
- Beaker (100 mI), para verificar la calidad de los huevos
- Pipetas (10 mi), para adicionar glicerol y verde de malaquita al 2%
- Glicerol
- Verde de malaquita al 2%
- Coagulador
- Bolsas de plástico para guardar los medios
- Refrigeradora
3.10.1. INGREDIENTES:
3.10.2 PROCEDIMIENTOS
Lavar los huevos con detergente y enjuagar con agua de caño, dejar secar
en una canastilla de alambre.
Limpiar los huevos con algodón embebido en alcohol al 70% y dejar secar.
Romper los huevos uno por uno y vertir en un vaso pequeño, para
comprobar si están en buenas condiciones, de 10 contrario descartar y
cambiar de vaso.
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Vaciar los huevos en un beaker y homogenizar con una bagueta o palillos
estériles, filtrar utilizando cuatro capas de gasa estéril.
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CAPITULO IV
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. CASAL, M. (1990). Microbiología Clínica de las enfermedades por
Micobacterias: Facultad de Medicina, Universidad de Córdoba, España: 19-42.
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ANEXOS
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 1
INSTRUCTIVO SOLICITUD PARA INVESTIGACION
BACTERIOLOGICA EN TUBERCULOSIS
2. Filiación del paciente: Anotar apellidos y nombres, edad, sexo, historia clínica o fichafamiliar.
3. Marcar con aspa (x) el tipo de muestra. Si es otra diferente a Esputo, mencionar en la línea
punteada.
l. Nunca Tratado: Marca con aspa (x) si no recibió tratamiento en una anterior oportunidad
(virgen al tratamiento).
2. Antes Tratado: Marca con aspa (x) en la categoría RECAIDA si el sintomático respiratorio
identificado recibió un tratamiento completo exitoso (curado) y existe la
sospecha de recaída, al solicitar la baciloscopía o en la categoría
ABANDONO si el paciente no concurrió a recibir tratamiento previo por
más de 30 días consecutivos.
6. Para control de.- Marcar con aspa (x) el mes de tratamiento actual. En caso de retratamiento,
anotar en la línea punteada el mes correspondiente.
RESULTADOS:
- Se marcará en los casilleros correspondientes el resultado: si es Positivo marcar el número
de cruces (+) (++) (+++) con tinta roja y Negativa (-) con tinta azul o negra, anotando el
N° de Registro que es el mismo N° de Orden del Libro de Registro de Muestras para
Investigación Bacteriológica enTuberculosis y la fecha correspondiente, tanto para el caso
de baciloscopía como para Cultivo.
- Escribir el nombre del laboratorio y la fecha en que se procesa la muestra.
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 3
4. Cada vez que las soluciones colorantes sean trasvasadas a los pequeños frascos
cuentagotas que se emplean para la tinción, deben filtrarse; esto es
especialmente necesario para la fucsina fenicada, porque con el tiempo se
forman pequeños cristales que son causas de error al hacer la lectura de las
láminas. Los frascos cuentagotas y sus tapas deben ser lavados con todo cuidado
cada vez que se renueve su contenido.
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
INSTRUCTIVO ANEXO 5
La Programación por Módulo Individual para el PeT, debe realizarse todos los
años en el mes de Julio, en la primera quincena e inmediatamente después remitir al
nivel correspondiente para su consolidación.
I. ATENDIDOS:
Enfermos con Tuberculosis (E), programar según la prevalencia local por 100
habitantes y con el too% de la población.
II. ATENCIONES:
Baciloscopías de Diagnóstico, 15 por enfermo y 3 de control.
III. INSTRUMENTOS:
Horas Baciloscopista. Rendimiento 5 baciloscopías por hora.
4. Aceite de inmersión, se requiere 0.36 cc. por enfermo o por cada 10 S.R.
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 6
REACTIVOS:
Hidróxido de sodio (NaOH) al 4% : : 0.16g para 4ml.de NaOH al 4%
Glutamato Monosódico : 0.02 g
Fosfato Monopotásico (KHlO.) : 0.06 g
Glicerina : 0.12 ml
Verde Malaquita : 0.0024g
Agua destilada : 2 ml
Huevos de gallina : 4 ml (01 huevo para 10 cultivo
Fenolal5% : 05 ml (01 litros de fenol
Cristalizados da 20 litros
de fenol 5%)
INSTRUMENTAL:
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 8
DIRECTIVA N° 001-95
_________________________________________
*· Las indicaciones han sido tomadas y adaptadas de las Directivas 001-94-INS y 014-94
PCT.
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5) El medio no deberá estar alcalinizado (color amarillo), acidificado (color
azulino) ni contaminado con hongos.
7) Los tubos de cultivo deberán estar sellados con cinta adhesiva para asegurar
el cierre hermético.
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PUBLICACIONES DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
ZAVALETA, A.; VERGARA, R.; VADILLO, B.; BARRIENTOS, A.; VENTO, C (1991).
Control de Calidad de Especialidades Far-macéuticas y Productos Galénicos.
Manual de Procedimientos Administrativos. Carrillo, C.; Aguilar O., J.;
EspinozaA, A; Galván, H.; Higuchi O., E. y Zavaleta, A (Eds). Ministerio de
Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro de Control de Calidad. Red de
Laboratorios de Control de Calidad de Medicamentos. Serie de Normas Técnicas
N° 4. Lima, Empresa Gráfica Cosmos. 44 págs.
CARRILLO, C; BURSTEIN, M; AGUILAR, J.; BRAVO, N; MURGUIA, M
(1991). Normas de Calificación de Laboratorios para Emisión de Certificados
Oficiales de Cólera. Carrillo, C.; Aguilar O., J.; Burstein P., M.; Espinoza A, A;
Galván, H.; Higuchi O., E. Y Zavaleta, A (Eds). Minis terio de Salud, Instituto
Nacional de Salud. Red de Laboratorios de Cólera. Serie de Normas Técnicas N°
5. Lima, Art. Lautrec, 14 págs.
51
QUlSPE T.N. Y DIAZ DE SILVA, S. (1995). Manual de normas de control de calidad
de las baciloscopías. Zavaleta, A; Vigil, L.; Cabezas, C. (Eds). Ministerio de
Salud, Instituto Nacional de Salud. Centro Nacional de Laboratorios de Salud
Pública. Red Nacional de Laboratorios de Salud. Laboratorio de Referencia
Nacional de Mycobacterias. Serie de Normas Técnicas N° 7. Lima, Art. Lautrec,
20 págs.
OTRAS PUBLICACIONES
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ANOTACIONES
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Esta publicación se terminó de imprimir
en mayo de 1995 en los
Talleres Gráficos de Art. Lautrec S:R:Ltda..
Av. Paseo de la República 731 – Lima 13
Tel/fax: 423-7616
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