Determinación de

la
biodegradabilidad
biológica de
sustancias
orgánicas bajo
condiciones
anaerobias usando
el sistema Oxitop
Control.
Ejemplos experimentales

Traducido por Juan Sebastian Alfonso.

Gerente producto Biosciences SAS.
Introducción

Durante décadas, la actividad biológica se ha usado como procedimiento de rutina para el

análisis de agua (DBO, agotamiento) para evaluar el efecto de los contaminantes. Sin
embargo, los procedimientos comparables en sistema anaerobios no han alcanzado gran
importancia hasta la fecha. Esto radica en el hecho de que los procedimientos de
medición requerían mucho tiempo y por lo tanto, eran costosos o no fáciles de realizar.
Como resultado de las preguntas en el campo del tratamiento biológico de residuos en
condiciones anaeróbicas o el posterior desarrollo de pruebas de toxicidad de bacterias
anaerobias, se crea un aumentó de la demanda de un procedimiento de medición que sea
simple y económico. Por tal razón y a través del desarrollo del sistema de medición
OxiTop Control establecido en el campo del análisis aeróbico junto con el desarrollo de
nuevos accesorios específicos, su rango de aplicación también podría ampliarse para
incluir pruebas anaeróbicas.

Este procedimiento de medición se presenta a continuación usando una serie de ejemplos

que muestran mediciones simples y reproducibles realizadas en el proceso de
degradación anaeróbica biológica en lodos digeridos o emulsiones de lodos digeridos,
particularmente en polímeros y grasas.

Fundamentos

Ventajas fundamentales de la degradación anaeróbica

La degradación anaeróbica de los contaminantes, por ejemplo como los productos
químicos en aguas residuales industriales tienen las siguientes ventajas en comparación
con los procedimientos de degradación aeróbica:

• La cantidad de masa biológica que resulta es considerablemente menor que en el

proceso aeróbico.
• Ya no se requiere el procedimiento de aireación con uso intensivo de energía.
• Esto forma gas biológico (dióxido de carbono (CO2) y metano (CH4)) que puede usarse
para la generación de energía.

Principio de medición
La degradación anaeróbica provoca la formación de gas biológico (CH4 y CO2) que da
como resultado un aumento de la presión en el espacio de cabeza del matraz graduado a
prueba de gases.
La sustancia de prueba se usa como fuente C, diluyéndose en una solución salina
mineral. (Sustancia de ensayo >> compuestos C en el lodo digerido). Se agrega una
cantidad específica de lodo digerido de una planta de tratamiento de aguas residuales.
Las soluciones de muestra se conducen paralelamente a soluciones en blanco o
soluciones de control. Los matraces graduados se agitan suavemente usando agitadores
magnéticos y sistemas de agitación inductiva y se incuban en la oscuridad a 35 ° C. La
presión del gas biológico resultante se registra mediante el sistema de medición OxiTop-
C/B y se almacena automáticamente durante todo el período de tiempo del experimento.
Los datos se transmiten de forma remota (por infrarrojo) al controlador OxiTop. Todo el
desarrollo de presión o la formación de gas biológico de la solución de muestra se puede
visualizar gráficamente en el controlador. Los datos almacenados en el controlador se
transmiten a una PC y luego se procesan en Excel. Después de la degradación posterior
que da como resultado la formación de una meseta (presión de gas biológica constante),
el CO2 resultante se puede recoger o absorber de acuerdo con a o b descrito a
continuación.

a) CO2 en el espacio superior

Inyecte un absorbedor de CO2 (por ejemplo, 1 ml de KOH (30% v/v)) a través del
tabique en el tapón del matraz graduado. El proceso de absorción conduce a una
disminución de la presión en el espacio de cabeza.
b) CO2 en la muestra y el espacio superior
Inyecte una solución de expulsión (por ejemplo, 1 ml de HCl al 19% v/v) en la solución
experimental a través del tabique. El CO2 expulsado de la fase líquida y hacia el
espacio de cabeza provoca un aumento de la presión en el espacio de cabeza.
Cuando el CO2 se ha expulsado completamente de la solución, el CO2 contenido en
el espacio libre se absorbe como se describe en a), conduciendo a una reducción de
la presión. La presión residual resultante en la solución experimental menos la presión
residual en la solución en blanco da como resultado una presión diferencial que
corresponde a la cantidad de CH4 que se forma. Esto se puede usar para hacer
declaraciones cuantitativas sobre la degradabilidad biológica anaeróbica de las
sustancias orgánicas que se están probando.

Bases de cálculo
La determinación de la degradabilidad biológica anaeróbica de compuestos orgánicos en
lodos digeridos se describe en la norma DIN EN ISO 11734 (1998) o DEV L47 como un
proceso que implica la medición de la producción de gases biológicos. Por razones
prácticas, la presión del gas se mide en hectopascales ((1 hPa = 100 Pa, 1 Pa = 1 N/m2)
o 1 hPa = 1 mbar), el volumen en mililitros y la temperatura en ° C. La temperatura se
especifica en Kelvin para el cálculo; p.ej. 35 ° C = 308,15 K.

La base de todos los cálculos siguientes es la ley de los gases ideales:

n número de moles del gas formado (mol).

p Presión del gas en Pascales. (N/m2)
V Volumen del gas (Metros cúbicos)
R Constante de los gases (8.314 J/(mol/K))
T Temperatura de incubación
Si el cálculo se realiza con las unidades de hPa y el volumen en mL, así como la
constante de gas R y una temperatura T de 35 ° C (equivalente a 308,15 K) se introducen
como un factor en la ecuación, simplificando la ecuación a:

Dónde:
n número de moles del gas formado [mol]
p presión del gas [hPa]
V volumen del gas [mL]

Contenido de carbono en la fase gaseosa

El contenido de carbono en la fase gaseosa está representado por la suma del metano y
el dióxido de carbono. El carbono neto producido en el gas formado en la fase gaseosa
(después de restar el valor en blanco respectivo) como resultado de la degradación de la
sustancia se calcula de acuerdo con:

Dónde:
nCO2 ,g/CH4: Número de moles del gas formado (CO2 y CH4) (mol)
Δp: Diferencia de la presión de gas en la botella (Presión final menos la presión inicial)
restándole el respectivo blanco. (hPa)
Vg: Volumen del gas en la botella [mL];
10−4: Factor de conversión de Pa a hPa y metros cúbicos a mililitros.

La curva de la degradación biológica se representa gráficamente como un aumento

acumulado de la presión Δp en hPa frente al tiempo. La fase de retardo se puede leer (en
minutos o en días) desde esta curva. La fase de retraso es el tiempo desde el cual el
experimento comienza hasta el momento en que ocurre la degradación significativa (ver
ejemplos en la sección de resultados).

Contenido de carbono en la fase acuosa

El carbono en la fase acuosa se encuentra principalmente en forma de carbonato, como
por ejemplo carbonato de hidrógeno. Esto significa carbono inorgánico. Al inyectar ácido
clorhídrico en la muestra, el carbonato se transforma en dióxido de carbono. Esto provoca
un aumento adicional de la presión, que corresponde al contenido de carbono de la fase
acuosa. Se calcula de la siguiente manera (El valor en blanco se puede calcular de
manera similar):
Dónde:
n Número de moles de carbón de la fase líquida (mol);
p1 Presión absoluta del gas [hPa] antes de la inyección del HCl
p2 Presión absoluta del gas [hPa] después de la liberación del CO2;
Vg Volumen del gas [mL];
V HCl Volumen del ácido clorhídrico [mL]
R Constante del gas [8,314 J/(mol * K)];
T temperatura de incubación [K].

Diferenciación entre metano y dióxido de carbono

Al inyectar la solución de KOH en el manguito de goma (en la fase gaseosa de la botella),
El dióxido de carbono transformado a carbonatos de potasio. La cantidad total de dióxido
de carbono se calcula de la siguiente manera (el valor en blanco se calcula de la misma
manera):

Dónde:
n número total de moles formados [mol];
p2 Presión absoluta [hPa] antes de la inyección de KOH
p3 Presión absoluta [hPa] después de la inyección de KOH.
Vg volumen del gas [mL];
VHCl volumen de HCl añadido [mL]
VKOH volumen de KOH añadido [mL]
R constante de gas [8,314 J/(mol * K)];
T temperatura de incubación [K].

Carbono total convertido a gas

El carbono total convertido a gas se calcula de acuerdo con la ecuación:

Dónde:
nC Número de moles totales de carbón.
Contenido de carbono de la sustancia problema
Para determinar el coeficiente de degradación biológica, es necesario establecer una
relación de los valores experimentales con el contenido de carbono real de la sustancia de
ensayo.
El contenido de carbono se calcula con la fórmula total de la sustancia de prueba:

Dónde:
nC,theo: número de moles de carbono en el test de la sustancia.[mol]
mPS: masa de la sustancia a analizar en la botella. [g]
MPS: peso molar de la sustancia. [g/mol]
xC: número de átomos de C en la formula total.

Coeficiente de degradación biológica

El coeficiente de degradación biológica se calcula a partir de la concentración de gas en la
fase gaseosa:

El coeficiente de degradación total se calcula de acuerdo con:

Dónde:
Dh: Coeficiente de degradación biológica del gas formado en la fase gaseosa en
porcentaje.
Dt: Coeficiente de degradación biológica total en porcentaje.
La curva del proceso de degradación se obtiene representando el grado de degradación
Dt frente al tiempo.
Material, medios e instrumentos
Reactivos
• H2O desionizado
• Expulsión de CO2 usando HCl (19% v/v).
• Absorbedor de CO2, KOH (30% v/v).

Sustancias de prueba
• Varios polímeros y grasas degradables fueron probados en los experimentos descritos a
continuación.
• El PVA (alcohol polivinílico) se utiliza en la industria textil como un agente suavizante en
el procesamiento de hilos.
• El almidón CM (carboximetilalmidón) también se usa en la industria textil como agente
de suavizado.
• PHB (ácido polihidroxibutírico) se utiliza, especialmente en medicina, como polímero
biológicamente degradable en implantes. PHB se utiliza en el reactor de laboratorio como
fuente C, como donador de electrones, como adhesivo y como eliminación de nitratos en
el agua potable.
• Grasa para freír

Las sustancias de prueba se disuelven en agua desionizada

Sustancia de referencia
Como sustancia de referencia fácilmente degradable, se usa glucosa en el experimento.
La glucosa normalmente se degrada a> 60%.
La glucosa se disuelve en agua desionizada

Medios

 Tap water: pH 7.1

 Soluciones Salinas de Baumann A and B:

Solución salina A:
5.44 g KH2PO4
6.97 g K2HPO4
10.70 g NH4Cl

Añadir todo esto a 1000 ml de agua desionizada de pH 7.0.

Solución salina B:
2.19 g CaCl2 * 6 H2O
2.03 g MgCl2 * 6 H2O
0.4 g FeCl2 * 4 H2O
6.3 mg MnCl2
1.0 mg ZnCl2
0.6 mg CuCl2
0.2 mg Na2MoO4 * 2 H2O
12.2 mg Co(NO3)2 * 6 H2O
1.0 mg NiCl2 * 6 H2O
1.0 mg Na2SeO3

Añadir todo esto a 1000 ml de agua desionizada.

 Solution de TeGeWa:
85 mg KH2PO4
218 mg K2HPO4
334 mg Na2HPO4 * 2 H2O
475 mg (NH4)2SO4
33 mg CaCl2 * 2 H2O
23 mg MgSO4 * 7 H2O
0.25 mg FeCl3

Añadir todo esto en 1000 ml de agua desionizada.

Microorganismos.

 Lodo anaerobio.
 La adición de 25 ml de lodo (10% v/v).

Equipos

 Beakers, pipetas, cilindros de medición entre otros.

 Cilindro con gas Nitrógeno (N2) para inyección a soluciones de experimentación.
 Jeringas con agujas de longitud de 10 cm como mínimo.
 Oxitop control AN6.
 Cámara anaeróbica con atmosfera N2/H2 y esclusa.
 Phmetro de laboratorio.
 Balanza de laboratorio con lectura precisión de 0.1g.
 Termostato incubador a 35°C.

Descripción del experimento

Preparación
• Determinación del volumen de la botella (volumen de gas) de los matraces graduados
MF 45/500 utilizados en el experimento con los tapones de goma GK 600, OxiTop®
Adapter AD / SK y un agitador magnético RST 600 mediante:
• Determinación del peso muerto de los matraces graduados,
• Relleno sin burbujas de aire de los matraces graduados con agua y determinación del
peso de la botella llena.
• Determinación del volumen de gas por formación de diferencia.
• El valor promedio por botella es: 617 ml de volumen líquido.
• Se utiliza un volumen experimental de 250 ml por botella para cada uno de los siguientes
experimentos (a menos que se especifique lo contrario).
• Esto corresponde a un espacio de cabeza resultante de 367 ml.
• Preparación de soluciones de medios anóxicos (por ejemplo, mediante la introducción de
N2).

Preparación de las soluciones experimentales y de control

• El relleno de las soluciones experimentales se realiza en la cámara anaeróbica bajo N2
atmosférico.
• Coloque el agitador magnético en el matraz graduado y llénelo con solución de medio
(agua corriente, soluciones salinas según Baumann, solución TEGEWA) de acuerdo con
las tablas de pipeteo proporcionadas para los experimentos individuales en la sección de
resultados.
• Inyecte con lodo digerido (25 ml) lo más fresco posible.
• Luego, agregue las sustancias de prueba (con la excepción de la glucosa que fue
inicialmente
inyectado inmediatamente antes del inicio del experimento) de acuerdo con el rango de
concentración seleccionado. Repita las determinaciones.
• Preparación de una muestra de control (valor en blanco) sin ninguna sustancia de
prueba para determinar la actividad intrínseca del lodo digerido. Se agregaron volúmenes
apropiados de H2O desionizada.
• Determinación del valor de pH de las soluciones experimentales; si es necesario,
ajústelo a pH 7 ± 0.2 con alcalinízante o ácido diluido.
• Cierre herméticamente las aberturas de los matraces graduados con tapones y tabiques
e inserte un adaptador OxiTop®. Coloque sin apretar el accesorio de rosca de tapón GL45
y el tapón de goma.
• Incubar durante la noche a 25 ° C (si es técnicamente posible, 35 ° C) en la camara
anaeróbica para asegurar una atmósfera anaeróbica para el experimento.
• Preajuste el gabinete del termostato con plataformas de agitación a 35 ° C durante 2-3 h.
• Antes de comenzar el experimento, inyecte una solución de glucosa (0.5 ml) en las
botellas apropiadas.
• Atornille firmemente el conector de rosca GL45 y el sensor de medición OxiTop® y retire
las botellas de la camara anaeróbica.
• Seleccione "Presión p" como el tipo de experimento en el controlador; Ingrese la
duración del experimento (por ejemplo, 20 días); Configure la presión de advertencia, p.
250 hPa (ver también BA OC110); Comience los sensores de medición. Incubación y
medición del gas
• Para la duración seleccionada del experimento, las soluciones de prueba se incuban a
35 ° C en el gabinete del termostato. Para obtener una temperatura uniforme en las
muestras, las soluciones de prueba se agitan a baja velocidad mediante un sistema de
agitación inductiva.
• Nota:
• Si es necesario, en el caso de stocks de bacterias sensibles, la agitación continua puede
o debe evitarse. Una alternativa a esto es el movimiento ligero en una máquina
sacudidora (50-100 rpm / min) o movimiento manual (por ejemplo, 1x por día).
• La formación de biogás durante el proceso de degradación causa sobrepresión en los
matraces graduados. Los valores de presión que se miden se almacenan
automáticamente en el sistema de medición OxiTop.
• La transmisión de los valores medidos en el controlador es realizada por el operador
dependiendo de la formación de biogás en los intervalos de tiempo seleccionados. Se
observa la curva de presión y, si es necesario, el valor actual almacenado.
Si se excede la presión de advertencia, se debe realizar el procesamiento selectivo de la
muestra (por ejemplo, aireación a través del tabique).
Al final del experimento, se determina el valor de pH, p. retirando alguna muestra.
Además, dependiendo del método de trabajo, se inyecta 1 ml de HCl en los matraces
graduados individuales (véase también 3.2). Esto se usa para expulsar el CO2 de la fase
acuosa. Las muestras se incuban durante 4 horas más a 35 ° C en el armario del
termostato.
• 1 ml de KOH se inyecta en el tapón de goma de las botellas de muestra. Esto absorbe el
CO2 formado en el espacio de cabeza.
• Los matraces graduados se incuban después de la adición de un absorbente (KOH)
durante otras 18-24 h a 35 ° C. El metano permanece como la presión residual.
• Los datos almacenados del sistema de medición se leen en el controlador y se
transmiten directamente desde el controlador a la PC utilizando el programa de
comunicación PC Achat OC. La evaluación de los datos se realiza utilizando el programa
de hoja de cálculo, Excel.

Realizando los experimentos; Resultados

Preparaciones con varias soluciones tamponadas
Para encontrar un medio óptimo para realizar el experimento, se probaron diversas
soluciones tampón en la primera parte del experimento.

Experimento 1: Usar las siguientes soluciones (cada una en doble preparación)

• Agua del grifo
• Solución salina mineral según Baumann A
• Solución salina según TeGeWa

Todas las soluciones experimentales fueron inyectadas con:

• Lodos digeridos disponibles a una concentración del 6% (v/v).

Sustancia de prueba para la degradación:

• Glucosa; la concentración de glucosa utilizada fue de 75 mg (concentración final en un
volumen de líquido en los matraces graduados de 365 ml)
El volumen de líquido en las botellas fue de 365 ml con un espacio de cabeza de 252 ml.
Tabla de pipeteo.
Figura 1: Degradación de la glucosa en varias soluciones buffer con lodo digerido.
(Ambos con y sin expulsión de CO2).

Las curvas anteriores muestran las siguientes soluciones experimentales:

• Agua + HCl: el CO2 se expulsó al final del experimento con HCl (aumento de la presión)
y luego se agregó KOH como absorbente (caída de presión).
• Agua: solo se añadió KOH como absorbente al final del experimento (Caída de presión).
• Baumann + HCl: el CO2 fue expulsado al final del experimento por el HCl (aumento
leve de la presión) y luego se agregó KOH como un absorbente (caída de presión).
• Baumann: se añadió KOH como absorbente al final del experimento (caída de presión).
• TeGeWa + HCl: el CO2 fue expulsado por HCl al final del experimento (aumento en
presión) y luego se añadió KOH como un absorbente (caída de presión).
• TeGeWa: se añadió KOH como absorbente al final del experimento (caída de presión).

El momento en el que se produjo la expulsión por el HCl, identificado como un fuerte

aumento de la presión al final del experimento, se marca en el gráfico. También se marca
el momento en que se agregó el absorbente KOH en el manguito de goma (fase gaseosa)
que está vinculado con una caída de presión.
La Figura 1 muestra un aumento de la presión en todas las soluciones inmediatamente
después del inicio del experimento que se remonta a un cambio de temperatura inicial de
25 ° C a 35 ° C. Después de una fase de latencia de 12 h, hay un aumento en la presión
que indica una degradación anaeróbica.
• En las soluciones que utilizan agua del grifo y la solución TeGeWa, el aumento de
presión fue mayor. En las soluciones que usaban agua del grifo, esto gradualmente se
convirtió en una meseta.
• En las soluciones TeGeWa, la presión volvió a caer después de alcanzar un máximo a
las 28 h y luego nivelarse a un valor casi constante.
• La Figura 1 muestra claramente que se logró un muy buen resultado de degradación
para la glucosa en las soluciones que usaban agua del grifo. En contraste con esto, con la
solución TeGeWa el aumento de presión fue mas bajo y la degradación de la glucosa se
retrasó.
• Además, en la solución salina mineral Baumannn A, solo se detectó un ligero aumento
en la presión y la meseta de la curva fue similar a la obtenida cuando se usó la solución
de TeGeWa.
• Después de alcanzar una fase de meseta, se inyectó 1 ml de HCl en las soluciones
experimentales respectivas después de 139,5 h (5,8 días) y se expulsó el CO2 en la
solución.
• Después de 144.2 h, el CO2 ahora presente en la fase gaseosa fue absorbido por la
adición de un absorbente (0.5 ml de KOH) a través del tapón del matraz graduado.
• Esto dio como resultado una caída en la presión.

Cálculos en el experimento 1, figura 1

El experimento se realizó sin ningún control (es decir, sin lodo digerido en blanco) de
modo que la cantidad de gas formado solo puede especificarse como un valor absoluto.
Las siguientes tablas se calcularon de acuerdo con la ecuación general de los gases.

Tabla 1ª. Formación de Biogases.

En agua potable, 75 mg de glucosa fueron convertidos en

 1.22 mmol de gas carbón (CO2 gaseoso + CH4)
 Duración: 123.2 horas
Tabla 1b. Expulsión usando HCl

En agua potable, gases expelidos con 1 ml de HCl.

 1.27 mmol de gas carbón en la fase acuosa (CO2 del liquido)
 Duración: 4.7 h

Tabla 1c. Desglose de la cantidad de CO2 en CO2 líquido y CO2 gaseoso por
absorción de KOH

Despues de la adición de HCl, se añadió 0.5 ml de sorbente KOH

 0.87 mmol de CO2.
 14.5 h de duración.
Sin expulsión de HCl, se añadió 0.5 ml de sorbente KOH:
 0.43 mmol.
 14.5 horas de duración.
Tabla 1d: Fermentación de glucosa en una solución según Baumann A (con lodo
digerido).

En la solución de Baumann A, se convirtieron 75 mg de glucosa en:

 0.36 mmol de gas carbón (CO2 g + CH4)
 Duración de 123.3 h

Tabla 1e. Usando expulsión con HCl

En la solución de Baumann A, con 1 ml de HCl:

 0,16 mmol de carbono en el gas (CO2 liquido)
 Duración: 4.7 h
Tabla 1f: Desglose de la cantidad de CO2 en CO2fl y CO2g por absorción de KOH

Despues de la adición de HCl, se añadió 0.5 ml de sorbente KOH

 0.24 mmol CO2
 14. 5 horas de duración
Botella sin adición de HCl, Se añadió 0.5 ml de sorbente KOH.
 0.08 mmol CO2
 Duración de 14.5 horas

Desde el incremento de presión (figura 1) en el ensayo usando la solución de TeGeWa

fue muy bajo. El resultado del total del biogás no fue calculado.

Tabla2. Sumatorias de gas formado y resultados de degradación después de una

fermentación total en un periodo de 123.5 horas.
La sumatoria del gas formado por expulsión con 1 ml HCl no pudo ser absorbida
completamente con los 0.5 ml de KOH. Para siguientes experimentos la addición de KOH
fue incrementada a 1 ml. Una verificación de la cantidad de material de absorción puede
ser útil para casos especiales.