Grupo 5:

Maria Jose Toledo

Manuela Londoño Tamayo
Valentina Gil Urquijo
Juan Esteban Castrillón

PASOS
Se hace uso de la base de datos DRUGBANK
y se obtiene la secuencia de nucleótidos.
Características de la proteína: Revisión
- 450 aminoácidos. bibliográfica
- Peso molecular 50 KDa.
- Secuencia de ácidos nucleicos codificante 1351pb.
- Un gen de 12000 pb que posee 7 intrones y 9
exones.
Este proteína es sencilla y se puede clonar en E.coli
pues no posee glicosilaciones ni puentes disulfuro.
 PASOS

Por tratarse de una célula eucariota donde el gen Obtención de

posee intrones y exones se empleará ARNm. ARNm
Los pasos son:

1.Obtención del ARN total con Trizol Invitrogen.

2.Purificación de ARNm.
3.Realización de RT-PCR para obtención de ADNc.

PASOS
Después de obtener el ADNc se realiza PCR
para amplificar la secuencia de interés. PCR
1. Desnaturalización.
2. Alineamiento.
3. Extensión.

PASOS
Se realiza electroforesis para visualizar el ADNc
obtenido. Electroforesis
1. preparación del gel de agarosa con buffer
2. Añadir buffer de carga al ADN y a la superficie
en gel de
de agarosa agarosa
3. Añadir marcador de tamaño, preparar la fuente
con el voltaje deseado y encender
4. Retirar el gel de agarosa y llevar a una cámara de
luz ultravioleta para visualizar

PASOS
Se usará como vector de expresión un plásmido. Se utilizara un
marcador de selección positivo añadiendo un gen de resistencia Selección y
a ampicilina y negativo añadiendo un gen LacZ. preparación de
1. Obtención del vector mediante la técnica de lisis alcalina vectores
2. Cortar el vector con enzimas de restricción.
3. Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los extremos
cohesivos

PASOS
Se hace uso de la técnica general de clonación utilizando enzimas
El ADN aislado se purifica y se fragmenta junto con el vector
mediante enzimas de restricción, se realizarán cortes cohesivos
con la enzima EcoRI:
1. Cada fragmento tiene una secuencia de una sola cadena de
nucleótidos en su terminación que es capaz de hibridar con
ADN que se ha fragmentado con la misma enzima de restricción Clonación
2.Los fragmentos de ADN se incorporan a plásmidos bacterianos mediante la técnica
3. El plásmido utilizado para la clonación tiene un solo sitio de general (enzimas)
restricción y cuando lo rompe la enzima de restricción, genera
las mismas terminaciones cohesivas que se encuentran en los
fragmentos del ADN que está siendo clonado.
4. Los extremos cohesivos del plásmido y los fragmentos de
ADN se alinean y se usa la enzima ligasa de ADN para formar
uniones covalentes.
Para identificar todos los genes que se expresan de forma activa en
la célula usaremos librarías de ADNc donde se hace necesario realizar
splicing para eliminar los intrones.

PASOS
Transferencia
de ADN
Realizaríamos este paso a través de la quimiotransformación:
1. Se incorporan los plásmidos al receptor bacteriano E. coli.
recombinante
2. Bacterias preparadas especialmente se mezclan con el ADN
3. Se aplica choque de calor, lo que causa que algunas bacterias
recolecten el plásmido

PASOS

Durante la selección del vector se añadieron genes de resistencia a

Detección y
ampicilina (selección positiva) y LacZ (selección negativa) por lo que selección de
en este paso se podrán descartar las células en las que no se dio clones
la clonación esperada y se selecciona la célula de interés.
 PASOS
1. Se toman los clones seleccionados.
2. Se depositan en un medio de cultivo liquido
Replicación en
en condiciones adecuadas. el hospedero
3. Crecimiento del cultivo y replicación de clones.

PASOS

La confirmación de la correcta clonación del ADN se evaluó

mediante una prueba PCR en tiempo real para poder amplificar Análisis de los
y al mismo tiempo cuantificar el producto. clones
Para confirmar la correcta expresión de las proteínas se uso la
electroforesis de proteínas SDS-PAGE, para separar estas por
diferencia de peso y compararla con la proteína de interés..

PASOS

Se realiza control de calidad de la proteína purificada respecto Control de

a su actividad mediante la prueba ELISA como método de calidad
cuantificación de esta proteína